CN106730026B - 一种组织工程软骨复合支架及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种组织工程软骨复合支架及制备方法，其中复合支架包括：具有孔隙结构的支架本体，所述支架本体由医用高分子材料通过快速成型技术制备而成；以及复合在所述支架本体的孔隙结构中以及支架本体表面的水凝胶，所述水凝胶中混合有骨髓间充质干细胞。本发明通过将水凝胶与医用高分子材料制成的支架本体复合，制得的组织工程软骨复合支架既具有医用高分子材料良好的机械强度，又能通过水凝胶保持高的水分含量，在支架内部及表面为骨髓间充质干细胞的物质交换以及向软骨细胞分化提供良好的微环境。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料与组织工程技术领域，尤其涉及一种组织工程软骨复合支架及制备方法。
背景技术
关节软骨是一种无血管、神经和淋巴的组织，这种结构特点使损伤的软骨组织自修复能力十分有限。关节软骨损伤后只有极低或没有有效的自身修复能力，损伤继续发展会导致进行性关节软骨破坏和骨性关节炎。
目前临床上常用的软骨修复技术包括骨髓刺激技术、自体骨软骨移植、异体骨软骨移植、自体软骨细胞移植技术等。目前，软骨组织工程技术是再生关节软骨的的最佳方法之一。
合适的支架材料、种子细胞、生长信号是组织工程的三个基本要素。理想的支架材料应具备以下几个特点：l)可控的降解性能；2)有利于细胞生长、分化以及细胞外基质的合成；3)便于营养物质和代谢产物的运输；4)具有合适的力学性能；5)和周围的组织进行良好整合。
水凝胶是水分含量较高的三维交联多孔网状结构，其中温度敏感性水凝胶已经被广泛应用于软骨组织工程领域。温敏水凝胶包括天然衍生的水凝胶和合成来源的水凝胶。天然温敏水凝胶包括胶原、明胶和壳聚糖等。合成温敏水凝胶包括聚醚、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、多肽和聚酯等。然而单纯温敏性水凝胶的主要缺点为机械强度不够。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有水凝胶支架的机械强度不够的缺陷，提供一种在三维立体支架上复合水凝胶的组织工程软骨复合支架及制备方法。
本发明第一方面，提供了一种组织工程软骨复合支架，包括：具有孔隙结构的支架本体，所述支架本体由医用高分子材料通过快速成型技术制备而成；以及复合在所述支架本体的孔隙结构中以及支架本体表面的水凝胶，所述水凝胶中混合有骨髓间充质干细胞。
在根据本发明的优选实施方式中，所述医用高分子材料为聚己内酯、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇或聚醚醚酮。
在根据本发明的优选实施方式中，所述水凝胶为胶原、壳聚糖或PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物。
在根据本发明的优选实施方式中，所述支架本体的孔隙结构为通过熔融沉积成型形成的在三个维度上互通的孔隙结构。
在根据本发明的优选实施方式中，所述支架本体由聚己内酯制成，所述支架本体由纤维方向互成90°的多层聚己内酯纤维叠加而成，且纤维直径为300～350μm，纤维间距为350～400μm。
在根据本发明的优选实施方式中，所述支架本体由聚乳酸-羟基乙酸共聚物制成，所述支架本体由纤维方向互成90°的多层聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维叠加而成，且纤维直径为200～300μm，纤维间距为300～350μm。
本发明第二方面，提供了一种组织工程软骨复合支架的制备方法，包括以下步骤：
S1、采用医用高分子材料通过快速成型技术制备具有孔隙结构的支架本体；
S2、将骨髓间充质干细胞悬液加入水凝胶溶液中，制备水凝胶细胞混合悬液，将所述水凝胶细胞混合悬液滴加于所述支架本体上，直至水凝胶细胞混合悬液渗透入所述支架本体的孔隙结构中并覆盖支架本体表面。
在根据本发明的优选实施方式中，所述水凝胶为PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物；所述步骤S2包括：
S2-1、将PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物与磷酸缓冲盐溶液在4～6℃充分搅拌溶解后形成三嵌段共聚物溶液，其中PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的质量分数为12％～16％；
S2-2、将三嵌段共聚物溶液与骨髓间充质干细胞悬液在18～22℃时混合均匀形成包裹细胞的水凝胶细胞混合悬液；其中，水凝胶细胞混合悬液中骨髓间充质干细胞的细胞浓度为5×105-2×106/ml；
S2-3、将所述水凝胶细胞混合悬液滴加于支架本体上，置于离心管中，在4℃以180～220rpm/min离心10～20分钟；取出离心后的支架本体置于37℃环境下，得到所述组织工程软骨复合支架。
在根据本发明的优选实施方式中，所述支架本体由聚己内酯制成；所述步骤S1包括：
S1-1、将聚己内酯材料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内加热至120～130℃，并在600～1000kPa的气压下准备打印；
S1-2、将纤维直径设置为300～350μm，纤维间距设置为350～400μm，以0.8～1mm/s的速度打印出支架本体。
在根据本发明的优选实施方式中，所述支架本体由聚乳酸-羟基乙酸共聚物制成；所述步骤S1包括：
S’1-1、将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与有机溶剂以1:6～1:8的质量比混合，配置PLGA溶液，在所述PLGA溶液中加入氯化钠颗粒得到打印浆料，其中PLGA与加入的氯化钠颗粒的质量比为1:1～2:1，将所述打印浆料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内，并在20～30℃温度及100～300kPa的气压下准备打印；
S’1-2、将纤维直径设置为200～300μm，纤维间距设置为300～350μm，以3～6mm/s的速度打印出含有氯化钠颗粒的支架本体，并通过干燥去除所述有机溶剂；
S’1-3、将含有氯化钠颗粒的支架本体置入水中浸泡，待氯化钠溶出后干燥得到支架本体。
本发明的上述技术方案具有如下优点：
1、本发明通过将水凝胶与快速成型制备的具有孔隙结构的医用高分子支架复合，制得的组织工程软骨复合支架既具有医用高分子材料良好的机械强度，又能通过水凝胶保持高的水分含量，在支架内部及表面为骨髓间充质干细胞的物质交换以及向软骨细胞分化提供良好的微环境。
2、本发明的水凝胶优选采用温度敏感性水凝胶材料，可在液态下与支架复合，并在37℃环境下转变成凝胶状，进而在医用高分子材料制成的三维立体的支架本体内形成水分含量较高的三维交联多孔网状结构，为骨髓间充质干细胞的生长提供环境。
3、本发明的水凝胶优选为PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物，并且得出最佳的溶液浓度为12％～16％，如果水凝胶浓度过高则粘度过大，不利于进入支架的内部孔隙结构，如果水凝胶浓度过小则凝胶无法维持一定形状，即无法成胶，因此无法起到包裹细胞的作用。同时PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物具有良好的生物降解性和生物相容性，适用于对软骨缺损进行修复。
4、可选地，本发明的支架采用PCL材料制备，并针对PCL设计了最佳的纤维直径和纤维间距分别为300～350μm以及350～400μm，可以在保障力学性能的同时，有利于水凝胶进入支架内部的孔隙结构中。
5、可选地，本发明的支架采用PLGA材料制备，并通过添加赋形剂实现低温打印，克服了高温熔融打印PLGA支架造成的孔径尺寸过大(>500μm)或者过小(<100μm)的缺陷，制得的PLGA支架的孔径为300～350μm左右，是最佳组织工程软骨支架，易于存留细胞，同时具有更好的表面活性，能促进细胞增殖，同时兼备良好的机械力学性能。
6、本发明还对低温打印PLGA支架的工艺进行了大量研究，得出PLGA与有机溶剂以1:6～1:8的质量比混合，并且PLGA与氯化钠颗粒按照1:1～2:1的质量比配制时，可以成功地打印出形态完整的三维支架，并且通过将纤维直径设置为200～300μm，纤维间距设置为300～350μm，可以得到最佳的力学性能及降解速度。
附图说明
图1为根据本发明较佳实施例的组织工程软骨复合支架的结构示意图；
图2为根据本发明较佳实施例的组织工程软骨复合支架的制备方法流程图；
图3为根据本发明的组织工程软骨复合支架经体外复合培养后的实物照片；
图4A-4F为根据本发明的激光共聚焦显示实验组和PCL支架对照组的细胞保留度以及细胞存活情况图；
图5为根据本发明的实验组、PCL支架对照组和水凝胶对照组的CCK8检测结果图；
图6A-6D为RT-PCR结果显示的软骨相关基因表达结果图；
图7为根据本发明的实验组、PCL支架对照组和水凝胶对照组的非限制性压缩弹性模量测试结果图；
图8A-8B为PLGA对照组和实验组PN11的实物照片；
图9A-9H为PLGA对照组、实验组PN21、实验组PN11和实验组PN12的电镜照片；
图10为PLGA对照组、实验组PN21、实验组PN11和实验组PN12的抗压强度测试结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，为根据本发明较佳实施例的组织工程软骨复合支架的结构示意图。如图1所示，该组织工程软骨复合支架1包括：具有孔隙结构的支架本体2，以及复合在支架本体2的孔隙结构中以及支架本体2表面的水凝胶3，该水凝胶3中混合有骨髓间充质干细胞4。
其中支架本体2由医用高分子材料通过快速成型技术制备而成，具有三维立体结构。该医用高分子材料包括但不限于聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)和聚醚醚酮(PEEK)等材料。所述包括快速成型技术但不限于熔融沉积成型(FDM)、立体平版印刷技术(SLA)、选择性激光烧结技术(SLS)或激光薄片叠层制造技术(LOM)。优选地，支架本体2的孔隙结构为通过熔融沉积成型形成的在三个维度上互通的孔隙结构。
本发明中水凝胶3选取温度敏感性水凝胶材料。该温度敏感性水凝胶材料包括但不限于胶原、壳聚糖和PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物等材料。更优选地，本发明特别选用PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物来制备组织工程软骨复合支架。其中聚丙交酯乙交酯(PLGA)是一种疏水性的官能聚合物，它具有良好的生物降解性及生物相容性，已被FDA批准可用于临床。而PLGA的降解产物谷氨酸是关节软骨中含量最高的氨基酸。聚乙二醇(PEG)是一种水溶性好、无毒的亲水性聚合物。基于这些聚合物，PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物具有良好的生物降解性和生物相容性。
本发明将水凝胶3与医用高分子材料制成的支架本体2复合，制得组织工程软骨复合支架。该支架一方面具有医用高分子材料良好的机械强度，另一方面由于水凝胶是水分含量较高的三维交联多孔网状结构，接种后骨髓间充质干细胞4呈圆形局限于陷窝内，可以为干细胞的物质交换以及向软骨细胞分化提供良好的微环境。
在本发明一个优选的实施例中，组织工程软骨复合支架的支架本体2由聚己内酯(PCL)制成。熔融沉积成型在制备三维的支架本体时，是通过将打印浆料挤压成纤维一层一层且每层间互成90°叠加制备而成。因此，该支架本体包括由熔融沉积得到的多层聚己内酯纤维构成，每层聚己内酯纤维的纤维直径(fiber diameter)为300～350μm(例如300、310、320、330、340或350μm)，纤维间距(spacing)为350～400μm(例如350、360、370、380、390或400μm)。
优选地，PCL的重均分子量(Mw)为50000～80000gmol-1(例如50000、60000、70000或80000gmol-1)，更优选为60000gmol-1。PCL与其他生物医用材料相比具有降解速度慢且初始强度高的特点，因此本发明使用PCL制备的支架本体在体内可以长期保有良好的力学强度，更适合在承受较高生物力学强度的环境中应用，例如骨缺损，关节骨软骨缺损等。实验证明，本发明采用上述纤维直径和纤维间距参数制备的PCL复合水凝胶支架，可以获得更好的力学性能。并且本发明采用的纤维间距较一般熔融沉积成型制备的支架纤维间距大，从而有利于水凝胶的进入。
在本发明另一个优选的实施例中，组织工程软骨复合支架的支架本体由聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)制成，因此，该支架本体包括由熔融沉积得到的多层PLGA纤维构成，相邻层的PLGA的纤维方向互成90°，且每层PLGA纤维的纤维直径为200～300μm(例如200、210、220、250、280或300μm)，纤维间距为300～350μm(例如300、310、320、330、340或350μm)。
现有技术中通常采用电纺丝技术制备PLGA三维支架。而熔融沉积打印PLGA支架的成功率很低。这是由于纯PLGA材料在高温熔融(例如150～220℃)后粘度较大，容易堵塞打印喷嘴，且PLGA的结晶度低，打印出的纤维不易成型，容易发生塌陷和向两侧弥散，使临近纤维之间产生粘连导致孔径闭合，例如孔径通常小于100μm。如果为了避免粘连而减小纤维直径，则打印出的纤维强度不够，不能成行。如果增大纤维直径，例如300～600μm，也不能有效避免粘连现象，还容易因为塌陷而出现极小的孔径。为了避免上述情况，只能在设计时考虑增加纤维间距，因此熔融沉积成型采用高温打印出的PLGA支架的孔径通常大于500μm。即使能够用尽可能细的纤维，打印出尽可能合理的孔径300μm，但是其重复性很低，而且材料的脆性大，生物力学强度低，无法满足软骨支架的修复要求。
综上所述，现有技术中熔融沉积成型在高温下打印的纯PLGA支架存在孔径尺寸过大(>500μm)或者过小(<100μm)的缺陷，不易于准确控制3D打印PLGA支架的微观结构，且不适于细胞在支架上的增殖。已有文献表明较300-400μm左右的孔径较适合于组织工程支架的组建，如果孔径过小，则不利于营养物质的输送和代谢产物的排出，以及分子的扩散；如果孔径过大，则影响支架的生物力学强度，且只能提供有限的细胞附着面积。本发明经过大量研究和摸索，提供了一种全新的PLGA支架的低温打印方法，在PLGA材料中添加赋形剂氯化钠(NaCl)颗粒以降低PLGA粘度，增强PLGA在3D打印过程的可塑性。具体地，将PLGA溶于有机溶剂中，并添加NaCl颗粒，制备成打印浆料，经过低温(20～30℃)熔融沉积成型后进行干燥，再将含有NaCl颗粒的PLGA支架置入水中浸泡去除NaCl，即得到PLGA支架。优选地，赋形剂NaCl颗粒的粒径优选为35μm～40μm。当添加赋形剂后，制得的支架本体的孔隙结构既包括熔融沉积成型制成的纤维直径为200～300μm(例如200、210、230、250、280或300μm)，纤维间距为300～350μm(例如300、310、320、330、340或350μm)的一级孔隙结构，又包括纤维内部由赋形剂构成的孔径为35～40μm的二级孔隙结构。优选地，PLGA的重均分子量(Mw)为80000～200000gmol-1(例如80000、100000、120000、150000或200000gmol-1)，更优选为100000gmol-1)。本发明的低温打印方法尤其适用于重均分子量(Mw)为80000～100000gmol-1的PLGA材料，可以避免高温加热造成的材料性质改变。
请参阅图2，为根据本发明较佳实施例的组织工程软骨复合支架的制备方法流程图。通过该方法可以制备出如前所述的组织工程软骨复合支架。如图2所示，该组织工程软骨复合支架的制备方法包括以下步骤：
S1、采用医用高分子材料通过快速成型技术制备具有孔隙结构的支架本体1。该医用高分子材料包括但不限于聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)和聚醚醚酮(PEEK)等材料。快速成型技术尤其是熔融沉积成型制备的支架具有在三个维度上连通的多孔结构，通过软件可以精确的控制内部连通孔的孔隙率和孔结构，且支架制备工艺的重复性好，从而可以获得个性化的具有特定生物力学和形貌特性的组织工程支架。
S2、将骨髓间充质干细胞悬液加入水凝胶溶液中，制备水凝胶细胞混合悬液，将水凝胶细胞混合悬液滴加于支架本体1上，直至水凝胶细胞混合悬液渗透入支架本体1的孔隙结构中并覆盖支架本体1表面。水凝胶材料包括但不限于胶原、壳聚糖和PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物等材料。优选地，支架本体1和水凝胶溶液均在使用前通过Co60进行消毒。
在本发明的一个优选实施例中，采用的水凝胶为PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物。则相应的步骤S2包括：
S2-1、将PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物与磷酸缓冲盐溶液在4～6℃充分搅拌溶解后形成三嵌段共聚物溶液。其中三嵌段共聚物溶液中PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的质量分数为12％～16％(例如12％、13％、14％、15％或16％)，更优选为15％。
S2-2、将三嵌段共聚物溶液与骨髓间充质干细胞悬液在18～22℃时混合均匀形成包裹细胞的水凝胶细胞混合悬液。其中，水凝胶细胞混合悬液中骨髓间充质干细胞的细胞浓度为5×105-2×106/ml。由于PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物为温度敏感性水凝胶，所以制得的三嵌段共聚物溶液在18～22℃时为液态，可与骨髓间充质干细胞悬液混合得到水凝胶细胞悬液。
S2-3、将水凝胶细胞混合悬液滴加于支架本体上，置于离心管中，在4℃下以180～220rpm/min(例如180、190、200、210或220rpm/min)离心10～20分钟；取出离心后的支架本体置于37℃环境下，得到组织工程软骨复合支架。该步骤中可以将水凝胶细胞混合悬液200μl滴加于支架本体上，置于EP管中，在4℃下离心，直至水凝胶细胞混合悬液充分渗透入到支架本体的孔隙结构中并覆盖支架本体表面。之后置于37℃环境下，水凝胶转变成凝胶状，进而在医用高分子材料制成的三维立体的支架本体内形成水分含量较高的三维交联多孔网状结构，为骨髓间充质干细胞的生长提供环境。
在本发明的一个优选实施例中，支架本体由聚己内酯(PCL)制成。相应地，步骤S1包括：
S1-1、将聚己内酯材料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内加热至120～130℃(例如120℃、125℃或130℃)，并在600～1000kPa(600、700、800、900或1000kPa)的气压下准备打印；优选地，PCL的重均分子量(Mw)为50000～80000gmol-1，更优选为60000gmol-1。
S1-2、将纤维直径设置为300～350μm(例如300μm、310μm、320μm、330μm、340μm或350μm)，纤维间距设置为350～400μm(例如350μm、360μm、370μm、380μm、390μm或400μm)，以0.8～1mm/s(例如0.8、0.9或1mm/s)的速度打印出支架本体。
在本发明的另一个优选实施例中，支架本体由聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)制成。相应地，步骤S1包括：
S’1-1、将PLGA溶于有机溶剂中得到PLGA溶液，其中PLGA与有机溶剂的质量比为1:6～1:8(例如1:6、1:7或1:8)，在所述PLGA溶液中加入与NaCl颗粒得到打印浆料。优选地，PLGA的重均分子量(Mw)为80000～200000gmol-1(例如80000、100000、120000、150000或200000gmol-1)，更优选为100000gmol-1。PLGA与NaCl颗粒的质量比为1:1～2:1。NaCl颗粒的粒径为35～40μm，优选采用400目筛网过滤得到的直径为37μm左右的NaCl颗粒。该步骤中采用的有机溶剂优选但不限于：氯仿、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或四氢呋喃。随后，将打印浆料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内，并在室温如20～30℃(例如20、22、25、28或30℃)以及100～300kPa(例如100、150、200、250或300kPa)的气压下准备打印。
S’1-2、将纤维直径设置为200～300μm(例如200、210、230、250、280或300μm)，纤维间距设置为300～350μm(例如300、310、320、330、340或350μm)，以3～6mm/s(例如3、4、5或6mm/s)的速度打印出含有NaCl颗粒的支架本体，并通过干燥去除所述有机溶剂。优选地，可将打印出的支架本体在37℃烘箱干燥24～48h(例如24、28、30、36、40或48h)。
S’1-3、将含有氯化钠颗粒的支架本体置入水中浸泡，待氯化钠溶出后干燥得到支架本体。优选地，可将含有氯化钠颗粒的支架本体置入水中浸泡10～48h(例如10、15、20、30、40或48h)。
需要特别指出的是，本说明书的数值范围表示该数值范围的上限值、下限值以及处在该数值范围之内的任何数值或者子范围。因此，如果没有特别说明，在本说明书中涉及数值范围时就不再详细列举包含在该数值范围内的具体数值。
实施例1
1、将重均分子量(Mw)为60000gmol-1的PCL置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内加热至130℃，并在800kPa的气压下准备打印。
2、将纤维直径设置为350μm，纤维间距设置为350μm，以0.88mm/s的速度打印出圆柱形的支架本体。该圆柱形的直径为9mm，厚度为2mm。
3、将PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物与磷酸缓冲盐溶液在4℃充分搅拌溶解后形成三嵌段共聚物溶液，其中PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的质量分数为14％。本实验中PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物由中科院长春应用化学研究所合成并提供。
4、将三嵌段共聚物溶液与骨髓间充质干细胞悬液在20℃时混合均匀形成包裹细胞的水凝胶细胞混合悬液；其中，水凝胶细胞混合悬液中骨髓间充质干细胞的细胞浓度为1×106/ml。
5、将水凝胶细胞混合悬液滴加于步骤2的支架本体上，置于离心管中，在4℃以200rpm/min离心15分钟；取出离心后的支架本体置于37℃环境下，得到所述组织工程软骨复合支架。
实施例2至14
除了下表格1的内容之外，实施例2至14以与实施例1基本相同的方式进行。
实施例15
1、将重均分子量(Mw)为100000gmol-1的PLGA与氯仿按照1:7的质量比混合得到PLGA溶液，在所述PLGA溶液中加入NaCl颗粒得到打印浆料，其中PLGA与NaCl颗粒的质量比为1:1，NaCl颗粒为经过400目筛网过滤得到的NaCl颗粒。将打印浆料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内，并在室温如24℃以及200kPa的气压下准备打印。
2、将纤维直径设置为300μm，纤维间距设置为300μm，以4mm/s的速度打印出含有NaCl颗粒的圆柱形的支架本体，并在37℃烘箱干燥48h。该圆柱形的直径为9mm，厚度为2mm。
3、将含有NaCl颗粒的支架本体置入水中浸泡48h，待NaCl溶出后干燥得到支架本体。
4、将PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物与磷酸缓冲盐溶液在4℃充分搅拌溶解后形成三嵌段共聚物溶液，其中PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的质量分数为14％。
5、将三嵌段共聚物溶液与骨髓间充质干细胞悬液在20℃时混合均匀形成包裹细胞的水凝胶细胞混合悬液；其中，水凝胶细胞混合悬液中骨髓间充质干细胞的细胞浓度为1×106/ml。
6、将水凝胶细胞混合悬液滴加于支架本体上，置于离心管中，在4℃以200rpm/min离心15分钟；取出离心后的支架本体置于37℃环境下，得到所述组织工程软骨复合支架。
实施例16至24
除了下表格2的内容之外，实施例16至24以与实施例15基本相同的方式进行。
本发明选取实施例1制得的组织工程软骨复合支架，作为实验组。本发明还将等量的骨髓间充质干细胞接种于PCL支架和水凝胶上，分别作为PCL对照组和水凝胶对照组。其中PCL支架对照组采用以实施例1的方法打印的PCL支架，在该PCL支架上滴加骨髓间充质干细胞悬液。水凝胶对照组则将PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物溶于磷酸缓冲盐溶液，并与骨髓间充质干细胞悬液混合后，在37℃得到凝胶状的水凝胶。上述实验组、PCL支架对照组和水凝胶对照组以相同的条件进行体外成软骨诱导培养21天。其中使用成软骨诱导液对接种了细胞的支架进行培养。该成软骨诱导液含有：6.25μg/ml胰岛素、6.25μg/ml转铁蛋白、5.35μg/ml亚麻酸、6.25ng/ml牛血清白蛋白、6.25μg/ml亚硒酸、1mmol/L丙酮酸钠、0.17mmol/L抗坏血酸、0.1μM地塞米松、0.35mmol/L脯氨酸和10ng/ml TGFβ3。在37℃含5％CO2培养箱中培养3周，每3天换液一次。
1、大体观察结果
请参阅图3，为根据本发明的组织工程软骨复合支架经体外复合培养后的实物照片。如图3所示，实验组的骨髓间充质干细胞在经过成软骨诱导培养21天后，在支架表面形成了软骨样基质。
2、激光共聚焦结果
请参阅图4A-4F，为根据本发明的激光共聚焦显示实验组和PCL支架对照组的细胞保留度以及细胞存活情况图。其中图4A、4B和4C分别为实验组的组织工程软骨复合支架在明场、暗场和合并后的结果图；图4D、4E和4F分别为PCL支架对照组在明场、暗场和合并后的结果图。从图中可以看到，实验组的细胞存活率明显高于PCL支架对照组，这是因为在三维立体结构的PCL支架内部复合水凝胶之后，可以更好地保留细胞，并且为细胞存活提供良好的微环境。
3、CCK8检测细胞增殖结果
请参阅图5，为根据本发明的实验组、PCL支架对照组和水凝胶对照组在接种骨髓间充质干细胞，复合培养1、7、21天后的CCK8检测结果图。如图5所示，实验组制备的组织工程软骨复合支架最利于种子细胞增殖，且差异有显著性。
4、软骨相关基因表达结果
请参阅图6A-6D，为上述实验组和对照组的RT-PCR结果显示的软骨相关基因表达结果图。其中图6A为II型胶原蛋白(Col II)，图6B为丝氨酸(AGC)，图6C为I型胶原蛋白(ColI)，图6D为碱性磷酸酶(ALP)。该RT-PCR结果显示实验组的复合支架的软骨相关基因表达显著优于单纯PCL支架。
5、生物力学分析
请参阅图7，为根据本发明的实验组、PCL支架对照组和兔骨软骨栓的非限制性压缩弹性模量测试结果图。其中，兔骨软骨栓从兔子的股骨髁取下，为带有软骨和软骨下骨的圆柱形组织块，其高度约2mm，直径6mm，用于进行天然软骨和软骨下骨的机械力学测试，作为和支架力学比较的对照物。实验结果表明，骨软骨栓的弹性模量为46MPa，单纯PCL支架的弹性模量为45MPa，实验组的组织工程软骨复合支架的弹性模量为48MPa。结果表明三者均与正常兔骨软骨栓具有相似的力学特性，三组之间差异无显著性。
本发明还对通过熔融沉积打印出的PLGA支架进行了研究，其中将实施例15打印出的PLGA/NaCl复合支架，在去除NaCl之后(未复合水凝胶)标记为PN11，同样，实施例16标记为PN21，实施例18标记为PN12。并且，以常规高温熔融沉积(参数：打印温度为180℃、纤维直径为300μm以及纤维间隔为300μm)打印出的PLGA支架作为PLGA对照组。
1、大体观察结果
请参阅图8A和8B，分别为PLGA对照组和实验组PN11的实物照片。从图中可以看到，采用高温熔融沉积打印出的PLGA支架孔径较大，且出现纤维坍塌和粘连现象，同时纤维排列也不规整。而本发明通过添加赋形剂制备的PLGA/NaCl复合支架不仅成功打印出孔径适中的支架，而且纤维排布规整，外形完好。
2、电镜下观察支架的表面形貌
请参阅图9A-9D，分别对应PLGA对照组、实验组PN21、实验组PN11和实验组PN12的电镜照片。图9E-9H，分别对应PLGA对照组、实验组PN21、实验组PN11和实验组12的纤维表面放大图。从图中可以看到，虽然4组样品的纤维直径和纤维间隔均设置为300μm。但是由于打印所采用的材料成分不同，工艺不同，导致纤维形态有较大的差异。如图9a中可以看到，高温熔融沉积打印的支架纤维粗细不均，且存在粘连和孔径坍塌的现象。本发明改进后的PLGA/NaCl复合支架纤维排列规则，有利于细胞生长。如图9B至9D中所示，随着添加的NaCl比例的升高，材料的粘度降低，采用同样打印参数制备的PLGA/NaCl复合支架的纤维逐渐变细。从图9F至9H中还可以看到，PLGA/NaCl复合支架表面随着NaCl所占质量分数的増长而变得更加粗糙，且表面出现了更多微孔，这些微孔平均直径在5～10μm左右，粗糙度是因为NaCl在复合支架打印纤维内聚集所引起的，而微孔是因为部分外露的NaCl结晶溶解所致，因为NaCl结晶部分所溶解部分的质量损失与NaCl所占质量分数的比例完全吻合。PLGA对照组的质量损失相对大于添加有NaCl的PLGA/NaCl复合支架。这些表面和内部的微孔有利于营养物质运送和代谢产物排出，同时这些微孔有助于细胞贴附。此外，实验证明，PLGA对照组的降解要比PLGA/NaCl复合支架的降解更快。因此，本发明通过加入NaCl，能够有效抑制支架的降解，促使支架的降解速度与软骨修复速度相匹配。
3、力学强度测试
请参阅图10，为PLGA对照组、实验组PN21、实验组PN11和实验组PN12的抗压强度测试结果图。如图所示，实验组的PLGA/NaCl复合支架即使在去除NaCl颗粒后也具有较高的抗压强度，可达6～8MPa，明显高于PLGA对照组的2.4MPa的检测结果。并且随着NaCl比例的提高，材料的抗压强度反而增加。当PLGA/NaCl的质量比为1:2时，该抗压强度高达22MPa，并不适用于作为软骨修复支架使用，因此，软骨修复用支架最佳的PLGA/NaCl的质量比为1:1～2:1。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (1)
1.一种组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采用医用高分子材料通过快速成型技术制备具有孔隙结构的支架本体；
S2、将骨髓间充质干细胞悬液加入水凝胶溶液中，制备水凝胶细胞混合悬液，将所述水凝胶细胞混合悬液滴加于所述支架本体上，直至水凝胶细胞混合悬液渗透入所述支架本体的孔隙结构中并覆盖支架本体表面；
所述水凝胶为PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物；所述步骤S2包括：
S2-1、将PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物与磷酸缓冲盐溶液在4～6℃充分搅拌溶解后形成三嵌段共聚物溶液，其中PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物的质量分数为12％～16％；
S2-2、将三嵌段共聚物溶液与骨髓间充质干细胞悬液在18～22℃时混合均匀形成包裹细胞的水凝胶细胞混合悬液；其中，水凝胶细胞混合悬液中骨髓间充质干细胞的细胞浓度为5×105-2×106/ml；
S2-3、将所述水凝胶细胞混合悬液滴加于支架本体上，置于离心管中，在4℃以180～220rpm/min离心10～20分钟；取出离心后的支架本体置于37℃环境下，得到所述组织工程软骨复合支架；
所述支架本体由聚乳酸-羟基乙酸共聚物制成；所述步骤S1包括：
S’1-1、将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与有机溶剂以1:6～1:8的质量比混合，配置PLGA溶液，在所述PLGA溶液中加入氯化钠颗粒得到打印浆料，其中PLGA与加入的氯化钠颗粒的质量比为1:1～2:1，氯化钠颗粒的粒径为35μm～40μm；将所述打印浆料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内，并在20～30℃温度及100～300kPa的气压下准备打印；
S’1-2、将纤维直径设置为200～300μm，纤维间距设置为300～350μm，以3～6mm/s的速度打印出含有氯化钠颗粒的支架本体，并通过干燥去除所述有机溶剂；
S’1-3、将含有氯化钠颗粒的支架本体置入水中浸泡，待氯化钠溶出后干燥得到支架本体。
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