CN110368527A - 一种温敏粘附性脱钙骨复合组织工程支架及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种温敏粘附性的组织工程材料和脱钙骨复合组织工程支架及其制备方法和应用。使用左旋多巴修饰的温敏性水凝胶制备组织工程材料和相应的复合组织工程支架，实现了多种性能的改善：1)承载大量细胞；方便共培养细胞；2)担载蛋白或者生长因子；3)增强与组织的黏附能力。使用时脱钙骨支架和水凝胶可担载不同细胞，既补偿了由于脱钙骨孔径较大而影响装载细胞数量的缺陷，又可方便实现细胞共培养，水凝胶中还可以装载蛋白和生长因子以进一步促进骨组织修复。水凝胶中左旋多巴的引入显著增强了组织工程支架与组织的粘附作用，复合支架粘附强度显著提高，达到11‑18KPa。

Description

一种温敏粘附性脱钙骨复合组织工程支架及制备方法
技术领域
本发明属于骨修复领域，具体涉及一种温敏粘附性的组织工程材料和脱钙骨复合组织工程支架及其制备方法和应用。
背景技术
创伤、感染、肿瘤、骨髓炎手术清创、以及各种先天性疾病是导致骨缺损的主要原因，目前临床上所采用的自体骨移植、异体骨移植和骨植入材料都不能达到理想的治疗效果，组织工程技术的出现为骨缺损重建提供了理想的治疗策略。
大量的骨组织工程研究表明，实现理想的骨缺损修复应满足三方面要求：1)材料能装载大量细胞。清华大学的Yaqian Li等认为有效数量的细胞装载对实现组织再生至关重要；2)材料能促进骨组织再生。大量的研究通过引入骨形态发生蛋白(BMP-2)以促进骨组织再生，然而BMP-2等细胞因子由于半衰期短，释放浓度不易控制，在体内外不能持续维持成骨环境，从而影响新骨再生。哈佛大学的David A.Weitz等研究表明构建干细胞和内皮细胞的共培养体系有利于促进碱性磷酸酶的表达，从而加速骨组织再生，通过细胞共培养从而加快骨组织再生是一种创新性很强的新技术；3)新生骨组织与周围正常软骨或者骨组织间良好的整合对于实现骨组织功能至关重要。密歇根大学的Peter X.Ma等通过凝胶材料间的结合力实现了良好的骨软骨界面整合。
脱钙骨是以胶原为主要成分，由猪或牛股骨、胫骨部位的松质骨经脱细胞、脱钙等处理获得的一类具有良好骨传导性和骨诱导活性的骨移植材料，其在骨缺损修复的治疗中发挥着重要作用。刘海峰等发明了基于脱钙骨的骨修复材料，其具备良好骨诱导和骨传导能力，并具有良好的力学性能；敖英芳等发明了具有良好生物力学强度的壳聚糖-脱钙骨复合支架，并能特异性富集骨髓间充质干细胞。
然而现有文献或专利报道的脱钙骨材料和脱钙骨复合组织工程支架仍存在以下缺陷：1)脱钙骨的孔径较大，不能够装载有效数量的细胞，2)现有脱钙骨装载细胞单一，无法进行细胞共培养从而不能加快骨组织修复，3)脱钙骨材料缺乏与周围正常组织进行整合的功能。因而仍然存在寻找新型组织工程材料和脱钙骨复合组织工程支架的需要。
发明内容
针对现有技术中组织工程材料和脱钙骨复合组织工程支架所存在的缺陷，本发明目的之一在于提供一种温敏粘附性组织工程材料，以及利用该材料制备的脱钙骨复合组织工程支架，以实现以下一种或多种性能的改善：1)承载大量细胞、方便共培养细胞；2)担载蛋白或者生长因子；3)增强与组织的黏附能力。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种组织工程材料，其包含左旋多巴(LDA)修饰的温敏性水凝胶。一种脱钙骨复合组织工程支架，其包含脱钙骨和上述组织工程材料。
作为优选，所述温敏性水凝胶可以选自温敏性聚异丙基丙烯酰胺水凝胶、温敏性聚己内酯和乙二醇嵌段共聚物水凝胶和温敏性羟丁基壳聚糖(hydroxybutyl chitosan，HBC)水凝胶中的任一种或组合；优选温敏性HBC水凝胶。
作为优选，所述羟丁基壳聚糖可以选自分子量为5-7万道尔顿的低粘度HBC、分子量为15-25万道尔顿的中粘度HBC和分子量为60-70万道尔顿的高粘度HBC中的一种或组合。
作为优选，所述左旋多巴在HBC侧链上的接枝率为5-20％。
作为优选，所述组织工程材料被注入所述脱钙骨中。
作为优选，所述脱钙骨来源于猪或牛的股骨和胫骨部位的松质骨。
作为优选，所述脱钙骨的孔径为300-600μm。
作为优选，所述脱钙骨的孔隙率为88-95％。
本发明的目的之二在于提供一种组织工程材料和脱钙骨复合组织工程支架的制备方法，本发明的组织工程材料和脱钙骨复合组织工程支架均可由所述制备方法获得。为了实现这一目的，本发明提供如下技术方案：
一种组织工程材料的制备方法，通过温敏性水凝胶与左旋多巴(LDA)反应制得。
作为优选，所述组织工程材料是由羟丁基壳聚糖(HBC)通过EDC/NHS活化作用与左旋多巴(LDA)反应制得。
其中，HBC可通过如下方法制得：将壳聚糖粉末进行碱化处理，碱化处理后加入异丙醇水溶液，待壳聚糖在异丙醇水溶液中分散均匀后加入环氧丁烷，回流反应，对产物进行透析、冻干，获得HBC。
左旋多巴修饰的温敏性羟丁基壳聚糖(hydroxybutyl chitosan-g-levodopa,HBC-g-LDA)可通过如下方法制得：将HBC溶解于去离子水中，加入EDC/NHS活化体系，再加入LDA使其在HBC侧链接枝，透析后冻干得到左旋多巴修饰的温敏性羟丁基壳聚糖(HBC-g-LDA)。
作为优选，所述组织工程材料的制备方法包含如下步骤：
a.将壳聚糖粉末进行碱化处理，碱化处理后加入异丙醇水溶液，待壳聚糖在异丙醇水溶液中分散均匀后加入环氧丁烷，回流反应，对产物进行透析、冻干，获得HBC。
b.将HBC溶解于去离子水中，加入EDC/NHS活化体系，再加入LDA使其在HBC侧链接枝，透析后冻干得到左旋多巴修饰的温敏性羟丁基壳聚糖(HBC-g-LDA)。
作为优选，所述组织工程材料的制备方法具体包含如下步骤：
a.1-3g壳聚糖粉末在氮气保护和室温下浸泡于10-30mL 50％的氢氧化钠水溶液中进行碱化处理，碱化处理6-24h后过滤除去氢氧化钠水溶液，加入10-30mL 50％的异丙醇水溶液，待壳聚糖在异丙醇水溶液中分散均匀后加入20-60mL环氧丁烷，60℃回流反应12-48h后，对产物进行透析、冻干，获得HBC。
b.将HBC溶解于去离子水中，按照摩尔比为HBC:EDC:NHS＝1:2:1加入EDC/NHS活化体系，再按照摩尔比为HBC:LDA＝1:0.05-0.2加入LDA使其在HBC侧链的接枝率为5-20％，室温下反应2-3天，透析后冻干得到左旋多巴修饰的温敏性羟丁基壳聚糖(HBC-g-LDA)。
作为优选，所述羟丁基壳聚糖是选自分子量为5-7万道尔顿的低粘度HBC、分子量为15-25万道尔顿的中粘度HBC和分子量为60-70万道尔顿的高粘度HBC中的一种或组合。
一种脱钙骨复合组织工程支架的制备方法，通过将组织工程材料注入脱钙骨孔洞中，发生溶液-凝胶转变而制得，其中，所述组织工程材料是由温敏性水凝胶与左旋多巴(LDA)反应制得。
作为优选，成胶温度为37℃。
作为优选，成胶时间为15s-2min，优选1-2min。
其中，脱钙骨可通过如下方法制备：将松质骨用1:1氯仿/甲醇溶液浸泡处理1.5h，接着2℃下用0.6mol/L的盐酸溶液软化过夜，无菌的去离子水洗至pH为7.4后，在2℃下分别用2mol/L的CaCl2水溶液、0.5mol/L的EDTA水溶液和8mol/L的LiCl水溶液各处理1h，用去离子水洗后在37℃下烘干，获得脱钙骨。
作为优选，所述脱钙骨复合组织工程支架的制备方法包含如下步骤：
a.将壳聚糖粉末进行碱化处理，碱化处理后加入异丙醇水溶液，待壳聚糖在异丙醇水溶液中分散均匀后加入环氧丁烷，回流反应，对产物进行透析、冻干，获得HBC。
b.将HBC溶解于去离子水中，加入EDC/NHS活化体系，再加入LDA使其在HBC侧链接枝，透析后冻干得到左旋多巴修饰的温敏性羟丁基壳聚糖(HBC-g-LDA)。
c.将HBC-g-LDA溶解并收集于注射器中，注入脱钙骨孔洞中。
d.将复合HBC-g-LDA的脱钙骨置于摇床中发生溶液-凝胶转变，得到温敏粘附性水凝胶脱钙骨复合组织工程支架。
作为优选，所述脱钙骨复合组织工程支架的制备方法具体包含如下步骤：
a.1-3g壳聚糖粉末在氮气保护和室温下浸泡于10-30mL 50％的氢氧化钠水溶液中进行碱化处理，碱化处理6-24h后过滤除去氢氧化钠水溶液，加入10-30mL 50％的异丙醇水溶液，待壳聚糖在异丙醇水溶液中分散均匀后加入20-60mL环氧丁烷，60℃回流反应12-48h后，对产物进行透析、冻干，获得HBC。
b.将HBC溶解于去离子水中，按照摩尔比为HBC:EDC:NHS＝1:2:1加入EDC/NHS活化体系，再按照摩尔比为HBC:LDA＝1:0.05-0.2加入LDA使其在HBC侧链的接枝率为5-20％，室温下反应2-3天，透析后冻干得到左旋多巴修饰的温敏性羟丁基壳聚糖(HBC-g-LDA)；
c.室温下将HBC-g-LDA用缓冲液或水溶解，水溶液收集于注射器中，并于室温将其缓慢注入脱钙骨孔洞中；
d.将复合HBC-g-LDA的脱钙骨置于37℃摇床中，15s-2min后水溶液发生溶液-凝胶转变，得到温敏粘附性水凝胶脱钙骨复合组织工程支架。
作为优选，所述羟丁基壳聚糖是选自分子量为5-7万道尔顿的低粘度HBC、分子量为15-25万道尔顿的中粘度HBC和分子量为60-70万道尔顿的高粘度HBC中的一种或组合；步骤c中，低粘度HBC-g-LDA溶液的质量浓度为5-7％，中粘度HBC-g-LDA溶液的质量浓度为3-5％，高粘度HBC-g-LDA溶液的质量浓度为1-3％。
本发明的目的之三在于提供上述组织工程材料和脱钙骨复合组织工程支架的应用。为了实现这一目的，本发明提供如下技术方案：
本发明的组织工程材料在制备脱钙骨复合组织工程支架中的应用。
本发明的组织工程材料在移植或骨缺损修复中的应用。
本发明的脱钙骨复合组织工程支架在移植或骨缺损修复中的应用。
本发明与现有技术相比具有如下优点和有益效果：本发明在孔径为300-600μm的脱钙骨多孔结构内部填充粘附性左旋多巴修饰的温敏性羟丁基壳聚糖(HBC-g-LDA)，由于温敏效应，其在室温保持流动状态，流动充满脱钙骨孔洞后在37℃下可成胶，形成温敏性水凝胶/脱钙骨复合支架。使用时脱钙骨支架和水凝胶可担载不同细胞，既补偿了由于脱钙骨孔径较大而影响装载细胞数量的缺陷，又可方便实现细胞共培养。除了实现共培养，水凝胶中还可以装载蛋白和生长因子以进一步促进骨组织修复。另外，水凝胶中左旋多巴的引入显著增强了组织工程支架与组织的粘附作用，实验结果显示，脱钙骨复合支架粘附强度显著提高，达到11-18KPa。本发明为理想的骨组织工程材料制备提供了一种新的思路。
附图说明
图1是按照本发明方法制备的脱钙骨复合组织工程支架的表征和实验数据图：(A)脱钙骨形貌，(B)脱钙骨扫描电镜图，(C)25℃下的HBC-g-LDA水溶液，(D)37℃下的HBC-g-LDA温敏性水凝胶，(E)25℃下将HBC-g-LDA水溶液填充脱钙骨孔洞中，(F)37℃下脱钙骨和HBC-g-LDA温敏粘附性水凝胶复合支架，(G1)37℃下HBC-g-LDA与脱钙骨复合支架粘附强度表征，(G2)37℃下HBC与脱钙骨复合支架粘附强度表征。
具体实施方式
本发明中，除非特别指明，所采用的原料和设备等均为本领域常用的，或可从市场购买获得。下面结合具体实施例详细描述本发明，应当理解的是这些实施例仅用于例证本发明，本发明并不仅局限于这些实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围之内。
实施例一：一种温敏粘附性脱钙骨复合组织工程支架制备Ⅰ
1g的低粘度壳聚糖粉末在氮气保护和室温下浸泡于10mL 50％的氢氧化钠水溶液中进行碱化处理，碱化处理6h后过滤除去氢氧化钠水溶液，加入10mL50％的异丙醇水溶液，待壳聚糖在异丙醇水溶液中分散均匀后加入20mL环氧丁烷，60℃回流反应12h后，对产物进行透析、冻干，获得低粘度HBC。低粘度HBC溶解于去离子水中，按照摩尔比为HBC:EDC:NHS＝1:2:1加入EDC/NHS活化体系，再按照摩尔比为HBC:LDA＝1:0.05加入LDA使其在HBC侧链的接枝率为5％，室温下反应2天，透析后冻干得到低粘度HBC-g-LDA；质量浓度为3％的上述低粘度HBC-g-LDA在室温下溶解于0.01M PBS，用1mL注射器收集HBC-g-LDA水溶液，并注入平均孔径为300μm的脱钙骨中，将复合HBC-g-LDA的脱钙骨置于37℃摇床，37s后水溶液发生溶液-凝胶转变，获得一种温敏粘附性脱钙骨复合组织工程支架。脱钙骨、水凝胶以及制得的组织工程支架的形貌特征如图1.A-F所示。
作为对照，还制备了未经左旋多巴修饰的HBC注入脱钙骨而成的复合支架，所述支架按如下方案制备：该对照支架采用与前述复合HBC-g-LDA的脱钙骨组织工程支架相同的方法制备，唯一的区别是低粘度的HBC未经LDA修饰。分别对复合HBC-g-LDA的组织工程支架与复合HBC的组织工程支架的粘附强度进行表征，复合HBC-g-LDA的组织工程支架的粘附强度为11KPa(图1.G1)，而复合HBC的组织工程支架几乎没有粘附强度(图1.G2)。
实施例二：一种温敏粘附性脱钙骨复合组织工程支架制备Ⅱ
1g的中粘度壳聚糖粉末在氮气保护和室温下浸泡于10mL 50％的氢氧化钠水溶液中进行碱化处理，碱化处理12h后过滤除去氢氧化钠水溶液，加入10mL50％的异丙醇水溶液，待壳聚糖在异丙醇水溶液中分散均匀后加入20mL环氧丁烷，60℃回流反应16h后，对产物进行透析、冻干，获得中粘度HBC。中粘度HBC溶解于去离子水中，按照摩尔比为HBC:EDC:NHS＝1:2:1加入EDC/NHS活化体系，再按照摩尔比为HBC:LDA＝1:0.1加入LDA使其在HBC侧链的接枝率为10％，室温下反应2天，透析后冻干得到中粘度HBC-g-LDA；质量浓度为3％的上述低粘度HBC-g-LDA在室温下溶解于0.01M PBS，用1mL注射器收集HBC-g-LDA水溶液，并注入平均孔径为500μm的脱钙骨中，将复合HBC-g-LDA的脱钙骨置于37℃摇床，32s后水溶液发生溶液-凝胶转变，获得一种温敏粘附性脱钙骨复合组织工程支架。脱钙骨、水凝胶以及制得的组织工程支架的形貌特征如图与图1.A-F类似。
作为对照，还制备了未经左旋多巴修饰的HBC注入脱钙骨而成的复合支架，所述支架按如下方案制备：该对照支架采用与前述复合HBC-g-LDA的脱钙骨组织工程支架相同的方法制备，唯一的区别是中粘度HBC未经LDA修饰。分别对复合HBC-g-LDA的组织工程支架与复合HBC的组织工程支架的粘附强度进行表征，复合HBC-g-LDA的组织工程支架的粘附强度为16KPa，而复合HBC的组织工程支架几乎没有粘附强度。
实施例三：一种温敏粘附性脱钙骨复合组织工程支架制备Ⅲ
1g的高粘度壳聚糖粉末在氮气保护和室温下浸泡于10mL 50％的氢氧化钠水溶液中进行碱化处理，碱化处理24h后过滤除去氢氧化钠水溶液，加入10mL50％的异丙醇水溶液，待壳聚糖在异丙醇水溶液中分散均匀后加入20mL环氧丁烷，60℃回流反应18h后，对产物进行透析、冻干，获得高粘度HBC。高粘度HBC溶解于去离子水中，按照摩尔比为HBC:EDC:NHS＝1:2:1加入EDC/NHS活化体系，再按照摩尔比为HBC:LDA＝1:0.15加入LDA使其在HBC侧链的接枝率为15％，室温下反应2天，透析后冻干得到高粘度HBC-g-LDA；质量浓度为2％的上述高粘度HBC-g-LDA在室温下溶解于0.01M PBS，用1mL注射器收集HBC-g-LDA水溶液，并注入平均孔径为400μm的脱钙骨中，将复合HBC-g-LDA的脱钙骨置于37℃摇床，27s后水溶液发生溶液-凝胶转变，获得一种温敏粘附性脱钙骨复合组织工程支架。脱钙骨、水凝胶以及制得的组织工程支架的形貌特征如图与图1.A-F类似。
作为对照，还制备了未经左旋多巴修饰的HBC注入脱钙骨而成的复合支架，所述支架按如下方案制备：该对照支架采用与前述复合HBC-g-LDA的脱钙骨组织工程支架相同的方法制备，唯一的区别是高粘度HBC未经LDA修饰。分别对复合HBC-g-LDA的组织工程支架与复合HBC的组织工程支架的粘附强度进行表征，复合HBC-g-LDA的组织工程支架的粘附强度为18KPa，而复合HBC的组织工程支架几乎没有粘附强度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种组织工程材料，其特征在于所述组织工程材料包含左旋多巴(LDA)修饰的温敏性水凝胶。
2.根据权利要求1所述的组织工程材料，其特征在于：所述温敏性水凝胶是选自温敏性聚异丙基丙烯酰胺水凝胶、温敏性聚己内酯和乙二醇嵌段共聚物水凝胶和温敏性羟丁基壳聚糖(hydroxybutyl chitosan，HBC)水凝胶中的任一种或组合；优选温敏性HBC水凝胶。
3.一种脱钙骨复合组织工程支架，其特征在于所述脱钙骨复合组织工程支架包含脱钙骨和如权利要求1-2任一项所述的组织工程材料。
4.一种组织工程材料的制备方法，其特征在于所述组织工程材料是由温敏性水凝胶与左旋多巴(LDA)反应制得。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述温敏性水凝胶是选自温敏性聚异丙基丙烯酰胺水凝胶、温敏性聚己内酯和乙二醇嵌段共聚物水凝胶和温敏性羟丁基壳聚糖(hydroxybutyl chitosan，HBC)水凝胶中的任一种或组合；优选温敏性HBC水凝胶。
6.一种脱钙骨复合组织工程支架的制备方法，其特征在于所述脱钙骨复合组织工程支架是通过将组织工程材料注入脱钙骨孔洞中，发生溶液-凝胶转变而制得，其中，所述组织工程材料是由温敏性水凝胶与左旋多巴(LDA)反应制得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于该方法包含如下步骤：
a.将壳聚糖粉末进行碱化处理，碱化处理后加入异丙醇水溶液，待壳聚糖在异丙醇水溶液中分散均匀后加入环氧丁烷，回流反应，对产物进行透析、冻干，获得HBC；
b.将HBC溶解于去离子水中，加入EDC/NHS活化体系，再加入LDA使其在HBC侧链接枝，透析后冻干得到左旋多巴修饰的温敏性羟丁基壳聚糖(HBC-g-LDA)；
c.将HBC-g-LDA溶解并收集于注射器中，注入脱钙骨孔洞中；
d.将复合HBC-g-LDA的脱钙骨置于摇床中发生溶液-凝胶转变，得到温敏粘附性水凝胶脱钙骨复合组织工程支架。
8.权利要求1-2任一项所述的组织工程材料在制备脱钙骨复合组织工程支架中的应用。
9.权利要求1-2任一项所述的组织工程材料在移植或骨缺损修复中的应用。
10.权利要求3所述的脱钙骨复合组织工程支架在移植或骨缺损修复中的应用。
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