JP2023524865A - 軟骨病変の骨関節再生の為の複合製品 - Google Patents
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Abstract
本発明は、生体材料であって、ナノファイバーポリマースキャフォールドで作られている膜創傷パッチ（ａ）、自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞を含むハイドロゲル（ｂ）、並びにポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドである骨創傷パッチ（ｃ）であって、該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴であり、該骨創傷パッチ（ｃ）が骨成長因子を更に含む、該骨創傷パッチ（ｃ）を含み、該ハイドロゲル（ｂ）が、該膜創傷パッチ（ａ）と該骨創傷パッチ（ｃ）との間に含まれている、前記生体材料に関する。【選択図】なし
Description
本発明は、軟骨病変の骨関節再生の為の複合先進治療医薬品（composite advanced therapy medicinal product）に関する。本発明は、特に、特に変形性関節症の予防及び／又は処置を目的とする、３つの主な要素を含む生体材料に関する。
平均余命の延長及び偶発的な外傷の増加により、骨関節の外科的手技の増加が必要とされる。骨関節病変を処置する為の主な臨床オプションである関節形成術は制限及び欠点を有する。
骨軟骨欠損の再生は、特に人口の高齢化及び公共健康システムに対する高い影響力を考慮すれば、大きな課題となる。現行で施与されている外科的手技（骨グラフト、骨軟骨柱移植術、マイクロフラクチャー、関節プロテーゼ、治療用インプラント）は、患者にとって侵襲的及び／又は有痛性であり、有効性が限られ、副作用を伴う。大腿顆の病変は特に一般的であり、重篤な帰結をもたらす可能性がある。２００２年の研究では、関節鏡検査を受けている患者の６０％は骨軟骨欠損を示し；症例の半分より多くにおいて、そのような病変は、国際軟骨修復学会（ＩＣＲＳ：International Cartilage Repair Society）スケールに従って、グレード３以上として分類されることが見出された。骨軟骨欠損は適切に治らず、処置（例えば、Ｐｒｉｄｉｅの骨髄刺激又は骨軟骨柱移植術（mosaicplasty）処置により）を受けた場合であっても、症例の５２％において変形性関節症（ＯＡ：osteoarthritis）をもたらす。軟骨の独特の特性（多層化されている細胞構造、異なる細胞外マトリックス組成及び原線維配向性）はその修復を困難としている。マイクロフラクチャー、骨軟骨柱移植術、骨関節移植術又は自家軟骨細胞インプラントのような外科的技術は部分的な機能的回復を可能としうるが、疼痛の緩和及び病変の拡大の予防をほぼ目的としている（Ho YY，Stanley AJ，Hui JH，Wang SC. Postoperative evaluation of the knee after autologous chondrocyte implantation：what radiologists need to know．Radiographics 27，207-220; discussion 221-202 (2007)）。全てのこれらの技術は変動的なアウトカム（Magnussen RA，Dunn WR，Carey JL，Spindler KP．Treatment of focal articular cartilage defects in the knee：a systematic review．Clin Orthop Relat Res 466，952-962 (2008)）及び内因性の制限（Horas U，Pelinkovic D，Herr G，Aigner T，Schnettler R．Autologous chondrocyte implantation and osteochondral cylinder transplantation in cartilage repair of the knee joint．A prospective，comparative trial．J Bone Joint Surg Am 85-A，185-192 (2003); Bark S，Piontek T，Behrens P，Mkalaluh S，Varoga D，Gille J．Enhanced microfracture techniques in cartilage knee surgery：Fact or fiction? World J Orthop 5，444-449 (2014)）を有し、硝子質関節表面を回復させることが示されたものはなく（Marcacci M，Filardo G，Kon E．Treatment of cartilage lesions：what works and why? Injury 44 Suppl 1，S11-15 (2013)）、骨関節再生（ＯＡＲ）を促進する為の代替的な療法に対する探索を正当化している。最近、前培養された自家軟骨細胞を含有する哺乳動物起源の膜ベースコラーゲン材料（Nixon AJ，Rickey E，Butler TJ，Scimeca MS，Moran N，Matthews GL．A chondrocyte infiltrated collagen type I/III membrane (MACI(R) implant) improves cartilage healing in the equine patellofemoral joint model．Osteoarthritis Cartilage 23，648-660 (2015); Volz M，Schaumburger J，Frick H，Grifka J，Anders S．A randomized controlled trial demonstrating sustained benefit of Autologous Matrix-Induced Chondrogenesis over microfracture at five years．Int Orthop 41，797-804 (2017); 12．Niethammer TR，Holzgruber M，Gulecyuz MF，Weber P，Pietschmann MF，Muller PE．Matrix based autologous chondrocyte implantation in children and adolescents：a match paired analysis in a follow-up over three years post-operation．Int Orthop 41，343-350 (2017); 及びCengiz IF，et al．Orthopaedic regenerative tissue engineering en route to the holy grail：disequilibrium between the demand and the supply in the operating room．J Exp Orthop 5，14 (2018)）が、関節限局性病変を充填して軟骨再生を促進する為に使用された。しかしながら、軟骨下骨に対して行われた場合、それらは部位罹患性及び線維軟骨形成を示し（Caldwell KL，Wang J．Cell-based articular cartilage repair：the link between development and regeneration．Osteoarthritis Cartilage 23，351-362 (2015)）、機能不全な修復に繋がった。これらの制限を克服する為に、自家骨髄由来間葉幹細胞（ＭＳＣ）を用いてＯＡＲの効率を増加させるＭＳＣベース療法が出現した（Magne D，Vinatier C，Julien M，Weiss P，Guicheux J．Mesenchymal stem cell therapy to rebuild cartilage．Trends Mol Med 11，519-526 (2005); Nejadnik H，Hui JH，Feng Choong EP，Tai BC，Lee EH．Autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells versus autologous chondrocyte implantation：an observational cohort study．Am J Sports Med 38，1110-1116 (2010); Seo S，Na K．Mesenchymal stem cell-based tissue engineering for chondrogenesis．J Biomed Biotechnol 2011，806891 (2011); 及びBeane OS，Darling EM．Isolation，characterization，and differentiation of stem cells for cartilage regeneration．Ann Biomed Eng 40，2079-2097 (2012)）。それ故に、生体材料、幹細胞及び活性分子の組み合わせが、有効な組織修復を促進する為及び関節の機能的回復を達成する為に必要とされる（Henkel J，et al．Bone Regeneration Based on Tissue Engineering Conceptions - A 21st Century Perspective．Bone Res 1，216-248 (2013); 及びDrevelle O，Faucheux N．Biomimetic materials for controlling bone cell responses．Front Biosci (Schol Ed) 5，369-395 (2013)）。
その為、本発明の目的は、軟骨下骨及び軟骨の両方の再生に対処することができる新規な生体材料を提供することである。
本発明の別の目的は、変形性関節症の予防の為に有用な生体材料を提供することである。
本発明は、インプラント、創傷パッチ及び保護カバーにおける異なる機能を有する合成パッチの最適化に関する。この革新的な戦略は、多組織分化（骨／軟骨）及び十分な投薬量の成長因子による局所的な精密な刺激（ナノスケール）を含む、軟骨下骨及び軟骨再生の分野における大きな進歩を提供する。
本発明は、生体材料であって、
ナノファイバーポリマースキャフォールドで作られている膜創傷パッチ（ａ）であって、任意的に該ポリマースキャフォールドが、
多層化された滴で作られている断続的な被覆物であって、該多層化された滴が、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴である、該断続的な被覆物、又は
１５超の層ペアを含む連続的な被覆物であって、各層ペアが、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる、該連続的な被覆物
のいずれかで被覆されている表面を有する、該膜創傷パッチ（ａ）、
幹細胞、好ましくは自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞、を含むハイドロゲル（ｂ）、並びに
ポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドである骨創傷パッチ（ｃ）であって、該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴であり、該骨創傷パッチ（ｃ）が骨成長因子を更に含む、該骨創傷パッチ（ｃ）
を含み、
該ハイドロゲル（ｂ）が、該膜創傷パッチ（ａ）と該骨創傷パッチ（ｃ）との間に含まれている、
上記の生体材料に関する。
ナノファイバーポリマースキャフォールドで作られている膜創傷パッチ（ａ）であって、任意的に該ポリマースキャフォールドが、
多層化された滴で作られている断続的な被覆物であって、該多層化された滴が、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴である、該断続的な被覆物、又は
１５超の層ペアを含む連続的な被覆物であって、各層ペアが、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる、該連続的な被覆物
のいずれかで被覆されている表面を有する、該膜創傷パッチ（ａ）、
幹細胞、好ましくは自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞、を含むハイドロゲル（ｂ）、並びに
ポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドである骨創傷パッチ（ｃ）であって、該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴であり、該骨創傷パッチ（ｃ）が骨成長因子を更に含む、該骨創傷パッチ（ｃ）
を含み、
該ハイドロゲル（ｂ）が、該膜創傷パッチ（ａ）と該骨創傷パッチ（ｃ）との間に含まれている、
上記の生体材料に関する。
本発明はまた、生体材料であって、
ナノファイバーポリマースキャフォールドで作られている膜創傷パッチ（ａ）であって、任意的に該ポリマースキャフォールドが、
多層化された滴で作られている断続的な被覆物であって、該多層化された滴が、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴である、該断続的な被覆物、又は
１５超の層ペアを含む連続的な被覆物であって、各層ペアが、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる、該連続的な被覆物
のいずれかで被覆されている表面を有する、該膜創傷パッチ（ａ）；
幹細胞を含むハイドロゲル（ｂ）、並びに
ポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドである骨創傷パッチ（ｃ）であって、該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴であり、該骨創傷パッチ（ｃ）が骨成長因子を更に含む、該骨創傷パッチ（ｃ）
を含み；
該ハイドロゲル（ｂ）が、該膜創傷パッチ（ａ）と該骨創傷パッチ（ｃ）との間に含まれている、
上記の生体材料に関する。
ナノファイバーポリマースキャフォールドで作られている膜創傷パッチ（ａ）であって、任意的に該ポリマースキャフォールドが、
多層化された滴で作られている断続的な被覆物であって、該多層化された滴が、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴である、該断続的な被覆物、又は
１５超の層ペアを含む連続的な被覆物であって、各層ペアが、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる、該連続的な被覆物
のいずれかで被覆されている表面を有する、該膜創傷パッチ（ａ）；
幹細胞を含むハイドロゲル（ｂ）、並びに
ポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドである骨創傷パッチ（ｃ）であって、該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴であり、該骨創傷パッチ（ｃ）が骨成長因子を更に含む、該骨創傷パッチ（ｃ）
を含み；
該ハイドロゲル（ｂ）が、該膜創傷パッチ（ａ）と該骨創傷パッチ（ｃ）との間に含まれている、
上記の生体材料に関する。
本発明は、生体材料であって、
ナノファイバーポリマースキャフォールドで作られている膜創傷パッチ（ａ）であって、該ポリマースキャフォールドが、
多層化された滴で作られている断続的な被覆物であって、該多層化された滴が、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴である、該断続的な被覆物、
又は１５超の層ペアを含む連続的な被覆物であって、各層ペアが、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる、該連続的な被覆物
のいずれかで被覆されている表面を有する、該膜創傷パッチ（ａ）；
幹細胞、好ましくは自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞、を含むハイドロゲル（ｂ）、並びに
ポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドである骨創傷パッチ（ｃ）であって、該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴であり、該骨創傷パッチ（ｃ）が骨成長因子を更に含む、該骨創傷パッチ（ｃ）
を含み；
該ハイドロゲル（ｂ）が、該膜創傷パッチ（ａ）と該骨創傷パッチ（ｃ）との間に含まれている、
上記の生体材料に関する。
ナノファイバーポリマースキャフォールドで作られている膜創傷パッチ（ａ）であって、該ポリマースキャフォールドが、
多層化された滴で作られている断続的な被覆物であって、該多層化された滴が、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴である、該断続的な被覆物、
又は１５超の層ペアを含む連続的な被覆物であって、各層ペアが、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる、該連続的な被覆物
のいずれかで被覆されている表面を有する、該膜創傷パッチ（ａ）；
幹細胞、好ましくは自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞、を含むハイドロゲル（ｂ）、並びに
ポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドである骨創傷パッチ（ｃ）であって、該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴であり、該骨創傷パッチ（ｃ）が骨成長因子を更に含む、該骨創傷パッチ（ｃ）
を含み；
該ハイドロゲル（ｂ）が、該膜創傷パッチ（ａ）と該骨創傷パッチ（ｃ）との間に含まれている、
上記の生体材料に関する。
膜創傷パッチ（ａ）
好ましくは、該膜創傷パッチはナノファイバーポリマースキャフォールドで作られており、ここで、該ポリマースキャフォールドは、任意的に被覆されていてもよい表面を有する。
好ましくは、該膜創傷パッチはナノファイバーポリマースキャフォールドで作られており、ここで、該ポリマースキャフォールドは、任意的に被覆されていてもよい表面を有する。
好ましくは、該膜創傷パッチは、ナノファイバーポリマースキャフォールドで作られており、ここで、該ポリマースキャフォールドは、上記に説明されている被覆されている表面を有する。
該パッチ（ａ）の該スキャフォールドはポリマーで作られている。好ましくは、該ポリマーは、ポリ（ε－カプロラクトン）、コラーゲン、フィブリン、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（エチレングリコール）－テレフタレート、ポリ（ブチレンテレフタレート）、又はこれらのコポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択される。該パッチ（ａ）の該スキャフォールドはまた、ポリマー、例えばヒアルロン酸、ヒドロキシアパタイト、コンドロイチン硫酸、キトサン、及びこれらの混合物で作られていることができる。
一つの実施態様に従うと、該膜創傷パッチ（ａ）の該ナノファイバーポリマースキャフォールドは、ポリエステル；ポリアミド；ポリウレタン及びポリウレア；ポリ（アミド－エナミン）；ポリ無水物；微小生物供給源、植物供給源、海洋供給源又は動物供給源から産生されたポリマー；並びにそれらのポリマーの混合物からなる群から選択されるポリマーで作られている。
より好ましくは、該膜創傷パッチ（ａ）の該ポリマースキャフォールドはポリ（ε－カプロラクトン）又はコラーゲンで作られている。
最も好ましくは、該膜創傷パッチ（ａ）の該ナノファイバーポリマースキャフォールドは、任意的にコンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸と混合された、ポリ（ε－カプロラクトン）で作られている。
本発明に従うと、該膜創傷パッチは、軟骨成分、最も好ましくはコンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸、を含む。ヒアルロン酸（ＨＡ：Hyaluronic acid）は、軟骨マトリックス中に豊富に存在する多糖であり、軟骨再生の為に理想的な、理想的な軟骨形成性微環境を構成する。コンドロイチン硫酸は、軟骨の重要な構造成分であり、圧縮に対する抵抗性の多くを提供する。
一つの実施態様に従うと、該コンドロイチン硫酸及び／又は該ヒアルロン酸は該ポリマースキャフォールド中に含まれている。そのような実施態様において、該スキャフォールドは更に被覆されていない。
一つの実施態様に従うと、該コンドロイチン硫酸及び該ヒアルロン酸は、多層化された滴の該被覆物中に、ポリアニオンとして含まれている。
好ましい実施態様に従うと、該膜創傷パッチ（ａ）は、コンドロイチン硫酸／ヒアルロン酸滴を含むポリ（ε－カプロラクトン）スキャフォールドで作られている。
好ましい実施態様に従うと、該ポリ（ε－カプロラクトン）は好ましくはエレクトロスピニングされている。
特定の実施態様において、該パッチ（ａ）の該スキャフォールドは、多層化された滴の断続的な被覆物で被覆されている表面を有する。これらの滴はまた、「ナノリザーバー」又は「ナノコンテナー」と命名されうる。
より特には、該パッチ（ａ）の該スキャフォールドは、レイヤー・バイ・レイヤーを基準にして、交互に負に又は正に荷電した層で被覆されている。
以後に説明されているように、この被覆物は、治療用分子のナノリザーバーを作出するように該スキャフォールドを治療用分子で機能化することを可能とする。
語「多層化された滴」は、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている、滴又はパッチを云う。該滴は、異なる形状：円形状、楕円形状又は目盛り形状を示すことができる。好ましくは、該滴は、１０～１５０ｎｍ、より好ましくは１５～１００ｎｍ、よりいっそう好ましくは２５～５０ｎｍ、のサイズを有する。
本発明に従うと、語「多層化された滴被覆物」は、該スキャフォールドの表面に配されており、及び反対に荷電した分子で多層化された滴のレイヤー・バイ・レイヤー（ＬｂＬ：layer-by-layer）堆積により得られる、滴又はパッチの被覆物を云う。
語「多層化された滴被覆物」は更に、該スキャフォールドの断続的な被覆物、すなわち該生体材料スキャフォールドの表面に沿った連続的なフィルムの形態ではない被覆物を云う。該多層滴被覆物は、その不規則な形状により、及び／又は該スキャフォールドの表面の少なくとも部分が被覆されないように、それは該スキャフォールドの表面の全体をカバーしないという事実により、特徴付けられうる。本発明の該多層滴被覆物は、滑らかな表面を有し及び該スキャフォールドの表面の全体をカバーするところのフィルム被覆物と対比されうる。
該被覆物の構築は、反対に荷電した分子のレイヤー・バイ・レイヤー（ＬｂＬ）堆積に基づく。すなわち、該パッチ（ａ）の該スキャフォールドの該被覆物は、高分子電解質の多層化されたフィルムと同じ方式で作られる。その為、該骨創傷パッチ（ａ）は、該スキャフォールドの表面上に、多数の多層化された滴の形態の、高分子電解質多層を含む。
より特には、本発明による該ナノファイバースキャフォールドは、レイヤー・バイ・レイヤーを基準にして、交互に負に又は正に荷電した層で被覆されている。これらの層の少なくとも１つは、該治療用分子を組み込んでいる及び／又はからなる。これらの層は、該ナノファイバースキャフォールドの表面上に「多層化された滴」を形成する。この被覆物は、治療用分子のナノリザーバーを作出するように該ナノファイバースキャフォールドを治療用分子で機能化することを可能とする。語「多層化された滴」は、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている、滴又はパッチを云う。該滴は、異なる形状：円形状、楕円形状又は目盛り形状を示すことができる。好ましくは該滴は、１０～１５０ｎｍ、より好ましくは１５～１００ｎｍ、よりいっそう好ましくは２５～５０ｎｍ、のサイズを有する。
好ましい実施態様に従うと、該ポリカチオンは、ポリ（リジン）ポリペプチド（ＰＬＬ）、共有結合的に連結されたシクロデキストリン－ポリ（リジン）（ＰＬＬ－ＣＤ）、ポリ（アルギニン）ポリペプチド、ポリ（ヒスチジン）ポリペプチド、ポリ（オルニチン）ポリペプチド、デンドリ－グラフトポリリジン（例えば、デンドリ－グラフトポリ－Ｌ－リジン）、キトサン、及びこれらの混合物からなる群から選択される。
より好ましくは、該ポリカチオンはキトサンである。
好ましい実施態様に従うと、該ポリアニオンはまた、該コンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸に加えて更なるポリアニオンを含みうる。そのような更なるポリアニオンは、ポリ（グルタミン酸）ポリペプチド（ＰＧＡ）、ポリ（アスパラギン酸）ポリペプチド、及びこれらの混合物からなる群から選択される。
一つの実施態様に従うと、多層化された滴の該被覆物は断続的であり、該多層化された滴は、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴である。
該パッチ（ａ）の該ナノファイバースキャフォールドを被覆する該高分子電解質多層は、少なくともコンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸を含むポリアニオンの層並びにポリカチオンの層からなる少なくとも１つの層ペアから構成されている。それらは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれより多くの層ペアを含みうる。好ましくは、それは３～１２個の層ペアを含む。
そのような被覆物の作製が以下において更に説明されている。
一つの実施態様に従うと、該パッチ（ａ）の該ポリマースキャフォールドは、１５超の層ペアを含む連続的な被覆物で被覆されており、各層ペアは、少なくともコンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる。
好ましくは、そのような実施態様に従うと、該ナノファイバースキャフォールドは、各々がポリアニオンの層（負に荷電した、ヒアルロン酸及び／又はコンドロイチン硫酸を含む）、並びにポリカチオンの層（すなわち、正に荷電したＤＧＬＧ５）からなる、１５～３０個の層ペアで被覆されている。
ＢＭＰ２を含む多層化された滴被覆物と比較したヒアルロン酸又はコンドロイチン硫酸を含む該多層化された滴被覆物の利点は、該ナノファイバースキャフォールドの機械的特性の改変である。
結果的に、該２つの軟骨成分は、関節摩擦を低減させ、スキャフォールドの機械的な抵抗性を向上させ、治療用分子の治療効果を通じて組織再生を増強することを助ける親水性及び粘性の軟骨様組成物を与える。
好ましい実施態様において、該ナノファイバースキャフォールドは、好ましくは、被覆されたフィルムである。本発明による該被覆物は、好ましくは、該ナノファイバーの表面上で規則的に広がっている。好ましくは、該連続的な被覆物は、１５超の層ペアを含み、各層ペアはポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる。それらは、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれより多くの層ペアを含みうる。好ましくは、それは１５～３０個の層ペアを含む。
本発明に従うと、語被覆されたフィルムは、該ナノファイバーの表面に配されており、及び反対に荷電した分子のレイヤー・バイ・レイヤー（ＬｂＬ）堆積により得られる、被覆物を云う。該ナノファイバーを構成するポリマーの表面電荷の再分配に起因して、ポリアニオン又はポリカチオンの第１の層は、該ナノファイバーの表面に沿って吸着された小さい滴又はパッチを形成する。ポリアニオン又はポリカチオンポリマーの施与の各々の工程において、各々の滴は、ポリアニオン又はポリカチオンポリマーの新たな層によりカバーされる。被覆プロセスは、フィルム被覆物が観察された場合に停止されることができる。該フィルム被覆物が得られる場合、該多層化された滴は、該被覆されたナノファイバーの表面に沿ってこれ以上得られることはできない。
語「連続的な被覆フィルム」は更に、該ナノファイバーの連続した被覆物、すなわち該ナノファイバーの表面に沿った連続的なフィルムの形態の被覆物を云う。該連続的な被覆フィルムは、その規則的な形状により、及び／又は該ナノファイバーの表面の少なくとも部分が被覆されないように、それは該ナノファイバーの表面の全体をカバーするという事実により、特徴付けられうる。該連続的な被覆物は、滑らかな表面を有し、及び該ナノファイバーの表面の全体を被覆する（図５を参照）。
本発明に従うと、この好ましい連続的な被覆物は、コンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸をポリアニオンとして含む。
該被覆されたフィルムは、該ナノファイバーに対して膜創傷パッチとしての使用の為に有利な特徴を提供する。該多層化された滴被覆物と比較した該フィルム被覆物の第１の利点は、インプラントの他の部分を固定及び保護する為のその機械的特性である。他の利点は、該ナノファイバーの、コンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸に施与されることができる、治療用分子の、遅い分解可能性と多い量との組み合わせであり、これは炎症のリスクを減少させ、及び長い時間にわたり再生を増強する。
好ましい実施態様において、ＰＣＬは、好ましくは、二相性のエレクトロスピニングされたＰＣＬ膜である。好ましくは、そのような実施態様に従うと、この膜は、並べられた繊維の層でカバーされているランダムな繊維から構成されていることができる。この二相性の膜は、例えば、実施例１の最初の２つの段落に記載されているようにＣＳ／ＨＡのナノリザーバーを用いて得られることができる。
ハイドロゲル（ｂ）
好ましくは、該ハイドロゲル（ｂ）は、ヒアルロン酸及び／又はアルギン酸塩を含む。
好ましくは、該ハイドロゲル（ｂ）は、ヒアルロン酸及び／又はアルギン酸塩を含む。
上記に言及されているように、該ハイドロゲルは、自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞である生細胞を含む。好ましくは、該ハイドロゲルは自家骨髄由来間葉幹細胞を含む。該生細胞は、好ましくは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ：induced pluripotent stem cells）技術により得られる。
特定の実施態様において、該生細胞は、該骨創傷パッチ（ｃ）のスキャフォールド上に堆積されたハイドロゲル（例えば、アルギン酸塩ハイドロゲル又はコラーゲンハイドロゲル）内に含まれる。
ハイドロゲルは当業者に周知である。アルギン酸塩ハイドロゲルは、例えば、アルギン酸塩とヒアルロン酸との混合物（例えば、アルギン酸塩：ヒアルロン酸溶液（４：１）；これは０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中ｐＨ７．４で調製されうる）でありうる。
骨創傷パッチ（ｃ）
該パッチ（ｃ）の該スキャフォールドはポリマーで作られている。
該パッチ（ｃ）の該スキャフォールドはポリマーで作られている。
好ましくは、該ポリマーは、ポリ（ε－カプロラクトン）、コラーゲン、フィブリン、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（エチレングリコール）－テレフタレート、ポリ（ブチレンテレフタレート）、又はこれらのコポリマー、及びこれらの混合物からなる群から選択される。
一つの実施態様に従うと、該骨創傷パッチ（ｃ）の該ナノファイバーポリマースキャフォールドは、ポリエステル；ポリアミド；ポリウレタン及びポリウレア；ポリ（アミド－エナミン）；ポリ無水物；微小生物供給源、植物供給源、海洋供給源又は動物供給源から産生されたポリマー；並びにそれらのポリマーの混合物からなる群から選択されるポリマーで作られている。
より好ましくは、該骨創傷パッチ（ｃ）の該ポリマースキャフォールドは、ポリ（ε－カプロラクトン）で又はコラーゲンで作られている。
上記に言及されているように、該パッチ（ｃ）の該スキャフォールドは、多層化された滴の断続的な被覆物で被覆されている表面を有する。これらの滴はまた「ナノリザーバー」又は「ナノコンテナー」と命名され得、該パッチ（ａ）について上記に定義される通りである。
一部の実施態様に従うと、該スキャフォールドは、多層化された滴で被覆されている。
該パッチ（ｃ）の該被覆物は、好ましくは、該スキャフォールドの表面上で不規則的に広がっている。
より特には、該パッチ（ｃ）の該スキャフォールドは、レイヤー・バイ・レイヤーを基準にして、交互に負に又は正に荷電した層で被覆されている。
以後に説明されているように、この被覆物は、治療用分子のナノリザーバーを作出するように該スキャフォールドを治療用分子で機能化することを可能とする。
語「多層化された滴被覆物」は更に、（ｃ）の該スキャフォールドの断続的な被覆物、すなわち（ｃ）の該ポリマースキャフォールドの表面に沿った連続的なフィルムの形態ではない被覆物を云う。該多層滴被覆物は、その不規則な形状により、及び／又は該スキャフォールドの表面の少なくとも部分が被覆されないように、それは該スキャフォールドの表面の全体をカバーしないという事実により、特徴付けられうる。そのような多層滴被覆物は、滑らかな表面を有し、及び該スキャフォールドの表面の全体をカバーする、フィルム被覆物と対比されうる。
該被覆物の構築は、反対に荷電した分子のレイヤー・バイ・レイヤー（ＬｂＬ）堆積に基づく。すなわち、該パッチ（ｃ）の該スキャフォールドの該被覆物は、高分子電解質の多層化されたフィルムと同じ方式で作られる。その為、該骨創傷パッチ（ｃ）は、該スキャフォールドの表面上に、多数の多層化された滴の形態の高分子電解質多層を含む。
スキャフォールド表面全体をカバーするフィルム被覆物とは対照的に、該多層化された滴被覆物は、好ましくは、該スキャフォールドの表面を部分的にのみカバーする。本発明による該被覆物は、レイヤー・バイ・レイヤー（ＬｂＬ）で施与され、過剰な量のポリアニオン又はポリカチオンは、連続する吸着工程の間のリンスする工程を用いて各々の工程において除去される。表面電荷の再分配に起因して、ポリアニオン又はポリカチオンの第１の層は、該スキャフォールドの表面に沿って吸着された小さい滴又はパッチを形成する。該ポリアニオン又はポリカチオン施与の各々の工程において、各々の滴はポリアニオン又はポリカチオンの新たな層によりカバーされる。被覆プロセスは、該多層化された滴被覆物が観察される場合及びフィルム被覆の前に停止される。該多層化された滴被覆物は、フィルム被覆物では観察されない有利な特徴を該スキャフォールドに提供する。該フィルム被覆物が得られる場合、該多層化された滴は、該被覆されているスキャフォールドの表面に沿ってこれ以上得られることはできない。
該フィルム被覆物又は該被覆されていないスキャフォールドと比較した該多層化された滴被覆物の第１の利点はその不規則な表面である。この不規則な形状は、該スキャフォールドへの細胞の付着を向上させる。更に、この不規則な形状は、該被覆物と細胞との間の接触の表面の増加を提供して、該被覆物と細胞との間の交換を最適化する。結果的に、低い濃度の治療用分子（存在する場合）が、細胞増殖のより良好な刺激を観察する為に必要とされる。
追加的に、本発明の該被覆物は、該フィルム被覆物よりも少ないポリアニオン及びポリカチオン層を使用する。その為、低減された数の層が、該多層化された滴被覆物を得る為に必要とされる。
本明細書において更に使用される場合、語「高分子電解質多層」はとりわけ、本発明による該パッチ（ｃ）の該スキャフォールドを被覆する該多層化された滴を包含する。
本明細書の枠内において、語「高分子電解質」は、幾つかの電解質基を有する化合物、特にその繰り返し単位が電解質基を有するポリマーを呼称する。該基は、水性溶液中で解離して、場合に応じて、ポリアニオン又はポリカチオンを生じさせて、該ポリマーを荷電させる。
該パッチ（ｃ）の該ナノファイバースキャフォールドを被覆する該高分子電解質多層は、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている。それらは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれより多くの層ペアを含みうる。好ましくは、それは３～１２個の層ペアを含む。
高分子電解質多層、及び特に本明細書に記載されている多層化された滴は、ポリアニオン及びポリカチオン溶液中への該パッチ（ｃ）の該スキャフォールドの交互の浸漬により容易に得られることができる。
当業者に明らかなように、該ポリアニオン及びポリカチオンの選択の為の唯一の要求は該分子の電荷であり、すなわち該ポリアニオンは負に荷電しており、該ポリカチオンは正に荷電している。本発明による該ポリアニオン及びポリカチオンは、任意の種類の分子、例えばポリペプチド（任意的に、化学的に修飾されている）又は多糖（シクロデキストリン、キトサン等を包含する）、に対応しうる。
好ましい実施態様に従うと、該ポリカチオンは、ポリ（リジン）ポリペプチド（ＰＬＬ）、共有結合的に連結されたシクロデキストリン－ポリ（リジン）（ＰＬＬ－ＣＤ）、ポリ（アルギニン）ポリペプチド、ポリ（ヒスチジン）ポリペプチド、ポリ（オルニチン）ポリペプチド、デンドリ－グラフトポリリジン（例えば、デンドリ－グラフトポリ－Ｌ－リジン）、キトサン、及びこれらの混合物からなる群から選択される。
より好ましくは、該ポリカチオンはキトサンである。
好ましい実施態様に従うと、該ポリアニオンは、ポリ（グルタミン酸）ポリペプチド（ＰＧＡ）、ポリ（アスパラギン酸）ポリペプチド、及びこれらの混合物からなる群から選択される。
上記に言及されているように、該骨創傷パッチ（ｃ）は成長因子を含む。
好ましくは、該成長因子は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ：vascular endothelial growth factor）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ：bone morphogenetic protein）、例えばＢＭＰ２、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ：transforming growth factor）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ：fibroblast growth factor）、それらをコードする核酸、及びこれらの混合物からなる群から選択される。
より好ましくは、該骨創傷パッチ（ｃ）は、キトサン／ＢＭＰ２滴を含むポリ（ε－カプロラクトン）スキャフォールドで作られている。
例えば、国際公開第０２／０８５４２３号パンフレット、国際公開第２００６／０７９９２８号パンフレット、Lynn (2006 Soft Matter 2:269-273)、Decher (1997 Science 277:1232-1237)及びJessel et al．(2003 Advanced Materials 15:692-695)に記載されているように、治療用分子、例えば成長因子、は、高分子電解質多層中に組み込まれることができる。
本発明による該生体材料が骨及び／又は軟骨再生の為に使用される場合、該成長因子は、最も好ましくは、骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、骨形態形成タンパク質７（ＢＭＰ７）、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、線維芽細胞成長因子８（ＦＧＦ８）、線維芽細胞成長因子９（ＦＧＦ９）及び線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ１８）からなる群から選択される。
特定の実施態様において、該高分子電解質多層は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれより多くの層ペアを含むか又はそれらからなり、各層ペアは、
該治療用分子（例えば、ポリペプチド、特に成長因子）を含むか又はそれらからなるポリアニオンの層；及び
キトサン又はリジンのポリマー（例えば、ポリ（リジン）ポリペプチド（ＰＬＬ）若しくはデンドリ－グラフトポリリジン（ＤＧＬ））を含むか又はそれらからなるポリカチオンの層からなる。
該治療用分子（例えば、ポリペプチド、特に成長因子）を含むか又はそれらからなるポリアニオンの層；及び
キトサン又はリジンのポリマー（例えば、ポリ（リジン）ポリペプチド（ＰＬＬ）若しくはデンドリ－グラフトポリリジン（ＤＧＬ））を含むか又はそれらからなるポリカチオンの層からなる。
本発明はまた、上記に定義されている該骨創傷パッチ（ｃ）を作製する為の方法であって、該スキャフォールドを、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアで被覆する工程を含む上記の方法に関する。
好ましくは、少なくとも１つの層ペアで被覆する上記に言及される工程は、以下の工程：
ｉ．該スキャフォールドを、該ポリカチオンを含む溶液に（例えば、約５～６０分間、好ましくは約１５分間）浸漬する工程；
ｉｉ．工程（ｉ）の終わりに得られた該スキャフォールドを（例えば、約５～６０分間、好ましくは約１５分間）リンスする工程；
ｉｉｉ．工程（ｉｉ）の終わりに得られた該スキャフォールドを、該ポリアニオンを含む溶液に（例えば、約５～６０分間、好ましくは約１５分間）浸漬する工程；
ｉｖ．工程（ｉｉｉ）の終わりに得られた該スキャフォールドを（例えば、約５～６０分間、好ましくは約１５分間）リンスする工程；及び、任意的に；
ｖ．工程（ｉ）～（ｉｖ）を少なくとももう一度繰り返す工程；及び、任意的に；
ｖｉ．工程（ｉｖ）又は（ｖ）の終わりに得られた該スキャフォールドを（例えば、紫外光への曝露により）滅菌する工程
を含む。
ｉ．該スキャフォールドを、該ポリカチオンを含む溶液に（例えば、約５～６０分間、好ましくは約１５分間）浸漬する工程；
ｉｉ．工程（ｉ）の終わりに得られた該スキャフォールドを（例えば、約５～６０分間、好ましくは約１５分間）リンスする工程；
ｉｉｉ．工程（ｉｉ）の終わりに得られた該スキャフォールドを、該ポリアニオンを含む溶液に（例えば、約５～６０分間、好ましくは約１５分間）浸漬する工程；
ｉｖ．工程（ｉｉｉ）の終わりに得られた該スキャフォールドを（例えば、約５～６０分間、好ましくは約１５分間）リンスする工程；及び、任意的に；
ｖ．工程（ｉ）～（ｉｖ）を少なくとももう一度繰り返す工程；及び、任意的に；
ｖｉ．工程（ｉｖ）又は（ｖ）の終わりに得られた該スキャフォールドを（例えば、紫外光への曝露により）滅菌する工程
を含む。
工程（ｉ）及び（ｉｉｉ）において、該ポリカチオン又はポリアニオンを含む該溶液は、例えば、約２０μＭ～約５００μＭ、好ましくは約５０μＭ～約２００μＭ、の範囲内の濃度のポリカチオン又はポリアニオンを含みうる。該溶液は、例えば、該ポリアニオン又はポリカチオンに加えて、０．０２Ｍ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）及び０．１５Ｍ ＮａＣｌを含みうるか又はそれらからなりうる。該溶液のｐＨは好ましくは中性（例えば、７．４のｐＨ）である。
工程（ｉｉ）及び（ｉｖ）において、該スキャフォールドは、例えば、中性ｐＨ（例えば、７．４のｐＨ）を有する溶液でリンスされうる。該溶液は、例えば、０．０２Ｍ ＭＥＳ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌを含みうるか又はそれらからなりうる。
工程（ｖ）は、該スキャフォールドを被覆するべき層ペアの数に依存して、任意の回数を繰り返されうる。
工程（ｖｉ）は、例えば、紫外光への曝露（例えば、２５４ｎｍ、３０Ｗ、２０ｃｍの照明距離、約１５分～約１時間、好ましくは約３０分間）により実行されうる。
使用の前に、本発明による該骨創傷パッチ（ｃ）は、（例えば、それを無血清培地と接触させることにより）平衡化されうる。
当業者に直ちに明らかとなるように、該ナノファイバースキャフォールドが、ポリカチオン又はポリアニオンを含む溶液に浸漬される該工程は、該溶液が該スキャフォールドに噴霧される工程で置き換えられうる。
上記に定義されている該ハイドロゲル（ｂ）は、以下の工程：
ａ）上記に定義されている該生細胞を提供するか又は得る工程；
ｂ）該生細胞をハイドロゲル（例えば、コラーゲンハイドロゲル又はアルギン酸塩ハイドロゲル）と混合する工程；及び
ｃ）任意的に、この混合物を該骨創傷パッチ（ｃ）に堆積させる工程
を含む方法により作製されうる。
ａ）上記に定義されている該生細胞を提供するか又は得る工程；
ｂ）該生細胞をハイドロゲル（例えば、コラーゲンハイドロゲル又はアルギン酸塩ハイドロゲル）と混合する工程；及び
ｃ）任意的に、この混合物を該骨創傷パッチ（ｃ）に堆積させる工程
を含む方法により作製されうる。
本発明はまた、上記に定義されている該生体材料を使用して軟骨病変を処置する方法であって、該骨創傷パッチ（ｃ）を施与する工程、該ハイドロゲル（ｂ）を施与する工程及び該膜創傷パッチ（ａ）を施与する工程を含む上記の方法に関する。
本発明はまた、骨及び／又は軟骨再生における使用の為の、上記に定義されている生体材料に関する。
本発明はまた、骨及び／又は軟骨欠損の処置における使用の為の、上記に定義されている生体材料に関する。
本発明はまた、変形性関節症の処置及び／又は予防の為の使用の為のキットであって、
上記に定義されている膜創傷パッチ（ａ）；
上記に定義されているハイドロゲル（ｂ）、及び
上記に定義されている骨創傷パッチ（ｃ）
を備えている、上記のキットに関する。
上記に定義されている膜創傷パッチ（ａ）；
上記に定義されているハイドロゲル（ｂ）、及び
上記に定義されている骨創傷パッチ（ｃ）
を備えている、上記のキットに関する。
本発明はまた、変形性関節症の処置及び／又は予防の為の使用の為のキットであって、
上記に定義されている膜創傷パッチ（ａ）；
上記に定義されている骨創傷パッチ（ｃ）；
自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞、
ヒアルロン酸及びアルギン酸塩の溶液、並びに
塩化カルシウム又はリン酸カルシウムの溶液
を含む、上記のキットに関する。
上記に定義されている膜創傷パッチ（ａ）；
上記に定義されている骨創傷パッチ（ｃ）；
自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞、
ヒアルロン酸及びアルギン酸塩の溶液、並びに
塩化カルシウム又はリン酸カルシウムの溶液
を含む、上記のキットに関する。
本発明はまた、生体材料であって、
上記に定義されている膜創傷パッチ（ａ）；
自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞を含むハイドロゲル（ｂ）、及び
上記に定義されている骨創傷パッチ（ｃ）
を、変形性関節症の処置及び／又は予防における同時の、別々の又は逐次的な使用の為の複合製剤（combined preparation）として含む、
上記の生体材料に関する。
上記に定義されている膜創傷パッチ（ａ）；
自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞を含むハイドロゲル（ｂ）、及び
上記に定義されている骨創傷パッチ（ｃ）
を、変形性関節症の処置及び／又は予防における同時の、別々の又は逐次的な使用の為の複合製剤（combined preparation）として含む、
上記の生体材料に関する。
本発明はまた、生体材料であって、
上記に定義されている膜創傷パッチ（ａ）、
自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞、
ヒアルロン酸と、アルギン酸塩との溶液、並びに
塩化カルシウム又はリン酸カルシウムの溶液
を、変形性関節症の処置及び／又は予防における同時の、別々の又は逐次的な使用の為の複合製剤として含む、
上記の生体材料に関する。
上記に定義されている膜創傷パッチ（ａ）、
自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞、
ヒアルロン酸と、アルギン酸塩との溶液、並びに
塩化カルシウム又はリン酸カルシウムの溶液
を、変形性関節症の処置及び／又は予防における同時の、別々の又は逐次的な使用の為の複合製剤として含む、
上記の生体材料に関する。
本発明はまた、ＡＲＴｉＣＡＲ、すなわち軟骨下骨及び軟骨の両方の再生に対処する為に２つの先進治療医薬品を組み合わせた、骨関節病変の処置の為の革新的なインプラント、に関する。
その為、本発明は、個別化されたＯＡＲの為のＡＲＴｉＣＡＲ（関節軟骨及び軟骨下骨インプラント；ARTicular CArtilage and subchondRal bone implant）組み合わせ先進治療医薬品（ＡＴＭＰ：dvanced Therapy Medicinal Product）に基づく（図１Ａ、Ｂ）。該インプラントは、ｉ）治療剤の細胞接触依存性局所送達の為の骨形態形成因子２（ＢＭＰ２）－ナノリザーバーでナノ機能化された、ナノファイバーＦＤＡ承認済み吸収性ポリマー（ポリ－ε－カプロラクトン：ＰＣＬ）創傷ドレッシング、及びｉｉ）ヒアルロン酸／アルギン酸塩ベースのハイドロゲル中に被包された自家骨髄由来ＭＳＣで作られている（図１Ａ）。該ナノリザーバー技術は、ＢＭＰ２の用量を生理学的レベルまで低減させることを可能にする為、局所的に及び持続可能に利用可能であり、例えば診療所において現行で使用されている浸漬されたコラーゲンスポンジからの、その大量の放出の有害効果を低減させる。
その為、本発明はまた、
ポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドであって；該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴である、該スキャフォールド、並びに
任意的に自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞を含む、ハイドロゲル
を含む生体材料に関する。
ポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドであって；該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴である、該スキャフォールド、並びに
任意的に自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞を含む、ハイドロゲル
を含む生体材料に関する。
一つの実施態様に従うと、この生体材料は、
自家骨髄由来間葉幹細胞を含むハイドロゲル（ｂ）、並びに
ポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドである骨創傷パッチ（ｃ）であって、該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴であり、並びに該骨創傷パッチ（ｃ）が骨成長因子を更に含む、該骨創傷パッチ（ｃ）
を含み、
該ハイドロゲル（ｂ）及び該骨創傷パッチ（ｃ）は上記に定義されている。
自家骨髄由来間葉幹細胞を含むハイドロゲル（ｂ）、並びに
ポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドである骨創傷パッチ（ｃ）であって、該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴であり、並びに該骨創傷パッチ（ｃ）が骨成長因子を更に含む、該骨創傷パッチ（ｃ）
を含み、
該ハイドロゲル（ｂ）及び該骨創傷パッチ（ｃ）は上記に定義されている。
好ましくは、該ナノファイバースキャフォールドは、ポリ（ε－カプロラクトン）又はコラーゲンで作られている。
好ましくは、該ハイドロゲルは、ヒアルロン酸／アルギン酸塩ベースのハイドロゲルである。
一つの実施態様に従うと、この生体材料は、少なくとも１つの多層化された滴内にあるか、又は治療用分子がチャージされた場合に少なくとも１つの多層化された滴を形成する、該治療用分子を更に含む。好ましくは、該治療用分子は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、それらをコードする核酸、及びこれらの混合物からなる群から選択される成長因子である。
本発明はまた、この生体材料を使用する軟骨病変の処置の為の方法であって、ナノファイバースキャフォールド施与の工程及びハイドロゲル施与の工程を含む、該方法に関する。
ＡＲＴｉＣＡＲは、軟骨下骨再生を促進する為の成長因子、及び軟骨再生の為の、ハイドロゲル中に包埋された骨髄間葉幹細胞でナノ機能化された、ポリマーナノファイバー骨創傷ドレッシングからなる。この研究において、ＡＲＴｉＣＡＲは、ｉ）大型動物モデルにおける骨軟骨欠損の処置における実現可能性、ｉｉ）非侵襲的な治癒をモニターする為の可能性及びｉｉｉ）ＧＬＰ前臨床標準下での２つの動物モデルにおける全体的な安全性について試験された。データは、フェーズＩ臨床試験を行いうる、国際規制ガイドラインに従ったＡＲＴｉＣＡＲの前臨床安全性を指し示す。
ＡＲＴｉＣＡＲ組み合わせＡＴＭＰの安全性は、２つの異なる動物モデルにおけるＯＡＲの促進において試験された。細胞療法及び医療用デバイスの為の国際規制ガイドライン並びにグッド・ラボラトリー・プラクティス（ＧＬＰ：Good Laboratory Practice）に従って実行された、実現可能性、毒性及び体内分布試験の結果は、ＡＲＴｉＣＡＲ組み合わせＡＴＭＰの生体内安全性を証明し、それ故に、ＡＲＴｉＣＡＲ組み合わせＡＴＭＰは、軟骨及び軟骨下骨の両方の再生に対処する為の、使用準備済みの、柔軟なインプラントとして、フェーズＩ臨床試験の為に使用されることができる。
材料及び方法
化学物質
分析グレードのポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入された。ＰＣＬが１５％ ｗｔ／ｖｏｌでジクロロメタン／ジメチルホルムアミド（ＤＣＭ／ＤＭＦ ５０／５０ｖｏｌ／ｖｏｌ）の混合物に溶解させられ、使用前に終夜撹拌された。デンドリグラフトポリ－Ｌ－リジン（ＤＧＬ）はＣＯＬＣＯＭ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、フランス国）から購入された。この研究において、第五世代ＤＧＬＧ５が使用された。ヒト組換えＢＭＰ２はＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入された。粘性アルギン酸ナトリウム培地（Sodium alginate medium viscosity）はＳｉｇｍａから、ヒアルロン酸（Ｍ．Ｗ．１３２３００）はＬｉｆｅｃｏｒｅからのものであった。ラット尾Ｉ型コラーゲンはＩｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｃｑｕｅｓ Ｂｏｙから購入された。ポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）はＳｉｇｍａから、キトサン（ＣＨＩ）、すなわちＰｒｏｔａｓａｎ ｕｐ ＣＬ １１３はＦＭＣ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ（ノルウェー）から購入された。ヒト組換えＢＭＰ－２はＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入された。
化学物質
分析グレードのポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入された。ＰＣＬが１５％ ｗｔ／ｖｏｌでジクロロメタン／ジメチルホルムアミド（ＤＣＭ／ＤＭＦ ５０／５０ｖｏｌ／ｖｏｌ）の混合物に溶解させられ、使用前に終夜撹拌された。デンドリグラフトポリ－Ｌ－リジン（ＤＧＬ）はＣＯＬＣＯＭ（Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、フランス国）から購入された。この研究において、第五世代ＤＧＬＧ５が使用された。ヒト組換えＢＭＰ２はＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入された。粘性アルギン酸ナトリウム培地（Sodium alginate medium viscosity）はＳｉｇｍａから、ヒアルロン酸（Ｍ．Ｗ．１３２３００）はＬｉｆｅｃｏｒｅからのものであった。ラット尾Ｉ型コラーゲンはＩｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｃｑｕｅｓ Ｂｏｙから購入された。ポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）はＳｉｇｍａから、キトサン（ＣＨＩ）、すなわちＰｒｏｔａｓａｎ ｕｐ ＣＬ １１３はＦＭＣ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ（ノルウェー）から購入された。ヒト組換えＢＭＰ－２はＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入された。
エレクトロスピニング
自家製標準エレクトロスピニング装置が、該ＰＣＬスキャフォールドを作製する為に使用された。該ＰＣＬ溶液が５ｍＬのシリンジに注がれ、プログラム可能なポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）によって、０．５ｍｍの直径を有する針を通して１．２ｍｌ／ｈの流速で排出された。高電圧電力供給（ＳＰＥＬＬＭＡＮ、ＳＬ３０Ｐ１０）が、該針において１５ｋＶに設定する為に使用された。該針から１７ｃｍの距離で地面に接続されたアルミニウム箔（２０×２０ｃｍ２）が、該エレクトロスピニングされたＰＣＬスキャフォールドを収集する為に使用された。該収集されたスキャフォールドは、均一な無作為に方向付けされている繊維を含む（Li et al，Figure 1，Biomaterials，Volume 26，Issue 6，February 2005，Pages 599-609）。
自家製標準エレクトロスピニング装置が、該ＰＣＬスキャフォールドを作製する為に使用された。該ＰＣＬ溶液が５ｍＬのシリンジに注がれ、プログラム可能なポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）によって、０．５ｍｍの直径を有する針を通して１．２ｍｌ／ｈの流速で排出された。高電圧電力供給（ＳＰＥＬＬＭＡＮ、ＳＬ３０Ｐ１０）が、該針において１５ｋＶに設定する為に使用された。該針から１７ｃｍの距離で地面に接続されたアルミニウム箔（２０×２０ｃｍ２）が、該エレクトロスピニングされたＰＣＬスキャフォールドを収集する為に使用された。該収集されたスキャフォールドは、均一な無作為に方向付けされている繊維を含む（Li et al，Figure 1，Biomaterials，Volume 26，Issue 6，February 2005，Pages 599-609）。
第２の方法はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）溶液（５％ ｗ／ｗ）の使用を含み、該溶液は、１８Ｇ針を有する２ｍＬプラスチックシリンジにロードされ、シリンジポンプを使用して０．５ｍＬ／ｈの一定速度で供給される。１０ｋＶの正電圧が、高電圧電力供給を使用して該針に印加された。捕集器と該針の先端との間の距離が１５ｃｍに設定された。回転するディスクが、エレクトロスピニングされた繊維状スキャフォールドの該捕集器として使用された。高い回転速度（１０００～３０００ｒｐｍ）が、並べられた繊維から構成されているスキャフォールドを製作する為に使用され、低い回転速度（２００～８００ｒｐｍ）が、無作為に方向付けされている繊維を有するスキャフォールドを収集する為に使用された。その後の実験の前に該スキャフォールドが終夜真空乾燥された。
高分子電解質多層の作製
パッチ（ｃ）の該スキャフォールドの該被覆物の作製
全ての生物学的活性実験の為に、高分子電解質多層が、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ ＰＣＬ膜上に作製された。（ＤＧＬＧ５－ＢＭＰ２）ｎ又は（ＰＬＬ－ＢＭＰ２）ｎ又は（ＣＨＩ－ＢＭＰ２）ｎにより構成されている多層が、０．０２Ｍ ＭＥＳ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）の存在下でのＤＧＬＧ５又はＰＬＬ又はＣＨＩについて５０μＭ及びＢＭＰ２について２００ｎＭのそれぞれの濃度でのそれぞれの溶液（３００μｌ）中の１５分間の表面の交互の浸漬により構築された。各々の堆積工程の後に、該膜が０．０２Ｍ ＭＥＳ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）で１５分間リンスされた。全ての膜が、紫外（ＵＶ）光（２５４ｎｍ、３０Ｗ、照明距離２０ｃｍ）への曝露により３０分間滅菌された。使用の前に、全ての膜が１ｍｌの無血清培地との接触で平衡化された（細胞培養を参照）。
パッチ（ｃ）の該スキャフォールドの該被覆物の作製
全ての生物学的活性実験の為に、高分子電解質多層が、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ ＰＣＬ膜上に作製された。（ＤＧＬＧ５－ＢＭＰ２）ｎ又は（ＰＬＬ－ＢＭＰ２）ｎ又は（ＣＨＩ－ＢＭＰ２）ｎにより構成されている多層が、０．０２Ｍ ＭＥＳ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）の存在下でのＤＧＬＧ５又はＰＬＬ又はＣＨＩについて５０μＭ及びＢＭＰ２について２００ｎＭのそれぞれの濃度でのそれぞれの溶液（３００μｌ）中の１５分間の表面の交互の浸漬により構築された。各々の堆積工程の後に、該膜が０．０２Ｍ ＭＥＳ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）で１５分間リンスされた。全ての膜が、紫外（ＵＶ）光（２５４ｎｍ、３０Ｗ、照明距離２０ｃｍ）への曝露により３０分間滅菌された。使用の前に、全ての膜が１ｍｌの無血清培地との接触で平衡化された（細胞培養を参照）。
追加的に、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ ＰＣＬ膜の代わりに、Ｂｉｏ－Ｇｉｄｅ（商標）吸収性コラーゲン膜（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上の高分子電解質多層も構築された。
パッチ（ａ）の該スキャフォールドの該不連続の被覆物の作製
全ての生物学的活性実験の為に、高分子電解質多層がＥｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ ＰＣＬ膜上に作製された。（ＤＧＬＧ５－ＣＳ／ＨＡ）ｎ又は（ＰＬＬ－ＣＳ／ＨＡ）ｎ又は（ＣＨＩ－ＣＳ／ＨＡ）ｎにより構成されている多層が、０．０２Ｍ ＭＥＳ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）の存在下でのＤＧＬＧ５又はＰＬＬ又はＣＨＩについて５０μＭ並びにコンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸の混合物について２００ｎＭのそれぞれの濃度でのそれぞれの溶液（３００μｌ）中の１５分間の表面の交互の浸漬により構築された。各々の堆積工程の後に、該膜が０．０２Ｍ ＭＥＳ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）で１５分間リンスされた。全ての膜が、紫外（ＵＶ）光（２５４ｎｍ、３０Ｗ、照明距離２０ｃｍ）への曝露により３０分間滅菌された。使用の前に、全ての膜が１ｍｌの無血清培地との接触で平衡化された（細胞培養を参照）。
全ての生物学的活性実験の為に、高分子電解質多層がＥｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ ＰＣＬ膜上に作製された。（ＤＧＬＧ５－ＣＳ／ＨＡ）ｎ又は（ＰＬＬ－ＣＳ／ＨＡ）ｎ又は（ＣＨＩ－ＣＳ／ＨＡ）ｎにより構成されている多層が、０．０２Ｍ ＭＥＳ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）の存在下でのＤＧＬＧ５又はＰＬＬ又はＣＨＩについて５０μＭ並びにコンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸の混合物について２００ｎＭのそれぞれの濃度でのそれぞれの溶液（３００μｌ）中の１５分間の表面の交互の浸漬により構築された。各々の堆積工程の後に、該膜が０．０２Ｍ ＭＥＳ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）で１５分間リンスされた。全ての膜が、紫外（ＵＶ）光（２５４ｎｍ、３０Ｗ、照明距離２０ｃｍ）への曝露により３０分間滅菌された。使用の前に、全ての膜が１ｍｌの無血清培地との接触で平衡化された（細胞培養を参照）。
追加的に、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ ＰＣＬ膜の代わりに、Ｂｉｏ－Ｇｉｄｅ（商標）吸収性コラーゲン膜（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上の高分子電解質多層も構築された。
パッチ（ａ）の該スキャフォールドの該連続的な被覆物の作製
全ての生物学的活性実験の為に、高分子電解質多層がＥｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ ＰＣＬ膜上に作製された。（ＤＧＬＧ５－ＣＳ／ＨＡ）ｎ又は（ＰＬＬ－ＣＳ／ＨＡ）ｎ又は（ＣＨＩ－ＣＳ／ＨＡ）ｎにより構成されている多層が、０．０２Ｍ ＭＥＳ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）の存在下でのＤＧＬＧ５又はＰＬＬ又はＣＨＩについて５０μＭ並びにコンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸の混合物について２００ｎＭのそれぞれの濃度でのそれぞれの溶液（３００μｌ）中の１５分間の表面の交互の浸漬により構築された。各々の堆積工程の後に、該膜が０．０２Ｍ ＭＥＳ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）で１５分間リンスされた。
全ての生物学的活性実験の為に、高分子電解質多層がＥｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ ＰＣＬ膜上に作製された。（ＤＧＬＧ５－ＣＳ／ＨＡ）ｎ又は（ＰＬＬ－ＣＳ／ＨＡ）ｎ又は（ＣＨＩ－ＣＳ／ＨＡ）ｎにより構成されている多層が、０．０２Ｍ ＭＥＳ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）の存在下でのＤＧＬＧ５又はＰＬＬ又はＣＨＩについて５０μＭ並びにコンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸の混合物について２００ｎＭのそれぞれの濃度でのそれぞれの溶液（３００μｌ）中の１５分間の表面の交互の浸漬により構築された。各々の堆積工程の後に、該膜が０．０２Ｍ ＭＥＳ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）で１５分間リンスされた。
繊維表面が、いかなる多層化された滴もなしに、均一な高分子電解質被覆物により完全に被覆されるまで、該堆積工程が行われた。少なくとも１５個の二重層が、少なくとも３０回の堆積工程で繊維上に堆積された。
全ての膜が、紫外（ＵＶ）光（２５４ｎｍ、３０Ｗ、照明距離２０ｃｍ）への曝露により３０分間滅菌された。使用の前に、全ての膜が１ｍｌの無血清培地との接触で平衡化された（細胞培養を参照）。
細胞培養
ヒト初代骨芽細胞（ＨＯＢ：Human primary osteoblasts）がＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓから得られ、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２．５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ及び１０％のＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ（商標））中で培養された。該培養物が、３７℃で５％のＣＯ２の加湿された雰囲気中でインキュベートされた。該細胞がサブコンフルエンスに達した時に、それらはトリプシンを用いて採取され、継代培養された。
ヒト初代骨芽細胞（ＨＯＢ：Human primary osteoblasts）がＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓから得られ、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２．５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ及び１０％のＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ（商標））中で培養された。該培養物が、３７℃で５％のＣＯ２の加湿された雰囲気中でインキュベートされた。該細胞がサブコンフルエンスに達した時に、それらはトリプシンを用いて採取され、継代培養された。
腸骨稜から採取されたＭＳＣが、細胞培養プラスチックへのそれらの付着に従って単離された。最初に、骨髄吸引液が、等しい体積のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、フランス国）の添加により洗浄され、２２０×ｇで５分間遠心分離された。細胞ペレットが、１０％の熱不活化ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、フランス国）、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｌｏｎｚａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、２．５μｇ／ｍＬのＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｌｏｎｚａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｏｎｚａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に懸濁され、標準的な細胞培養条件下で、Ｔ７５培養フラスコに播種された。翌日、培地が廃棄され、付着した細胞がＰＢＳで数回穏やかに洗浄されて、非付着細胞を除去した。次にフラスコが数日間ＤＭＥＭ中でインキュベートされ、ＤＭＥＭが７２ｈ毎に交換されて付着細胞からのコロニーの出現を促進した。細胞が最終的にサブコンフルエンスに達した時に、細胞が継代２まで継代培養され、継代２において細胞が幹細胞性特徴付けの為に拡大増殖された。
インプラント２型及び３型の作製
５×１０４個のヒト骨芽細胞が播種され、７２ｈインキュベートされた後にゲル作製が行われた。コラーゲン格子の作製の為に、３ｍｌのＲａｔ Ｔａｉｌ Ｔｙｐｅ－Ｉ Ｃｏｌｌａｇｅｎ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｃｑｕｅｓ Ｂｏｙ）が、１０％のＦＢＳ、０．５ｍＬの０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液及び２×１０５細胞／ｍｌで１ｍｌの細胞懸濁物を含有する５．５ｍｌの培地と混合された。０．５ｍＬの該細胞懸濁物：コラーゲン調製物が、該エレクトロスピニングされた膜の上に注がれ、それを３７℃で３０分間インキュベートすることにより重合させられた。重合後に、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）中に調製されたアルギン酸塩ヒアルロン酸溶液（４：１）中の０．５ｍｌのヒト軟骨細胞懸濁物（１×１０５細胞／ｍｌ）が該コラーゲン格子の上に注がれ、３層構築物を得た。５ｍｍ又は２ｍｍシリンダーが、無菌生検パンチを使用して切断（cute）され、３７℃で５％のＣＯ２の加湿された雰囲気中で終夜インキュベートされた後に、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）実験が行われた。
５×１０４個のヒト骨芽細胞が播種され、７２ｈインキュベートされた後にゲル作製が行われた。コラーゲン格子の作製の為に、３ｍｌのＲａｔ Ｔａｉｌ Ｔｙｐｅ－Ｉ Ｃｏｌｌａｇｅｎ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｃｑｕｅｓ Ｂｏｙ）が、１０％のＦＢＳ、０．５ｍＬの０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液及び２×１０５細胞／ｍｌで１ｍｌの細胞懸濁物を含有する５．５ｍｌの培地と混合された。０．５ｍＬの該細胞懸濁物：コラーゲン調製物が、該エレクトロスピニングされた膜の上に注がれ、それを３７℃で３０分間インキュベートすることにより重合させられた。重合後に、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）中に調製されたアルギン酸塩ヒアルロン酸溶液（４：１）中の０．５ｍｌのヒト軟骨細胞懸濁物（１×１０５細胞／ｍｌ）が該コラーゲン格子の上に注がれ、３層構築物を得た。５ｍｍ又は２ｍｍシリンダーが、無菌生検パンチを使用して切断（cute）され、３７℃で５％のＣＯ２の加湿された雰囲気中で終夜インキュベートされた後に、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）実験が行われた。
細胞生存及び増殖
細胞生存がトリパンブルー排除により決定された。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（Ｓｅｒｏｔｅｃ）が、細胞増殖を評価する為に使用された。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ試験は、細胞代謝に応答して色を変化させる非毒性の、水溶性の、比色レドックス指示薬である。この研究において、２×１０４個のヒト骨芽細胞が、２４ウェルプレート上に置かれたＬｂＬで被覆された１４ｍｍの直径の膜（ｎ＝３）の上に播種された。２日の培養後に、細胞が、１０％ ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ／ＤＭＥＭ溶液中、３７℃及び５％のＣＯ２の加湿された雰囲気中でインキュベートされた。４時間後に、１００ｍＬのインキュベーション培地が９６ウェルプレートに移され、５９０ｎｍ及び６３０ｎｍで測定されてＡｌａｍａｒＢｌｕｅ低減のパーセンテージを決定した。
細胞生存がトリパンブルー排除により決定された。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（Ｓｅｒｏｔｅｃ）が、細胞増殖を評価する為に使用された。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ試験は、細胞代謝に応答して色を変化させる非毒性の、水溶性の、比色レドックス指示薬である。この研究において、２×１０４個のヒト骨芽細胞が、２４ウェルプレート上に置かれたＬｂＬで被覆された１４ｍｍの直径の膜（ｎ＝３）の上に播種された。２日の培養後に、細胞が、１０％ ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ／ＤＭＥＭ溶液中、３７℃及び５％のＣＯ２の加湿された雰囲気中でインキュベートされた。４時間後に、１００ｍＬのインキュベーション培地が９６ウェルプレートに移され、５９０ｎｍ及び６３０ｎｍで測定されてＡｌａｍａｒＢｌｕｅ低減のパーセンテージを決定した。
研究設計：
この研究における全ての実験は、細胞療法及び医療用デバイスの為の国際規則ガイドラインに従って計画され、行われた。全てのプロトコールの為にグッド・ラボラトリー・プラクティス及び標準作業手順書（ＳＯＰ：Standard Operating Procedures）が使用された。イン・ビトロ細胞傷害性アッセイはＩＳＯ １０９９３－５（２００９及び２０１２）ガイドラインに従って行われた。ＯＡＲの評価は、ＩＣＲＳ ＩＩスコアシステムに従って行われた。
この研究における全ての実験は、細胞療法及び医療用デバイスの為の国際規則ガイドラインに従って計画され、行われた。全てのプロトコールの為にグッド・ラボラトリー・プラクティス及び標準作業手順書（ＳＯＰ：Standard Operating Procedures）が使用された。イン・ビトロ細胞傷害性アッセイはＩＳＯ １０９９３－５（２００９及び２０１２）ガイドラインに従って行われた。ＯＡＲの評価は、ＩＣＲＳ ＩＩスコアシステムに従って行われた。
ＡＲＴｉＣＡＲのナノファイバー区画（該骨創傷パッチ（ｃ）に対応する）の製造
以前に記載されたように（Mendoza-Palomares C，et al．Smart hybrid materials equipped by nanoreservoirs of therapeutics．ACS Nano 6，483-490 (2012)）、ＡＲＴｉＣＡＲのナノファイバー成分が、ＰＣＬのエレクトロスピニングを介して得られた。簡潔に述べれば、ＰＣＬ（ＰＵＲＡＳＯＲＢ（商標）、ＰＵＲＡＣ、Ｃｏｒｂｉｏｎ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のジメチルホルムアミド／ジクロロメタン溶液（３／２、ｖ／ｖ）に溶解させられ、１ｍｌ／ｈの一定速度で、高電圧（２０＋／－３ｋＶ）に設定されたＥＣ－ＤＩＧエレクトロスピニングデバイス（ＩＭＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に送達された。エレクトロスピニング後に、ＰＣＬ膜が４５℃のデシケーター中に保たれて残留溶媒を除去し、ガンマ照射（２５ｋＧｙ）により滅菌された。次に膜が、１２回にわたり、４０ｍＭの４－モルホリノエタンスルホン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ－Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス国）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐＨ ５．５（ＭＥＳ緩衝液）及び０．５ｍｇ／ｍｌのキトサン（Ｐｒｏｔａｓａｎ ＵＰ ＣＬ １１３、Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ、Ｓａｎｄｖｉｋａ、ノルウェー）中の２００μｇ／ｍｌのＢＭＰ２溶液（ｒｈ－ＢＭＰ２、Ｉｎｄｕｃｔｏｓ、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ、フランス国）に交互に浸漬された。各々の浴が、ＭＥＳ緩衝液中での３回の洗浄により後続された。
以前に記載されたように（Mendoza-Palomares C，et al．Smart hybrid materials equipped by nanoreservoirs of therapeutics．ACS Nano 6，483-490 (2012)）、ＡＲＴｉＣＡＲのナノファイバー成分が、ＰＣＬのエレクトロスピニングを介して得られた。簡潔に述べれば、ＰＣＬ（ＰＵＲＡＳＯＲＢ（商標）、ＰＵＲＡＣ、Ｃｏｒｂｉｏｎ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のジメチルホルムアミド／ジクロロメタン溶液（３／２、ｖ／ｖ）に溶解させられ、１ｍｌ／ｈの一定速度で、高電圧（２０＋／－３ｋＶ）に設定されたＥＣ－ＤＩＧエレクトロスピニングデバイス（ＩＭＥ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に送達された。エレクトロスピニング後に、ＰＣＬ膜が４５℃のデシケーター中に保たれて残留溶媒を除去し、ガンマ照射（２５ｋＧｙ）により滅菌された。次に膜が、１２回にわたり、４０ｍＭの４－モルホリノエタンスルホン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ－Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス国）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐＨ ５．５（ＭＥＳ緩衝液）及び０．５ｍｇ／ｍｌのキトサン（Ｐｒｏｔａｓａｎ ＵＰ ＣＬ １１３、Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ、Ｓａｎｄｖｉｋａ、ノルウェー）中の２００μｇ／ｍｌのＢＭＰ２溶液（ｒｈ－ＢＭＰ２、Ｉｎｄｕｃｔｏｓ、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ、フランス国）に交互に浸漬された。各々の浴が、ＭＥＳ緩衝液中での３回の洗浄により後続された。
ＡＲＴｉＣＡＲの該ハイドロゲル区画の製造
１２ｍｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び３ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｃｈａｓｋａ、米国）が９ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解させられた。埋め込みの前に、該ハイドロゲル（ｂ）がヒトＭＳＣ又はヒツジＭＳＣのいずれかと混合された。該ＭＳＣ／ハイドロゲル区画が該欠損を埋めるように施与された後に、１０２ｍＭの塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してゲル化が達成された。
１２ｍｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び３ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｃｈａｓｋａ、米国）が９ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解させられた。埋め込みの前に、該ハイドロゲル（ｂ）がヒトＭＳＣ又はヒツジＭＳＣのいずれかと混合された。該ＭＳＣ／ハイドロゲル区画が該欠損を埋めるように施与された後に、１０２ｍＭの塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してゲル化が達成された。
細胞培養
腸骨稜から採取されたＭＳＣが、細胞培養プラスチックへのそれらの付着に従って単離された。最初に、骨髄吸引液が、等しい体積のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、フランス国）の添加により洗浄され、２２０×ｇで５分間遠心分離された。細胞ペレットが、１０％の熱不活化ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、フランス国）、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｌｏｎｚａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、２．５μｇ／ｍＬのＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｌｏｎｚａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｏｎｚａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に懸濁され、標準的な細胞培養条件下で、Ｔ７５培養フラスコに播種された。翌日、培地が廃棄され、付着した細胞が、ＰＢＳで数回穏やかに洗浄されて、非付着細胞を除去した。次に、フラスコが数日間ＤＭＥＭ中でインキュベートされ、ＤＭＥＭが７２ｈ毎に交換されて付着細胞からのコロニーの出現を促進した。最終的に、細胞がサブコンフルエンスに達した時に、細胞が継代２まで継代培養され、継代２において細胞が幹細胞性特徴付けの為に拡大増殖された。
腸骨稜から採取されたＭＳＣが、細胞培養プラスチックへのそれらの付着に従って単離された。最初に、骨髄吸引液が、等しい体積のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、フランス国）の添加により洗浄され、２２０×ｇで５分間遠心分離された。細胞ペレットが、１０％の熱不活化ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、フランス国）、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン（Ｌｏｎｚａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、２．５μｇ／ｍＬのＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（Ｌｏｎｚａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｏｎｚａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に懸濁され、標準的な細胞培養条件下で、Ｔ７５培養フラスコに播種された。翌日、培地が廃棄され、付着した細胞が、ＰＢＳで数回穏やかに洗浄されて、非付着細胞を除去した。次に、フラスコが数日間ＤＭＥＭ中でインキュベートされ、ＤＭＥＭが７２ｈ毎に交換されて付着細胞からのコロニーの出現を促進した。最終的に、細胞がサブコンフルエンスに達した時に、細胞が継代２まで継代培養され、継代２において細胞が幹細胞性特徴付けの為に拡大増殖された。
イン・ビトロでの細胞傷害性評価
ＭＲＣ５細胞が２４ウェルプレートにプレーティングされた。ナノＭ１－ＢＭＰ２創傷ドレッシングが、０．１％のジエチルジチオカルバミン酸亜鉛を含有するポリウレタンフィルム（細胞傷害性効果を誘導することが既知；食品薬品安全センター秦野研究所、日本）及び高密度ポリエチレンフィルム（陰性対照；秦野研究所）と隣り合わせて試験された。細胞傷害性を評価する為に、７０～８０％のコンフルエンスが到達された時に、異なるサイズ（２０ｍｍ２、１６ｍｍ２、９ｍｍ２、４ｍｍ２、１ｍｍ２）の小片が該培養された細胞に接触させて置かれた。細胞が該膜の存在下で３日間培養された後に、全般的形態における変化、空胞形成の存在、剥離、溶解及び膜完全性について、ＩＳＯ １０９９３ガイドライン、パート５（２００９）及びパート１２（２０１２）：クラス０、反応性なし（試料の周囲にも下にも効果なし）；クラス１、わずかな反応性（形成異常はほとんどない又は変性した細胞）；クラス２、軽度の反応性（小さい面積の、該試料の下の形成異常の又は変性した細胞）；クラス３、中等度の反応性（該試料のサイズより大きいが≦１ｃｍ２の面積の、形成異常の又は変性した細胞）；クラス４、重度の反応性（該試料のサイズより大きく＞１ｃｍ２の面積の、形成異常の又は変性した細胞）に従って細胞傷害性の定性的評価の為の基準に従って顕微鏡により調べられた。２より高いグレードが細胞傷害性として考えられた。
ＭＲＣ５細胞が２４ウェルプレートにプレーティングされた。ナノＭ１－ＢＭＰ２創傷ドレッシングが、０．１％のジエチルジチオカルバミン酸亜鉛を含有するポリウレタンフィルム（細胞傷害性効果を誘導することが既知；食品薬品安全センター秦野研究所、日本）及び高密度ポリエチレンフィルム（陰性対照；秦野研究所）と隣り合わせて試験された。細胞傷害性を評価する為に、７０～８０％のコンフルエンスが到達された時に、異なるサイズ（２０ｍｍ２、１６ｍｍ２、９ｍｍ２、４ｍｍ２、１ｍｍ２）の小片が該培養された細胞に接触させて置かれた。細胞が該膜の存在下で３日間培養された後に、全般的形態における変化、空胞形成の存在、剥離、溶解及び膜完全性について、ＩＳＯ １０９９３ガイドライン、パート５（２００９）及びパート１２（２０１２）：クラス０、反応性なし（試料の周囲にも下にも効果なし）；クラス１、わずかな反応性（形成異常はほとんどない又は変性した細胞）；クラス２、軽度の反応性（小さい面積の、該試料の下の形成異常の又は変性した細胞）；クラス３、中等度の反応性（該試料のサイズより大きいが≦１ｃｍ２の面積の、形成異常の又は変性した細胞）；クラス４、重度の反応性（該試料のサイズより大きく＞１ｃｍ２の面積の、形成異常の又は変性した細胞）に従って細胞傷害性の定性的評価の為の基準に従って顕微鏡により調べられた。２より高いグレードが細胞傷害性として考えられた。
定量的細胞生存アッセイ
細胞傷害性の定量的な指標として、細胞生存が評価された。３日目に、内部ＳＯＰに従って、膜が廃棄され、細胞がＰＢＳで２回洗浄され、１ｍｌの培養培地が供給され、１００μｌ／ウェルのＣｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｒｅａｇｅｎｔ ＷＳＴ－１（Ｌｏｎｚａ）が各々のウェルに加えられた。該細胞が３ｈにわたり３７℃で５％のＣＯ２中でインキュベートされ、１００μｌの上清が９６ウェルプレートに移された。吸光度がＭｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸデバイス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｆｆｅｎｓｔａｄｅｎ、フランス国）で４５０及び６２０ｎｍにおいて測定された。データ分析がＡｓｃｅｎｔ ２．６（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行われた。結果がブランク対照に対する生存細胞のパーセンテージとして表された。３０％の生存の減少が細胞傷害性として考えられた。
細胞傷害性の定量的な指標として、細胞生存が評価された。３日目に、内部ＳＯＰに従って、膜が廃棄され、細胞がＰＢＳで２回洗浄され、１ｍｌの培養培地が供給され、１００μｌ／ウェルのＣｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｒｅａｇｅｎｔ ＷＳＴ－１（Ｌｏｎｚａ）が各々のウェルに加えられた。該細胞が３ｈにわたり３７℃で５％のＣＯ２中でインキュベートされ、１００μｌの上清が９６ウェルプレートに移された。吸光度がＭｕｌｔｉｓｋａｎ ＥＸデバイス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｒａｆｆｅｎｓｔａｄｅｎ、フランス国）で４５０及び６２０ｎｍにおいて測定された。データ分析がＡｓｃｅｎｔ ２．６（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行われた。結果がブランク対照に対する生存細胞のパーセンテージとして表された。３０％の生存の減少が細胞傷害性として考えられた。
動物での実験
動物実験が動物実験の為の倫理的ガイドラインに従って行われた。プロジェクト「Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｅ Ｒｅｇｌｅｍｅｎｔａｉｒｅ」に含まれる、使用されたプロトコールは「Ｍｉｎｉｓｔｅｒｅ ｄｅ ｌ’Ｅｎｓｅｉｇｎｅｍｅｎｔ ｓｕｐｅｒｉｅｕｒ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ」 Ｎｏ．０１１９１．０２により認可された。７週齢のラットが少なくとも５日間Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ ｒｏｏｍ（ｔｈｅ Ｆｒｅｎｃｈ Ｍｉｎｉｓｔｒｉｅｓ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈにより認可されている；承認番号Ａ３５ ２８８－１）中に、該研究の開始前に、内部ＳＯＰに従って、温度（２２±３℃）、湿度（５０±２０％）、光周期（１２ｈ明／１２ｈ暗）及び空気交換の制御された条件下で、内部ＳＯＰに従って維持された。動物は標準サイズのポリカーボネートケージ（フィルター蓋を有する）中で飼育され、寝具は週に２回置き換えられた。
動物実験が動物実験の為の倫理的ガイドラインに従って行われた。プロジェクト「Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｅ Ｒｅｇｌｅｍｅｎｔａｉｒｅ」に含まれる、使用されたプロトコールは「Ｍｉｎｉｓｔｅｒｅ ｄｅ ｌ’Ｅｎｓｅｉｇｎｅｍｅｎｔ ｓｕｐｅｒｉｅｕｒ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ」 Ｎｏ．０１１９１．０２により認可された。７週齢のラットが少なくとも５日間Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ ｒｏｏｍ（ｔｈｅ Ｆｒｅｎｃｈ Ｍｉｎｉｓｔｒｉｅｓ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈにより認可されている；承認番号Ａ３５ ２８８－１）中に、該研究の開始前に、内部ＳＯＰに従って、温度（２２±３℃）、湿度（５０±２０％）、光周期（１２ｈ明／１２ｈ暗）及び空気交換の制御された条件下で、内部ＳＯＰに従って維持された。動物は標準サイズのポリカーボネートケージ（フィルター蓋を有する）中で飼育され、寝具は週に２回置き換えられた。
ヌードラットにおけるＡＲＴＩＣＡＲの関節内埋め込み
イン・ビボでの急性毒性の評価は、ＲＨ－Ｆｏｘｎ１ ｒｎｕ／ｒｎｕヌードラット（Ｈａｒｌａｎ、Ｇａｎｎａｔ、フランス国）における誘導された骨軟骨欠損のモデルにおいてＡＲＴｉＣＡＲの関節内埋め込みを介して達成された。簡潔に述べれば、無菌ナノＭ１－ＢＭＰ２が無菌ＰＢＳ中でリンスされ、埋め込みの前に４つ（１．７７ｍｍ２）に切断された。以前に報告（Keller L，et al．Bi-layered nano active implant with hybrid stem cell microtissues for tuned cartilage hypertrophy．Journal of Stem Cell Research & Therapeutics 1，9 (2015);及びKeller L，Wagner Q，Schwinte P，Benkirane-Jessel N．Double compartmented and hybrid implant outfitted with well-organized 3D stem cells for osteochondral regenerative nanomedicine．Nanomedicine (Lond) 10，2833-2845 (2015)）されたように、サブコンフルエントのヒト骨髄ＭＳＣ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が洗浄され、ヒアルロン酸／アルギン酸塩混合物に３．０×１０７細胞／ｍｌの濃度まで再懸濁された。埋め込みの前に、ラットは７０ｍｇ／ｋｇのケタミン及び１０ｍｇ／ｋｇのキシラジンの溶液の腹腔内注射で麻酔された。右後肢の剃毛及び消毒後に、軟骨下骨（約２ｍｍ）の出血まで、大腿滑車の正中における、大腿の膝蓋溝において丸い１．５ｍｍの骨軟骨欠損がショートドリルで誘導された。ナノＭ１－ＢＭＰ２膜が該欠損の底部に置かれ、次いで該欠損がｈＭＳＣ／ハイドロゲルミックスで充填され、５分にかけて１０２ｍＭの塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の滴下の添加を介してゲル化された。これらのラットは実験群１（ＡＲＴｉＣＡＲ；ｎ＝２０匹のラット；１０匹のオス及び１０匹のメス；１０５，０００±１０％の細胞を含有する３．５μｌのハイドロゲル）を構成した。他のラットが同じ手技に供されたが、（ビヒクルとして）ハイドロゲルのみが埋め込まれ、該ラットは群２（ｎ＝２０匹のラット；１０匹のオス及び１０匹のメス；３．５μｌのハイドロゲル）を構成した。ゲル化後に、関節嚢が閉じられ、筋肉及び皮膚が縫合され、該創傷がポビドンヨード溶液で徹底的に殺菌された。手術後に、ラットが麻酔後の回復についての観察下に保たれた。回復後に、０．０５～０．１ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンが皮下注射により投与された。動物は、該研究の持続期間（９０日）にわたり制約されない運動を許容された。ラットが１日毎に創傷治癒、脚可動性、罹病、死亡及び毒性の著明な徴候についてモニターされた。
イン・ビボでの急性毒性の評価は、ＲＨ－Ｆｏｘｎ１ ｒｎｕ／ｒｎｕヌードラット（Ｈａｒｌａｎ、Ｇａｎｎａｔ、フランス国）における誘導された骨軟骨欠損のモデルにおいてＡＲＴｉＣＡＲの関節内埋め込みを介して達成された。簡潔に述べれば、無菌ナノＭ１－ＢＭＰ２が無菌ＰＢＳ中でリンスされ、埋め込みの前に４つ（１．７７ｍｍ２）に切断された。以前に報告（Keller L，et al．Bi-layered nano active implant with hybrid stem cell microtissues for tuned cartilage hypertrophy．Journal of Stem Cell Research & Therapeutics 1，9 (2015);及びKeller L，Wagner Q，Schwinte P，Benkirane-Jessel N．Double compartmented and hybrid implant outfitted with well-organized 3D stem cells for osteochondral regenerative nanomedicine．Nanomedicine (Lond) 10，2833-2845 (2015)）されたように、サブコンフルエントのヒト骨髄ＭＳＣ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が洗浄され、ヒアルロン酸／アルギン酸塩混合物に３．０×１０７細胞／ｍｌの濃度まで再懸濁された。埋め込みの前に、ラットは７０ｍｇ／ｋｇのケタミン及び１０ｍｇ／ｋｇのキシラジンの溶液の腹腔内注射で麻酔された。右後肢の剃毛及び消毒後に、軟骨下骨（約２ｍｍ）の出血まで、大腿滑車の正中における、大腿の膝蓋溝において丸い１．５ｍｍの骨軟骨欠損がショートドリルで誘導された。ナノＭ１－ＢＭＰ２膜が該欠損の底部に置かれ、次いで該欠損がｈＭＳＣ／ハイドロゲルミックスで充填され、５分にかけて１０２ｍＭの塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の滴下の添加を介してゲル化された。これらのラットは実験群１（ＡＲＴｉＣＡＲ；ｎ＝２０匹のラット；１０匹のオス及び１０匹のメス；１０５，０００±１０％の細胞を含有する３．５μｌのハイドロゲル）を構成した。他のラットが同じ手技に供されたが、（ビヒクルとして）ハイドロゲルのみが埋め込まれ、該ラットは群２（ｎ＝２０匹のラット；１０匹のオス及び１０匹のメス；３．５μｌのハイドロゲル）を構成した。ゲル化後に、関節嚢が閉じられ、筋肉及び皮膚が縫合され、該創傷がポビドンヨード溶液で徹底的に殺菌された。手術後に、ラットが麻酔後の回復についての観察下に保たれた。回復後に、０．０５～０．１ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンが皮下注射により投与された。動物は、該研究の持続期間（９０日）にわたり制約されない運動を許容された。ラットが１日毎に創傷治癒、脚可動性、罹病、死亡及び毒性の著明な徴候についてモニターされた。
血液の分析
埋め込み後７日目に、５匹のオス及び５匹のメスの絶食させたラット／群（ｎ＝２０）が過剰なイソフルランで麻酔され、心室血液がＥＤＴＡ含有チューブ又はヘパリン含有チューブのいずれかにそれぞれ血液学的又は生化学的分析の為に収集された。７～９０日目に、残存するラットが観察され、体重の任意の損失について週に２回モニターされた。ヘマトクリット、ヘモグロビン濃度、赤血球数、白血球数、平均血球体積及び血小板数が、インピーダンス変動及び測光法により収集の日に該血液試料において決定された（ＭＩＮＤＲＡＹ ＢＣ ２８００ ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｅｒ、４Ｍ、フランス国）。生化学評価の為に、血漿試料が内部ＳＯＰに従って調製された。ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、無機リン酸塩、グルコース、尿素、クレアチニン、総ビリルビン、総コレステロール、トリグリセリド、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、総タンパク質、アルブミン、及びアルブミン／グロブリン比が定量化された（Ｃｏｂａｓ Ｍｉｒａ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎａｌｙｓｅｒ、４Ｍ、フランス国）。
埋め込み後７日目に、５匹のオス及び５匹のメスの絶食させたラット／群（ｎ＝２０）が過剰なイソフルランで麻酔され、心室血液がＥＤＴＡ含有チューブ又はヘパリン含有チューブのいずれかにそれぞれ血液学的又は生化学的分析の為に収集された。７～９０日目に、残存するラットが観察され、体重の任意の損失について週に２回モニターされた。ヘマトクリット、ヘモグロビン濃度、赤血球数、白血球数、平均血球体積及び血小板数が、インピーダンス変動及び測光法により収集の日に該血液試料において決定された（ＭＩＮＤＲＡＹ ＢＣ ２８００ ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｅｒ、４Ｍ、フランス国）。生化学評価の為に、血漿試料が内部ＳＯＰに従って調製された。ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、無機リン酸塩、グルコース、尿素、クレアチニン、総ビリルビン、総コレステロール、トリグリセリド、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、総タンパク質、アルブミン、及びアルブミン／グロブリン比が定量化された（Ｃｏｂａｓ Ｍｉｒａ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎａｌｙｓｅｒ、４Ｍ、フランス国）。
ヌードラットへの埋め込みの病理組織学的分析
病理組織学的分析が、血液検査の為に使用された該絶食された動物において実行された。簡潔に述べれば、肉眼的検死が、新たに安楽死させたラットにおいて行われた。臓器（処置された膝、脾臓、腸間膜リンパ節、肝臓、気管支及び細気管支を伴う肺、腎臓並びに心臓）が巨視的に観察され、外植され、収集された。右後肢が、埋め込みに供される膝関節を回収する為に大腿骨及び脛骨の両方の骨端において切片化された。脾臓、肝臓、腎臓及び心臓が計量され、該他の臓器と共に室温で４％のホルマリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中に組織学的分析まで保存された。臓器は、４％のパラホルムアルデヒド中に固定され、脱水され、パラフィン中に包埋され、切片化され、病理組織学の為に調べられた。
病理組織学的分析が、血液検査の為に使用された該絶食された動物において実行された。簡潔に述べれば、肉眼的検死が、新たに安楽死させたラットにおいて行われた。臓器（処置された膝、脾臓、腸間膜リンパ節、肝臓、気管支及び細気管支を伴う肺、腎臓並びに心臓）が巨視的に観察され、外植され、収集された。右後肢が、埋め込みに供される膝関節を回収する為に大腿骨及び脛骨の両方の骨端において切片化された。脾臓、肝臓、腎臓及び心臓が計量され、該他の臓器と共に室温で４％のホルマリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中に組織学的分析まで保存された。臓器は、４％のパラホルムアルデヒド中に固定され、脱水され、パラフィン中に包埋され、切片化され、病理組織学の為に調べられた。
ヒトＤＮＡ ＱＰＣＲの為の組織採取
埋め込みの９０日後に、５匹のオス及び５匹のメスラット／群（ｎ＝２０）が、麻酔下での失血により安楽死させられた。肉眼的検死後に、臓器（卵管を伴う卵巣、精巣、脳、処置された膝、脾臓、肝臓、腎臓、肺、骨髄、心臓及び該処置された膝関節をカバーする皮膚）が計量され、生産者の指示書に従ってＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ ＡＸＧ１００ ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、Ｈｏｅｒｄｔ、フランス国）を使用してＤＮＡ抽出の為に収集された。簡潔に述べれば、膝関節を除く全ての組織試料が、バッファーＧ２を含有するＭ－チューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｐａｒｉｓ、フランス国）中、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｐａｒｉｓ、フランス国）でホモジナイズされた。膝関節が、バッファーＧ２中でＵｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘ（商標）解離機器を使用してホモジナイズされた。抽出後に、ＤＮＡペレットが分子生物学グレードの水に溶解させられ、２０℃で貯蔵された。ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅｓ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ、Ｍａｒｎｅｓ－ｌａ－Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、フランス国）を用いる定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が、ＴａｑＭａｎ ＡｌｕＹＢ８ Ｐｒｏｂｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてヒトＡｌｕ配列を定量化する為に使用された。該埋め込みされたラットの該異なる組織からのゲノムＤＮＡが、対照ラットからのＤＮＡと並べて増幅され、Ｕ８７－ＭＧヒト細胞からの可変量のＤＮＡ（２２、７、０．７ｎｇ；７０、７、２．２、０．７、０．０７ｐｇ又はＤＮＡなし）をスパイクされて、標準曲線を構築した。試料はＣＦＸ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で３５サイクルにわたり３連で実行された。検出限度は、ヒトＤＮＡをスパイクされなかった対照ラットＤＮＡからの平均シグナルに対応した。
埋め込みの９０日後に、５匹のオス及び５匹のメスラット／群（ｎ＝２０）が、麻酔下での失血により安楽死させられた。肉眼的検死後に、臓器（卵管を伴う卵巣、精巣、脳、処置された膝、脾臓、肝臓、腎臓、肺、骨髄、心臓及び該処置された膝関節をカバーする皮膚）が計量され、生産者の指示書に従ってＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ ＡＸＧ１００ ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、Ｈｏｅｒｄｔ、フランス国）を使用してＤＮＡ抽出の為に収集された。簡潔に述べれば、膝関節を除く全ての組織試料が、バッファーＧ２を含有するＭ－チューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｐａｒｉｓ、フランス国）中、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｐａｒｉｓ、フランス国）でホモジナイズされた。膝関節が、バッファーＧ２中でＵｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘ（商標）解離機器を使用してホモジナイズされた。抽出後に、ＤＮＡペレットが分子生物学グレードの水に溶解させられ、２０℃で貯蔵された。ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅｓ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ、Ｍａｒｎｅｓ－ｌａ－Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、フランス国）を用いる定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が、ＴａｑＭａｎ ＡｌｕＹＢ８ Ｐｒｏｂｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてヒトＡｌｕ配列を定量化する為に使用された。該埋め込みされたラットの該異なる組織からのゲノムＤＮＡが、対照ラットからのＤＮＡと並べて増幅され、Ｕ８７－ＭＧヒト細胞からの可変量のＤＮＡ（２２、７、０．７ｎｇ；７０、７、２．２、０．７、０．０７ｐｇ又はＤＮＡなし）をスパイクされて、標準曲線を構築した。試料はＣＦＸ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で３５サイクルにわたり３連で実行された。検出限度は、ヒトＤＮＡをスパイクされなかった対照ラットＤＮＡからの平均シグナルに対応した。
ヒツジ骨髄からのＭＳＣの採取
関節間手術の４週（２８±２日）前に、成体ヒツジメス（Ｒｉｄｅａｕ Ａｒｃｏｔｔ Ｈｙｂｒｉｄｓ系統）が骨髄吸引手技に供された。簡潔に述べれば、動物は腹側横臥に置かれ、筋肉内（ＩＭ）に投与されたグリコピロラート（ｇｌｙｃｏｐｙｒｏｌａｔｅ）、キシラジン及びケタミンの混合物で麻酔された。ＩＶカテーテルが適切な静脈中に置かれた。喉頭はリドカインを噴霧され、該動物は、適切なサイズのカフ付き経口気管内チューブを挿管された。挿管法がＩＭ麻酔下で可能でない場合、誘導は、Ｏ２中のイソフルラン（１～５％）又はプロポフォールを使用して静脈内に行われた。次に、該ヒツジは、Ｏ２中のイソフルランで機械的に人工呼吸された。採取部位が消毒され、針が腸骨稜に導入された。無菌の１０ｍＬのシリンジが１ｍＬの５，０００ＩＵ／ｍＬのヘパリンで充填され、及び約８ｍＬの骨髄で充填された。骨髄試料及びヘパリンを含有する該シリンジが、間葉幹細胞の単離、特徴付け及び該外科的手技の為の調製の為に適切な無菌のキャップで密閉された。
関節間手術の４週（２８±２日）前に、成体ヒツジメス（Ｒｉｄｅａｕ Ａｒｃｏｔｔ Ｈｙｂｒｉｄｓ系統）が骨髄吸引手技に供された。簡潔に述べれば、動物は腹側横臥に置かれ、筋肉内（ＩＭ）に投与されたグリコピロラート（ｇｌｙｃｏｐｙｒｏｌａｔｅ）、キシラジン及びケタミンの混合物で麻酔された。ＩＶカテーテルが適切な静脈中に置かれた。喉頭はリドカインを噴霧され、該動物は、適切なサイズのカフ付き経口気管内チューブを挿管された。挿管法がＩＭ麻酔下で可能でない場合、誘導は、Ｏ２中のイソフルラン（１～５％）又はプロポフォールを使用して静脈内に行われた。次に、該ヒツジは、Ｏ２中のイソフルランで機械的に人工呼吸された。採取部位が消毒され、針が腸骨稜に導入された。無菌の１０ｍＬのシリンジが１ｍＬの５，０００ＩＵ／ｍＬのヘパリンで充填され、及び約８ｍＬの骨髄で充填された。骨髄試料及びヘパリンを含有する該シリンジが、間葉幹細胞の単離、特徴付け及び該外科的手技の為の調製の為に適切な無菌のキャップで密閉された。
ヒツジにおける骨軟骨欠損の誘導
計１６匹の成体ヒツジは、内側大腿顆への骨軟骨欠損の外科的誘導を受けた。ヒツジの３つの群（ＡＲＴｉＣＡＲ、ＡＧ対照、ＮＴ対照）が検討され；各々のヒツジは、後肢の右顆又は左顆の近位部分又は遠位部分のいずれかにおいて埋め込みされた。手術の為に、該後肢は、内側顆が皮膚下で触診されうる位置に曲げられた。１５ｃｍの内側傍膝蓋骨皮膚切開が行われた。皮下組織の鈍的切開後に、内側広筋を覆う筋膜が、筋肉繊維と平行な小さい切開で腹筋の遠位でのみ切開され、広筋が近位に陥没させられた。鈍的切開が、大腿骨の内側顆まで骨膜を露出させる為に使用された。関節包及び骨膜が、内側側副靭帯の起源の近位でのみ切開された。覆う軟組織が、ドリル穴の近傍においてのみ骨から除去された。穴は、該穴が６ｍｍの深さを有する該ＡＧ群を除いて、３ｍｍの深さまで６ｍｍドリルビットを使用して予めドリルされた。
計１６匹の成体ヒツジは、内側大腿顆への骨軟骨欠損の外科的誘導を受けた。ヒツジの３つの群（ＡＲＴｉＣＡＲ、ＡＧ対照、ＮＴ対照）が検討され；各々のヒツジは、後肢の右顆又は左顆の近位部分又は遠位部分のいずれかにおいて埋め込みされた。手術の為に、該後肢は、内側顆が皮膚下で触診されうる位置に曲げられた。１５ｃｍの内側傍膝蓋骨皮膚切開が行われた。皮下組織の鈍的切開後に、内側広筋を覆う筋膜が、筋肉繊維と平行な小さい切開で腹筋の遠位でのみ切開され、広筋が近位に陥没させられた。鈍的切開が、大腿骨の内側顆まで骨膜を露出させる為に使用された。関節包及び骨膜が、内側側副靭帯の起源の近位でのみ切開された。覆う軟組織が、ドリル穴の近傍においてのみ骨から除去された。穴は、該穴が６ｍｍの深さを有する該ＡＧ群を除いて、３ｍｍの深さまで６ｍｍドリルビットを使用して予めドリルされた。
ヒツジにおけるＡＲＴＩＣＡＲの関節内埋め込み
欠損の誘導後に、ナノＭ１－ＢＭＰ２が置かれ、該欠損がＭＳＣ／ハイドロゲルミックス（ＡＲＴｉＣＡＲ組み合わせＡＴＭＰ、ｎ＝９）で充填された。該ＡＧ群（ｎ＝１０）において、６ｍｍの直径及び６ｍｍの深さの骨試料が顆から採取され、該欠損中に置かれた。該ＮＴ群（ｎ＝１３）において、該欠損は処置も充填もされなかった。最大５ｍＬの０．２５％のブピバカインが手術部位中に浸潤させられて局所麻酔を達成し、手術後の疼痛を管理した。該組織が再配置され、適切な縫合糸を使用してレイヤー・バイ・レイヤーで閉じられた。術後の鎮痛及び抗生物質療法が行われ、５ｍｇ／ｋｇのＥｘｃｅｄｅ（ＩＭ）が麻酔からの回復の間に投与され、４ｍｇ／ｋｇのカプロフェン（ＩＭ）が手術の３日後に投与された。
欠損の誘導後に、ナノＭ１－ＢＭＰ２が置かれ、該欠損がＭＳＣ／ハイドロゲルミックス（ＡＲＴｉＣＡＲ組み合わせＡＴＭＰ、ｎ＝９）で充填された。該ＡＧ群（ｎ＝１０）において、６ｍｍの直径及び６ｍｍの深さの骨試料が顆から採取され、該欠損中に置かれた。該ＮＴ群（ｎ＝１３）において、該欠損は処置も充填もされなかった。最大５ｍＬの０．２５％のブピバカインが手術部位中に浸潤させられて局所麻酔を達成し、手術後の疼痛を管理した。該組織が再配置され、適切な縫合糸を使用してレイヤー・バイ・レイヤーで閉じられた。術後の鎮痛及び抗生物質療法が行われ、５ｍｇ／ｋｇのＥｘｃｅｄｅ（ＩＭ）が麻酔からの回復の間に投与され、４ｍｇ／ｋｇのカプロフェン（ＩＭ）が手術の３日後に投与された。
ＭＲＩを介するＡＲＴＩＣＡＲ埋め込みの非侵襲的モニタリング
膝修復の縦断的分析の為に、ヒツジが３回、ＭＲＩを介して、手術の直後、１５及び２６週時に、Ｍａｇｎｅｔｏｍ Ｖｅｒｉｏ ３Ｔ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）を使用して調べられた。該手技の為に、ヒツジは、０．０５ｍｇ／ｋｇのキシラジン及び５ｍｇ／Ｋｇのケタミンの静脈内注射で麻酔され、背側臥位に置かれた。計６つの手術の部位が各々の群についてイメージングされた。重み付けされたプロトン密度、獲得された脂肪飽和矢状切片が、Ｏｓｉｒｉｘオープンソースソフトウェアを使用して分析された。
膝修復の縦断的分析の為に、ヒツジが３回、ＭＲＩを介して、手術の直後、１５及び２６週時に、Ｍａｇｎｅｔｏｍ Ｖｅｒｉｏ ３Ｔ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）を使用して調べられた。該手技の為に、ヒツジは、０．０５ｍｇ／ｋｇのキシラジン及び５ｍｇ／Ｋｇのケタミンの静脈内注射で麻酔され、背側臥位に置かれた。計６つの手術の部位が各々の群についてイメージングされた。重み付けされたプロトン密度、獲得された脂肪飽和矢状切片が、Ｏｓｉｒｉｘオープンソースソフトウェアを使用して分析された。
外植された大腿顆の三次元マイクロＣＴ
骨石灰化の分析の為に、手術の２６週後にヒツジは麻酔され、計量され、５４０ｍｇ／ｍｌのＥｕｔｈａｎｙｌ急速ＩＶボーラスの致死的な注射により安楽死させられた。心電図又は聴診のいずれかでの、心停止又は心室細動の観察により死が確認され、記録された。大腿顆が、安楽死させられたヒツジから外植され、３ＤマイクロＣＴ（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｆｘ ｍＣＴ、Ｊｕｌｉｅｎ Ｂｅｃｋｅｒ、ＩＣＳ、ＩＧＢＭＣ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、フランス国）を介してイメージングされた。計６つの手術の部位が各々の群についてイメージングされた。三次元表面レンダリングが、Ｏｓｉｒｉｘオープンソースソフトウェアを使用してマイクロＣＴ ２Ｄ画像から得られた。
骨石灰化の分析の為に、手術の２６週後にヒツジは麻酔され、計量され、５４０ｍｇ／ｍｌのＥｕｔｈａｎｙｌ急速ＩＶボーラスの致死的な注射により安楽死させられた。心電図又は聴診のいずれかでの、心停止又は心室細動の観察により死が確認され、記録された。大腿顆が、安楽死させられたヒツジから外植され、３ＤマイクロＣＴ（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｆｘ ｍＣＴ、Ｊｕｌｉｅｎ Ｂｅｃｋｅｒ、ＩＣＳ、ＩＧＢＭＣ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、フランス国）を介してイメージングされた。計６つの手術の部位が各々の群についてイメージングされた。三次元表面レンダリングが、Ｏｓｉｒｉｘオープンソースソフトウェアを使用してマイクロＣＴ ２Ｄ画像から得られた。
ヒツジにおけるインプラントの病理組織学的分析
処置された大腿が、安楽死させられた動物から除去され、関節表面の肉眼的検査に供された。肉眼的検査後に、遠位大腿骨端（顆を伴う）が個々に同定され、１０％の中性緩衝化ホルマリン中に収集された。その長手方向の軸に沿って該試料の中央においてノコギリで切ることにより骨ブロックは二等分に切断された。切片が、該欠損を通じてそのより深い軸に沿って、骨表面から該ドリル穴の終わりまで切断されて、矩形状の欠損半切片を生成した。全厚さの大腿骨－軟骨欠損部位は、脱灰されていない骨の調製を受け、メチルメタクリル酸塩を浸潤させられ、重合された。該欠損の幅全体に及ぶ単一の８μｍの切片が、傍矢状面に沿って各々の内側大腿顆から切断された。軟骨及び骨の両方の染色の為に、該切片はサフラニンｏ－ファストグリーンで染色された。該大腿欠損部位が慎重に評価され、以下の表に従ってＩＣＲＳ組織学的スコアシステムに従ってスコア付けされた。
処置された大腿が、安楽死させられた動物から除去され、関節表面の肉眼的検査に供された。肉眼的検査後に、遠位大腿骨端（顆を伴う）が個々に同定され、１０％の中性緩衝化ホルマリン中に収集された。その長手方向の軸に沿って該試料の中央においてノコギリで切ることにより骨ブロックは二等分に切断された。切片が、該欠損を通じてそのより深い軸に沿って、骨表面から該ドリル穴の終わりまで切断されて、矩形状の欠損半切片を生成した。全厚さの大腿骨－軟骨欠損部位は、脱灰されていない骨の調製を受け、メチルメタクリル酸塩を浸潤させられ、重合された。該欠損の幅全体に及ぶ単一の８μｍの切片が、傍矢状面に沿って各々の内側大腿顆から切断された。軟骨及び骨の両方の染色の為に、該切片はサフラニンｏ－ファストグリーンで染色された。該大腿欠損部位が慎重に評価され、以下の表に従ってＩＣＲＳ組織学的スコアシステムに従ってスコア付けされた。
埋め込みの１２又は２６週後に、安全性パラメータがＡＲＴｉＣＡＲ（１２週時にｎ＝４～７；２６週時にｎ＝４～７）について評価され、自家移植片（１２週時にｎ＝４；２６週時にｎ＝６）処置（手術における軟骨処置の為に現行で行われている骨軟骨柱移植術に相当する）及び処置なし（１２週時にｎ＝６；２６週時にｎ＝７）と比較された。値は平均±ＳＤとして提示されている。差異が一元配置ＡＮＯＶＡ／クラスカル－ウォリス検定で評価された。＊＝ＡＲＴｉＣＡＲと自家移植片との間でｐ≦０．０５。
また、該欠損の下の及び隣接する組織が、該処置の安全性及び有効性を評価する為の多数のパラメータ（下記の表２を参照）について評価された。
埋め込みの１２又は２６週後に、安全性パラメータがＡＲＴｉＣＡＲ（１２週時にｎ＝４～７；２６週時にｎ＝４～７）について評価され、自家移植片（１２週時にｎ＝４；２６週時にｎ＝６）処置（手術における軟骨処置の為に現行で行われている骨軟骨柱移植術に相当する）及び処置なし（１２週時にｎ＝６；２６週時にｎ＝７）と比較された。値は平均±ＳＤとして提示されている。ＮＡ：該当せず、ｐｈｆ＊：高倍率（×４００）視野当たり。
統計分析
ＷＳＴ１アッセイからの結果が、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてチューキー事後検定を使用してＰｒｉｓｍ ４．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ）上で統計的に評価された。ｐ値≦０．０５が有意と考えられた。一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニ事後検定が、Ｐｒｉｓｍ ４．０３を使用して、血液検査において血液学的及び生化学的パラメータを比較する為に使用された。ｐ値≦０．０５が有意と考えられた。ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（ＳＹＳＴＡＴ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）及びＰｒｉｓｍ ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）の両方が、ヒツジにおけるイン・ビボ実験からのＩＣＳＲ ＩＩスコアを比較する為に使用された。等分散検定及び正規性検定が行われた。一元配置ＡＮＯＶＡ（処置により誘導された差異）又は二元配置ＡＮＯＶＡ（処置及び時間の両方により誘導された差異）のいずれか、続いてボンフェローニ事後検定が、研究群の連続変数の間の有意な差異を評価する為に使用された。等分散検定又は正規性検定のいずれかが失敗した場合、ダンの補正を伴うクラスカル－ウォリス一元配置ＡＮＯＶＡが実行された。ｐ値≦０．１が有意と考えられた。
ＷＳＴ１アッセイからの結果が、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてチューキー事後検定を使用してＰｒｉｓｍ ４．０３（ＧｒａｐｈＰａｄ）上で統計的に評価された。ｐ値≦０．０５が有意と考えられた。一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてボンフェローニ事後検定が、Ｐｒｉｓｍ ４．０３を使用して、血液検査において血液学的及び生化学的パラメータを比較する為に使用された。ｐ値≦０．０５が有意と考えられた。ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（ＳＹＳＴＡＴ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）及びＰｒｉｓｍ ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）の両方が、ヒツジにおけるイン・ビボ実験からのＩＣＳＲ ＩＩスコアを比較する為に使用された。等分散検定及び正規性検定が行われた。一元配置ＡＮＯＶＡ（処置により誘導された差異）又は二元配置ＡＮＯＶＡ（処置及び時間の両方により誘導された差異）のいずれか、続いてボンフェローニ事後検定が、研究群の連続変数の間の有意な差異を評価する為に使用された。等分散検定又は正規性検定のいずれかが失敗した場合、ダンの補正を伴うクラスカル－ウォリス一元配置ＡＮＯＶＡが実行された。ｐ値≦０．１が有意と考えられた。
実施例１：イン・ビトロでのナノＭ１－ＢＭＰ２創傷ドレッシングの細胞傷害性（工程１）：
ＡＲＴｉＣＡＲ組み合わせＡＴＭＰの該骨創傷パッチ（ｃ）の為の該ナノファイバーＰＣＬ創傷ドレッシング構成要素（ナノＭ１－ＢＭＰ２；図１Ａ）が、イン・ビトロでのＭＲＣ－５胎仔肺線維芽細胞に対する細胞傷害性について試験された。細胞が、ナノＭ１－ＢＭＰ２創傷ドレッシングの存在下で播種され、陽性（ポリウレタンフィルム；ＲＭ－Ａ）及び陰性（高密度ポリエチレンフィルム；ＲＭ－Ｃ）対照と比較された。異なるサイズのナノＭ１－ＢＭＰ２膜及び該対照フィルムの両方が、１～２０ｍｍ２の範囲内で試験された。細胞密度及び形態が明視野顕微鏡法により定性的に評価された。ＲＭ－Ａの存在下で培養された細胞は、２４時間後に既に脱着し始めた（図２Ａ～Ｅ）。対照的に、ナノＭ１－ＢＭＰ２スキャフォールドの存在下で培養された細胞はいかなる形態学的異常も示さず（図２Ｆ～図２Ｊ）、ＲＭ－Ｃフィルムの存在下で培養された細胞は形態学的異常を示した（図２Ｋ～図２Ｏ）。次に、我々は、ＷＳＴ－１生／死細胞アッセイを使用して、試験された該３つの条件における該ＭＲＣ－５細胞の生存を評価した。ＲＭ－Ａ及びナノＭ１－ＢＭＰ２の両方は、２４時間にかけて細胞生存における減少を示し、これは、補間された傾向線（図２Ｐ～図２Ｒにおける太黒線）が指し示したように、使用された膜のサイズに直接的に比例した。しかしながら、２０ｍｍ２のＲＭ－Ａの存在下で、該細胞生存はｔ０と比較して７２±５％まで低減し（図２Ｐ、ｐ≦０．０５）、同じサイズのナノＭ１－ＢＭＰ２の断片の存在下で、該細胞生存は９７±５％まで低減した（図２Ｑ）。細胞数の有意な低減はまた、該陰性対照フィルムの存在下で観察された（図２Ｒ）。これらの結果は、ナノＭ１－ＢＭＰ２はイン・ビトロでＭＲＣ－５細胞に対して毒性でないことを指し示す。
ＡＲＴｉＣＡＲ組み合わせＡＴＭＰの該骨創傷パッチ（ｃ）の為の該ナノファイバーＰＣＬ創傷ドレッシング構成要素（ナノＭ１－ＢＭＰ２；図１Ａ）が、イン・ビトロでのＭＲＣ－５胎仔肺線維芽細胞に対する細胞傷害性について試験された。細胞が、ナノＭ１－ＢＭＰ２創傷ドレッシングの存在下で播種され、陽性（ポリウレタンフィルム；ＲＭ－Ａ）及び陰性（高密度ポリエチレンフィルム；ＲＭ－Ｃ）対照と比較された。異なるサイズのナノＭ１－ＢＭＰ２膜及び該対照フィルムの両方が、１～２０ｍｍ２の範囲内で試験された。細胞密度及び形態が明視野顕微鏡法により定性的に評価された。ＲＭ－Ａの存在下で培養された細胞は、２４時間後に既に脱着し始めた（図２Ａ～Ｅ）。対照的に、ナノＭ１－ＢＭＰ２スキャフォールドの存在下で培養された細胞はいかなる形態学的異常も示さず（図２Ｆ～図２Ｊ）、ＲＭ－Ｃフィルムの存在下で培養された細胞は形態学的異常を示した（図２Ｋ～図２Ｏ）。次に、我々は、ＷＳＴ－１生／死細胞アッセイを使用して、試験された該３つの条件における該ＭＲＣ－５細胞の生存を評価した。ＲＭ－Ａ及びナノＭ１－ＢＭＰ２の両方は、２４時間にかけて細胞生存における減少を示し、これは、補間された傾向線（図２Ｐ～図２Ｒにおける太黒線）が指し示したように、使用された膜のサイズに直接的に比例した。しかしながら、２０ｍｍ２のＲＭ－Ａの存在下で、該細胞生存はｔ０と比較して７２±５％まで低減し（図２Ｐ、ｐ≦０．０５）、同じサイズのナノＭ１－ＢＭＰ２の断片の存在下で、該細胞生存は９７±５％まで低減した（図２Ｑ）。細胞数の有意な低減はまた、該陰性対照フィルムの存在下で観察された（図２Ｒ）。これらの結果は、ナノＭ１－ＢＭＰ２はイン・ビトロでＭＲＣ－５細胞に対して毒性でないことを指し示す。
実施例２：ヌードラットにおけるＡＲＴｉＣＡＲ組み合わせＡＴＭＰの関節内埋め込み後のヒト細胞の急性毒性、体内分布及び持続性（工程２）：
ＡＲＴｉＣＡＲの急性毒性がヌードラットにおいてイン・ビボで評価され、ビヒクルとしての該インプラントの非活性部分（ｈＭＳＣを有しないハイドロゲル）と比較された。臨床的、血液学的及び生化学的パラメータが評価された。該移植された細胞の体内分布及び持続性も評価された。簡潔に述べれば、ＡＲＴｉＣＡＲ組み合わせＡＴＭＰ（群１）又はビヒクル（群２）がヌードラットにおける大腿欠損に埋め込まれた。埋め込みの７日後に該動物が安楽死させられる前に心室血液が採取され、大腿が病理組織学的分析の為に収集された。ＡＲＴｉＣＡＲ組み合わせＡＴＭＰも該ビヒクルも、該埋め込み後９０日の期間にかけて、メスラット又はオスラットのいずれにおいても、体重に対するいかなる有意な効果のトリガーともならなかった（図３Ａ）。血液学的パラメータ（図３Ｂ）は、動物の該４つの群（群１のオス、群１のメス、群２のオス、群２のメス）の間で有意な差異を示さなかった。生化学的パラメータもまた評価された（図３Ｃ）。群１におけるメスラットは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ；群１及び群２についてそれぞれ１７．０±２．０Ｕ／ｌ対１３．２±１．６Ｕ／ｌ；ｐ≦０．０５）並びにカルシウム（群１及び群２についてそれぞれ９１．７４±１．０２ｍｇ／ｌ対８８．４６±０．９１ｍｇ／ｌ；ｐ≦０．０５）の両方の、群２におけるよりも有意に高い血漿濃度を示した。これらの差異は、いかなる追加の症状とも関連付けられず、全体として、検討された該血液学的及び生化学的パラメータの分析は、ＡＲＴｉＣＡＲで処置された動物と該対照群との間でいかなる臨床的に関連する差異も示さなかった。大腿骨－脛骨関節もまた収集され、組織学的分析に供された。ＡＲＴｉＣＡＲ及び該ビヒクルの両方は、該誘導された骨欠損の骨治癒プロセスと適合性の、埋め込み部位（図３Ｄ、図３Ｅにおいてアステリスクにより区切られる）における同等のレベルの炎症応答を誘導した（図３Ｄ、図３Ｅ）。最終的に、埋め込み後９０日目における該ヒトＭＳＣの体内分布もまた、ヒトＤＮＡを検出する為のｑＰＣＲを使用して評価された。ｈＭＳＣ ＤＮＡからのシグナルは、群１における１匹のオスラットの精巣を除いて、閾値レベルを上回っては決して検出されなかった。２．５％のアガロースゲル上のＰＣＲ産物の泳動は増幅産物の特異性を裏付けた。以上を合わせると、臨床的、血液学的及び生化学的データは、ＡＲＴｉＣＡＲインプラントはいかなる臨床的に関連する症状も誘導しなかったことを示唆し；該埋め込み部位の組織学的分析から検出された炎症応答は該対照群との差異を明らかにせず、骨欠損の処置の為のＡＲＴｉＣＡＲインプラントの安全性を強く指し示した。
ＡＲＴｉＣＡＲの急性毒性がヌードラットにおいてイン・ビボで評価され、ビヒクルとしての該インプラントの非活性部分（ｈＭＳＣを有しないハイドロゲル）と比較された。臨床的、血液学的及び生化学的パラメータが評価された。該移植された細胞の体内分布及び持続性も評価された。簡潔に述べれば、ＡＲＴｉＣＡＲ組み合わせＡＴＭＰ（群１）又はビヒクル（群２）がヌードラットにおける大腿欠損に埋め込まれた。埋め込みの７日後に該動物が安楽死させられる前に心室血液が採取され、大腿が病理組織学的分析の為に収集された。ＡＲＴｉＣＡＲ組み合わせＡＴＭＰも該ビヒクルも、該埋め込み後９０日の期間にかけて、メスラット又はオスラットのいずれにおいても、体重に対するいかなる有意な効果のトリガーともならなかった（図３Ａ）。血液学的パラメータ（図３Ｂ）は、動物の該４つの群（群１のオス、群１のメス、群２のオス、群２のメス）の間で有意な差異を示さなかった。生化学的パラメータもまた評価された（図３Ｃ）。群１におけるメスラットは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ；群１及び群２についてそれぞれ１７．０±２．０Ｕ／ｌ対１３．２±１．６Ｕ／ｌ；ｐ≦０．０５）並びにカルシウム（群１及び群２についてそれぞれ９１．７４±１．０２ｍｇ／ｌ対８８．４６±０．９１ｍｇ／ｌ；ｐ≦０．０５）の両方の、群２におけるよりも有意に高い血漿濃度を示した。これらの差異は、いかなる追加の症状とも関連付けられず、全体として、検討された該血液学的及び生化学的パラメータの分析は、ＡＲＴｉＣＡＲで処置された動物と該対照群との間でいかなる臨床的に関連する差異も示さなかった。大腿骨－脛骨関節もまた収集され、組織学的分析に供された。ＡＲＴｉＣＡＲ及び該ビヒクルの両方は、該誘導された骨欠損の骨治癒プロセスと適合性の、埋め込み部位（図３Ｄ、図３Ｅにおいてアステリスクにより区切られる）における同等のレベルの炎症応答を誘導した（図３Ｄ、図３Ｅ）。最終的に、埋め込み後９０日目における該ヒトＭＳＣの体内分布もまた、ヒトＤＮＡを検出する為のｑＰＣＲを使用して評価された。ｈＭＳＣ ＤＮＡからのシグナルは、群１における１匹のオスラットの精巣を除いて、閾値レベルを上回っては決して検出されなかった。２．５％のアガロースゲル上のＰＣＲ産物の泳動は増幅産物の特異性を裏付けた。以上を合わせると、臨床的、血液学的及び生化学的データは、ＡＲＴｉＣＡＲインプラントはいかなる臨床的に関連する症状も誘導しなかったことを示唆し；該埋め込み部位の組織学的分析から検出された炎症応答は該対照群との差異を明らかにせず、骨欠損の処置の為のＡＲＴｉＣＡＲインプラントの安全性を強く指し示した。
実施例３：大型動物モデルにおけるＡＲＴｉＣＡＲ関節内埋め込みの病理組織学的分析（工程３）：
ＡＲＴｉＣＡＲ組み合わせＡＴＭＰの安全性を更に確認する為に、及び大型動物におけるその使用の実現可能性を評価する為に、骨関節欠損が成体ヒツジの大腿顆において誘導され、充填しないままとされたか（無処置対照：ＮＴ）、又はＡＲＴｉＣＡＲインプラント若しくは自家移植片（ＡＧ）で充填された。治癒プロセスが、非侵襲的に磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）によって０、１２及び２６週時にモニターされた（図４Ａ～Ｃ）。埋め込みから１２又は２６週後に、ヒツジは安楽死させられ、大腿骨－脛骨関節が外植され、マイクロコンピューティング断層撮影法（マイクロＣＴ；図４Ｄ）を介して走査され；該関節の３Ｄ表面レンダリングもまた２Ｄ断面画像から構築された（図４Ｅ）。該外植された関節が、以下：グレードＩ＝正常な軟骨、グレードＩＩ＝ほぼ正常、グレードＩＩＩ＝異常な軟骨及びグレードＩＶ＝重度に異常な軟骨のようにＩＣＲＳスコアシステムに従って巨視的にスコア付けされた（図４Ｆ）。最終的に、該外植片がサフラニンｏ－ファストグリーンの溶液中で染色され、組織学的に調べられた（図４Ｇ）。以下のパラメータが該修復された組織内で考慮に入れられ、ＩＣＲＳ ＩＩスコアシステムに従ってスコア付けされた：軟骨下骨異常／髄線維化、組織形態、細胞形態、基礎の一体化、タイドマークの形成、血管新生、全体的な評価及び中央／深部区域評価（表１）。一般に、正確な軟骨下骨形成、適切な骨軟骨再構築区域及びグラフトと宿主組織との間の良好な一体化が、検討された全ての実験群において処置の２６週後に該誘導された骨欠損内で観察された（図４Ｇ、図４Ｈ）。興味深いことに、埋め込みの１２週後に、ＡＲＴｉＣＡＲで処置された欠損は、血管新生の低減（６６±１６％）、軟骨下骨のより不良な質（２５±２４％）及びタイドマークの低減（２９±３４％）（図４Ｈ、左パネル）を示した。これらのスコアは該ＮＴ群に対して整合されたが（それぞれ８０±１４％；５４±３０％；４４±３０％）、該ＡＧ群とは有意に異なった（それぞれ１００±０％、ｐ≦０．０５；８８±６％、ｐ≦０．０５；８０±１６％；ｐ≦０．１）。しかしながら、ＡＲＴｉＣＡＲ群は、該欠損に隣接する組織において該ＡＧ群より良好な血管新生（２．５±０．５）及びより高い程度の線維化（２．７５±０．５）を示したが（両方のパラメータについてｐ≦０．１）、該ＮＴ対照におけるほどの高さの線維軟骨形成のレベルを示さなかった（埋め込みの１２及び２６週後にそれぞれｐ≦０．１及びｐ≦０．０５）（図４Ｈ、右パネル、図４Ｊにおける黒矢印）。これらの結果は、ＡＲＴｉＣＡＲは、低い炎症応答を誘導する可能性があり、それが再生３８のトリガーとなって、軟骨下骨形成を誘導し（図４Ｋ～図４Ｎにおける黄矢印）、長期間の有効な治癒を促進することを示唆する。更に、埋め込みの２６週後に、マトリックス染色、表面／表在性評価、中央／深部区域評価及び全体的な評価は、ＡＲＴｉＣＡＲ群について最も高いスコアを示し（表１）、多形核細胞、感染、線維素性滲出物及び脂肪浸潤物は、ＡＲＴｉＣＡＲ群及び該ＡＧ群の両方において該欠損に隣接する組織において検出されず（表２）、ＡＲＴｉＣＡＲ組み合わせＡＴＭＰ処置は、自家移植片と同等に長期間にかけて安全性を有することを指し示した。
ＡＲＴｉＣＡＲ組み合わせＡＴＭＰの安全性を更に確認する為に、及び大型動物におけるその使用の実現可能性を評価する為に、骨関節欠損が成体ヒツジの大腿顆において誘導され、充填しないままとされたか（無処置対照：ＮＴ）、又はＡＲＴｉＣＡＲインプラント若しくは自家移植片（ＡＧ）で充填された。治癒プロセスが、非侵襲的に磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）によって０、１２及び２６週時にモニターされた（図４Ａ～Ｃ）。埋め込みから１２又は２６週後に、ヒツジは安楽死させられ、大腿骨－脛骨関節が外植され、マイクロコンピューティング断層撮影法（マイクロＣＴ；図４Ｄ）を介して走査され；該関節の３Ｄ表面レンダリングもまた２Ｄ断面画像から構築された（図４Ｅ）。該外植された関節が、以下：グレードＩ＝正常な軟骨、グレードＩＩ＝ほぼ正常、グレードＩＩＩ＝異常な軟骨及びグレードＩＶ＝重度に異常な軟骨のようにＩＣＲＳスコアシステムに従って巨視的にスコア付けされた（図４Ｆ）。最終的に、該外植片がサフラニンｏ－ファストグリーンの溶液中で染色され、組織学的に調べられた（図４Ｇ）。以下のパラメータが該修復された組織内で考慮に入れられ、ＩＣＲＳ ＩＩスコアシステムに従ってスコア付けされた：軟骨下骨異常／髄線維化、組織形態、細胞形態、基礎の一体化、タイドマークの形成、血管新生、全体的な評価及び中央／深部区域評価（表１）。一般に、正確な軟骨下骨形成、適切な骨軟骨再構築区域及びグラフトと宿主組織との間の良好な一体化が、検討された全ての実験群において処置の２６週後に該誘導された骨欠損内で観察された（図４Ｇ、図４Ｈ）。興味深いことに、埋め込みの１２週後に、ＡＲＴｉＣＡＲで処置された欠損は、血管新生の低減（６６±１６％）、軟骨下骨のより不良な質（２５±２４％）及びタイドマークの低減（２９±３４％）（図４Ｈ、左パネル）を示した。これらのスコアは該ＮＴ群に対して整合されたが（それぞれ８０±１４％；５４±３０％；４４±３０％）、該ＡＧ群とは有意に異なった（それぞれ１００±０％、ｐ≦０．０５；８８±６％、ｐ≦０．０５；８０±１６％；ｐ≦０．１）。しかしながら、ＡＲＴｉＣＡＲ群は、該欠損に隣接する組織において該ＡＧ群より良好な血管新生（２．５±０．５）及びより高い程度の線維化（２．７５±０．５）を示したが（両方のパラメータについてｐ≦０．１）、該ＮＴ対照におけるほどの高さの線維軟骨形成のレベルを示さなかった（埋め込みの１２及び２６週後にそれぞれｐ≦０．１及びｐ≦０．０５）（図４Ｈ、右パネル、図４Ｊにおける黒矢印）。これらの結果は、ＡＲＴｉＣＡＲは、低い炎症応答を誘導する可能性があり、それが再生３８のトリガーとなって、軟骨下骨形成を誘導し（図４Ｋ～図４Ｎにおける黄矢印）、長期間の有効な治癒を促進することを示唆する。更に、埋め込みの２６週後に、マトリックス染色、表面／表在性評価、中央／深部区域評価及び全体的な評価は、ＡＲＴｉＣＡＲ群について最も高いスコアを示し（表１）、多形核細胞、感染、線維素性滲出物及び脂肪浸潤物は、ＡＲＴｉＣＡＲ群及び該ＡＧ群の両方において該欠損に隣接する組織において検出されず（表２）、ＡＲＴｉＣＡＲ組み合わせＡＴＭＰ処置は、自家移植片と同等に長期間にかけて安全性を有することを指し示した。
結論として、世界的な軟骨修復／再生市場は２０１６年に４２億ＵＳドルの価値があり、平均余命の増加の為、２０１４～２０２５年の期間の間に５．４％のＣＡＧＲで増大することが予想される。現行で、ＯＡに対する国際的な標準処置は全人工膝関節全置換術（ＴＫＡ）である。その急速に増加している利用（米国において５５歳未満の７７，０００人の患者／年）にもかかわらず、ＴＫＡは、線維軟骨形成、細胞肥大又は発育不全及び軟骨と軟骨下骨との間の適切な境界面の欠如を誘導するので、若年の身体的に活発な患者において最適以下である。再生ナノ医療は、生体材料、ナノテクノロジー及び細胞の使用を組み合わせて、複雑な境界面再生が要求されるＯＡＲのような問題に対するより良好な解決策を与える。この研究において、我々は、ＡＲＴｉＣＡＲ組み合わせＡＴＭＰの実現可能性、非侵襲的モニタリング及び安全性を評価した。骨軟骨分化を促進する他の洗練されたインプラント挿入可能なスキャフォールドと同様に、ＡＲＴｉＣＡＲはＢＭＰ２を放出する。しかしながら、細胞接触依存性の空間的－時間的放出を提供するナノリザーバー技術のおかげで、ＡＲＴｉＣＡＲにおいて使用されるＢＭＰ２の総量は、診療所において使用されるＢＭＰ２を浸漬させたコラーゲン膜の総量よりも１０，０００倍低く（McKay WF，Peckham SM，Badura JM．A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft)．Int Orthop 31，729-734 (2007)）、潜在的な炎症性副作用（図３Ｄ；図４Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ）及び手技の全体的なコストの両方を低減させる。不良な軟骨下骨再生が達成される他のアプローチ（Buda R，Vannini F，Cavallo M，Grigolo B，Cenacchi A，Giannini S．Osteochondral lesions of the knee：a new one-step repair technique with bone-marrow-derived cells．J Bone Joint Surg Am 92 Suppl 2，2-11 (2010)；及びGiannini S，et al．One-step repair in talar osteochondral lesions：4-year clinical results and t2-mapping capability in outcome prediction．Am J Sports Med 41，511-518 (2013)）とは異なり、ＡＲＴｉＣＡＲは、軟骨下骨及び軟骨の両方の同時の再生に対処し（図４Ｇ、Ｋ、Ｎ）、局在化された骨軟骨欠損においてＯＡＲを促進する為の革新的な技術となる。軟骨再生の為に、ＡＲＴｉＣＡＲはＭＳＣを組み込んでいる。ヒトＭＳＣは、免疫調節効果に連結されたそれらの分化転換潜在能力の為に、ＯＡＲを促進する為に臨床試験において現行で使用されている。しかしながら、ＭＳＣの腫瘍原性が議論されているので、ｈＭＳＣの体内分布は前臨床安全性の不可欠な懸念である（Goldring CE，et al．Assessing the safety of stem cell therapeutics．Cell Stem Cell 8，618-628 (2011)；及びSensebe L，Fleury-Cappellesso S．Biodistribution of mesenchymal stem/stromal cells in a preclinical setting．Stem Cells Int 2013，678063 (2013)）。ＡＲＴｉＣＡＲの埋め込み後に、４０匹の埋め込みされた動物のうちの１匹のオスヌードラットの精巣において微量のｈＭＳＣ ＤＮＡが見出され（図３Ｃ）、ＡＲＴｉＣＡＲインプラントの安全性を強調した。
要約すると、本発明は、大型動物モデルにおけるＡＲＴｉＣＡＲインプラントの実現可能性、及びＭＲＩによって非侵襲的にＯＡＲを追跡する可能性を示した（図４Ａ～図４Ｃ）。より重要なことに、ヌードラット（図３Ｄ）においてもヒツジ（図４Ｇ、図４Ｈ、図４Ｋ、図４Ｎ）においても急性毒性も長期毒性も検出されなかったので、ＡＲＴｉＣＡＲの安全性が示された。それ故に、ＡＲＴｉＣＡＲは、ＯＡ、腱変性症及び他の年齢関連の変性性筋骨格の問題に対する処置としてフェーズＩ臨床試験に入ることができる。その為、ＡＲＴｉＣＡＲは、現行の侵襲的な処置を置き換えることができる可能性があり、米国だけでも３００，０００～４５０，０００人の患者／年に影響する潜在能力を有する（４０～５０億ドルの世界的な市場）。
Claims (18)
- 生体材料であって、
ナノファイバーポリマースキャフォールドで作られている膜創傷パッチ（ａ）であって、任意的に該ポリマースキャフォールドが、
多層化された滴で作られている断続的な被覆物であって、該多層化された滴が、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴である、該断続的な被覆物、又は
１５超の層ペアを含む連続的な被覆物であって、各層ペアが、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる、該連続的な被覆物
のいずれかで被覆されている表面を有する、該膜創傷パッチ（ａ）、
幹細胞を含むハイドロゲル（ｂ）、並びに
ポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドである骨創傷パッチ（ｃ）であって、該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴であり、該骨創傷パッチ（ｃ）が骨成長因子を更に含む、該骨創傷パッチ（ｃ）
を含み、
該ハイドロゲル（ｂ）が、該膜創傷パッチ（ａ）と該骨創傷パッチ（ｃ）との間に含まれている、
前記生体材料。 - 生体材料であって、
ナノファイバーポリマースキャフォールドで作られている膜創傷パッチ（ａ）であって、任意的に該ポリマースキャフォールドが、
多層化された滴で作られている断続的な被覆物であって、該多層化された滴が、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴である、該断続的な被覆物、又は
１５超の層ペアを含む連続的な被覆物であって、各層ペアが、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる、該連続的な被覆物
のいずれかで被覆されている表面を有する、該膜創傷パッチ（ａ）、
自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞、を含むハイドロゲル（ｂ）、並びに
ポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドである骨創傷パッチ（ｃ）であって、該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴であり、該骨創傷パッチ（ｃ）が骨成長因子を更に含む、該骨創傷パッチ（ｃ）
を含み、
該ハイドロゲル（ｂ）が、該膜創傷パッチ（ａ）と該骨創傷パッチ（ｃ）との間に含まれている、
前記生体材料。 - 前記ハイドロゲル（ｂ）が、ヒアルロン酸、及び／又はアルギン酸塩を含む、請求項１又は２に記載の生体材料。
- 前記膜創傷パッチ（ａ）の前記ナノファイバーポリマースキャフォールドが、ポリエステル；ポリアミド；ポリウレタン及びポリウレア；ポリ（アミド－エナミン）；ポリ無水物；微小生物供給源、植物供給源、海洋供給源又は動物供給源から産生されたポリマー；並びにそれらのポリマーの混合物からなる群から選択されるポリマーで作られている、請求項１～３のいずれか１項に記載の生体材料。
- 前記膜創傷パッチ（ａ）の前記ナノファイバーポリマースキャフォールドが、任意的にコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含んでいてもよいポリ（ε－カプロラクトン）から作られている、請求項１～４のいずれか１項に記載の生体材料。
- 前記骨創傷パッチ（ｃ）の前記ナノファイバーポリマースキャフォールドが、ポリエステル；ポリアミド；ポリウレタン及びポリウレア；ポリ（アミド－エナミン）；ポリ無水物；微小生物供給源、植物供給源、海洋供給源又は動物供給源から産生されたポリマー；並びにそれらのポリマーの混合物からなる群から選択されるポリマーで作られている、請求項１～５のいずれか１項に記載の生体材料。
- 前記骨創傷パッチ（ｃ）の前記ナノファイバーポリマースキャフォールドが、ポリ（ε－カプロラクトン）で又はコラーゲンで作られている、請求項１～６のいずれか１項に記載の生体材料。
- 前記成長因子が、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、例えばＢＭＰ２、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、それらをコードする核酸、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の生体材料。
- 前記骨創傷パッチ（ｃ）が、キトサン／ＢＭＰ２滴を含むポリ（ε－カプロラクトン）スキャフォールドで作られている、請求項１～８のいずれか１項に記載の生体材料。
- 前記膜創傷パッチ（ａ）は、コンドロイチン硫酸／ヒアルロン酸滴を含むポリ（ε－カプロラクトン）スキャフォールドで作られている、請求項１～９のいずれか１項に記載の生体材料。
- 請求項１～１０のいずれか１項に記載の生体材料を使用して軟骨病変を処置する方法であって、前記骨創傷パッチ（ｃ）を施与する工程、前記ハイドロゲル（ｂ）を施与する工程、及び前記膜創傷パッチ（ａ）を施与する工程を含む、前記方法。
- 骨及び／又は軟骨再生における使用の為の、請求項１～１０のいずれか１項に記載の生体材料。
- 骨及び／又は軟骨欠損の処置における使用の為の、請求項１～１０のいずれか１項に記載の生体材料。
- 変形性関節症の処置及び／又は予防の為の使用の為のキットであって、
ナノファイバーポリマースキャフォールドで作られている膜創傷パッチ（ａ）であって、任意的に該ポリマースキャフォールドが、
多層化された滴で作られている断続的な被覆物であって、該多層化された滴が、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴である、該断続的な被覆物、又は
１５超の層ペアを含む連続的な被覆物であって、各層ペアが、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる、該連続的な被覆物
のいずれかで被覆されている表面を有する、該膜創傷パッチ（ａ）、
幹細胞、好ましくは自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞、を含むハイドロゲル（ｂ）、並びに
ポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドである骨創傷パッチ（ｃ）であって、該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴であり、該骨創傷パッチ（ｃ）が骨成長因子を更に含む、該骨創傷パッチ（ｃ）
を含む、前記キット。 - 変形性関節症の処置及び／又は予防の為の使用の為のキットであって、
ナノファイバーポリマースキャフォールドで作られている膜創傷パッチ（ａ）であって、任意的に該ポリマースキャフォールドが、
多層化された滴で作られている断続的な被覆物であって、該多層化された滴が、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴である、該断続的な被覆物、又は
１５超の層ペアを含む連続的な被覆物であって、各層ペアが、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる、該連続的な被覆物
のいずれかで被覆されている表面を有する、該膜創傷パッチ（ａ）、
自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞を含むハイドロゲル（ｂ）、並びに
ポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドである骨創傷パッチ（ｃ）であって、該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴であり、該骨創傷パッチ（ｃ）が骨成長因子を更に含む、該骨創傷パッチ（ｃ）
を含む、前記キット。 - 変形性関節症の処置及び／又は予防の為の使用の為のキットであって、
ナノファイバーポリマースキャフォールドで作られている膜創傷パッチ（ａ）であって、任意的に該ポリマースキャフォールドが、
多層化された滴で作られている断続的な被覆物であって、該多層化された滴が、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴である、該断続的な被覆物、又は
１５超の層ペアを含む連続的な被覆物であって、各層ペアが、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる、該連続的な被覆物
のいずれかで被覆されている表面を有する、該膜創傷パッチ（ａ）、
ポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドである骨創傷パッチ（ｃ）であって、該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴であり、該骨創傷パッチ（ｃ）が骨成長因子を更に含む、該骨創傷パッチ（ｃ）、
自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞、
ヒアルロン酸と、アルギン酸塩との溶液、並びに
塩化カルシウム又はリン酸カルシウムの溶液
を含む、前記キット。 - 生体材料であって、
ナノファイバーポリマースキャフォールドで作られている膜創傷パッチ（ａ）であって、任意的に該ポリマースキャフォールドが、
多層化された滴で作られている断続的な被覆物であって、該多層化された滴が、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴である、該断続的な被覆物、又は
１５超の層ペアを含む連続的な被覆物であって、各層ペアが、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる、該連続的な被覆物
のいずれかで被覆されている表面を有する、該膜創傷パッチ（ａ）、
自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞を含むハイドロゲル（ｂ）、並びに
ポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドである骨創傷パッチ（ｃ）であって、該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴であり、該骨創傷パッチ（ｃ）が骨成長因子を更に含む、該骨創傷パッチ（ｃ）
を、変形性関節症の処置及び／又は予防における同時の、別々の又は逐次的な使用の為の複合製剤として含む、前記生体材料。 - 生体材料であって、
ナノファイバーポリマースキャフォールドで作られている膜創傷パッチ（ａ）であって、任意的に該ポリマースキャフォールドが、
多層化された滴で作られている断続的な被覆物であって、該多層化された滴が、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴である、該断続的な被覆物、又は
１５超の層ペアを含む連続的な被覆物であって、各層ペアが、少なくともコンドロイチン硫酸及び／又はヒアルロン酸を含むポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる、該連続的な被覆物
のいずれかで被覆されている表面を有する、該膜創傷パッチ（ａ）、
ポリマーで作られているナノファイバースキャフォールドである骨創傷パッチ（ｃ）であって、該スキャフォールドが、多層化された滴で作られている断続的な被覆物で被覆されている表面を有し、該多層化された滴が、ポリアニオンの１つの層とポリカチオンの１つの層とからなる少なくとも１つの層ペアから構成されている滴であり、該骨創傷パッチ（ｃ）が骨成長因子を更に含む、該骨創傷パッチ（ｃ）
自家又は同種の骨髄由来間葉幹細胞、
ヒアルロン酸と、アルギン酸塩との溶液、並びに
塩化カルシウム又はリン酸カルシウムの溶液
を、変形性関節症の処置及び／又は予防における同時の、別々の又は逐次的な使用の為の複合製剤として含む、前記生体材料。
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