CN113350563B - 一种组织粘合剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种组织粘合剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医用材料技术领域，尤其涉及一种用于软骨修复再生的组织粘合剂及其制备方法和应用。该组织粘合剂由多电荷类弹性蛋白、羧基化聚乙二醇和糖胺聚糖制得。本发明所述粘合剂具备组织粘合、损伤修复和生物可降解性能，可以将断裂、缺损的软骨组织进行粘合固定并填充，可以缓慢释放糖胺聚糖分子，并通过增加细胞粘附、增殖和分化等功能，促进受损软骨和半月板的修复，并可以被机体生物降解成对人体无毒无害的小分子氨基酸、二氧化以及水等。

Description

一种组织粘合剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医用材料技术领域，尤其涉及一种组织粘合剂及其制备方法和应用。
背景技术
软骨缺损是运动损伤和骨关节炎的主要病理表现。在60岁以上的老年人群中，骨关节炎患者占比超过60％，75岁以上可达到80％。软骨的缺损减少了关节在运动中的缓冲和润滑作用，会加重关节炎症的进展，进而会导致关节功能障碍。据报道，骨关节炎的致残率在60岁以上人群中可达到53％，对个人和社会都造成巨大的压力。因此，软骨缺损的修复和再生是一个急需解决的问题。
相比于人体其他组织而言，软骨组织内缺乏血管，因此自我修复能力极差。目前临床工作中针对软骨缺损的各种治疗措施仍无法完全达到预期效果。其中常见的口服药物治疗，比如氨糖片等，对关节局部的治疗作用十分有限。手术疗法中常见的有微骨折技术、自体软骨移植技术、一体软骨移植技术、自体或异体骨软骨移植技术、软骨细胞植入技术以及干细胞疗法等。这些疗法虽然能在短期内实现一定的疗效，但由于各种原因，远期疗效并不理想。微骨折技术可能会加重病变不稳的损伤，且引入骨髓血对软骨修复的帮助作用十分有限。软骨移植技术由于患者自身软骨储备有限以及异体免疫排斥反应等原因开展的并不多。细胞疗法治疗周期长、费用高，软骨修复再生效果一般。近年来的研究热点集中在生物材料的研发。生物材料包括凝胶、三支架、粘合剂、纳米颗粒等形式。其中粘合剂材料因为其有粘合性能，能够提高组织和细胞的粘附作用而具有突出优势。传统的用于软骨修复的组织粘合剂主要有纤维蛋白胶粘剂，主要成分为胶原蛋白。由于是异种来源，存在免疫排斥等问题，加之缺乏促进细胞生长分化的活性物质，所以功能有限。
理想的软骨修复材料应该具备组织粘附、缺损填充作用，同时又应具备促进细胞增殖分化的生理作用。类弹性蛋白是一类模拟人体组织中弹性蛋白氨基酸序列的人工蛋白，具有良好的生物亲和性，同时又有良好的抗压抗牵拉等力学性能，而且可以被人体完全降解吸收，无毒无害，是应用于人体生物材料研发的一种理想蛋白材料，在软骨缺损修复方面具有良好的应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种组织粘合剂及其制备方法和应用，体内外实验证明，该组织粘合剂能够有效地促进细胞粘附增殖和软骨修复。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种组织粘合剂，包括类弹性蛋白、聚乙二醇和糖胺聚糖。
本发明组织粘合剂包含的类弹性蛋白带有大量正电荷，对带有负电的细胞膜等组织具有较强的的静电作用力，粘附作用强。本发明组织粘合剂的组成材料均为生物相容性好的天然可降解材料，具有良好的生物亲和性和可降解性，降解产物为小分子氨基酸、二氧化碳、水等对人体无毒无害的物质。
本发明组织粘合剂由类弹性蛋白、聚乙二醇和糖胺聚糖按照一定的电荷比混合制成。一些实施方案中，所述类弹性蛋白、聚乙二醇和糖胺聚糖的电荷比为1:(0.5～2):(0.5～2)，优选为1:1:(1～1.5)。一些具体实施例例中，具体为1:1:0.25、1:1:0.5、1:1:1或1:1:1.5。
本发明中，类弹性蛋白为工程化多电荷类弹性蛋白(K蛋白)，为人工设计氨基酸序列，通过大肠杆菌表达后纯化所得。该类弹性蛋白包含n个重复的五肽序列，五肽序列如SEQID NO:1所示，具体为VPGKG(缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-赖氨酸-甘氨酸)，其中，n为≥18的整数，优选为18-144的整数，具体实施例中为72。其中，赖氨酸(K)在人体环境中带正电荷，其上的氨基可以与其他物质结合从而赋予该蛋白一定的功能。
糖胺聚糖是人体软骨中的一种天然粘多糖，具有促进软骨细胞粘附增殖分化促进软骨组织修复等生理作用，其上带有羧基和黄酸根等负电荷基团，可以与正电荷基团互相作用。一些实施方案中，所述糖胺聚糖为硫酸软骨素或透明质酸钠。
一些实施方案中，所述聚乙二醇为羧基化聚乙二醇。羧基化聚乙二醇的一端修饰有羧基，可以与氨基等正电荷基团相互作用，并可以连同硫酸软骨素或(和)透明质酸钠和K蛋白共同形成一种具有粘合性能的组织粘合剂。优选地，羧基化聚乙二醇的分子量为100～20000。
本发明还提供了所述的组织粘合剂的制备方法，将类弹性蛋白、聚乙二醇、糖胺聚糖与水混合，4℃、10000-12000r/min离心5-30min，于液氮或-80℃冷冻至固态，冻干后得到粘稠凝胶，获得所述组织粘合剂。
在一个具体实施例中，本发明考察了不同电荷比的组织粘合剂对猪皮的粘合强度，结果显示，类弹性蛋白、聚乙二醇和糖胺聚糖按照1:1:1或1:1:1.5的电荷比制备的组织粘合剂具有更优异的效果。
在一个具体实施例中，将组织粘合剂涂于大鼠股骨的软骨表面缺损处，8周后观察软骨表面缺损处已经由再生软骨填充替代，且表面光滑，与周围软骨组织形态一致，无明显界限，表明，本发明组织粘合剂显示出良好的粘附填充软骨缺损灶并促进软骨修复再生的作用。
基于上述效果，本发明还提供了所述组织粘合剂在制备用于组织粘合、修复和再生的药物中的应用。
所述组织为半月板组织、肌肉组织、肌腱组织、骨组织、结缔组织、皮肤组织或粘膜组织中的至少一种。
进一步地，所述组织为骨组织，优选为软骨组织。所述修复为促进损伤部位的细胞粘附、增殖或分化。
本发明组织粘合剂包括类弹性蛋白、羧基化聚乙二醇和糖胺聚糖。本发明所述粘合剂具备组织粘合、损伤修复和生物可降解性能，可以将断裂、缺损的软骨组织进行粘合固定并填充，可以缓慢释放糖胺聚糖分子，并通过增加细胞粘附、增殖和分化等功能，促进受损软骨和半月板的修复，并可以被机体生物降解成对人体无毒无害的小分子氨基酸、二氧化以及水等。
附图说明
图1示猪皮粘合测试的实验操作图；
图2示不同电荷比的组织粘合剂对猪皮粘合强度的结果图；
图3示本发明组织粘合剂对大鼠软骨全层缺损的修复作用的结果图；其中3a为软骨缺损模型的制备，黑色圆圈内所示为直径1mm的软骨全层缺损；3b为本发明粘合剂填充缺损，黑色圆圈内所示为将粘合剂填充入缺损中；3c为8周后修复效果；3d为8周后修复的组织切片，可见新生修复软骨与周围组织整合良好。
具体实施方式
本发明提供了一种组织粘合剂及其制备方法和应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1不同电荷比的组织粘合剂的粘合强度测试试验
将人工表达的类弹性蛋白(K蛋白，含72个VPGKG重复序列)、羧基化聚乙二醇和糖胺聚糖(为硫酸软骨素)分别按照电荷比例1:1:0.25、1:1:0.5、1:1:1、1:1:1.5的比例混合，制备得到四种组织粘合剂，依次命名为KPC0.25，KPC0.5，KPC1,KPC1.5。
制备过程：根据电荷比例确定溶液用量，混合后静置5min，然后以12000r/min的速度4℃离心5min，于液氮或-80℃冰箱冷冻至完全呈固态，置于冻干机中冻干20分钟左右至粘稠凝胶状，获得组织粘合剂。
将猪皮肤切成长条状，在两条皮肤底片一端分别涂抹所述组织粘合剂，将二者粘合固定，使用力学测量仪分别可以测量其粘合强度，测试图如图1所示，测试结果如图2所示。
由图2的粘合强度测试结果可知，不同电荷比的组织粘合剂的粘合强度有所不同。其中，KPC1和KPC1.5明显强于KPC0.25和KPC0.5(*代表具有统计学差异，p<0.05)。
实施例2本发明组织粘合剂对软骨缺损的修复试验
在大鼠股骨滑车出制备一个直径约1mm的软骨全层缺损灶，取适量紫外线消毒后的所述粘合剂(KPC1)涂于缺损处，可见其牢固附着不易被冲洗下来。8周后观察软骨表面缺损处已经由再生软骨填充替代，且表面光滑。与周围软骨组织形态一致，无明显界限，见图3。组织切片显示，修复再生的软骨组织与周围软骨组织形态完全一致，证明修复成功。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 清华大学
<120> 一种组织粘合剂及其制备方法和应用
<130> MP2119546
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Pro Gly Lys Gly
1 5

Claims (11)

1.一种组织粘合剂，其特征在于，包括类弹性蛋白、羧基化聚乙二醇和糖胺聚糖；
所述类弹性蛋白包含n个重复的五肽序列，所述五肽序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；其中，n为≥18的整数。
2.根据权利要求1所述的组织粘合剂，其特征在于，所述类弹性蛋白、聚乙二醇和糖胺聚糖的电荷比为1:（0.5~2）:（0.5~2）。
3.根据权利要求1所述的组织粘合剂，其特征在于，n为18~144的整数。
4.根据权利要求1所述的组织粘合剂，其特征在于，所述糖胺聚糖为硫酸软骨素或透明质酸钠。
5.根据权利要求1所述的组织粘合剂，其特征在于，所述聚乙二醇为羧基化聚乙二醇，所述羧基化聚乙二醇的分子量为100~20000。
6.权利要求1~5任一项所述的组织粘合剂的制备方法，其特征在于，将类弹性蛋白、羧基化聚乙二醇、糖胺聚糖与水混合，4℃、10000-12000r/min离心5-30min，于液氮或-80℃冷冻至固态，冻干后得到粘稠凝胶，获得所述组织粘合剂。
7.权利要求1~5任一项所述的组织粘合剂在制备用于组织粘合、修复和再生的药物中的应用。
8.权利要求1~5任一项所述的组织粘合剂在制备用于肌肉、半月板、皮肤或粘膜的粘合、修复和再生的药物中的应用。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述组织为结缔组织。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述结缔组织为骨组织或肌腱组织。
11.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述修复为促进损伤部位的细胞粘附、增殖或分化中的至少一种。
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