CN108704164A - 一种注射用细胞辅助自体脂肪移植物及其制备方法 - Google Patents

一种注射用细胞辅助自体脂肪移植物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明实施例提供一种注射用细胞辅助自体脂肪移植物及其制备方法，涉及医学整形和美容领域，注射用细胞辅助自体脂肪移植物能够提高自体脂肪移植成活率，显著改善脂肪移植后效果。所述注射用细胞辅助自体脂肪移植物包括自体脂肪颗粒、间充质干细胞聚集体和自体富含血小板血浆PRP。

Description

一种注射用细胞辅助自体脂肪移植物及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学整形和美容领域，尤其涉及一种注射用细胞辅助自体脂肪移植物及其制备方法。
背景技术
软组织移植物利用占位效应支撑组织结构，起到修复软组织缺失、祛除凹陷的作用，还可为胸部或臀部增加容积，达到重塑外形的目的。良好的软组织移植物需要具有以下特征：（1）组织相容性好，不引起炎症反应；（2）能够与填充部位整合；（3）填充效果持久可靠。
自体脂肪作为软组织移植物最早应用于1893年， Neuber使用患者自体脂肪填充凹陷性面部缺陷。自体脂肪与胶原蛋白、透明质酸、PMMA、聚丙烯酰胺等凝胶类软组织填充剂相比优势明显：可通过抽脂术获得，经离心去除肿胀液后即可填充至修复部位，无需纯化、交联、灭菌等工艺过程，步骤简单，安全可靠。但是，自体脂肪填充血供重建困难，中心部位易发生坏死、液化，最终纤维化且被吸收，制约了该技术的临床应用。
为了改善移植效果，人们开始尝试向脂肪组织中加入成纤维细胞、血管基质片段（SVF）或干细胞，期望细胞能够参与新生血管生成，有助于移植脂肪组织早期血供的建立，从而提高移植物成活率，称之为“细胞辅助自体脂肪移植”（cell assistedliportransfer, CAL）。专利CN 102205147 A公开了一种包含SVF和PRF的脂肪移植物，就是利用SVF的细胞混合物特征以及PRF包含的多种生长因子促进软组织再生。文献中也有将CAL应用于临床治疗的报道。然而，大样本比较发现CAL的移植效果并不明显优于传统的自体脂肪移植方法。分析原因：在脂肪移植物构建过程中，天然脂肪组织结构受到破坏，缺少支撑，使添加的细胞被脂肪颗粒包裹其中，难以参与血供重建，最终导致移植物中心坏死，移植失败。
发明内容
本发明实施例提供了一种注射用细胞辅助自体脂肪移植物及其制备方法，注射用细胞辅助自体脂肪移植物能够提高自体脂肪移植成活率，显著改善脂肪移植后效果。
为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：
本发明实施例提供一种注射用细胞辅助自体脂肪移植物，所述注射用细胞辅助自体脂肪移植物包括自体脂肪颗粒、间充质干细胞聚集体和自体富含血小板血浆PRP。
进一步地，所述间充质干细胞聚集体具有力学强度。
进一步地，所述间充质干细胞聚集体中至少包括胶原。
进一步地，所述自体富含血小板血浆PRP中至少包括转化生长因子β-1(TGFβ-1)、血小板源性生长因子 (PDGFs)和胰岛素样生长因子(IGFs)。
进一步地，所述自体富含血小板血浆PRP具有纤维蛋白支架作用和缓释作用。
本发明实施例还提供一种注射用细胞辅助自体脂肪移植物的制备方法，所述注射用细胞辅助自体脂肪移植物的制备方法至少包括如下步骤：
步骤一：自体脂肪颗粒的纯化
处理抽脂获得的脂肪组织，得到固态的脂肪颗粒；再将得到的脂肪颗粒去除结缔组织，用组织剪将大块组织剪碎，以1 ml注射器去除针头后能正常抽取为宜；
步骤二：间充质干细胞聚集体制备
将间充质干细胞接种在一次性培养皿中，于37℃，5 % CO2条件下进行细胞膜片培养；使用DMEM高糖培养基培养7~10天后，细胞膜片形成；将细胞膜片从边缘揭起，在无菌环境下分割成边长1~1.5 mm的间充质干细胞聚集体，备用；
步骤三：自体富含血小板血浆PRP分离
根据所需比例，从患者外周静脉抽取静脉血，置于无菌离心管中，于1500 rpm 离心15min，将上清转移至另一无菌离心管中，于3000 rpm离心15 min，弃去上1/3血浆后，重悬血小板制备成富含血小板血浆；
步骤四：移植物制备
将上述纯化后的脂肪颗粒与间充质干细胞聚集体充分混合，于37℃条件下孵育15~30min；然后，将脂肪颗粒、间充质干细胞聚集体、自体富含血小板血浆充分混合，即制成脂肪移植物。
进一步地，所述步骤一，具体包括：
将抽脂获得的脂肪组织 1000-2000 r/min，21℃离心 2-10min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒；再将得到的脂肪颗粒去除结缔组织，用组织剪将大块组织剪碎，以1 ml注射器去除针头后能正常抽取为宜；所述脂肪组织离心去除麻醉过程中注射的肿胀液，使脂肪组织纯度更高；去除结缔组织使后续移植材料混合均匀和易于注射。
进一步地，所述步骤二，具体包括：
将间充质干细胞以1×105~1×106个/cm2密度接种在直径为100 mm的一次性培养皿中，于37℃，5 % CO2条件下进行细胞膜片培养；使用DMEM高糖培养基，所述高糖培养基中含有10 % 胎牛血清（FBS）、30~70 mg/ml 维生素C、2~5 ng/ml 成纤维细胞生长因子、2~5 ng/mlTGF-β，每两天换液一次，培养7~10天后，细胞膜片形成；将细胞膜片从边缘小心揭起，在无菌环境下分割成边长1~1.5 mm的间充质干细胞聚集体，备用。
进一步地，所述步骤三，具体包括：
根据所需比例，从患者外周静脉抽取静脉血，置于无菌离心管中，于1500 rpm 离心15min，将上清转移至另一无菌离心管中，于3000 rpm离心15 min，弃去上1/3血浆后，重悬血小板制备成富含血小板血浆。
进一步地，所述步骤四，具体包括：
将纯化后的脂肪颗粒与间充质干细胞聚集体按照V/V=1/1充分混合，于37℃条件下孵育15~30 min；然后，将脂肪颗粒、间充质干细胞聚集体、富含血小板血浆充分混合，即制成脂肪移植物。
本发明提供的发明与现有技术相比具有以下优点 ：
（1）间充质干细胞聚集体具有一定的力学强度，能够在脂肪移植物中起到内支撑的作用，将脂肪颗粒分隔，有助于脂肪颗粒与周围组织的营养交换，易于血管化。
（2）PRP含有转化生长因子β-1(TGFβ-1)、血小板源性生长因子 (PDGFs)、胰岛素样生长因子(IGFs)等，并具有纤维蛋白支架和缓释作用，具有良好的促进软组织再生的能力。此外，间充质干细胞聚集体中的胶原可以促进PRP形成凝胶，使脂肪移植物不会轻易分散，提升注射后的填充效果。
因此，本发明方法制备的复合脂肪移植材料具有来源丰富、获取方便、价格低廉、制备简单、安全有效、没有免疫排斥、无需体外培养、可以即时移植等特点。复合脂肪移植材料的制备方法具有普遍意义，适用于每个患者。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。
实施例1
本发明实施例提供一种注射用细胞辅助自体脂肪移植物，所述注射用细胞辅助自体脂肪移植物包括自体脂肪颗粒、间充质干细胞聚集体和自体富含血小板血浆PRP。
在一种可选的实施方式中，所述间充质干细胞聚集体具有一定的力学强度。
进一步地，所述间充质干细胞聚集体中至少包括胶原。
在另一种可选的实施方式中，所述自体富含血小板血浆PRP中至少包括转化生长因子β-1(TGFβ-1)、血小板源性生长因子 (PDGFs)和胰岛素样生长因子(IGFs)。
进一步地，所述自体富含血小板血浆PRP具有纤维蛋白支架作用和缓释作用。
该方法是向自体脂肪颗粒中加入细胞聚集体和富含血小板血浆，细胞聚集体在脂肪移植物中起到内支撑作用，为脂肪组织的营养交换提供空间。富含血小板血浆中的多种生长因子能够促进组织再生，提升注射后效果。与传统的脂肪移植方法相比，本发明能够显著改善脂肪移植后效果。
实施例2
本发明实施例还提供一种注射用细胞辅助自体脂肪移植物的制备方法，所述注射用细胞辅助自体脂肪移植物的制备方法至少包括如下步骤：
步骤一：自体脂肪颗粒的纯化
处理抽脂获得的脂肪组织，得到固态的脂肪颗粒；再将得到的脂肪颗粒去除结缔组织，用组织剪将大块组织剪碎，以1 ml注射器去除针头后能正常抽取为宜；
步骤二：间充质干细胞聚集体制备
将间充质干细胞接种在一次性培养皿中，于37℃，5 % CO2条件下进行细胞膜片培养；使用DMEM高糖培养基培养7~10天后，细胞膜片形成；将细胞膜片从边缘揭起，在无菌环境下分割成边长1~1.5 mm的间充质干细胞聚集体，备用；
步骤三：自体富含血小板血浆PRP分离
根据所需比例，从患者外周静脉抽取静脉血，置于无菌离心管中，于1500 rpm 离心15min，将上清转移至另一无菌离心管中，于3000 rpm离心15 min，弃去上1/3血浆后，重悬血小板制备成富含血小板血浆；
步骤四：移植物制备
将上述纯化后的脂肪颗粒与间充质干细胞聚集体充分混合，于37℃条件下孵育15~30min；然后，将脂肪颗粒、间充质干细胞聚集体、自体富含血小板血浆充分混合，即制成脂肪移植物。
进一步地，所述步骤一，具体包括：
将抽脂获得的脂肪组织 1000-2000 r/min，21℃离心 2-10min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒；再将得到的脂肪颗粒去除结缔组织，用组织剪将大块组织剪碎，以1 ml注射器去除针头后能正常抽取为宜；所述脂肪组织离心去除麻醉过程中注射的肿胀液，使脂肪组织纯度更高；去除结缔组织使后续移植材料混合均匀和易于注射。
进一步地，所述步骤二，具体包括：
将间充质干细胞以1×105~1×106个/cm2密度接种在直径为100 mm的一次性培养皿中，于37℃，5 % CO2条件下进行细胞膜片培养；使用DMEM高糖培养基，所述高糖培养基中含有10 % 胎牛血清（FBS）、30~70 mg/ml 维生素C、2~5 ng/ml 成纤维细胞生长因子、2~5 ng/mlTGF-β，每两天换液一次，培养7~10天后，细胞膜片形成；将细胞膜片从边缘小心揭起，在无菌环境下分割成边长1~1.5 mm的间充质干细胞聚集体，备用。
进一步地，所述步骤三，具体包括：
根据所需比例，从患者外周静脉抽取静脉血，置于无菌离心管中，于1500 rpm 离心15min，将上清转移至另一无菌离心管中，于3000 rpm离心15 min，弃去上1/3血浆后，重悬血小板制备成富含血小板血浆。
进一步地，所述步骤四，具体包括：
将纯化后的脂肪颗粒与间充质干细胞聚集体按照V/V=1/1充分混合，于37℃条件下孵育15~30 min；然后，将脂肪颗粒、间充质干细胞聚集体、富含血小板血浆充分混合，即制成脂肪移植物。
实施例3
本发明所述的自体脂肪移植物包含自体脂肪颗粒、间充质干细胞聚集体和自体富含血小板血浆。构建方法如下：
步骤一：自体脂肪颗粒的纯化
将抽脂获得的脂肪组织 1000-2000 r/min，21℃离心 2-10min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒；再将得到的脂肪颗粒去除结缔组织，用组织剪将大块组织剪碎，以1 ml注射器去除针头后能正常抽取为宜；所述脂肪组织离心，目的为去除麻醉过程中注射的肿胀液，使脂肪组织纯度更高；去除结缔组织是使后续移植材料混合均匀和易于注射。
步骤二：间充质干细胞聚集体制备
将间充质干细胞以1×105~1×106个/cm2密度接种在直径为100 mm的一次性培养皿中，于37℃，5 % CO2条件下进行细胞膜片培养；使用DMEM高糖培养基，其中含有10 % 胎牛血清（FBS）、30~70 mg/ml 维生素C、2~5 ng/ml 成纤维细胞生长因子、2~5 ng/ml TGF-β，每两天换液一次，培养7~10天后，细胞膜片形成；将细胞膜片从边缘小心揭起，在无菌环境下分割成边长1~1.5 mm的间充质干细胞聚集体，备用。
步骤三：富含血小板血浆（PRP）分离
根据所需比例，从患者外周静脉抽取静脉血，置于无菌离心管中，于1500 rpm 离心15min，将上清转移至另一无菌离心管中，于3000 rpm离心15 min，弃去上1/3血浆后，重悬血小板制备成富含血小板血浆。
步骤四：移植物制备
将上述纯化后的脂肪颗粒与间充质干细胞聚集体按照V/V=1/1充分混合，于37℃条件下孵育15~30 min；然后，将脂肪颗粒、间充质干细胞聚集体、富含血小板血浆充分混合，即制成脂肪移植物。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种注射用细胞辅助自体脂肪移植物，其特征在于，所述注射用细胞辅助自体脂肪移植物包括自体脂肪颗粒、间充质干细胞聚集体和自体富含血小板血浆PRP。
2.根据权利要求1所述的注射用细胞辅助自体脂肪移植物，其特征在于，所述间充质干细胞聚集体具有力学强度。
3.根据权利要求2所述的注射用细胞辅助自体脂肪移植物，其特征在于，所述间充质干细胞聚集体中至少包括胶原。
4.根据权利要求1或2所述的注射用细胞辅助自体脂肪移植物，其特征在于，所述自体富含血小板血浆PRP中至少包括转化生长因子β-1(TGFβ-1)、血小板源性生长因子 (PDGFs)和胰岛素样生长因子(IGFs)。
5.根据权利要求4所述的注射用细胞辅助自体脂肪移植物，其特征在于，所述自体富含血小板血浆PRP具有纤维蛋白支架作用和缓释作用。
6.一种注射用细胞辅助自体脂肪移植物的制备方法，其特征在于，所述注射用细胞辅助自体脂肪移植物的制备方法至少包括如下步骤：
步骤一：自体脂肪颗粒的纯化
处理抽脂获得的脂肪组织，得到固态的脂肪颗粒；再将得到的脂肪颗粒去除结缔组织，用组织剪将大块组织剪碎，以1 ml注射器去除针头后能正常抽取为宜；
步骤二：间充质干细胞聚集体制备
将间充质干细胞接种在一次性培养皿中，于37℃，5 % CO2条件下进行细胞膜片培养；使用DMEM高糖培养基培养7~10天后，细胞膜片形成；将细胞膜片从边缘揭起，在无菌环境下分割成边长1~1.5 mm的间充质干细胞聚集体，备用；
步骤三：自体富含血小板血浆PRP分离
根据所需比例，从患者外周静脉抽取静脉血，置于无菌离心管中，于1500 rpm 离心15min，将上清转移至另一无菌离心管中，于3000 rpm离心15 min，弃去上1/3血浆后，重悬血小板制备成富含血小板血浆；
步骤四：移植物制备
将上述纯化后的脂肪颗粒与间充质干细胞聚集体充分混合，于37℃条件下孵育15~30min；然后，将脂肪颗粒、间充质干细胞聚集体、自体富含血小板血浆充分混合，即制成脂肪移植物。
7.根据权利要求6所述的注射用细胞辅助自体脂肪移植物的制备方法，其特征在于，所述步骤一，具体包括：
将抽脂获得的脂肪组织 1000-2000 r/min，21℃离心 2-10min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒；再将得到的脂肪颗粒去除结缔组织，用组织剪将大块组织剪碎，以1 ml注射器去除针头后能正常抽取为宜；所述脂肪组织离心去除麻醉过程中注射的肿胀液，使脂肪组织纯度更高；去除结缔组织使后续移植材料混合均匀和易于注射。
8.根据权利要求6所述的注射用细胞辅助自体脂肪移植物的制备方法，其特征在于，所述步骤二，具体包括：
将间充质干细胞以1×105~1×106个/cm2密度接种在直径为100 mm的一次性培养皿中，于37℃，5 % CO2条件下进行细胞膜片培养；使用DMEM高糖培养基，所述高糖培养基中含有10 % 胎牛血清（FBS）、30~70 mg/ml 维生素C、2~5 ng/ml 成纤维细胞生长因子、2~5 ng/mlTGF-β，每两天换液一次，培养7~10天后，细胞膜片形成；将细胞膜片从边缘小心揭起，在无菌环境下分割成边长1~1.5 mm的间充质干细胞聚集体，备用。
9.根据权利要求6所述的注射用细胞辅助自体脂肪移植物的制备方法，其特征在于，所述步骤三，具体包括：
根据所需比例，从患者外周静脉抽取静脉血，置于无菌离心管中，于1500 rpm 离心15min，将上清转移至另一无菌离心管中，于3000 rpm离心15 min，弃去上1/3血浆后，重悬血小板制备成富含血小板血浆。
10.根据权利要求6所述的注射用细胞辅助自体脂肪移植物的制备方法，其特征在于，所述步骤四，具体包括：
将纯化后的脂肪颗粒与间充质干细胞聚集体按照V/V=1/1充分混合，于37℃条件下孵育15~30 min；然后，将脂肪颗粒、间充质干细胞聚集体、富含血小板血浆充分混合，即制成脂肪移植物。
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