CN103877616A - 一种软骨组织工程修复支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种软骨组织工程修复支架及其制备方法，属于软骨组织修复领域。该支架包括天然高分子水凝胶和表面偶联有骨髓间充质干细胞亲和肽的脱钙骨基质，通过将骨髓间充质干细胞亲和肽偶联到脱钙骨基质表面，得到具有特异性骨髓间充质干细胞亲和能力的软骨组织工程修复支架。将其置于软骨缺损区能够募集到大量BMSC，且在该支架中天然高分子水凝胶与脱钙骨基质的配合作用下，BMSC能够长期保留在软骨缺损区，保证了软骨修复具有更长的疗效期。本发明还公开了该支架的制备方法，通过将天然高分子水凝胶溶液注射至表面偶联有骨髓间充质干细胞亲和肽的脱钙骨基质中进行凝胶化反应，得到力学强度及诱导能力均较高的支架。该方法简单，实用性高。

Description

一种软骨组织工程修复支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及软骨修复领域，特别涉及一种软骨组织工程修复支架及其制备方法。

背景技术

软骨组织工程是一种采用组织工程学方法构建透明软骨组织的技术。软骨组织工程中三大基本要素是：种子细胞，可降解的软骨组织工程修复支架以及细胞生长调节因子。对于软骨组织工程修复支架来说，由于软骨组织工程修复支架能够为软骨修复细胞的构建提供三维空间结构，利于细胞的黏附、增殖，为细胞的生长提供良好的生长环境，通常将软骨组织工程修复支架置于软骨缺损区，用于软骨缺损的填充修补，来促进软骨组织的再生修复。常用的软骨组织工程修复支架主要采用天然生物支架材料制备而成，其不仅能够促进正常细胞外基质的生成及重塑，且在生物相容性、生物降解及成软骨分化（即软骨诱导能力）方面具有不可比拟的优势。对于种子细胞来说，目前，依靠内源性细胞进行软骨修复仍是临床第一线选择。

目前，常利用微骨折手术，通过钻孔暴露软骨下骨内的骨髓，使内源性的多潜能细胞：骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells，BMSC)进入软骨缺损区进行软骨修复。该手术简单，花费较低，不涉及外源细胞，能有效缓解患者伤痛症状，使其成为临床的一线治疗方案。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：

由于软骨缺损区内BMSC较少、且BMSC不易保留在软骨缺损区，致使新生软骨组织力学强度较弱，不能应对关节应力，导致现有技术利用微骨折手术对软骨修复的疗效期短。

发明内容

为了解决现有技术软骨缺损区内BMSC较少、且BMSC不易保留在软骨缺损区的问题，本发明实施例提供了一种软骨组织工程修复支架。所述技术方案如下：

一方面，本发明实施例提供了一种软骨组织工程修复支架，所述软骨组织工程修复支架的成分包括天然高分子水凝胶和脱钙骨基质，所述脱钙骨基质表面偶联有骨髓间充质干细胞亲和肽。

作为优选，所述骨髓间充质干细胞亲和肽的纯度大于等于95%。

作为优选，所述天然高分子水凝胶为壳聚糖水凝胶。

另一方面，本发明实施例还提供了一种软骨组织工程修复支架的制备方法，所述方法包括：

制备脱钙骨基质；

将骨髓间充质干细胞亲和肽偶联到所述脱钙骨基质表面，得到骨髓间充质干细胞亲和肽修饰的脱钙骨基质；

配制天然高分子水凝胶溶液；

将所述天然高分子水凝胶溶液注射至所述骨髓间充质干细胞亲和肽修饰的脱钙骨基质中，使所述天然高分子水凝胶溶液完全渗入所述骨髓间充质干细胞亲和肽修饰的脱钙骨基质中，并在预设温度下进行凝胶化反应，得到所述软骨组织工程修复支架。

作为优选，所述天然高分子水凝胶溶液在20℃时的粘度为100-400cP。

作为优选，所述预设温度为34-38℃。

具体地，所述制备脱钙骨基质具体为：

将股骨上附着的软组织剔去，得到修整的股骨；

取所述修整的股骨的骨骺并清洗；

将所述骨骺切割成预定大小的骨块，对所述骨块进行脱脂处理；

利用EDTA脱钙技术对脱脂后的骨块进行脱钙，待所述骨块完全脱钙后，对所述骨块进行修剪、消毒，得到所述脱钙骨基质，并于4℃保存。

具体地，所述将骨髓间充质干细胞亲和肽偶联到所述脱钙骨基质表面具体为：

配制浓度为10%的己二胺的异丙醇溶液，将所述脱钙骨基质浸泡在所述己二胺的异丙醇溶液内1小时，进行胺化处理后冲洗，得到胺化处理的脱钙骨基质；

将所述胺化处理的脱钙骨基质浸泡在含双异官能团交联剂的有机溶液中，并用磷酸盐缓冲液进行冲洗，得到双异官能团交联剂功能化的脱钙骨基质；

将含有骨髓间充质干细胞亲和肽的磷酸盐缓冲液注入所述双异官能团交联剂功能化的脱钙骨基质中，室温孵育，将骨髓间充质干细胞亲和肽偶联到所述脱钙骨基质表面。

具体地，所述配制天然高分子水凝胶溶液具体为：

配制浓度为2.5%g/ml的壳聚糖的乙酸溶液，高压灭菌后于4℃保存；

配制浓度为60%的甘油磷酸钠溶液，除菌后于4℃保存；

在冰浴环境中，将所述甘油磷酸钠溶液滴加到所述壳聚糖的乙酸溶液中，搅拌至澄清，得到所述天然高分子水凝胶溶液，室温保存；

所述甘油磷酸钠溶液与所述壳聚糖的乙酸溶液的质量比为1：9。

具体地，作为优选，所述壳聚糖的脱乙酰度大于等于95%。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

本发明实施例提供了一种包括天然高分子水凝胶和表面偶联有骨髓间充质干细胞亲和肽的脱钙骨基质的软骨组织工程修复支架，通过将天然高分子水凝胶与脱钙骨基质相结合，一方面，该软骨组织工程修复支架具备了水凝胶的可塑性、粘附性和可注射性，使其具备了天然生物支架材料本身所带来的各种优势；另一方面，脱钙骨基质能够提供胶原纤维网架，赋予所制备的软骨组织工程修复支架更高的力学强度和诱导能力，进一步促进了细胞的粘附、增殖和分化。在上述软骨组织工程修复支架提供平台的基础上，本发明实施例通过将骨髓间充质干细胞亲和肽偶联到脱钙骨基质表面，得到具有特异性骨髓间充质干细胞亲和能力的软骨组织工程修复支架。将该具有特异性骨髓间充质干细胞亲和能力的软骨组织工程修复支架置于软骨缺损区，能够在软骨缺损区募集到大量BMSC，且在该软骨组织工程修复支架中天然高分子水凝胶与脱钙骨基质的配合作用下，该BMSC能够长期保留在软骨缺损区，保证了软骨修复具有更长的疗效期。

本发明实施例还提供了一种软骨组织工程修复支架的制备方法，通过将配制的天然高分子水凝胶溶液注射至表面偶联有骨髓间充质干细胞亲和肽的脱钙骨基质中，使该天然高分子水凝胶溶液完全渗入脱钙骨基质中的空隙中，并在预设温度下进行凝胶化反应，得到力学强度及诱导能力均较高，且具有在软骨缺损区募集并长期保留大量BMSC的能力的软骨组织工程修复支架。该方法简单，易操作，实用性高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的软骨组织工程修复支架的制备方法流程图；

图2是本发明又一实施例提供的软骨组织工程修复支架的制备方法流程图；

图3是本发明又一实施例提供的软骨组织工程修复支架的扫描电镜图；

图4为本发明又一实施例提供的软骨组织工程修复支架的体外募集BMSC的能力示意图；

图5为本发明又一实施例提供的软骨组织工程修复支架的体内募集BMSC的能力示意图；

图6a为利用本发明又一实施例提供的软骨组织工程修复支架体外培养BMSC四周后，该软骨组织工程修复支架内BMSC的DNA增殖表达示意图；

图6b为利用本发明又一实施例提供的软骨组织工程修复支架体外培养BMSC四周后，该软骨组织工程修复支架内BMSC的软骨糖胺多糖表达示意图；

图6c为利用本发明又一实施例提供的软骨组织工程修复支架体外培养BMSC四周后，该软骨组织工程修复支架内BMSC的羟脯氨酸表达示意图；

图6d为利用本发明又一实施例提供的软骨组织工程修复支架体外培养BMSC四周后，该软骨组织工程修复支架内聚集蛋白聚糖的实时聚合酶链反应表达示意图；

图6e为利用本发明又一实施例提供的软骨组织工程修复支架体外培养BMSC四周后，该软骨组织工程修复支架内二型胶原蛋白的实时聚合酶链反应表达示意图；

图6f为利用本发明又一实施例提供的软骨组织工程修复支架体外培养BMSC四周后，该软骨组织工程修复支架内一型胶原蛋白的实时聚合酶链反应表达示意图；

图7是本发明又一实施例提供的体内修复软骨缺损24周时，软骨组织的形态、软骨组织的核磁共振成像、软骨细胞的苏木素-伊红染色及软骨组织中蛋白聚糖的甲苯胺蓝染色示意图。

其中，1  未用E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架，

2  E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架，

3 正常软骨，

4 微骨折手术，

5  体外培养BMSC3天，

6  体外培养BMSC14天，

7  体外培养BMSC28天，

8 天然高分子水凝胶，

9 脱钙骨基质，

10 含天然高分子水凝胶和脱钙骨基质的软骨组织工程修复支架。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

实施例1

本发明实施例提供了一种软骨组织工程修复支架，该软骨组织工程修复支架的成分包括天然高分子水凝胶和脱钙骨基质，该脱钙骨基质表面偶联有骨髓间充质干细胞亲和肽。

本发明实施例提供的软骨组织工程修复支架，包括天然高分子水凝胶和表面偶联有骨髓间充质干细胞亲和肽的脱钙骨基质。通过将天然高分子水凝胶与脱钙骨基质相结合，一方面，该软骨组织工程修复支架具备了水凝胶的可塑性、粘附性和可注射性，使其具备了天然生物支架材料本身所带来的各种优势；另一方面，脱钙骨基质能够提供胶原纤维网架，赋予所制备的软骨组织工程修复支架更高的力学强度和诱导能力，进一步促进了细胞的粘附、增殖和分化。重要的是，本发明实施例通过将偶联有骨髓间充质干细胞亲和肽的软骨组织工程修复支架置于软骨缺损区，能够在软骨缺损区募集到大量BMSC，且在该软骨组织工程修复支架中天然高分子水凝胶与脱钙骨基质的配合作用下，该BMSC能够长期保留在软骨缺损区，保证了软骨修复具有更长的疗效期。

实施例2

本发明实施例提供了一种软骨组织工程修复支架，该软骨组织工程修复支架的成分包括天然高分子水凝胶和脱钙骨基质，该脱钙骨基质表面偶联有骨髓间充质干细胞亲和肽。

天然高分子水凝胶具有高含水性、可塑性及可注射性，是组织工程研究的常用材料。天然高分子水凝胶最大的优势是能使包裹的细胞维持圆球形的软骨细胞表型及不发生去分化。其能设计成液体形态使其具备可注射性，能与软骨修复细胞较好的混合，避免细胞丢失。可见，天然高分子水凝胶具备的可注射性、高粘附性，使其能够广泛应用在微创医学领域。此外，由于天然高分子水凝胶可在水中溶胀并保持大量水分而又不溶解，使得其与充盈有大量水性液体的机体组织及其相似，而且天然高分子水凝胶柔软，润湿的表面能够与组织亲和，极大减少了其对周围机体组织的刺激性，从而使其具有了良好的生物相容性。

脱钙骨基质是一种天然固态生物材料，不仅具备一定的力学强度，而且生物相容性高。发明人研究发现脱钙骨内含有的生物因子，能在不同的环境下诱导出相应的再生组织，这些特性使其在骨骼运动系统修复上有一定优势。通过严格的脱钙及脱细胞制备过程，脱钙骨基质的主要成分仅由一种胶原纤维网架构成，不具有生物毒性及免疫源性，同时能够促使各种组织细胞的粘附、增殖、分化等。虽然脱钙骨基质拥有较大的孔隙，约300～600um之间，容易造成细胞的逸漏，不利于与体内组织的粘附整合，但本发明实施例通过将一定粘度的天然高分子水凝胶溶液注入该脱钙骨基质中的孔隙内，使脱钙骨基质的孔隙内完全充满天然高分子水凝胶成分，有效避免细胞的遗漏，而且通过两者结合所制备的软骨组织工程修复支架能够与周边组织紧密粘附，从而促使软骨组织与周边组织形成整体化修复。

骨髓包括基质系统和造血系统，基质系统中含有的对造血系统起支持诱导作用、能分化成多种成熟间质细胞的非造血组织干细胞，称为骨髓间充质干细胞Bone marrow stromal cell(BMSC)。BMSC由骨前体细胞、软骨前体细胞、脂肪前体细胞、神经细胞和肌细胞前体细胞组成，因此BMSCs是由骨髓组织干细胞或前体细胞和躯体组织干细胞组成的成份及功能复杂的细胞群体。BMSC对骨髓中的造血干细胞（HSC）不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）来支持造血。基于BMSC上述优点，本发明实施例在脱钙骨基质表面偶联骨髓间充质干细胞亲和肽，来大量募集微骨折手术动员的BMSC，避免了外源性细胞的使用，同时利用该软骨组织修复支架的特性使BMSC保留在软骨缺损区，为软骨缺损区提供更多的修复细胞，有效促进软骨的修复。

作为优选，该骨髓间充质干细胞亲和肽的纯度大于等于95%。

为了提高该软骨组织修复支架在软骨缺损区募集BMSC的能力，本发明实施例优选骨髓间充质干细胞亲和肽的纯度大于等于95%。

更具体地，该骨髓间充质干细胞亲和肽为E7多肽。

作为优选，该天然高分子水凝胶为壳聚糖水凝胶。

壳聚糖是一种来源广泛，廉价易得，且具有良好的生物相容性、安全性和生物降解性的用于制备水凝胶的理想材料。壳聚糖具有温敏性，其在室温或低于室温时可保持液态较长时间，而温度升高到生理体温（37℃）后则发生凝胶化，生成水凝胶。基于此，本发明实施例优选壳聚糖水凝胶。本发明实施例通过将天然的壳聚糖水凝胶与天然固态支架结合，利用壳聚糖的温敏性，使壳聚糖溶液发生凝胶化生成壳聚糖水凝胶，制备成一种软骨组织工程固胶双相支架。这种固胶双相支架不仅能保留天然高分子水凝胶的可注射性、高含水性、粘附性、可塑性，还能利用脱钙骨基质提供的胶原纤维网架，赋予支架更高的力学强度，避免了单纯增加天然高分子水凝胶交联密度而出现的骨分化或软骨肥大，最终能够诱导出适宜的成软骨分化。

可以理解的是，该天然高分子水凝胶还可选自明胶、胶原、纤维蛋白、透明质酸盐、海藻酸盐和琼脂糖中的任意一种。

实施例3

如附图1所示，本发明实施例提供了一种软骨组织工程修复支架的制备方法，包括：

步骤101：制备脱钙骨基质。

步骤102：将骨髓间充质干细胞亲和肽偶联到脱钙骨基质表面，得到骨髓间充质干细胞亲和肽修饰的脱钙骨基质。

步骤103：配制天然高分子水凝胶溶液。

步骤104：将该天然高分子水凝胶溶液注射至骨髓间充质干细胞亲和肽修饰的脱钙骨基质中，使天然高分子水凝胶溶液完全渗入骨髓间充质干细胞亲和肽修饰的脱钙骨基质中，并在预设温度下进行凝胶化反应，得到软骨组织工程修复支架。

本发明实施例提供的软骨组织工程修复支架的制备方法，通过将配制的天然高分子水凝胶溶液注射至表面偶联有骨髓间充质干细胞亲和肽的脱钙骨基质中，使水凝胶溶液完全渗入脱钙骨基质中的空隙中，并在预设温度下进行凝胶化反应，得到力学强度及诱导能力均较高，且具有在软骨缺损区募集并长期保留大量BMSC的能力的软骨组织工程修复支架。该方法简单，易操作，实用性高。

实施例4

本发明实施例提供了一种软骨组织工程修复支架的制备方法，包括：

步骤201：制备脱钙骨基质：

将股骨上附着的软组织剔去，得到修整的股骨；

取该修整的股骨的骨骺并清洗；

将骨骺切割成预定大小的骨块，并对骨块进行脱脂处理；

利用EDTA脱钙技术对脱脂后的骨块进行脱钙，待骨块完全脱钙后，对骨块进行修剪、消毒，得到脱钙骨基质，并于4℃保存。

步骤202：将骨髓间充质干细胞亲和肽偶联到脱钙骨基质表面，得到骨髓间充质干细胞亲和肽修饰的脱钙骨基质：

配制浓度为10%的己二胺的异丙醇溶液，将所述脱钙骨基质浸泡在所述己二胺的异丙醇溶液内1小时，进行胺化处理后冲洗，得到胺化处理的脱钙骨基质；

将所述胺化处理的脱钙骨基质浸泡在含双异官能团交联剂的有机溶液中，并用磷酸盐缓冲液进行冲洗，得到双异官能团交联剂功能化的脱钙骨基质；

将含有骨髓间充质干细胞亲和肽的磷酸盐缓冲液注入所述双异官能团交联剂功能化的脱钙骨基质中，室温孵育，将骨髓间充质干细胞亲和肽偶联到所述脱钙骨基质表面。

步骤203：配制在20℃时的粘度为100～400cP的天然高分子水凝胶溶液：

配制浓度为2.5%g/ml的壳聚糖的乙酸溶液，高压灭菌后于4℃保存；

配制浓度为60%的甘油磷酸钠溶液，除菌后于4℃保存；

在冰浴环境中，将上述甘油磷酸钠溶液滴加到上述壳聚糖的乙酸溶液中，搅拌至澄清，得到天然高分子水凝胶溶液，室温保存；

其中，甘油磷酸钠溶液与壳聚糖的乙酸溶液的质量比为1：9。

为了保证天然高分子水凝胶溶液兼具较好的可注射性和粘附性，本发明实施例将该天然高分子水凝胶溶液在20℃时的粘度控制为100～400cP。此外，在配制壳聚糖的乙酸溶液时，还可选用其他弱酸溶液来溶解壳聚糖，例如，草酸、碳酸等。

作为优选，壳聚糖的脱乙酰度大于等于95%。

为了保证壳聚糖能够容易地在乙酸溶液中溶解，且保持其高分子量、高粘度的特性，从而保证所制备的软骨组织工程修复支架具有结构形态完好均一，本发明实施例将壳聚糖的脱乙酰度控制在大于等于95%，例如96%、98%等。

步骤204：将该天然高分子水凝胶溶液注射至骨髓间充质干细胞亲和肽修饰的脱钙骨基质中，使天然高分子水凝胶溶液完全渗入骨髓间充质干细胞亲和肽修饰的脱钙骨基质中，并在34-38℃下进行凝胶化反应，得到软骨组织工程修复支架。

其中，上述使天然高分子水凝胶溶液完全渗入骨髓间充质干细胞亲和肽修饰的脱钙骨基质中指的是天然高分子水凝胶溶液完全充满脱钙骨基质中任何空隙的一种理想状态。

实施例5

脱钙骨基质制备：

1)将股骨上附着的肌肉、筋膜、脂肪等软组织剔去，仅保留骨性成分。

2)将修整的股骨进行切割，选取骨骺端，利用生理盐水冲洗残留的骨髓3次。

3)将冲洗后的骨骺切割成4×4×2cm3大小的骨块，悬浸于脱脂液（甲醇∶氯仿=1:1）内，进行脱脂处理48小时。

4)脱钙液配制：用去离子水配制0.5M乙二胺四乙酸脱钙液，控制其PH=8.3，脱钙液保存及脱钙过程均在4℃下用塑料容器盛载（避免玻璃容器）。

5)生理盐水冲洗脱脂后骨块，浸泡于乙二胺四乙酸脱钙液中，脱钙液每日更换。

6)脱钙完全度检测：每日换下的脱钙液用原子吸收分光光度计检测钙离子浓度以监测脱钙进程，当脱钙液中的钙(Ca)螯合物浓度<0.5g/L，即为完全脱钙，脱钙后的标本进行x线和CT检测，证明完全脱钙。

向脱钙骨基质表面偶联骨髓间充质干细胞亲和肽：

1)采用固相法在聚乙二醇-聚苯乙烯树脂上合成E7多肽分子，利用高效液相色谱法测定E7多肽纯度，保证其纯度≥95%。

2)将脱钙骨基质修整成1×1×0.5cm³大小。

3)配制浓度为10%的己二胺的异丙醇溶液，37℃的温度下将修整后的脱钙骨基质浸泡在该溶液内1小时，进行胺化处理。

4)利用双蒸水冲洗胺化处理后的脱钙骨基质3次。

5)双异官能团交联：将10mg的双异官能团交联剂：4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠于100ul二甲基亚砜溶液内溶解，得到双异官能团交联剂溶液（该溶液需现配现用）。然后在在避光环境中，利用该双异官能团交联剂溶液浸泡上述双蒸水冲洗过的胺化后的脱钙骨基质1小时。

6)用磷酸盐缓冲（PBS）溶液配制浓度为0.1M的乙二胺四乙酸缓冲液，利用该缓冲液冲洗上述脱钙骨基质3次。

7)将E7多肽分子溶解在PBS溶液中，配制成浓度为0.1mg/ml的E7多肽的PBS溶液，并将该E7多肽的PBS溶液注入到缓冲液冲洗过的脱钙骨基质中，室温孵育2小时，使E7多肽充分偶联到脱钙骨基质的固态支架上，实现E7多肽对脱钙骨基质的表面修饰。

8)利用双蒸水冲洗修饰有E7多肽的脱钙骨基质3次，洗去脱钙骨基质表面未偶联上的E7多肽。

9)将修饰有E7多肽的脱钙骨基质冷冻干燥24小时，密封，使用前进行钴60照射消毒。

天然高分子水凝胶溶液的制备：

1)壳聚糖的乙酸溶液配制：用去离子水配制0.1M乙酸溶液，将2.5g壳聚糖颗粒加到100ml乙酸溶液内，磁力搅拌48小时至完全溶解，高压灭菌后分装4℃保存。

2)甘油磷酸钠溶液配制：去离子水配制60%甘油磷酸钠溶液，0.22um过滤除菌，4℃保存。

3)冰浴搅拌下，将质量份分别为1等份的甘油磷酸钠溶液缓慢滴加进9等份的壳聚糖的乙酸溶液内，搅拌至澄清，得到天然高分子水凝胶溶液，室温保存。

将本发明实施例制备的软骨组织工程修复支架用于软骨损伤修复中，根据经微骨折处理后的软骨缺损的大小，对E7多肽修饰的脱钙骨基质进行修剪至合适的大小，并将其填塞进软骨缺损中；随后将上述配制的天然高分子水凝胶溶液注射进该软骨缺损区内，使天然高分子水凝胶溶液渗透进脱钙骨基质中孔隙内，并完全填充整个软骨缺损区。利用体温使天然高分子水凝胶溶液发生凝胶化，最终在软骨缺损区内形成软骨组织工程修复支架。该软骨组织工程修复支架利用脱钙骨基质偶联的E7多肽特异地募集微骨折释放的内源性BMSC，并在该软骨组织工程修复支架提供的微环境中，进行新生软骨的再生，最终促进软骨修复。通过扫描电镜分别对比观察天然高分子水凝胶8、脱钙骨基质9和所制备的含天然高分子水凝胶9、脱钙骨基质9的软骨组织工程修复支架10的结构，如附图3所示，含天然高分子水凝胶8、脱钙骨基质9的软骨组织工程修复支架10有效并充分地将上述两者进行了结合，形成一体结构。该含天然高分子水凝胶8、脱钙骨基质9的软骨组织工程修复支架10不仅保留了天然高分子水凝胶的有利的微观结构，即30～70um的微孔，且利用了脱钙骨基质的300～600um的胶原蛋白网架，使该软骨组织工程修复支架有效保留大量细胞。

本发明实施例通过利用微骨折技术，在软骨损伤区内清除坏死的组织、暴露新鲜创面、动员软骨修复细胞，为该软骨组织工程修复支架提供修复空间及修复细胞。利用脱钙骨基质填塞软骨缺损，可以发挥其力学优势，使新生的修复组织具有一定的力学强度，以应对关节腔内的应力要求。另外，脱钙骨基质内含有的生物因子，能进一步诱导成软骨分化。通过脱钙骨基质表面修饰的亲和多肽，能特异性地募集骨髓来源干细胞，为软骨修复提供更多的修复细胞。利用壳聚糖溶液的温敏化，使缺损区及脱钙骨基质的孔隙内充满水凝胶成分，可以有效避免修复细胞的丢失，并且与周边组织粘附紧密，从而促使再生软骨与周围组织形成整体化修复。

实施例6

本发明实施例分别对软骨组织工程修复支架体外和体内募集BMSC的能力进行了测定，具体过程如下：

体外募集BMSC的能力：

1）在同样条件下分别制备E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架1和未用E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架2，并将两者均放入6孔板内，用磷酸盐缓冲溶液浸泡4小时，除去凝胶后残留的甘油磷酸钠。

2）吸走磷酸盐缓冲溶液，向6孔板里加入含浓度为10%的胎牛血清的MEM-α培养基(Minimum essential medium alpha medium)，每孔2ml，37℃孵育支架1小时。

3）向6孔板里添加含SD大鼠(Sprague Dawley)的骨髓间充质干细胞的α培养基1ml(3×106/ml)，细胞密度最终为1×106/ml，37℃孵箱培养。

4）培养3天后，取出上述支架，并用磷酸盐缓冲溶液冲洗2次。利用浓度为4%多聚甲醛对其进行固定，罗丹明-鬼笔环肽(160nM，2ml)避光染细胞骨架4小时。

5）磷酸盐缓冲溶液冲洗2次，利用DNA染料Hoechst33258(1:800，2ml)复染细胞核1小时。

6）磷酸盐缓冲溶液冲洗2次，激光共聚焦显微镜观测细胞分布情况。

体内募集BMSC的能力：

1）SD大鼠(400g，雄性)，动物后肢膝关节备皮，消毒，取正中切口，向外侧翻转髌骨，暴露膝关节腔。在膝关节滑车部位用3mm角膜环钻钻至钙化层，取出软骨部分。用10ml注射器针头在暴露的钙化层上穿刺，进针密度为间隔0.5mm，深度到达软骨下骨内，释放骨髓。

2）根据钻取的软骨缺损大小分别修剪E7多肽修饰的脱钙骨基质和未用E7多肽修饰的脱钙骨基质，填充软骨缺损区。

3）向脱钙骨基质及软骨缺损区内注射预制的壳聚糖溶液，关闭关节腔，体温作用15分钟。暴露关节腔，检查凝胶化程度，确定软骨组织工程修复支架成功。

4）生理盐水冲洗关节腔，关闭关节腔，缝合切口。

5）2周后处死动物，解剖取出手术膝关节。

6）按照上述体外方法进行细胞骨架及细胞核染色，利用激光聚焦显微镜对软骨缺损部位进行直接观测。

如附图4所示，E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架2比未用E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架1体外募集到更多的BMSC。其中电镜图中的灰白色区域分别代表Hoechest33258标记的细胞核、罗丹明-鬼笔环肽标记的细胞骨架和异硫氰酸荧光素标记的E7多肽。

在微骨折手术的基础上，检测软骨组织工程修复支架体内募集BMSC的能力。如附图5所示，正常软骨3的BMSC及其细胞核（Nuclei）、细胞骨架(cytoskeleton)、的分布均匀，且存在异硫氰酸荧光素标记的E7多肽（Petide-FITC）；单纯的微骨折手术4能释放一定量细胞，细胞分布不均匀；未用E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架1募集的BMSC较少，且不利于细胞动员;E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架2能在软骨缺损区募集到大量的BMSC，且细胞分布均匀，与正常软骨内的细胞分布相似。可见，E7多肽修饰后的软骨组织工程修复支架2能有效募集到大量的BMSC，同时利用该生物支架的特性使BMSC保留在缺损区，为软骨缺损区提供更多的修复细胞，从而促进软骨修复效果。

实施例7

本发明实施例分别对上述E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架和未用E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架的软骨分化诱导能力进行了测试，具体过程如下：

1)BMSC原代培养及传代：商品化SD大鼠骨髓间充质干细胞P1代（RASMX-01001，广州赛业），复苏后加入含浓度为10%的胎牛血清的MEM-α培养基（minimum essential medium），2-3天换一次液，并传一代，传至P4代进行软骨分化能力检测

2)P4代大鼠BMSC，胰酶消化，计算细胞数量，离心，用预先配制的壳聚糖溶液重悬细胞，细胞密度控制在1×107/ml。

3)将含有BMSC的壳聚糖溶液注射在E7多肽修饰的脱钙骨基质上，转移至6孔板内，37℃孵育15分钟，使壳聚糖溶液凝胶化，制成含BMSC的软骨组织工程修复支架。

4)将商品化软骨诱导培养基（RASMX-90041，广州赛业）添加到6孔板内，37℃孵箱培养，2～3天更换诱导培养液。培养4周后，收集软骨组织工程修复支架，进行软骨分化检测，包括RT-PCR(Real Time-Polymerase Chain Reaction，实时聚合酶链反应)，GAG(Glycosaminoycan，软骨糖胺多糖)的测定，HYP(Hydroxyproline，羟脯氨酸)的测定。

如附图6a所示，利用本发明实施例提供的软骨组织工程修复支架分别体外培养BMSC3天5、体外培养BMSC14天6及体外培养BMSC28天7后，相比未用E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架1，E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架2内修复细胞的增殖更明显；如附图6b所示，利用本发明实施例提供的软骨组织工程修复支架体外培养BMSC3天、14天及28天后，相比未用E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架1，E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架2产生了更多的软骨特异性细胞外基质：软骨糖胺多糖；如附图6c所示，利用本发明实施例提供的软骨组织工程修复支架体外培养BMSC的时间分别为3天、14天及28天后，相比未用E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架1，E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架2产生了更多的羟脯氨酸；如附图6d所示，利用本发明实施例提供的软骨组织工程修复支架体外培养BMSC的时间分别为14天及28天后，相比未用E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架1，E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架2产生更多的聚集蛋白聚糖；如附图6e所示，利用本发明实施例提供的软骨组织工程修复支架体外培养BMSC的时间分别为14天及28天后，相比未用E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架1，E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架2产生更多的二型胶原蛋白；如附图6f所示，利用本发明实施例提供的软骨组织工程修复支架体外培养BMSC的时间分别为14天及28天后，相比未用E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架1，E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架2有效抑制了一型胶原蛋白的表达，有利于软骨特异基因（例如，聚集蛋白聚糖，二型胶原蛋白）的上调。可见，在基因水平上，E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架2表现出更明显的软骨分化，说明BMSC亲和肽：E7多肽修饰后的软骨组织工程修复支架2能够更有效地诱导软骨分化的发生，有利于软骨基质的生成，最终促进体内软骨修复效果。

实施例8

本发明实施例对所制备的软骨组织工程修复支架体内修复软骨缺损的能力进行测试，具体过程如下：

1)膝关节软骨缺损常规微骨折手术处理，测量软骨缺损区。

2)根据软骨缺损区的大小，对E7多肽修饰的脱钙骨基质进行修剪。

3)将修整后的脱钙骨基质填塞进软骨缺损区中，利用脱钙骨基质的强度给予软骨缺损区一定的力学支持。

4)将预先配制的壳聚糖水凝胶溶液注射进软骨缺损区内，使壳聚糖水凝胶溶液渗透进脱钙骨基质中孔隙内，并完全填充整个软骨缺损区。

5)利用体温使壳聚糖水凝胶溶液发生凝胶化，在软骨缺损区内形成固胶双相的软骨组织工程修复支架。壳聚糖水凝胶溶液能有效避免修复细胞的丢失，并且与周边组织粘附紧密，从而促使再生软骨与周围组织的整合。

6)利用脱钙骨偶联的E7多肽特异性募集微骨折释放的内源性骨髓来源干细胞，在支架提供的微环境中，进行新生软骨的再生，最终促进软骨修复。

7)体内修复6月后，通过组织学及核磁共振成像检测，来判断本发明实施例制备的E7修饰的软骨组织工程修复支架的软骨修复效果。

在同样操作条件下，还对微骨折手术及未修饰E7多肽的软骨组织工程修复支架的软骨修复效果进行了测定。

如附图7所示，正常软骨3的组织，其软骨连续，有光泽。单纯的微骨折手术4术后6个月，新生软骨组织仍未能填满软骨缺损区，缺损周边有骨质的增生表现；对软骨组织的核磁共振成像（MRI）及对软骨细胞（Chondrocyte）的苏木素-伊红染色显示软骨缺损未填充，对蛋白聚糖（Proteoglycan）的甲苯胺蓝染色显示软骨缺损区修复组织内蛋白多糖的含量较低，为纤维软骨修复。使用未修饰E7多肽的软骨组织工程修复支架1在体内修复6个月后，软骨缺损有一定填充，但不完全，且表面粗糙；对软骨组织的核磁共振成像可见软骨不连续，软骨下骨有囊表；对软骨细胞的苏木素-伊红染色及对蛋白聚糖的甲苯胺蓝染色见缺损部分填充，表面不平，GAG含量低。使用E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架2于体内修复6个月后，软骨的大体形态与正常软骨相似，软骨缺损填充完全，软骨有光泽，对软骨组织的核磁共振成像可见软骨连续，软骨下骨无囊变等异常；对软骨细胞的苏木素-伊红染色及对蛋白聚糖的甲苯胺蓝染色显示缺损填充良好，与周边组织结合紧密，GAG含量接近正常软骨。

可见，本发明实施例提供的E7多肽修饰的软骨组织工程修复支架对软骨缺损进行了有效缺损，且在6个月内使受损的软骨组织达到正常软骨组织的形态和功能，对于软骨修复具有重要的意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种软骨组织工程修复支架，其特征在于，所述软骨组织工程修复支架的成分包括天然高分子水凝胶和脱钙骨基质，所述脱钙骨基质表面偶联有骨髓间充质干细胞亲和肽。

2.根据权利要求1所述的软骨组织工程修复支架，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞亲和肽的纯度大于等于95%。

3.根据权利要求1所述的软骨组织工程修复支架，其特征在于，所述天然高分子水凝胶为壳聚糖水凝胶。

4.一种权利要求1-3任一项所述的软骨组织工程修复支架的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

制备脱钙骨基质；

将骨髓间充质干细胞亲和肽偶联到所述脱钙骨基质表面，得到骨髓间充质干细胞亲和肽修饰的脱钙骨基质；

配制天然高分子水凝胶溶液；

将所述天然高分子水凝胶溶液注射至所述骨髓间充质干细胞亲和肽修饰的脱钙骨基质中，使所述天然高分子水凝胶溶液完全渗入所述骨髓间充质干细胞亲和肽修饰的脱钙骨基质中，并在预设温度下进行凝胶化反应，得到所述软骨组织工程修复支架。

5.根据权利要求4所述的软骨组织工程修复支架的制备方法，其特征在于，所述天然高分子水凝胶溶液在20℃时的粘度为100-400cP。

6.根据权利要求4所述的软骨组织工程修复支架的制备方法，其特征在于，所述预设温度为34-38℃。

7.根据权利要求4所述的软骨组织工程修复支架的制备方法，其特征在于，所述制备脱钙骨基质具体为：

将股骨上附着的软组织剔去，得到修整的股骨；

取所述修整的股骨的骨骺并清洗；

将所述骨骺切割成预定大小的骨块，对所述骨块进行脱脂处理；

利用EDTA脱钙技术对脱脂后的骨块进行脱钙，待所述骨块完全脱钙后，对所述骨块进行修剪、消毒，得到所述脱钙骨基质，并于4℃保存。

8.根据权利要求4所述的软骨组织工程修复支架的制备方法，其特征在于，所述将骨髓间充质干细胞亲和肽偶联到所述脱钙骨基质表面具体为：

配制浓度为10%的己二胺的异丙醇溶液，将所述脱钙骨基质浸泡在所述己二胺的异丙醇溶液内1小时，进行胺化处理后冲洗，得到胺化处理的脱钙骨基质；

将所述胺化处理的脱钙骨基质浸泡在含双异官能团交联剂的有机溶液中，并用磷酸盐缓冲液进行冲洗，得到双异官能团交联剂功能化的脱钙骨基质；

将含有骨髓间充质干细胞亲和肽的磷酸盐缓冲液注入所述双异官能团交联剂功能化的脱钙骨基质中，室温孵育，将骨髓间充质干细胞亲和肽偶联到所述脱钙骨基质表面。

9.根据权利要求4所述的软骨组织工程修复支架的制备方法，其特征在于，所述配制天然高分子水凝胶溶液具体为：

配制浓度为2.5%g/ml的壳聚糖的乙酸溶液，高压灭菌后于4℃保存；

配制浓度为60%的甘油磷酸钠溶液，除菌后于4℃保存；

在冰浴环境中，将所述甘油磷酸钠溶液滴加到所述壳聚糖的乙酸溶液中，搅拌至澄清，得到所述天然高分子水凝胶溶液，室温保存；

所述甘油磷酸钠溶液与所述壳聚糖的乙酸溶液的质量比为1：9。

10.根据权利要求9所述的软骨组织工程修复支架的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖的脱乙酰度大于等于95%。

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