CN107432955B - 用于制备生物构建体的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于制备生物构建体的试剂盒及其用途，所述试剂盒包含彼此分离的第一试剂和第二试剂，其中，所述第一试剂含有第一组分，所述第二试剂含有第二组分，并且当所述第一组分与第二组分接触时，能够产生粘连效果，实现粘合作用。此外，本发明还涉及一种用于构建生物结构或组织的方法，其包括使用本发明的试剂盒。

Description

用于制备生物构建体的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及3D生物打印领域和组织工程领域。具体而言，本发明涉及一种用于制备生物构建体的试剂盒及其用途，所述试剂盒包含彼此分离的第一试剂和第二试剂，其中，所述第一试剂含有第一组分，所述第二试剂含有第二组分，并且当所述第一组分与第二组分接触时，能够产生粘连效果，实现粘合作用。此外，本发明还涉及一种用于构建生物结构或组织的方法，其包括使用本发明的试剂盒。
背景技术
在人体组织中，细胞按照一定的规则和顺序进行排列与分布。不同功能的组织，其细胞排布不同。例如，构成上皮组织的上皮细胞呈单层紧密排列以保证其保护功能；肌细胞成条索状排列以保证其收缩功能；神经细胞间平行排列或交织成网以增强其信息传递功能等。在利用微结构或微组织构建大尺寸的生物结构或组织的过程中，细胞只有恢复正常排布，才能恢复其所处的原有微环境，进而促使细胞功能正常发挥。因此，实现对微结构的精确、有序组装、实现对细胞的精确排布是人工构建组织器官的关键。3D生物打印技术的终极目标就在于，按照目标组织的原位组成和结构，精确排布细胞，精确、有序组装微结构和微组织，从而构建复杂的三维人工组织器官。
目前，利用微结构或微组织来构建大尺寸的生物结构或组织的方法主要有两种。Y.Du等人报导了一种利用微结构或微组织的材料特性来构建大尺寸的生物结构或组织的方法，其包括：构建甲基丙烯酸化聚乙二醇微凝胶(poly(ethylene glycol)-methacrylatepolymer,PEGmA)，并将微凝胶置于矿物油中；随后，由于疏水作用，亲水性的微凝胶将在油/水界面进行组装，形成块状或条状组装体；然后，利用组装体中甲基丙烯酸基团的光敏性质，对组装体进行光交联，从而形成稳定的大尺寸结构(Y.Du,E.Lo,A.Shamsher,A.Khademhosseini.Directed assembly of cell-laden microgels for fabrication of3D tissue constructs.Proceedings of National Academy of Sciences USA,2008,150,9522-9527)。
Depeng Kou等人报导了一种利用微结构或微组织中的细胞的生长连接来构建大尺寸的生物结构或组织的方法，其包括：(1)将明胶微球和细胞共培养，以制备微组织；和(2)然后，在体外灌注培养系统中培养微组织，由此微组织中的细胞将生长并分泌细胞外基质，从而将微组织连接形成目标结构；或者，将微组织注入动物体内，进行体内培养，从而构建得到目标结构或组织(Depeng Kou,Mingchun Du,Xianglin Hou,Bing Chen,Xing Li,Yongxiang Fang,Yannan Zhao,Hong Wang,Ling Wang,Jianwu Dai.Centimeter-sizedbiomimetic bone constructs fabricated via CBD-BMP2-collagen microcarriers andBMSC-gelatin microspheres.J.Mater.Chem.B,2016,4,461-470)。
然而，上述两种构建大尺寸的生物结构或组织的方法均存在着不足。例如，在Y.Du等人报导的方法中，由于疏水作用的自发性，无法精确控制微结构的空间位置和排列方式，从而无法实现对微结构的有序组装，无法实现对细胞的精确排布。此外，在Y.Du等人报导的方法中，必须经过光交联才能保持获得的结构稳定，整个方法的时效性较差。在Depeng Kou等人报导的方法中，为了获得大尺寸的生物结构或组织，必须经过细胞培养过程，时效性差。此外，在Depeng Kou等人报导的方法中，微结构在培养和堆积过程中呈无序状态，无法精确控制微结构的空间位置和排列方式，从而无法实现对微结构的有序组装，无法实现对细胞的精确排布。
因此，现有的构建大尺寸的生物结构或组织的方法均不能实现微结构和微组织的精确、有序组装，无法快速、精确地构建具有精确的细胞排布的复杂结构或组织(例如人工组织或器官)。因此，本领域需要开发能够将微结构或微组织快速、多向、精确地组装成大尺寸的生物结构或组织的新方法，以解决上述技术问题。
发明概述
为了解决上述技术问题，本申请发明人开发了一种新的用于制备生物构建体的方法。本发明的方法能够快速地对含有细胞的结构单元进行组装，并且能够按照预设的排列结构或排列程序来对含有细胞的结构单元进行精确定位和精确排布，从而特别适合于快速、多向、精确地构建大尺寸的生物构建体(例如三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官)。此外，本申请发明人还开发了用于实施本发明方法的试剂盒。本发明的方法和试剂盒特别适合用于3D生物打印大尺寸的生物构建体(例如三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官)。
因此，在一个方面，本发明提供了一种用于制备生物构建体(例如三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官)的试剂盒，所述试剂盒包含彼此分离的第一试剂和第二试剂，其中，所述第一试剂含有第一组分，所述第二试剂含有第二组分，并且当所述第一组分与第二组分接触时，能够产生粘连效果，实现粘合作用。在本发明的某些优选实施方案中，所述第一组分与第二组分接触而产生的粘连效果可用于将两个结构单元粘合在一起，形成构建体；并且由此所获得的构建体的拉伸模量不低于10Pa(例如不低于100Pa)。进一步优选地，当结构单元中包含细胞时，结构单元中的细胞能够迁移通过粘合部位。例如，结构单元中的细胞能够迁移通过粘合部位，进入邻近的结构单元中或者更远端的结构单元中。由此，结构单元中的细胞能够在整个构建体内生长、迁移、分化和增殖。在本发明的某些优选实施方案中，所述第二试剂还含有第三组分，所述第三组分为粘性剂，例如明胶、嵌段聚合物F-127、琼脂糖、聚乙二醇、瓜尔胶、聚乙烯醇、壳聚糖、胶原、透明质酸、甲壳素、纤维素及其衍生物(例如羟丙基纤维素)、聚氨基酸、聚N-异丙基丙烯酰胺-聚乙二醇嵌段共聚物、聚乙二醇共聚物(例如聚乙烯醇-聚乙二醇共聚物)、海藻酸盐(例如海藻酸钠)、改性的海藻酸盐(例如氧化的海藻酸盐，例如氧化的海藻酸钠)、Matrigel、壳聚糖/甘油磷酸钠体系、聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)水凝胶。在本发明的某些优选实施方案中，所述试剂盒还包含含有细胞的结构单元，例如生物砖。
在另一个方面，本发明提供了一种用于制备生物构建体(例如三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官)的方法，其包括使用本发明的试剂盒。
在另一个方面，本发明提供了一种用于制备生物构建体(例如三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官)的方法，其包括下述步骤：
(1)提供一种或多种含有细胞的结构单元，其全部或者部分表面附着有第一组分；优选地，所述第一组分包含于第一试剂中；
(2)在支持物上用含有第二组分的第二试剂绘制预设的图案；其中，当所述第一组分与第二组分接触时，能够产生粘连效果，实现粘合作用；
(3)根据步骤(2)绘制的图案来放置步骤(1)中所述的结构单元，使所述结构单元表面上的第一组分与所述图案中的第二组分接触，产生粘连效果，从而将所述结构单元组装成生物构建体；
其中，任选地，所述方法还包括下述步骤：
(4)在前一步骤获得的生物构建体上，用所述第二试剂绘制预设的图案；
(5)根据前一步骤绘制的图案来放置步骤(1)中所述的结构单元，使所述结构单元表面上的第一组分与所述图案中的第二组分接触，产生粘连效果，从而将所述结构单元组装到前一步骤的生物构建体上，形成新的生物构建体；
(6)任选地，重复步骤(4)和(5)一次或多次；
从而，制备得到生物构建体。
在某些优选实施方案中，所述结构单元为生物砖。在某些优选实施方案中，所述结构单元为具有小尺寸的微结构，例如包含生物砖或者用生物砖制成的微结构。在某些优选实施方案中，利用3D生物打印机来实施本发明的方法。在某些优选实施方案中，所述生物构建体具有大尺寸，例如其具有毫米级或者厘米级或者更大的尺寸。
在另一个方面，本发明还涉及，如上所述的试剂盒用于制备生物构建体(例如三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官)的用途。
下面将结合附图和发明详述来对本发明的实施方案进行详细阐释。但是，本领域技术人员将理解，下列附图和发明详述仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和发明详述的详细公开内容，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1A-1E示意性描述了本发明的生物砖的示例性结构，其包括：细胞，其能够进行生长、增殖、分化或迁移；包裹细胞的核层，其由生物可降解材料制成，并且为细胞的生命活动提供微环境，例如营养物质；和，封装核层的壳层，由生物可降解材料制成，其为内部的核层和细胞提供力学保护，并维持生物砖的空间状态。此外，所述壳层是通透性的，具有用于生物砖内外物质交换的通道。在优选的实施方案中，细胞可均匀分散于核层中，或者可以聚集在一起，位于核层内部。
特别地，图1A示意性描述了本发明生物砖的一种结构，其包括一个核层和一个壳层，其中，所述核层包裹有细胞，并且所述壳层位于核层外侧，且封装核层。
图1B示意性描述了本发明生物砖的一种结构，其由内到外依次包含：包裹细胞的核层、封装所述核层的第一壳层、和围绕第一壳层的第二壳层。
图1C示意性描述了本发明生物砖的一种结构，其由内到外依次包含：包裹细胞的第一核层、位于第一核层外侧的包裹细胞的第二核层、和封装所述第一核层和第二核层的第一壳层。
图1D示意性描述了本发明生物砖的一种结构，其由内到外依次包含：包裹细胞的第一核层、位于第一核层外侧的包裹细胞的第二核层、封装所述第一核层和第二核层的第一壳层、和围绕第一壳层的第二壳层。
图1E示意性描述了本发明生物砖的一种结构，其由内到外依次包含：包裹细胞的第一核层、封装所述第一核层的第一壳层、包裹细胞的第二核层、和封装所述第二核层的第二壳层。
图2展示了使用本发明方法来制备条状生物构建体的示意性流程图。
图3展示了利用3D生物打印机来实施本发明方法，以制备条状生物构建体的示意性流程图。
图4展示了利用生物砖、纤维蛋白原和凝血酶来制备管状三维构建体的实验步骤和实验结果；其中，图4A显示的是，在生物砖表面附着/组装纤维蛋白原；图4B显示的是，用辅助材料构建环状辅助结构(任选的步骤)；图4C显示的是，沿环状辅助结构滴加第二试剂，绘制圆环图案；图4D显示的是，将组装单元沿圆环图案放置形成环状结构；图4E显示的是，在环状结构的上表面用第二试剂绘制圆环图案，然后将组装单元沿圆环图案放置(任选地，可以重复该步骤一次或多次，以构建含有多层结构的构建体)；图4F显示的是，构建得到的管状结构；图4G显示的是，去除辅助结构(任选的步骤)。实验结果显示，本发明的方法可用于快速、多向、精确地构建管状三维构建体。
图5展示了实施例1中刚刚制备获得的管状结构(图5A)以及经培养的管状结构(图5B)的显微镜观察结果。结果显示，在刚刚制备获得的管状结构中，生物砖尚未发生相互融合，细胞在各自的生物砖中均匀分布；而在经培养的管状结构中，生物砖已完全相互融合，紧密连接在一起，形成了完整的生物构建体。
图6展示了利用生物砖、海藻酸钠和Ca2+来制备条状三维构建体的实验步骤和实验结果；其中，图6A显示的是，表面附着/组装了第一试剂/第一组分的生物砖；图6B显示的是，用第二试剂绘制线型图案；图6C显示的是，沿线型图案放置组装单元；图6D显示的是，用组装单元构建得到的条状结构。实验结果显示，本发明的方法可用于快速、多向、精确地构建条状三维构建体。
图7展示了利用生物砖、α-氰基丙烯酸酯和含阴离子物质来制备环状三维构建体的实验步骤和实验结果；其中，图7A显示的是，表面附着/组装了第一试剂/第一组分的生物砖；图7B显示的是，用第二试剂绘制环型图案；图7C显示的是，沿环型图案放置组装单元；图7D显示的是，用组装单元构建得到的环状结构。实验结果显示，本发明的方法可用于快速、多向、精确地构建环状三维构建体。
图8展示了利用生物砖、纤维蛋白原和α-氰基丙烯酸酯来制备十字三维构建体的实验步骤和实验结果；其中，图8A显示的是，表面附着/组装了第一试剂/第一组分的生物砖；图8B显示的是，用第二试剂绘制十字型图案；图8C显示的是，沿十字型图案放置组装单元；图8D显示的是，用组装单元构建得到的十字结构。实验结果显示，本发明的方法可用于快速、多向、精确地构建十字三维构建体。
图9展示了利用生物砖、微结构、纤维蛋白原和凝血酶来制备条状结构的实验结果；其中，图9A显示了连接/组装前的两个生物砖；图9B显示了连接/组装后的两个生物砖(其构成了一个条状微结构)；图9C显示了由生物砖制备的更大尺寸的条状微结构；图9D显示了连接/组装前的两个条状微结构(其长度各自为约3mm)；图9E显示了用两个条状微结构构建得到的更大尺寸的条状结构(其长度为约6mm)；图9F显示了被提拉的条状结构(其长度为约6mm)。实验结果显示，本发明的方法能够在5s内将两个生物砖或者两个微结构连接/组装在一起，从而可用于快速、多向、精确地构建大尺寸的三维构建体。此外，实验结果还显示，所获得的条状结构即使处于提拉状态下也不会断裂分开，这表明通过本发明方法获得的三维构建体是稳固的，具有足够的力学强度。
图10展示了利用生物砖、纤维蛋白原和凝血酶制备的柱状三维构建体；该柱状三维构建体的直径为约5mm(图10A)，高度为约8mm(图10B)，并且可以在任意方向上进行进一步的精确组装，形成更大尺寸的规则或者不规则结构(图10C)。这些实验结果证实，本发明方法可以用于快速、多向、精确地构建大尺寸的三维构建体。
图11显示了经过300rpm振荡处理后的柱状三维构建体。结果显示，所制备的柱状三维构建体在经过300rpm振荡处理后仍然稳定存在，不会断裂分开。这表明，通过本发明方法获得的三维构建体是稳固的，具有足够的力学强度。
图12展示了利用生物砖、纤维蛋白原和凝血酶制备的管状三维构建体。另外，图12的实验结果还显示，在不使用纤维蛋白原或者不使用凝血酶的情况下，溶液中仅离散分布有未组装的微结构，而无法形成稳定的管状三维构建体。
发明详述
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数的指示物，除非上下文另有明确规定。此外，本文中任何提及的“或”意在包括“和/或”，除非另有说明。
如本文中所使用的，术语“生物构建体”是指，人工构建的、含有细胞的二维或三维的结构。在某些优选的实施方案中，生物构建体是三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官。
如本文中所使用的，术语“生物相容性材料”是指这样的材料，其(以及其降解产物)对于细胞是无毒性的，并且在植入宿主(例如人体)后与宿主相容，不会造成显著的或者严重的副作用，例如，不会对宿主(例如人体组织)造成毒害作用，不会引起宿主的免疫排斥反应、过敏反应或炎症反应等等。
如本文中所使用的，术语“生物可降解材料”是指这样的材料，其能够被细胞或生物体降解和吸收，并且其降解产物是生物相容性的。此类材料可以是天然来源的(例如来源于动植物)，也可以是人工合成的。
如本文中使用的，“用所述第二试剂绘制预设的图案”是指，根据预先确定的图案来排布或分布第二试剂。
如本文中使用的，“粘度”是指流体粘滞性的一种量度，是流体流动力对其内部摩擦现象的一种表示。将两块面积为1㎡的板浸于液体中,两板距离为1米,若在某一块板上加1N的切应力,使两板之间的相对速率为1m/s,则此液体的粘度为1Pa·s。
如本文中使用的，“粘性剂”是指用于调节液体或半固体(例如凝胶)的粘度的试剂。如本文中所描述的，本发明的第二试剂优选地具有适于绘制图案的粘度。因此，在某些优选实施方案中，可通过使用粘性剂来方便地调节第二试剂的粘度。
如本文中所使用的，术语“含有细胞的结构单元”是指，含有细胞的微结构(例如，微米级至毫米级的结构)，其用作基本单元，用于构建本发明的生物构建体。
如本文中所使用的，术语“生物砖”用于指本申请发明人构建的一种基本单元，其可用于多个领域，例如生物打印(如3D生物打印)、组织工程、再生医学等领域。特别地，本发明的生物砖具有特定的结构和组成，即，其包括：细胞，包裹所述细胞的核层，和，封装所述细胞和核层的壳层，其中所述核层和壳层各自由生物可降解材料制成。本发明的生物砖的示意性结构可参见图1A-1E。在本发明中，生物砖不局限于特定的形状或大小，例如，其可以是球形的，或者任何期望的形状。
如本文中使用的，术语“生物打印”是指：利用生物材料(包括但不限于，生物分子例如蛋白质，脂质，核酸和代谢产物；细胞例如细胞溶液、含细胞的凝胶、细胞悬浮液、细胞浓缩物、多细胞聚集体和多细胞体；亚细胞结构例如细胞器和细胞膜；与生物分子相关的分子例如合成的生物分子或生物分子的类似物)的打印。如本文中使用的，术语“打印”是指，按照预定的模式沉积材料的过程。在本发明中，生物打印优选地通过与自动的或半自动的、计算机辅助的三维原型装置(例如生物打印机)相匹配的方法来实现。然而，在本发明中，“打印”(例如生物打印)可通过各种方法来进行，包括但不限于，使用打印机(例如3D打印机或生物打印机)进行打印；使用自动化或非自动化机械过程(而非打印机)进行打印；通过手工放置或手工沉积(例如使用移液器)进行打印。
如本文中使用的，术语“组织”是指由形态相同或类似、机能相同的细胞群构成的细胞集合体，并且通常还包含非细胞形态的物质(称为细胞间质，例如基质、纤维等)。组织可包括一种或多种细胞。如本文中使用的，术语“器官”是指由不同的细胞和组织构成的、用于实现某一或某些特定功能的结构。器官可包括一种或多种组织。“人工组织”是指，不是通过天然组织生成或发育过程在生物体内形成的组织。人工组织可以是人为制造的组织，例如通过生物打印方法获得的组织。在本发明中，术语“人工组织”和“组织构建体”可互换使用。如本文中使用的，术语“组织前体”是指细胞集合体，其在培养、诱导或操作步骤后，能够形成组织。在本发明中，组织前体可以是人为制造的组织前体(即，人工组织前体)。
如本文中使用的，“海藻酸”是指一类由褐藻提取的多糖,其为β-1,4-D-甘露糖醛酸(M单元)和α-1,4-L-古洛糖醛酸(G单元)的无规嵌段共聚物。通常，海藻酸中的M和G单元以M-M，G-G或M-G的组合方式通过1,4糖苷键相连成为嵌段共聚物。海藻酸的实验式为(C6H8O6)n，其分子量通常为4kDa-1500kDa。如本文中使用的，“海藻酸盐”是指由海藻酸形成的盐，包括但不限于，海藻酸钠，海藻酸钙，海藻酸锶，海藻酸钡等。
如本文中使用的，“氧化的海藻酸盐”是指，对海藻酸盐(例如海藻酸钠)进行氧化反应后形成的产物。通常情况下，氧化反应将使得海藻酸盐(例如海藻酸钠)中的部分糖醛酸单元的羟基被氧化为醛基。
如本文中使用的，“G/M值”是指海藻酸、海藻酸盐或氧化的海藻酸盐中，α-1,4-L-古洛糖醛酸(G单元)和β-1,4-D-甘露糖醛酸(M单元)的摩尔比。
如本文中所使用的，术语“力学保护”是指，生物砖或其壳层具有一定的硬度和弹性模量，从而能够减少或避免其内封装的细胞遭受外界的机械损伤/力学损伤(例如，3D生物打印过程中可能产生的剪切力，挤压力等引起的损伤)。
因此，在一个方面，本发明提供了一种用于制备生物构建体(例如三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官)的试剂盒，所述试剂盒包含彼此分离的第一试剂和第二试剂，其中，所述第一试剂含有第一组分，所述第二试剂含有第二组分，并且当所述第一组分与第二组分接触时，能够产生粘连效果，实现粘合作用。
在某些优选的实施方案中，所述第一组分和/或第二组分为生物相容性材料。在某些优选的实施方案中，所述第一组分和/或第二组分为来源于生物的材料。在某些优选的实施方案中，所述第一组分和/或第二组分为生物可降解材料。
在某些优选的实施方案中，所述第一组分与第二组分在接触时能够发生强烈相互作用(例如，能够发生化学反应)，并产生粘连效果，实现粘合作用。此类粘合作用不仅能够实现细胞与细胞之间、细胞与组织之间、组织与组织之间的粘合，而且能够实现细胞/组织与外部物质之间的粘合。特别优选地，此类粘合作用具备至少一种选自以下的性质：(1)其是安全、可靠、无毒性、不致癌、不致畸、不致突变的；(2)其具有良好的生物相容性，不妨碍机体组织的自身愈合；(3)其能够在有血液和组织液的条件下使用；(4)其能够在常温、常压下实现快速粘合；(5)其具有良好的粘合强度及持久性，粘合部分具有一定的弹性和韧性；(6)其在使用过程中对机体组织无刺激性；(7)在达到粘合效果后，相关的组分能够逐渐被降解和吸收；和，(8)粘合部位能够被细胞迁移通过。
在某些优选实施方案中，所述第一组分与第二组分接触而产生的粘连效果可用于将两个结构单元粘合在一起，形成构建体；并且由此所获得的构建体的拉伸模量不低于10Pa，例如不低于20Pa，不低于30Pa，不低于40Pa，不低于50Pa，不低于60Pa，不低于70Pa，不低于80Pa，不低于90Pa，不低于100Pa，不低于200Pa，不低于300Pa，不低于400Pa，不低于500Pa，不低于600Pa，不低于700Pa，不低于800Pa，不低于900Pa，不低于1000Pa。在某些优选实施方案中，所获得的构建体的拉伸模量可达到1KPa-10Mpa，例如1-5KPa，5-10KPa，10-50KPa，50-100KPa，100-500KPa，500-1000KPa，1-5MPa，或5-10MPa。在某些优选实施方案中，当结构单元中包含细胞时，结构单元中的细胞能够迁移通过粘合部位。例如，结构单元中的细胞能够迁移通过粘合部位，进入邻近的结构单元中或者更远端的结构单元中。由此，结构单元中的细胞能够在整个构建体内生长、迁移、分化和增殖。
在某些优选的实施方案中，所述第一组分和第二组分是选自下列的组合：
(1)纤维蛋白原和凝血酶；
(2)海藻酸盐(例如海藻酸钠)或氧化的海藻酸盐(例如氧化的海藻酸钠)和含有Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+、或Fe3+的物质(例如含有Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+、或Fe3+的溶液或半固体(例如凝胶))；
(3)含马来酰亚胺基团的分子(例如含有马来酰亚胺基团的聚乙二醇(MAL-PEG))和含自由巯基的分子(例如含有自由巯基的聚乙二醇(PEG-SH))；
(4)含有阴离子的物质(例如含有阴离子的溶液或半固体(例如凝胶))和α-氰基丙烯酸酯(例如α-氰基丙烯酸甲酯，α-氰基丙烯酸乙酯，α-氰基丙烯酸异丁酯，α-氰基丙烯酸异己酯，α-氰基丙烯酸正辛酯)；
(5)纤维蛋白原和α-氰基丙烯酸酯(例如α-氰基丙烯酸甲酯，α-氰基丙烯酸乙酯，α-氰基丙烯酸异丁酯，α-氰基丙烯酸异己酯，α-氰基丙烯酸正辛酯)；
(6)血清白蛋白(例如，牛血清白蛋白)和戊二醛；
(7)含氨基甲酸酯基团(-NHCOO-)或异氰酸酯基团(-NCO)的分子(例如含氨基甲酸酯基团的聚乙二醇或含异氰酸酯基团的聚乙二醇)和含活泼氢的分子(例如含羧基的聚乙二醇)；
(8)明胶-间苯二酚和戊二醛；
(9)碳化二亚胺交联明胶和聚L-谷氨酸(PLGA)；和
(10)胺基化明胶和醛基化多糖。
应当特别指出的是，只要所述第一组分与第二组分接触时，能够产生粘连效果，实现粘合作用，即可用于实施本发明的实施方案。本发明的第一组分与第二组分并不局限于上述特定的组合。此外，当将某一组合用作第一组分和第二组分时，第一组分可以是该组合的任一成员，且第二组分是该组合的另一成员。例如，当使用纤维蛋白原和凝血酶这个组合时，第一组分可以是纤维蛋白原(此时第二组分为凝血酶)，或者可以是凝血酶(此时第二组分为纤维蛋白原)。
在某些优选的实施方案中，所述第一组分为纤维蛋白原，且第二组分为凝血酶。在某些优选的实施方案中，所述第一组分为海藻酸盐(例如海藻酸钠)或氧化的海藻酸盐(例如氧化的海藻酸钠)，且第二组分为含有Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+、或Fe3+的物质，例如含有Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+、或Fe3+的溶液或半固体(例如凝胶)。在某些优选的实施方案中，所述第一组分为含马来酰亚胺基团的分子(例如含有马来酰亚胺基团的聚乙二醇(MAL-PEG))，且第二组分为含自由巯基的分子(例如含有自由巯基的聚乙二醇(PEG-SH))。在某些优选的实施方案中，所述第一组分为含有阴离子的物质，例如含有阴离子的溶液或半固体(例如凝胶)，且第二组分为α-氰基丙烯酸酯(例如α-氰基丙烯酸甲酯，α-氰基丙烯酸乙酯，α-氰基丙烯酸异丁酯，α-氰基丙烯酸异己酯，α-氰基丙烯酸正辛酯)。在某些优选的实施方案中，所述第一组分为纤维蛋白原，且第二组分为α-氰基丙烯酸酯(例如α-氰基丙烯酸甲酯，α-氰基丙烯酸乙酯，α-氰基丙烯酸异丁酯，α-氰基丙烯酸异己酯，α-氰基丙烯酸正辛酯)。在某些优选的实施方案中，所述第一组分为血清白蛋白(例如，牛血清白蛋白)，且第二组分为戊二醛。在某些优选的实施方案中，所述第一组分为含氨基甲酸酯基团(-NHCOO-)或异氰酸酯基团(-NCO)的分子(例如含氨基甲酸酯基团的聚乙二醇或含异氰酸酯基团的聚乙二醇)，且第二组分为含活泼氢的分子(例如含羧基的聚乙二醇)。在某些优选的实施方案中，所述第一组分为明胶-间苯二酚，且第二组分为戊二醛。在某些优选的实施方案中，所述第一组分为碳化二亚胺交联明胶，且第二组分为聚L-谷氨酸(PLGA)。在某些优选的实施方案中，所述第一组分为胺基化明胶，且第二组分为醛基化多糖。
在某些优选的实施方案中，在所述第一试剂中，第一组分的浓度(按重量计)为0.01-50wt％。例如，在某些优选的实施方案中，所述第一组分的浓度(按重量计)为0.01-0.05wt％，0.05-0.1wt％，0.1-0.5wt％，0.5-1wt％，1-5wt％，5-10wt％，10-15wt％，15-20wt％，20-25wt％，25-30wt％，30-35wt％，35-40wt％，40-45wt％，或者45-50wt％。
在某些优选的实施方案中，在所述第二试剂中，第二组分的浓度(按重量计)为0.01-50wt％。例如，在某些优选的实施方案中，所述第二组分的浓度(按重量计)为0.01-0.05wt％，0.05-0.1wt％，0.1-0.5wt％，0.5-1wt％，1-5wt％，5-10wt％，10-15wt％，15-20wt％，20-25wt％，25-30wt％，30-35wt％，35-40wt％，40-45wt％，或者45-50wt％。
在某些优选的实施方案中，可通过选择第一组分和第二组分的类别和/或浓度来控制粘合作用的强度和/或持续时间。例如，当纤维蛋白原和凝血酶接触时，二者能够发生相互作用并产生力学强度较弱的纤维蛋白。因此，在某些优选的实施方案中，可将纤维蛋白原和凝血酶用作第一组分和第二组分，并且，此类试剂盒特别适合用于构建力学强度较小的组织，如弹性模量小于10MPa的组织。例如，α-氰基丙烯酸酯能够与含有阴离子的溶液发生强烈的聚合反应，生成力学强度较大的聚合物。因此，在某些优选的实施方案中，可将含有阴离子的物质和α-氰基丙烯酸酯用作第一组分和第二组分，并且，此类试剂盒特别适合用于构建力学强度较大的组织，如弹性模量大于10MPa的组织。
在某些优选的实施方案中，所述第二试剂为液体或半固体(例如凝胶)。在某些优选的实施方案中，第二试剂用于绘制/形成预设的图案。因此，特别优选地，所述第二试剂具有适当的粘度，以便其在用于绘制图案时，能够稳定维持图案的形状/模式/轮廓，而不任意流动。因此，在某些优选的实施方案中，所述第二试剂的粘度为1-1000Pa·s，例如30-160Pa·s。在某些优选的实施方案中，所述第二试剂的粘度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、50、80、100、200、300、400、500、800、或1000Pa·s。在某些优选的实施方案中，所述第二试剂的粘度为1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-12、12-14、14-16、16-18、18-20、20-25、25-30、30-50、50-80、80-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-800、或800-1000、1-3、3-8、8-16、3-10、10-20、20-50、50-160Pa·s、或30-160Pa·s。
在某些优选的实施方案中，所述第二试剂还含有第三组分，所述第三组分为粘性剂。可通过调整第三组分(粘性剂)的含量来方便地调整第二试剂的粘度，以便第二试剂能够维持特定的形状，从而适合用于绘制图案。在某些优选的实施方案中，所述第三组分为生物相容性材料。在某些优选的实施方案中，所述第三组分为来源于生物的材料。在某些优选的实施方案中，所述第三组分为生物可降解材料。在某些优选的实施方案中，所述第三组分为温敏性材料。在某些优选的实施方案中，所述温敏性材料在不同的温度下具有不同的形态。例如，所述温敏性材料(例如明胶)在较低的温度下呈固态或半固态，而在较高的温度下呈液态。在某些优选的实施方案中，所述温敏性材料的相变温度在5-40℃之间，例如5-10℃，10-15℃，15-20℃，20-25℃，25-30℃，30-35℃，35-40℃。在某些优选的实施方案中，所述温敏性材料选自明胶，聚N-异丙基丙烯酰胺-聚乙二醇嵌段共聚物，聚乙二醇共聚物(例如聚乙烯醇-聚乙二醇共聚物)，琼脂糖，Matrigel，壳聚糖/甘油磷酸钠体系，PluronicF127，和聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)水凝胶。在某些优选的实施方案中，所述第三组分(粘性剂)选自明胶、嵌段聚合物F-127、琼脂糖、聚乙二醇、瓜尔胶、聚乙烯醇、壳聚糖、胶原、透明质酸、甲壳素、纤维素及其衍生物(例如羟丙基纤维素)、聚氨基酸、聚N-异丙基丙烯酰胺-聚乙二醇嵌段共聚物、聚乙二醇共聚物(例如聚乙烯醇-聚乙二醇共聚物)、海藻酸盐(例如海藻酸钠)、改性的海藻酸盐(例如氧化的海藻酸盐，例如氧化的海藻酸钠)、Matrigel、壳聚糖/甘油磷酸钠体系、和聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)水凝胶。在某些优选的实施方案中，所述第三组分(粘性剂)为明胶。
在某些优选的实施方案中，在所述第二试剂中，第三组分的浓度(按重量计)为0.01-50wt％。例如，在某些优选的实施方案中，所述第三组分的浓度(按重量计)为0.01-0.05wt％，0.05-0.1wt％，0.1-0.5wt％，0.5-1wt％，1-5wt％，5-10wt％，10-15wt％，15-20wt％，20-25wt％，25-30wt％，30-35wt％，35-40wt％，40-45wt％，或者45-50wt％。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含含有细胞的结构单元。在某些优选的实施方案中，所述含有细胞的结构单元为具有小尺寸的微结构。在某些优选的实施方案中，所述微结构具有微米至厘米级别的尺寸，例如100μm-10cm，例如，100μm-200μm，200μm-300μm，300μm-400μm，400μm-500μm，500μm-600μm，600μm-700μm，700μm-800μm，800μm-900μm，900μm-1mm，1mm-2mm，2mm-3mm，3mm-4mm，4mm-5mm，5mm-6mm，6mm-7mm，7mm-8mm，8mm-9mm，9mm-10mm，10mm-20mm，20mm-30mm，30mm-40mm，40mm-50mm，50mm-60mm，60mm-70mm，70mm-80mm，80mm-90mm，90mm-100mm，100μm-5mm，500μm-1mm，100μm-800μm，300μm-600μm。在某些优选的实施方案中，所述微结构的尺寸可以为不超过100μm、不超过200μm、不超过500μm、不超过1mm、不超过2mm、不超过5mm、不超过1cm、不超过2cm、不超过5cm、或不超过10cm。在某些优选的实施方案中，所述微结构包含生物砖或者用生物砖制成。在某些优选的实施方案中，所述含有细胞的结构单元为生物砖。有关生物砖的详细描述可参见例如，中国专利申请201610211570.4和PCT国际申请PCT/CN2016/078678，其各自以其全文通过引用并入本文。
在某些优选的实施方案中，所述生物砖包括：细胞，包裹细胞的核层，和，封装核层的壳层，其中所述核层和壳层各自独立地由生物可降解材料制成。在本发明的某些优选实施方案中，所述核层和壳层中的生物可降解材料能够减少或避免生物砖内的细胞在操作(例如生物打印)过程中遭受机械损伤，并且能够提供物质(例如营养物质，细胞外基质，细胞因子或药物活性成分等)的可控释放，以促进细胞活性和功能(增殖、分化、迁移、分泌或新陈代谢)。在某些优选实施方案中，所述生物砖是生物打印的基本单元。在某些优选实施方案中，所述生物砖用于生物打印。
生物砖的核层提供了适合细胞粘附和伸展的空间结构和微环境，从而细胞在该结构内能够正常进行增殖、分化、迁移、分泌或新陈代谢。所述微环境指细胞所生长的环境，其包含的要素包括物理因素，比如空间结构、力学强度、温度、湿度、渗透压等；化学因素，比如酸碱度、离子浓度等；生物因素，包括细胞、细胞因子等。这些要素共同构成细胞生命活动的环境，并对在这个环境中生长的细胞的增殖、分化、迁移、分泌和新陈代谢进行动态调控。在某些实施方案中，所述核层能够为细胞的生命活动提供微环境，例如空间结构、营养物质等。优选地，所述核层各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述生物可降解材料是生物相容性的。
在本发明中，使用生物可降解材料来制备生物砖的核层是特别优选的。特别地，对于生物砖的某些用途(例如，生物打印，制备构建体，组织工程等)而言，无法降解的材料的使用是不利的。这是因为，一方面，这些无法降解的材料将被保留在所获得的构建体或人工组织中，从而限制构建体或人工组织的应用；另一方面，这些无法降解的材料将阻碍不同生物砖的细胞之间建立细胞连接，不利于构建有机的整体(例如，人工组织)。因此，生物可降解材料在核层中的使用对于利用生物砖来制备构建体、人工组织、器官是特别有利的和优选的。
在本发明的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料可以是天然存在的(例如来源于动植物的天然存在的生物可降解材料，例如胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，琼脂糖，明胶，葡聚糖，以及其任意组合)，人工合成的，重组产生的，经过改性的，或者其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的所述生物可降解材料是天然存在的生物可降解材料。优选地，所述生物可降解材料选自胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐(例如海藻酸钠)，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，琼脂糖，明胶，葡聚糖，甲壳素，纤维素(例如细菌纤维素)，蚕丝蛋白，硫酸软骨素，肝素，纤维蛋白原，纤连蛋白，粘多糖，粘液素，以及其任意组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的所述生物可降解材料是经过改性的生物可降解材料，例如经过改性的海藻酸盐，例如氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)，改性明胶(例如双醛淀粉DAS交联改性明胶)，改性纤维素(例如羧甲基纤维素，氧化再生纤维素)，以及其任意组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的所述生物可降解材料是人工合成的生物可降解材料。此类生物可降解材料包括但不限于，聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(PLA)，聚羟基乙酸(PGA)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，聚原酸酯(POE)，聚己内酯(PCL)，聚羟基丁酸酯(PHB)，聚氨基酸(例如聚赖氨酸)，可降解性聚氨酯(如淀粉改性聚氨酯)，聚羟基烷酸酯(PHAs)，聚羟基戊酸酯(PHV)，聚丁二酸丁二醇酯(PBS)，聚乙烯醇，聚对二氧环己酮，聚对二氧杂环己酮，聚二氧杂环己烷酮，聚碳酸丁二醇酯，以及其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的所述生物可降解材料包含天然存在的生物可降解材料和人工合成的生物可降解材料。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的所述生物可降解材料能够被酶(例如细胞分泌的酶)所降解。不同的生物可降解材料的降解速率差异很大，其范围可以为一个月到数年。然而在本发明中，特别优选地，用于制备核层的生物可降解材料在不超过2个月的时间内降解，例如在不超过1个月的时间内降解，例如在不超过30天、不超过25天、不超过20天、不超过15天、不超过10天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、不超过2天、或不超过1天的时间内降解。例如，用于制备核层的生物可降解材料可以在1-2天，2-3天，3-4天，4-5天，5-10天，10-15天，15-20天，20-25天，25-30天，或30-60天的时间内降解。降解速率与生物可降解材料的分子组成、分子量大小和分子排列(例如，直链或支链)密切相关。一般情况下，分子量越高、分子排列越紧密，降解时间越长。因此，核层的降解速率可通过对核层的组分和/或含量的配置来控制。例如，为了获得更快的降解速率，可使用低含量(例如低于0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％)的生物可降解材料、低分子量(例如低于500Da、1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、或10kDa)的生物可降解材料，和/或具有疏松分子排布的生物可降解材料。为了获得更慢的降解速率，可使用高含量(例如高于0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％)的生物可降解材料、高分子量(例如高于500Da、1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、或10kDa)的生物可降解材料，和/或具有紧密分子排布的生物可降解材料。另外，还可通过改变生物砖的结构(如：多层包裹、表面多孔、孔隙率大小、比表面积等)来调节生物可降解材料的降解速率。此外，生物可降解材料的降解速率还可以通过改变合成该材料的聚合方式和共聚物比例来进行调节；或者，可通过对该材料的交联来进行调节。
各种生物可降解材料是本领域技术人员已知的，并且其降解性能已被进行了广泛研究。参见例如，Alexander D.Augst,Hyun Joon Kong,David J.Mooney,AlginateHydrogels as Biomaterials,Macromol.Biosci.2006,6,623-633，其通过引用并入本文。
在某些优选的实施方案中，所述核层的降解能够提供维持或促进所述细胞的生命活动的微环境，例如营养物质。在某些优选的实施方案中，核层的降解产物为小分子化合物，例如有机酸、单糖(例如葡萄糖)、寡糖、氨基酸、脂质等。此类降解产物可参与到细胞的新陈代谢活动中，用于合成细胞外基质或转化为活动所需的能量。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料及其降解产物对于细胞是无毒的，和/或对于宿主是非免疫原性的。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料选自胶原蛋白(例如I型，II型，III型胶原蛋白)、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐(例如海藻酸钠)、氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)、淀粉、透明质酸，层粘连蛋白，弹性蛋白，明胶、葡聚糖、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、琼脂糖、可降解性聚氨酯，或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料含有细胞外基质或其类似物(例如胶原蛋白)。细胞外基质或其类似物(例如胶原蛋白)的使用能够为生物砖内的细胞的生命活动(特别是细胞的生长、粘附、伸展，以及细胞间连接的建立)提供类似于体内的有利的微环境，从而是优选的。例如，I型胶原的空间结构与细胞外基质的空间结构类似，能够为细胞生存和增殖提供类似于细胞外基质骨架结构的微环境，为细胞生物学功能的实现提供支持。因此，在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为I型胶原或者含有I型胶原。
在某些优选的实施方案中，所述核层包含I型胶原蛋白和/或海藻酸盐，例如包含I型胶原蛋白和海藻酸钠。在某些优选的实施方案中，I型胶原蛋白和海藻酸钠在核层中的重量比为约1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、3:25、1:9、1:10、1:20、1:30、或1:50。在某些优选的实施方案中，I型胶原蛋白和海藻酸钠在核层中的重量比为1:1-1:2、1:2-1:4、1:4-1:6、1:6-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、1:10-1:20、1:20-1:30、1:30-1:50、1:1-1:5、1:5-1:10、1:7-1:10、或1:8-1:9。在某些优选的实施方案中，I型胶原蛋白在核层中的重量百分比为约0.01％、0.05％、0.1％、0.125％、0.15％、0.175％、0.2％、0.25％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％。在某些优选的实施方案中，I型胶原蛋白在核层中的重量百分比为0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.125％、0.125％-0.15％、0.15％-0.175％、0.175％-0.2％、0.2％-0.25％、0.25％-0.3％、0.3％-0.4％、0.4％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、0.01％-0.1％、0.1％-0.2％、0.125％-0.175％、0.2％-0.5％、0.1％-0.5％、0.1％-1％、或0.05％-5％。在某些优选的实施方案中，海藻酸钠在核层中的重量百分比为约0.1％、0.5％、1％、1.25％、1.5％、2％、3％、4％、5％、7.5％、或10％。在某些优选的实施方案中，海藻酸钠在核层中的重量百分比为0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-1.25％、1.25％-1.5％、1.5％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-7.5％、7.5％-10％、0.1％-1％、1％-1.5％、1％-2％、0.5-2.5％、1％-3％、5-10％、或0.5-5％。
在某些优选的实施方案中，所述核层包含海藻酸钠。在某些优选的实施方案中，所述核层包含I型胶原蛋白。在某些优选的实施方案中，所述核层包含淀粉。在某些优选的实施方案中，所述核层包含可降解性聚氨酯。在某些优选的实施方案中，所述核层包含层粘连蛋白。
在某些优选的实施方案中，所述核层为凝胶状。
生物砖的壳层为包裹的细胞提供了力学保护。在某些优选的实施方案中，所述生物砖或生物砖的壳层具有一定的力学强度，从而能够实现立体堆积。在本发明中，特别优选地，生物砖及其壳层具有适当的力学保护性能(例如，具有合适的硬度和/或弹性模量)。一方面，生物砖内的细胞在操作过程中(例如，在3D打印过程中)易于因外界压力或剪切力的伤害而受损或死亡。因此，如果生物砖及其壳层的硬度和/或弹性模量太低，那么将导致生物砖内的细胞存活率在人工操作后显著下降，进而导致生物砖的应用受到限制，或者需要使用大量的细胞。另一方面，如果生物砖及其壳层的硬度和/或弹性模量太高，那么将导致生物砖内的细胞的伸展、迁移受到限制，并且阻碍不同生物砖的细胞之间建立细胞连接，不利于构建有机的整体(例如，人工组织)。因此，适当的力学保护性能不仅使得能够对本发明的生物砖进行各种操作(例如进行3D生物打印，进行生物砖的精确排布等)，而且有利于生物砖内的细胞伸展、迁移、建立细胞连接，并形成有机的构建体(例如人工组织)，因此，是特别优选的。
在某些优选的实施方案中，所述生物砖或生物砖的壳层各自独立地具有约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.3、或0.4GPa的硬度。在某些优选的实施方案中，所述生物砖或生物砖的壳层各自独立地具有0.01-0.02、0.02-0.03、0.03-0.04、0.04-0.05、0.05-0.06、0.06-0.07、0.07-0.08、0.08-0.09、0.09-0.1、0.1-0.15、0.15-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.01-0.4、0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.2、0.2-0.4、0.05-0.15、或0.06-0.1GPa的硬度。在某些优选的实施方案中，所述生物砖或生物砖的壳层具有约0.083GPa的硬度。在某些优选的实施方案中，所述生物砖或生物砖的壳层各自独立地具有约0.01、0.05、0.1、0.5、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.4、2.8、3.2、4、10、20、30、40、50、80、或100MPa的弹性模量。在某些优选的实施方案中，所述生物砖或生物砖的壳层各自独立地具有0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.5、0.5-0.8、0.8-1、1-1.2、1.2-1.4、1.4-1.6、1.6-1.8、1.8-2、2-2.4、2.4-2.8、2.8-3.2、3.2-4、4-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-80、80-100、0.5-4、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-3、0.8-1.6、1.4-2.4、0.8-3.2、0.01-100、1-100、10-100、或0.5-50MPa的弹性模量。在某些优选的实施方案中，所述生物砖或生物砖的壳层具有约1.683MPa的弹性模量。壳层的力学保护作用(例如，硬度和弹性模量)可通过对壳层的组分和/或含量的配置来控制。
在某些优选的实施方案中，所述壳层也能够为细胞的生命活动提供微环境，例如营养物质。优选地，所述壳层各自独立地由生物可降解材料制成，并且所述生物可降解材料是生物相容性的。
在本发明中，使用生物可降解材料来制备生物砖的壳层是特别优选的。特别地，对于生物砖的某些用途(例如，生物打印，制备构建体，组织工程等)而言，无法降解的材料的使用是不利的。这是因为，一方面，这些无法降解的材料将被保留在所获得的构建体或人工组织中，从而限制构建体或人工组织的应用；另一方面，这些无法降解的材料将阻碍不同生物砖的细胞之间建立细胞连接，不利于构建有机的整体(例如，人工组织)。因此，生物可降解材料在壳层中的使用对于利用生物砖来制备构建体、人工组织、器官是特别有利的和优选的。
在本发明的实施方案中，用于制备壳层的生物可降解材料可以是天然存在的(例如来源于动植物的天然存在的生物可降解材料，例如胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，琼脂糖，明胶，葡聚糖，以及其任意组合)，人工合成的，重组产生的，经过改性的，或者其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的所述生物可降解材料是天然存在的生物可降解材料。优选地，所述生物可降解材料选自胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)，淀粉，透明质酸，层粘连蛋白，琼脂糖，明胶，葡聚糖，甲壳素，纤维素(例如细菌纤维素)，蚕丝蛋白，硫酸软骨素，肝素，纤维蛋白原，纤连蛋白，粘多糖，粘液素，以及其任意组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的所述生物可降解材料是经过改性的生物可降解材料，例如经过改性的海藻酸盐，例如氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)，改性明胶(例如双醛淀粉DAS交联改性明胶)，改性纤维素(例如羧甲基纤维素，氧化再生纤维素)，以及其任意组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的所述生物可降解材料是人工合成的生物可降解材料。此类生物可降解材料包括但不限于，聚磷腈，聚丙烯酸及其衍生物(例如聚甲基丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物)，聚乳酸(PLA)，聚羟基乙酸(PGA)，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，聚原酸酯(POE)，聚己内酯(PCL)，聚羟基丁酸酯(PHB)，聚氨基酸(例如聚赖氨酸)，可降解性聚氨酯(如淀粉改性聚氨酯)，聚羟基烷酸酯(PHAs)，聚羟基戊酸酯(PHV)，聚丁二酸丁二醇酯(PBS)，聚乙烯醇，聚对二氧环己酮，聚对二氧杂环己酮，聚二氧杂环己烷酮，聚碳酸丁二醇酯，以及其任何组合。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的所述生物可降解材料包含天然存在的生物可降解材料和人工合成的生物可降解材料。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的所述生物可降解材料能够被酶(例如细胞分泌的酶)所降解。不同的生物可降解材料的降解速率差异很大，其范围可以为一个月到数年。然而在本发明中，特别优选地，用于制备壳层的生物可降解材料在不超过1个月的时间内降解，例如在不超过30天、不超过25天、不超过20天、不超过15天、不超过10天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、不超过2天、或不超过1天的时间内降解。例如，用于制备壳层的生物可降解材料可以在1-2天，2-3天，3-4天，4-5天，5-10天，10-15天，15-20天，20-25天，或25-30天的时间内降解。特别优选地，用于制备壳层的生物可降解材料在不超过10天的时间内降解。降解速率与生物可降解材料的分子组成、分子量大小和分子排列(例如，直链或支链)密切相关。一般情况下，分子量越高、分子排列越紧密，降解时间越长。因此，壳层的降解速率可通过对壳层的组分和/或含量的配置来控制。例如，为了获得更快的降解速率，可使用低含量(例如低于0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％)的生物可降解材料、低分子量(例如低于500Da、1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、或10kDa)的生物可降解材料，和/或具有疏松分子排布的生物可降解材料。为了获得更慢的降解速率，可使用高含量(例如高于0.5％、1％、2％、3％、4％、或5％)的生物可降解材料、高分子量(例如高于500Da、1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、或10kDa)的生物可降解材料，和/或具有紧密分子排布的生物可降解材料。另外，还可通过改变生物砖的结构(如：多层包裹、表面多孔、孔隙率大小、比表面积等)来调节生物可降解材料的降解速率。此外，生物可降解材料的降解速率还可以通过改变合成该材料的聚合方式和共聚物比例来进行调节；或者，可通过对该材料的交联来进行调节。此外，用于制备壳层的生物可降解材料的降解速率还可受细胞生命活动的影响。
在本发明中，特别优选的是，生物砖内的细胞能够生长、伸展、增殖、迁移，并与其他生物砖内的细胞建立细胞连接，形成有机的构建体(例如人工组织)。因此，在某些优选的实施方案中，所述生物砖的壳层在相对短的时间(例如不超过30天的时间内，例如不超过10天的时间内)降解，以促进不同生物砖之间的细胞连接的建立，避免因壳层的存在而阻碍或影响不同生物砖之间的细胞建立相互的细胞连接。在某些优选的实施方案中，所述生物砖的壳层在不超过30天、不超过25天、不超过20天、不超过15天、不超过10天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、不超过2天、或不超过1天的时间内降解。例如，所述生物砖的壳层可以在1-2天，2-3天，3-4天，4-5天，5-10天，10-15天，15-20天，20-25天，或25-30天的时间内降解。
各种生物可降解材料是本领域技术人员已知的，并且其降解性能已被进行了广泛研究。参见例如，Alexander D.Augst,Hyun Joon Kong,David J.Mooney,AlginateHydrogels as Biomaterials,Macromol.Biosci.2006,6,623-633，其通过引用并入本文。
在某些优选的实施方案中，所述壳层的降解能够提供维持或促进所述细胞的生命活动的微环境，例如营养物质。在某些优选的实施方案中，壳层的降解产物为小分子化合物，例如有机酸、单糖(例如葡萄糖)、寡糖、氨基酸、脂质等。此类降解产物可参与到细胞的新陈代谢活动中，用于合成细胞外基质或转化为活动所需的能量。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的生物可降解材料及其降解产物对于细胞是无毒的，和/或对于宿主是非免疫原性的。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的生物可降解材料含有细胞外基质或其类似物(例如弹性蛋白)。细胞外基质或其类似物(例如弹性蛋白)的使用能够为生物砖内的细胞的生命活动(特别是细胞的生长、粘附、伸展，以及细胞间连接的建立)提供类似于体内的有利的微环境，从而是优选的。
在某些优选的实施方案中，用于制备壳层的生物可降解材料选自胶原蛋白(例如I型，II型，III型胶原蛋白)、纤维蛋白、壳聚糖、海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)、氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)、淀粉、透明质酸，层粘连蛋白，弹性蛋白，明胶、葡聚糖、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、琼脂糖，或其任何组合。
在某些优选的实施方案中，所述壳层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)，例如包含海藻酸钙和明胶，任选地还包含弹性蛋白。
在某些优选的实施方案中，所述壳层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和明胶。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和明胶在壳层中的重量比为约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和明胶在壳层中的重量比为10:1-9:1、9:1-8:1、8:1-7:1、7:1-6:1、6:1-5:1、5:1-4:1、4:1-3:1、3:1-2:1、2:1-1:1、1:1-1:2、1:2-1:3、1:3-1:4、1:4-1:5、1:5-1:6、1:6-1:7、1:7-1:8、1:8-1:9、1:9-1:10、10:1-5:1、5:1-1:1、1:1-1:5、1:5-1:10、2:1-1:2、4:1-1:4、或10:1-1:10。在某些优选的实施方案中，所述壳层还包含弹性蛋白。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和弹性蛋白在壳层中的重量比为约1000:1、500:1、400:1、300:1、250:1、200:1、100:1、50:1或10:1。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和弹性蛋白在壳层中的重量比为10:1-50:1、50:1-100:1、100:1-200:1、200:1-250:1、250:1-300:1、300:1-400:1、400:1-500:1、500:1-1000:1、10:1-100:1、100:1-200:1、200:1-300:1、300:1-400:1、400:1-1000:1、或100:1-500:1。在某些优选的实施方案中，明胶和弹性蛋白在壳层中的重量比为约1000:1、500:1、400:1、300:1、250:1、200:1、100:1、50:1或10:1。在某些优选的实施方案中，明胶和弹性蛋白在壳层中的重量比为10:1-50:1、50:1-100:1、100:1-200:1、200:1-250:1、250:1-300:1、300:1-400:1、400:1-500:1、500:1-1000:1、10:1-100:1、100:1-200:1、200:1-300:1、300:1-400:1、400:1-1000:1、或100:1-500:1。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)、明胶和弹性蛋白在壳层中的重量比为约250:250:1。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)在壳层中的重量百分比为约0.1％、0.5％、1％、1.25％、1.5％、2％、3％、4％、5％、7.5％、或10％。在某些优选的实施方案中，海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)在壳层中的重量百分比为0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-1.25％、1.25％-1.5％、1.5％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-7.5％、7.5％-10％、0.1％-1％、1％-1.5％、1％-2％、0.5-2.5％、1％-3％、5-10％、或0.5％-5％。在某些优选的实施方案中，明胶在壳层中的重量百分比为约0.1％、0.5％、1％、1.25％、1.5％、2％、3％、4％、5％、7.5％、或10％。在某些优选的实施方案中，明胶在壳层中的重量百分比为0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-1.25％、1.25％-1.5％、1.5％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-7.5％、7.5％-10％、0.1％-1％、1％-1.5％、1％-2％、0.5-2.5％、1％-3％、5-10％、或0.5％-5％。在某些优选的实施方案中，弹性蛋白在壳层中的重量百分比为约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.1％、0.15％、0.2％、或0.5％。在某些优选的实施方案中，弹性蛋白在壳层中的重量百分比为0.01％-0.02％、0.02％-0.03％、0.03％-0.04％、0.04％-0.05％、0.05％-0.06％、0.06％-0.07％、0.07％-0.08％、0.08％-0.1％、0.1％-0.15％、0.15％-0.2％、0.2％、0.2％-0.5％、0.01％-0.03％、0.03％-0.05％、0.05％-0.08％、0.08％-0.15％、0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.03％-0.07％、0.04％-0.06％、0.01％-0.1％、0.1％-0.5％、或0.01％-0.5％。
在某些优选的实施方案中，所述壳层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)，例如包含海藻酸钙和明胶，任选地还包含弹性蛋白。在某些优选的实施方案中，所述壳层包含氧化海藻酸盐(例如氧化海藻酸钠)。在某些优选的实施方案中，所述壳层包含海藻酸盐(例如海藻酸钠或海藻酸钙)和琼脂糖。
在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的分子量为4kDa-1500kDa。在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的分子量为4-10kDa、10-20kDa、20-30kDa、30-40kDa、40-50kDa、50-60kDa、60-70kDa、70-80kDa、80-90kDa、90-100kDa、100-200kDa、200-300kDa、300-400kDa、400-500kDa、500-600kDa、700-800kDa、800-900kDa、900-1000kDa、1100-1200kDa、1200-1300kDa、1300-1400kDa、或1400-1500kDa。在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的分子量为32k-250k Da。
在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的G/M值为0.2-5。在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的G/M值为0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、0.9-1.0、1.0-1.5、1.5-2.0、2.0-2.5、2.5-3.0、3.0-3.5、3.5-4.0、4.0-4.5、或4.5-5.0。在某些优选的实施方案中，包含于所述至少一个壳层中的海藻酸盐的G/M值为0.2-2.5。
在某些优选的实施方案中，用于制备所述至少一个壳层的海藻酸盐的粘度为100-3000mPa·s。在某些优选的实施方案中，用于制备所述至少一个壳层的海藻酸盐的粘度为100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2700、2700-2800、2800-2900、或2900-3000mPa·s。在某些优选的实施方案中，用于制备所述至少一个壳层的海藻酸盐的粘度为200-2000mPa·s。
在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层在不超过28天的时间内完全降解。在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层在不超过21天、不超过14天、不超过12天、不超过10天、不超过9天、不超过8天、不超过7天、不超过6天、不超过5天、不超过4天、不超过3天、或不超过2天的时间内完全降解。在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层在2-5天，2-6天，2-8天，2-10天，2-12天，或2-14天内完全降解。
在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层的粘度为100-3000mPa·s。在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层的粘度为100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000、2000-2100、2100-2200、2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2700、2700-2800、2800-2900、或2900-3000mPa·s。在某些优选的实施方案中，所述至少一个壳层的粘度为200-2000mPa·s。
在某些优选的实施方案中，用于制备核层和壳层的生物可降解材料可以是相同的或不同的。然而，特别优选地，根据其预期的目的，核层和壳层具有不同的组成。不拘于理论限制，通常认为，壳层提供了主要的力学保护作用，而核层则提供了细胞生命活动所需的主要的营养成分和微环境。因此，在某些优选的实施方案中，与壳层相比，核层具有更多的营养物质。在某些优选的实施方案中，与核层相比，壳层具有较低的降解速率，但具有更高的硬度和/或弹性模量。在某些优选的实施方案中，壳层中不包含细胞。
因此，在某些优选的实施方案中，核层和壳层由不同的生物可降解材料制成。例如，在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为，海藻酸钠和任选的I型胶原；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为，海藻酸钠和任选的弹性蛋白。在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为淀粉；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为海藻酸钠。在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为I型胶原；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为聚赖氨酸。在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为I型胶原；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为海藻酸钠。在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为聚氨酯；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为海藻酸钠。在某些优选的实施方案中，用于制备核层的生物可降解材料为海藻酸钠；并且，用于制备壳层的生物可降解材料为聚赖氨酸。
在某些优选的实施方案中，核层和壳层分别以不同的重量比包含相同的生物可降解材料。换言之，核层和壳层可以由相同的生物可降解材料制成，但以不同的重量比包含生物可降解材料。例如，在某些优选的实施方案中，核层和壳层均由海藻酸钠制成；但核层包含不超过2％(例如1.5％)的海藻酸钠，而壳层包含超过4％(例如5％)的海藻酸钠。不超过2％(例如1.5％)的海藻酸钠能够为细胞在核层中的生长、增殖、分化或迁移提供优良的条件(通常，细胞难以在超过2％的海藻酸钠的条件下生长和存活)；而超过4％(例如5％)的海藻酸钠则能够为壳层提供足够的硬度和弹性。
在某些优选的实施方案中，所述核层和壳层包含选自下述的组合：
核层材料 壳层材料
组合1 I型胶原 海藻酸钠
组合2 I型胶原 氧化海藻酸钠
组合3 I型胶原 海藻酸钠+氧化海藻酸钠(二者浓度比为9:1)
组合4 I型胶原 海藻酸钠+氧化海藻酸钠(二者浓度比为7:3)
组合5 层粘连蛋白 海藻酸钠+琼脂糖(二者浓度比为8:2)
组合6 淀粉 氧化海藻酸钠
组合7 淀粉 海藻酸钠+氧化海藻酸钠(二者浓度比为7:3)
组合8 可降解聚氨酯 氧化海藻酸钠
组合9 可降解聚氨酯 海藻酸钠+氧化海藻酸钠(二者浓度比为9:1)
组合10 可降解聚氨酯 海藻酸钠+明胶(二者浓度比为85:15)
在某些优选的实施方案中，所述壳层各自独立地是通透性的。例如，所述壳层对于水，氧气，和营养物质(糖类例如葡萄糖，脂肪，蛋白质，氨基酸，短肽，矿物质，维生素、细胞因子、核苷酸等)是通透性的。
一般认为，半通透的(即，选择通透的)壳层的使用可能是有利的，因为其能够使得水，氧气，葡萄糖，矿物质，和氨基酸等营养物质透过壳层，进入核层，并提供给细胞，并且能够阻止对细胞有害的物质(例如来自宿主免疫系统的抗体蛋白)进入核层。然而，在本发明的生物砖中，通透性壳层的使用是优选的和有利的。特别地，通透性的壳层使得各种营养物质(包括大分子和小分子营养物质，例如葡萄糖，脂肪，蛋白质，氨基酸，短肽，矿物质，维生素、细胞因子、核苷酸等)能够更加容易、顺畅地进行交换，避免局部区域的细胞无法获得充足的营养物质。例如，当使用本发明的生物砖构建大尺寸的人工组织时，通透性的壳层将能够促进各种营养物质的交换，促进人工组织内部/核心区域的生物砖内的细胞获得充足的营养物质。此外，通透性的壳层有利于不同生物砖之间的细胞进行信号传递和建立细胞连接。特别地，细胞在生长过程中会分泌多种物质(包括细胞外基质的某些组分和多种信号分子)，与邻近的、甚至远端的细胞进行信号传递和/或物质交流，并由此对细胞自身的生命活动以及邻近的、甚至远端的细胞的生命活动产生影响或进行调控。因此，如果使用选择通透性的壳层的话，那么细胞之间的信号传递和/或物质交流将有可能受到影响/阻碍，例如细胞分泌的某些大分子信号物质(例如细胞因子蛋白)可能无法透过壳层，从而可能阻碍不同生物砖之间的细胞信号的传递和细胞连接的建立，不利于构建有机的整体(例如，人工组织)。因此，通透性壳层的使用对于本发明的生物砖而言是优选的。在本发明中，表述“通透性壳层”意指，各种小分子和大分子物质(例如蛋白质)能够自由通过壳层。例如，在某些优选的实施方案中，所述壳层对于分子量在5000kDa以下的分子是通透的。例如，在某些实施方案中，所述壳层对于分子量在200kDa以下或分子量在200kDa-300kDa、300kDa-400kDa、400kDa-500kDa、500kDa-800kDa、800kDa-1000kDa、1000kDa-1500kDa、1500kDa-2000kDa、2000kDa-3000kDa、3000kDa-4000kDa或4000kDa-5000kDa范围内的分子是通透的。在某些实施方案中，所述壳层对于免疫球蛋白(例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE)是通透的。
在某些优选的实施方案中，所述壳层各自独立地具有用于生物砖内外物质交换的通道或孔。在某些优选的实施方案中，营养物质(糖类例如葡萄糖，脂肪，蛋白质，氨基酸，短肽，矿物质，维生素、细胞因子、核苷酸等)通过所述通道或孔扩散进入所述生物砖内。在某些优选的实施方案中，所述通道的直径为至少10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、或500nm。在某些优选的实施方案中，所述通道的直径为例如1nm-5μm；10nm-2μm；100nm-1μm；200-800nm等。在某些优选的实施方案中，所述孔的直径为至少100、200、400、600、800、1000、1500、2000、4000、或5000nm。
本发明的生物砖的壳层的厚度可以根据实际需要进行选择，而不受特别限制。例如，本发明生物砖的壳层的厚度各自独立地可以为1-20μm，例如5-15μm，例如8-12μm。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖的壳层的厚度各自独立地可以为约0.1、0.5、1、2、5、10、15、20、25、30、或50μm。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖的壳层的厚度各自独立地可以为0.1-0.5、0.5-1、1-2、2-5、5-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、0.1-1、1-5、1-10、5-10、10-20、10-30、5-20、或1-20μm。
在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖的壳层不包含细胞。
本发明生物砖的核层所包含的细胞的数量可以根据实际需要进行选择，而不受特别限制。例如，本发明生物砖的核层各自独立地可以包含1-106个细胞，例如10-900、20-800、30-700、40-600、50-500、60-400、70-300、80-200、10-100个、10-103个、10-104个、10-105个、10-106个细胞。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的核层各自独立地包含至少1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、或106个细胞。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的核层各自独立地可以包含1-2、2-4、4-6、6-8、8-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200、200-300、300-400、400-500、500-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-104、104-2x104、2x104-3x104、3x104-4x104、4x104-5x104、5x104-105、105-2x105、2x105-3x105、3x105-4x105、4x105-5x105、5x105-106、1-10、2-10、2-5、5-10、10-20、20-30、30-50、2-25、25-50、2-50、50-100、100-200、50-250、250-500、500-2000、2-100、2-500、或2-2000个细胞。
不受理论限制，本发明的生物砖可以包含任何种类和类型的细胞。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或更多种类型的细胞。例如，所述细胞可以为细菌、酵母、植物细胞或动物细胞，例如哺乳动物细胞，优选人细胞。优选地，所述细胞为粘附细胞，例如分化的粘附细胞或未分化的粘附细胞。优选地，所述细胞为多能干细胞。在某些优选的实施方案中，所述粘附细胞来源于选自下述的组织：结缔组织(例如，疏松结缔组织、致密结缔组织、弹性组织、网状结缔组织和脂肪组织)、肌肉组织(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖组织、胃肠组织、肺组织、骨组织、神经组织和上皮组织(例如，单层上皮和复层上皮)、内胚层来源的组织、中胚层来源的组织和外胚层来源的组织。
在某些优选的实施方案中，所述粘附细胞选自肌肉细胞(例如，骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成肌细胞)、结缔组织细胞(例如，骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞以及分化为成骨细胞、软骨细胞或淋巴组织的细胞)、骨髓细胞、内皮细胞、皮肤细胞、上皮细胞、乳腺细胞、血管细胞、血细胞、淋巴细胞、神经细胞、许旺细胞、胃肠细胞、肝细胞、胰细胞、肺细胞、气管细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、肾细胞、脂肪细胞、实质细胞、周细胞、间皮细胞、基质细胞、未分化的细胞(如干细胞和祖细胞)、内胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、癌来源的细胞，细胞系、诱导的多能干细胞(iPS)、或其任何组合。
可根据实际需要来选择合适的细胞。例如，在某些优选的实施方案中，所述生物砖包含心肌细胞，并且其用于产生心脏组织。在某些优选的实施方案中，所述生物砖包含内皮细胞，平滑肌细胞和成纤维细胞，并且其用于产生血管。在某些优选的实施方案中，所述生物砖包含内皮细胞，并且其用于产生皮肤组织。
本发明的生物砖的尺寸可以根据实际需要进行选择，而不受特别限制。球形生物砖的尺寸通常可以通过其直径来进行明确定义。在严格定义的情况下，术语“直径”不能用于描述非球形的结构。然而，在本发明中，也使用术语“直径”来描述非球形的生物砖的尺寸。在此情况下，术语“直径”表示，与非球形的生物砖具有相同体积的球形生物砖的直径。换言之，在本发明中，使用球形生物砖的直径来描述具有相同体积的非球形的生物砖的尺寸。因此，在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的尺寸(即，本文所定义的直径)可以为20-2000μm，例如30-1900μm，40-1800μm，50-1700μm，60-1600μm，70-1500μm，80-1400μm，90-1300μm，100-1200μm，200-1000μm，300-800μm，400-600μm，100-500μm。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的尺寸(即，本文所定义的直径)可以为20-30、30-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、20-50、20-100、100-200、200-400、500-600、600-800、800-1000、或1000-2000μm。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的尺寸(即，本文所定义的直径)为至少20、30、50、100、120、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500、或2000μm。
本发明的生物砖的形状可以根据实际需要进行选择，而不受特别限制。例如，本发明生物砖可以是球形，或者任何期望的形状(例如立方体，矩形棱柱，六棱柱，圆柱，或不规则的形状)。例如，一些形状(例如球形，立方体，矩形棱柱，六棱柱)可用于实现生物砖在构建体中的紧密堆积。
在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖为固体或半固体。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖为凝胶态。例如，本发明的生物砖的核层和/或壳层可以为凝胶态。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包含水凝胶。在某些优选的实施方案中，所述水凝胶包含海藻酸盐，琼脂糖，明胶，壳聚糖，或其它水溶性或亲水性聚合物。
在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖以混合物的形式存在。在此类实施方案中，生物砖可以与混合物中的另一生物砖接触或融合。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖是分离的生物砖。例如，在某些实施方案中，生物砖不与其他的生物砖直接接触。在某些优选的实施方案中，本发明的分离的生物砖提供于容器中。
本发明的生物砖可使用各种方法来制备。例如，在某些优选的实施方案中，可使用用于制造微球体的方法来制备本发明的生物砖，例如使用造粒仪来进行制备。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖是在无菌条件下制备的。某些优选的实施方案中，本发明的生物砖是在GMP工作间中制备的。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖在即将使用前被制备。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖在制备后贮存于4℃，例如贮存3小时、6小时、12小时、1天、2天、或3天。
在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖能够减少细胞在生物打印过程中受到的机械损伤。例如，在某些优选的实施方案中，在使用相同生物打印机和相同打印条件的情况下，与将细胞直接用于生物打印相比，本发明的生物砖能够减少细胞受到的机械损伤至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、70％、80％、或90％。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖能够在生物打印过程中保留生物砖内的细胞的生物活性(例如，增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢)。在某些优选的实施方案中，生物砖内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印后存活至少24小时。在某些优选的实施方案中，生物砖内至少90％的细胞在生物打印后存活至少3小时、6小时、12小时、1天、2天、4天、或7天。在某些优选的实施方案中，生物砖内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印24小时后能够增殖和/或分化。在某些优选的实施方案中，生物砖内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印24小时后具有正常的新陈代谢。在某些优选的实施方案中，生物砖内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印24小时后能够迁移。在某些优选的实施方案中，生物砖内至少80％、85％、87.5％、90％、92.5％、95％、或98％的细胞在生物打印24小时后能够分泌。
本发明的生物砖的示意性结构示于图1A-1E中。如图1A-1E所示，本发明的生物砖包括：细胞，其能够进行生长、增殖、分化或迁移；包裹细胞的核层，其由生物可降解材料制成，并且为细胞的生命活动提供微环境，例如营养物质；和，封装核层的壳层，由生物可降解材料制成，并且为内部的核层和细胞提供力学保护。在某些优选的实施方案中，所述壳层是通透性的，具有用于生物砖内外物质交换的通道。在某些优选的实施方案中，细胞可均匀分散于核层中，或者可以聚集在一起，位于核层内部。
在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包括至少一个核层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包括至少二个核层。例如，本发明的生物砖可包括1个、2个、3个、4个、5个或更多个核层。
在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的各个核层各自独立地由上文所定义的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成。换言之，在本发明的生物砖包含至少二个核层的情况下，各个核层可以独立地由相同或不同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成。例如，如果本发明的生物砖包含2个核层，那么这2个核层可以由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成，也可以由不同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成。如果本发明的生物砖包含3个核层，那么这3个核层可以由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成；或者可以由3种不同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成；或者其中的2个核层由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成，且第3个核层由另一种生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的各个核层具有不同的组成成分。
在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的各个核层各自独立地包裹细胞。换言之，在本发明的生物砖包含至少二个核层的情况下，各个核层可以独立地包裹相同或不同的细胞或细胞组合。例如，如果本发明的生物砖包含2个核层，那么这2个核层可以包裹相同的细胞或细胞组合，也可以包裹不同的细胞或细胞组合。如果本发明的生物砖包含3个核层，那么这3个核层可以包裹相同的细胞或细胞组合；或者可以包裹3种不同的细胞或细胞组合；或者其中的2个核层包裹相同的细胞或细胞组合，且第3个核层包裹另一种细胞或细胞组合。
此外，本发明生物砖的各个核层各自独立地包含一个或多个细胞，例如，本发明生物砖的各个核层各自独立地可以包含1-106个细胞，例如10-900、20-800、30-700、40-600、50-500、60-400、70-300、80-200、10-100个、10-103个、10-104个、10-105个、10-106个细胞。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的各个核层各自独立地包含至少1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、或106个细胞。
通常，用于制备核层的生物可降解材料的选择与核层包裹的细胞的选择是独立的。因此，本发明生物砖的不同核层可以：(1)由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成，且包裹相同的细胞或细胞组合；或者(2)由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成，且包裹不同的细胞或细胞组合；或者(3)由不同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成，且包裹相同的细胞或细胞组合；或者(4)由不同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成，且包裹不同的细胞或细胞组合。然而，特别优选地，根据所使用的细胞或细胞组合以及预期的目的，选择合适的生物可降解材料或生物可降解材料的组合来制备核层，以给细胞的生长、增殖、分化或迁移提供最佳的条件。
在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包括至少一个壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包括至少二个壳层。例如，本发明的生物砖可包括1个、2个、3个、4个、5个或更多个壳层。
在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的各个壳层各自独立地由上文所定义的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成。换言之，在本发明的生物砖包含至少二个壳层的情况下，各个壳层可以独立地由相同或不同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成。例如，如果本发明的生物砖包含2个壳层，那么这2个壳层可以由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成，也可以由不同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成。如果本发明的生物砖包含3个壳层，那么这3个壳层可以由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成；或者可以由3种不同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成；或者其中的2个壳层由相同的生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成，且第3个壳层由另一种生物可降解材料或生物可降解材料的组合制成。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的各个壳层具有不同的组成成分。
在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的各个壳层各自任选地经过处理(例如使用壳层固定液进行处理，例如，以改善壳层的力学性能)。在某些优选的实施方案中，本发明生物砖的各个壳层均经过处理。在某些优选的实施方案中，位于本发明生物砖最外侧的壳层经过处理。
本发明生物砖中的核层和壳层的数量和排布方式不受特别的限制。然而，特别优选地，生物砖的最外侧包含至少一个壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包括一个核层和一个壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包括一个核层和2个或更多个壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包括2个或更多个核层和一个壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖包括至少2个核层和至少2个壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖由内到外依次包括，核层、第一壳层、和第二壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖由内到外依次包括，第一核层、第二核层、和壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖由内到外依次包括，第一核层、第二核层、第一壳层、和第二壳层。在某些优选的实施方案中，本发明的生物砖由内到外依次包括，第一核层、第一壳层、第二核层、和第二壳层。本说明书的图1A-1E示意性描述了本发明生物砖的多种结构。
在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包含辅助材料。在某些优选实施方案中，所述辅助材料不包含细胞。在某些优选实施方案中，所述辅助材料是生物相容性和/或生物可降解的。在某些优选实施方案中，所述辅助材料是温敏性材料。在某些优选的实施方案中，所述温敏性材料在不同的温度下具有不同的形态。例如，所述温敏性材料(例如明胶)在较低的温度下呈固态或半固态，而在较高的温度下呈液态。在某些优选的实施方案中，所述温敏性材料的相变温度在5-40℃之间，例如5-10℃，10-15℃，15-20℃，20-25℃，25-30℃，30-35℃，35-40℃。在某些优选的实施方案中，所述温敏性材料选自明胶，聚N-异丙基丙烯酰胺-聚乙二醇嵌段共聚物，聚乙二醇共聚物(例如聚乙烯醇-聚乙二醇共聚物)，琼脂糖，Matrigel，壳聚糖/甘油磷酸钠体系，Pluronic F127，和聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)水凝胶。
在某些优选的实施方案中，所述辅助材料可以具有任何想要的尺寸。在某些优选的实施方案中，所述辅助材料具有微米至厘米级别的尺寸，例如1μm-10cm，例如，1μm-2μm，2μm-3μm，3μm-4μm，4μm-5μm，5μm-6μm，6μm-7μm，7μm-8μm，8μm-9μm，9μm-10μm，10μm-20μm，20μm-30μm，30μm-40μm，40μm-50μm，50μm-60μm，60μm-70μm，70μm-80μm，80μm-90μm，90μm-100μm，100μm-200μm，200μm-300μm，300μm-400μm，400μm-500μm，500μm-600μm，600μm-700μm，700μm-800μm，800μm-900μm，900μm-1mm，1mm-2mm，2mm-3mm，3mm-4mm，4mm-5mm，5mm-6mm，6mm-7mm，7mm-8mm，8mm-9mm，9mm-10mm，10mm-20mm，20mm-30mm，30mm-40mm，40mm-50mm，50mm-60mm，60mm-70mm，70mm-80mm，80mm-90mm，90mm-100mm，100μm-5mm，500μm-1mm，100μm-800μm，300μm-600μm。
在某些优选的实施方案中，所述辅助材料可以具有任何想要的形状。例如，所述辅助材料可以是片状结构(例如长方形，正方形，圆形，椭圆形，六角形或不规则形状的片状结构)，或中空管状结构，或中空三维结构(例如中空立方体，中空球体，中空的矩形棱柱体，中空圆柱体，或中空的不规则形状的三维结构)，或实心三维结构(例如实心立方体，实心球体，实心矩形棱柱体，实心圆柱体，或实心不规则形状的三维结构)，或其任何组合。在某些优选的实施方案中，所述辅助材料的形状模拟天然组织或器官的形状。
在另一个方面，本发明提供了一种用于制备生物构建体(例如三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官)的套盒(package)，其包含一个或多个如上所定义的试剂盒。在某些优选的实施方案中，不同的试剂盒使用相同的第一试剂和第二试剂的组合。在某些优选的实施方案中，不同的试剂盒使用不同的第一试剂和第二试剂的组合。
在另一个方面，本发明提供了一种用于制备生物构建体(例如三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官)的方法，其包括使用本发明的试剂盒。
在另一个方面，本发明提供了一种用于制备生物构建体(例如三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官)的方法，其包括下述步骤：
(1)提供一种或多种含有细胞的结构单元，其全部或者部分表面附着有第一组分；优选地，所述第一组分包含于第一试剂中；
(2)在支持物上用含有第二组分的第二试剂绘制预设的图案；其中，当所述第一组分与第二组分接触时，能够产生粘连效果，实现粘合作用；
(3)根据步骤(2)绘制的图案来放置步骤(1)中所述的结构单元，使所述结构单元表面上的第一组分与所述图案中的第二组分接触，产生粘连效果，从而将所述结构单元组装(粘合)成生物构建体；
其中，任选地，所述方法还包括下述步骤：
(4)在前一步骤获得的生物构建体上，用第二试剂绘制预设的图案；
(5)根据前一步骤绘制的图案来放置步骤(1)中所述的结构单元，使所述结构单元表面上的第一组分与所述图案中的第二组分接触，产生粘连效果，从而将所述结构单元组装到前一步骤的生物构建体上，形成新的生物构建体；
(6)任选地，重复步骤(4)和(5)一次或多次；
从而，制备得到生物构建体。
在某些优选的实施方案中，所述含有细胞的结构单元为具有小尺寸的微结构。在某些优选的实施方案中，所述微结构具有微米至厘米级别的尺寸，例如100μm-10cm，例如，100μm-200μm，200μm-300μm，300μm-400μm，400μm-500μm，500μm-600μm，600μm-700μm，700μm-800μm，800μm-900μm，900μm-1mm，1mm-2mm，2mm-3mm，3mm-4mm，4mm-5mm，5mm-6mm，6mm-7mm，7mm-8mm，8mm-9mm，9mm-10mm，10mm-20mm，20mm-30mm，30mm-40mm，40mm-50mm，50mm-60mm，60mm-70mm，70mm-80mm，80mm-90mm，90mm-100mm，100μm-5mm，500μm-1mm，100μm-800μm，300μm-600μm。在某些优选的实施方案中，所述微结构的尺寸可以为不超过100μm、不超过200μm、不超过500μm、不超过1mm、不超过2mm、不超过5mm、不超过1cm、不超过2cm、不超过5cm、或不超过10cm。在某些优选的实施方案中，所述微结构包含生物砖或者用生物砖制成。在某些优选实施方案中，所述结构单元为如上文所详细定义和描述的生物砖。
在某些优选实施方案中，所述第一试剂和第二试剂具有如上文所描述的一种或多种特征。在某些优选实施方案中，所述第一组分和第二组分具有如上文所描述的一种或多种特征。
在某些优选实施方案中，在步骤(1)中，全部或者部分表面附着有第一组分的结构单元是通过将所述结构单元在包含所述第一组分的第一试剂中浸渍而获得的。因此，在某些优选实施方案中，步骤(1)包括，将所述结构单元在所述第一试剂中进行浸渍，从而提供全部或者部分表面附着有所述第一组分的结构单元。在某些优选实施方案中，将所述结构单元在第一试剂中浸渍0.1-30min，例如0.1-0.2min，0.2-0.3min，0.3-0.4min，0.4-0.5min，0.5-0.6min，0.6-0.7min，0.7-0.8min，0.8-0.9min，0.9-1min，1-2min，2-3min，3-4min，4-5min，5-6min，6-7min，7-8min，8-9min，9-10min，1-5min，5-10min，10-15min，15-20min，20-25min，或25-30min。在某些优选实施方案中，在摇晃或振荡的条件下，将所述结构单元在第一试剂中浸渍。摇晃或振荡条件可用于促进第一试剂/第一组分附着至结构单元表面。在某些优选实施方案中，浸渍步骤是在4-37℃下进行的。在某些优选实施方案中，浸渍步骤是在室温条件(例如15-37℃或25-37℃)下进行的。在某些优选实施方案中，浸渍步骤是在低温条件(例如4-15℃)下进行的。在某些优选实施方案中，步骤(1)还包括，在浸渍于第一试剂中后，洗涤所述结构单元。在某些优选实施方案中，使用缓冲液(例如生理缓冲溶液)或培养基溶液来洗涤所述结构单元。在某些优选实施方案中，在浸渍于第一试剂中后，通过将所述结构单元浸于缓冲液(例如生理缓冲溶液)或培养基溶液中来洗涤所述结构单元。洗涤步骤可以用于去除结构单元表面所附着的过量第一试剂/第一组分。在某些优选实施方案中，洗涤步骤可进行0.1-10min，例如0.1-0.2min，0.2-0.3min，0.3-0.4min，0.4-0.5min，0.5-0.6min，0.6-0.7min，0.7-0.8min，0.8-0.9min，0.9-1min，1-2min，2-3min，3-4min，4-5min，5-6min，6-7min，7-8min，8-9min，9-10min，1-5min或5-10min。在某些优选实施方案中，洗涤步骤是在4-37℃下进行的。在某些优选实施方案中，洗涤步骤可在室温条件(例如15-37℃或25-37℃)下或低温条件(例如4-15℃)下进行。
在某些优选实施方案中，在步骤(1)中，全部或部分表面附着有第一组分的结构单元是通过将包含所述第一组分的第一试剂涂布于所述结构单元的表面而获得的。因此，在某些优选实施方案中，步骤(1)包括，将所述第一试剂涂布于所述结构单元的全部或部分表面，从而提供全部或部分表面附着有所述第一组分的结构单元。
在本发明的方法中，步骤(2)中预设的图案与步骤(4)中预设的图案可以相同或者不同。在通常情况下，根据想要制备的生物构建体的形状来预设步骤(2)和步骤(4)中的图案。在某些优选实施方案中，可以将步骤(2)和/或步骤(4)中的图案预设为任何期望的图案，例如点状图案，线形图案，条形图案，三角形图案，四边形图案，环形图案，圆形图案，十字形图案，不规则图案，或其任何组合。
例如，在某些优选实施方案中，想要制备的生物构建体具有条状结构。在此情况下，可以将步骤(2)和/或步骤(4)中的图案预设为线形或条形图案。在某些优选实施方案中，想要制备的生物构建体具有管状或环状结构。在此情况下，可以将步骤(2)和/或步骤(4)中的图案预设为环形图案。在某些优选实施方案中，想要制备的生物构建体具有柱状结构。在此情况下，可以将步骤(2)和步骤(4)中的图案预设为圆形图案。在某些优选实施方案中，想要制备的生物构建体具有十字结构。在此情况下，可以将步骤(2)和步骤(4)中的图案预设为十字形图案。
在某些优选实施方案中，步骤(2)中的支持物可以是固体或半固体(例如凝胶)。在某些优选实施方案中，步骤(2)中的支持物可以是生物构建体(例如，使用本发明方法构建的生物构建体)。在某些优选实施方案中，步骤(2)中的支持物为平台(例如打印平台)。
在某些优选实施方案中，在步骤(3)中，由所述结构单元与步骤(2)中的支持物共同组装成生物构建体。在某些优选实施方案中，在步骤(3)中，由所述结构单元组装成生物构建体。
在某些优选实施方案中，在步骤(3)中，在放置所述的结构单元后，静置0.1-60s(例如0.1-1s，1-2s，2-3s，3-4s，4-5s，5-10s，10-15s，15-20s，20-25s，25-30s，30-35s，35-40s，40-45s，45-50s，50-55s，或55-60s)。该静置步骤有利于所述结构单元表面上的第一组分与所述图案中的第二组分充分接触，并发生相互作用，从而将所述结构单元组装(粘合)成生物构建体。在某些优选实施方案中，步骤(3)是在4-37℃下进行的。在某些优选实施方案中，步骤(3)是在室温条件(例如15-37℃或25-37℃)下或者在低温条件(例如4-15℃)下进行的。
在某些优选实施方案中，在步骤(5)中，在放置所述的结构单元后，静置0.1-60s(例如0.1-1s，1-2s，2-3s，3-4s，4-5s，5-10s，10-15s，15-20s，20-25s，25-30s，30-35s，35-40s，40-45s，45-50s，50-55s，或55-60s)。该静置步骤有利于所述结构单元表面上的第一组分与所述图案中的第二组分充分接触，并发生相互作用，从而将所述结构单元组装到前一步骤的生物构建体上，形成新的生物构建体。在某些优选实施方案中，步骤(5)是在4-37℃下进行的。在某些优选实施方案中，步骤(5)是在室温条件(例如15-37℃或25-37℃)下或者在低温条件(例如4-15℃)下进行的。
在本发明的方法中，步骤(3)中使用的结构单元与步骤(5)中使用的结构单元可以相同或者不同。在某些优选实施方案中，步骤(3)中使用的结构单元与步骤(5)中使用的结构单元是相同的。在某些优选实施方案中，步骤(3)中使用的结构单元与步骤(5)中使用的结构单元是不同的。例如，步骤(3)中的结构单元所包含的细胞与步骤(5)中的结构单元所包含的细胞可以是相同或不同的。
在通常情况下，根据想要制备的生物构建体的细胞分布模式来选择步骤(3)和步骤(5)中使用的结构单元(特别是，结构单元中包含的细胞)。例如，当想要制备的生物构建体仅包含一种细胞时，可在步骤(3)和步骤(5)中使用包含相同细胞的结构单元。当想要制备的生物构建体仅包含两种或更多种细胞时，可在步骤(3)和步骤(5)中使用两种或更多种的结构单元，其各自包含不同的细胞或细胞组合。
如上文中所详细描述的，本发明的第一试剂(或第一组分)和第二试剂(或第二组分)不局限于特定的组合。相应地，本发明的方法也不限于特定的第一试剂(或第一组分)和第二试剂(或第二组分)的组合。此外，对于每一轮的图案绘制和结构单元组装(例如，步骤(2)和(3)构成一轮的图案绘制和结构单元组装，且步骤(4)和(5)构成另一轮的图案绘制和结构单元组装)，可使用相同或不同的第一试剂(或第一组分)和第二试剂(或第二组分)的组合。例如，本发明方法的步骤(2)和(3)可以使用第一试剂(或第一组分)和第二试剂(或第二组分)的第一种组合，而步骤(4)和(5)可以使用相同的组合或者不同的组合(即，第一试剂(或第一组分)和第二试剂(或第二组分)的另一种组合)。
因此，在某些优选实施方案中，本发明的方法可包括下述步骤：
(1)提供至少两种含有细胞的结构单元，其中，第一种结构单元的全部或者部分表面附着有A1试剂，并且，第二种结构单元的全部或者部分表面附着有A2试剂；
(2)在支持物上用B1试剂绘制预设的图案；
(3)根据步骤(2)绘制的图案来放置步骤(1)中所述的第一种结构单元，使所述第一种结构单元表面上的A1试剂与所述图案中的B1试剂接触，产生粘连效果，从而将所述第一种结构单元组装(粘合)成生物构建体；
(4)在前一步骤获得的生物构建体上，用B2试剂绘制预设的图案；
(5)根据前一步骤绘制的图案来放置步骤(1)中所述的第二种结构单元，使所述第二种结构单元表面上的A2试剂与所述图案中的B2试剂接触，产生粘连效果，从而将所述第二种结构单元组装到前一步骤的生物构建体上，形成新的生物构建体；
从而，制备得到生物构建体；
其中，A1试剂和B1试剂在接触时，能够产生粘连效果，实现粘合作用(即，A1试剂和B1试剂是上文所定义的第一试剂和第二试剂的一种组合)；并且，A2试剂和B2试剂在接触时，能够产生粘连效果，实现粘合作用(即，A2试剂和B2试剂是上文所定义的第一试剂和第二试剂的另一种组合)。
在本发明的方法中，不同的结构单元可包含不同的细胞和/或附着不同的第一组分。例如，不同的结构单元可包含不同的细胞，但附着相同的第一组分。或者，不同的结构单元可包含相同的细胞，但附着不同的第一组分。或者，不同的结构单元可包含不同的细胞，且附着不同的第一组分。
在某些优选实施方案中，步骤(4)所述的生物构建体可以是三维的。在某些优选实施方案中，在步骤(4)中，可以在所述生物构建体的任一个或多个表面上，用第二试剂绘制预设的图案。由此，本发明的方法可以在任一个或多个方向上实现结构单元的组装，从而可以用于构建任何形状的生物构建体。
在某些优选实施方案中，不进行步骤(6)。在某些优选实施方案中，在步骤(6)中，重复步骤(4)和(5)一次或多次。在某些优选实施方案中，在步骤(6)中，重复步骤(4)和(5)至少1次，至少2次，至少3次，至少4次，至少5次，至少10次，至少15次，至少20次，至少30次，至少40次，至少50次，至少100次，至少200次，至少500次，或更多次。
如上文所描述的，每一次的步骤(4)和(5)的重复各自构成了一轮的图案绘制和结构单元组装。对于每一轮的图案绘制和结构单元组装，可使用相同或不同的结构单元(例如，含有相同或不同的细胞或细胞组合的结构单元)；和/或，相同或不同的第一试剂(或第一组分)和第二试剂(或第二组分)的组合；和/或，相同或不同的图案。
在某些优选实施方案中，本发明方法所制备的生物构建体具有两层或更多层的结构单元。在某些优选实施方案中，本发明方法所制备的生物构建体具有至少3层(例如至少4层，至少5层，至少10层，至少15层，至少20层，至少30层，至少40层，至少50层，至少100层，至少200层，至少500层，或更多层)的结构单元。
在某些优选实施方案中，本发明方法所制备的生物构建体具有两个或更多个的区段。在某些优选实施方案中，本发明方法所制备的生物构建体具有至少3个(例如至少4个，至少5个，至少10个，至少15个，至少20个，至少30个，至少40个，至少50个，至少100个，至少200个，至少500个，或更多个)的区段。
在某些优选实施方案中，在进行步骤(2)-(6)期间，还在所产生的生物构建体的内部或外周添加辅助材料(例如用于支撑的辅助材料)。在某些优选实施方案中，所述辅助材料不包含细胞。优选地，此类辅助材料的添加/使用能够帮助限定所产生的生物构建体的形状，和/或帮助维持或增强所产生的生物构建体的稳定性。在某些优选实施方案中，所述辅助材料包含于本发明方法所制备的生物构建体中。在某些优选实施方案中，所述辅助材料包含于本发明方法所制备的生物构建体中，并且其随后能够被降解。在此类情况下，所述辅助材料仅仅是暂时性地构成了生物构建体的一部分。在某些优选实施方案中，所述辅助材料包含于本发明方法所制备的生物构建体中，并且其是不可降解的。在此类情况下，所述辅助材料直接(稳定地)构成了生物构建体的一部分。在某些优选实施方案中，此类辅助材料是生物相容性和/或生物可降解的。在某些优选实施方案中，所述辅助材料是为温敏性材料。在某些优选的实施方案中，所述温敏性材料在不同的温度下具有不同的形态。例如，所述温敏性材料(例如明胶)在较低的温度下呈固态或半固态，而在较高的温度下呈液态。在某些优选的实施方案中，所述温敏性材料的相变温度在5-40℃之间，例如5-10℃，10-15℃，15-20℃，20-25℃，25-30℃，30-35℃，35-40℃。在某些优选实施方案中，所述温敏性材料选自明胶，聚N-异丙基丙烯酰胺-聚乙二醇嵌段共聚物，聚乙二醇共聚物(例如聚乙烯醇-聚乙二醇共聚物)，琼脂糖，Matrigel，壳聚糖/甘油磷酸钠体系，Pluronic F127，和聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)水凝胶。
在某些优选实施方案中，本发明的方法用于制备条状生物构建体。在某些优选实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：
(1)提供含有细胞的结构单元，其全部或者部分表面附着有第一组分；优选地，所述第一组分包含于第一试剂中；例如，通过将含有细胞的的结构单元在包含所述第一组分的第一试剂中浸渍，使所述第一组分附着于所述结构单元的表面，从而提供其全部或者部分表面附着有第一组分的结构单元；
(2)在支持物上用含有第二组分的第二试剂绘制线形或条形图案；其中，当所述第一组分与第二组分接触时，能够产生粘连效果，实现粘合作用；
(3)根据步骤(2)绘制的图案来放置步骤(1)中所述的结构单元，使所述结构单元表面上的第一组分与所述图案中的第二组分接触，产生粘连效果，从而将所述结构单元组装(粘合)成生物构建体(即，第一层条状结构)；
(4)在前一步骤获得的生物构建体(即，条状结构)上，用所述第二试剂绘制线形或条形图案；
(5)根据前一步骤绘制的图案来放置步骤(1)中所述的结构单元，使所述结构单元表面上的第一组分与所述图案中的第二组分接触，产生粘连效果，从而将所述结构单元组装到前一步骤的生物构建体上，形成新的生物构建体(即，在前一步骤的条状结构上，将所述结构单元组装(粘合)成另一层条状结构)；
(6)任选地，重复步骤(4)和(5)一次或多次；
从而，制备得到条状生物构建体。
图2展示了使用本发明方法来制备条状生物构建体的示意性流程图。
本发明的制备生物构建体的方法可通过生物打印法来实施。在某些优选的实施方案中，使用打印机(例如3D生物打印机)来进行生物打印法。在某些优选的实施方案中，使用自动化或非自动化机械过程来进行生物打印法。在某些优选的实施方案中，通过使用手工放置或手工沉积法(例如使用移液器)来进行生物打印法。在某些优选的实施方案中，通过挤出式打印法或模块化打印法来对结构单元进行打印。优选地，使用模块化打印法来对结构单元进行打印。如本文中所使用的，“模块化打印法”是指，通过吸取/抓取模块(例如本发明的结构单元，例如生物砖)，并将其精确定位/排布来进行打印的方法。由于本发明所使用的结构单元包含细胞，因此，在本文中，此类模块化打印法也被称为“模块化生物打印法”。然而，应当理解的是，在本发明的方法中，可使用各种合适的打印方法来对所述第二试剂和/或辅助材料进行打印。例如，可使用模块化打印法，挤出式打印法，或喷墨式打印法来对所述第二试剂进行打印。类似地，可使用模块化打印法，挤出式打印法，或喷墨式打印法来对所述辅助材料进行打印。
在某些优选实施方案中，使用3D生物打印机来实施本发明的方法(即，制备生物构建体)。在某些优选的实施方案中，所述3D生物打印机包含：第一墨盒，其用于提供含有细胞的结构单元(例如生物砖)；第二墨盒，其用于提供第二试剂；第一打印喷头；以及，连接至第二墨盒的第二打印喷头。在某些优选的实施方案中，所述生物打印机还包含：第三墨盒，其用于提供辅助材料；以及，第三打印喷头。在某些优选的实施方案中，所述生物打印机还包含：用于提供第一试剂的第四墨盒。在某些优选的实施方案中，本发明的方法包括下述步骤：
(1)在3D生物打印机的第一墨盒中提供含有细胞的结构单元(例如生物砖)，其全部或者部分表面附着有第一组分，并且在3D生物打印机的第二墨盒中提供含有第二组分的第二试剂；其中，当所述第一组分与第二组分接触时，能够产生粘连效果，实现粘合作用；
(2)通过3D生物打印机的连接至第二墨盒的第二打印喷头，在打印平台上用所述第二试剂绘制预设的图案(例如线形或条形图案)；
(3)使用3D生物打印机的第一打印喷头，将步骤(1)中的结构单元打印至步骤(2)绘制的图案上，使所述结构单元表面上的第一组分与所述图案中的第二组分接触，产生粘连效果，从而将所述结构单元组装(粘合)成生物构建体(例如条状结构)；
任选地，所述方法还包括下述步骤：
(4)通过所述第二打印喷头，在前一步骤获得的生物构建体(例如条状结构)上，用所述第二试剂绘制预设的图案(例如线形或条形图案)；
(5)通过所述第一打印喷头，将步骤(1)中的结构单元打印至前一步骤绘制的图案上，使所述结构单元表面上的第一组分与所述图案中的第二组分接触，产生粘连效果，从而将所述结构单元组装到前一步骤的生物构建体上，形成新的生物构建体(例如，在前一步骤的条状结构上，将所述结构单元组装(粘合)成另一层条状结构)；
(6)任选地，重复步骤(4)和(5)一次或多次；
从而，制备得到生物构建体(例如条状生物构建体)。
在某些优选的实施方案中，使用3D生物打印机来制备生物构建体的方法可具有如上文所描述的本发明方法的一种或多种特征。
在某些优选实施方案中，在步骤(1)中，全部或者部分表面附着有第一组分的结构单元是通过将所述结构单元在包含所述第一组分的第一试剂中浸渍而获得的。因此，在某些优选实施方案中，步骤(1)包括，将第一试剂(例如提供于第四墨盒的第一试剂)注入第一墨盒中，以将所述结构单元在所述第一试剂中进行浸渍，从而提供全部或者部分表面附着有所述第一组分的结构单元。在某些优选实施方案中，浸渍步骤具有如上文描述的一种或多种特征。在某些优选实施方案中，步骤(1)还包括，在浸渍后，将第一墨盒中的的第一试剂排出。在某些优选实施方案中，步骤(1)还包括，在排出第一试剂后，向第一墨盒中注入洗涤液，以洗涤所述结构单元。在某些优选实施方案中，步骤(1)还包括，在洗涤后，将第一墨盒中的洗涤液排出。在某些优选实施方案中，洗涤步骤具有如上文描述的一种或多种特征。
在另外的一些优选实施方案中，步骤(1)包括，使用第一打印喷头从第一墨盒中吸取/抓取含有细胞的结构单元(例如生物砖)，然后将其浸渍于第一试剂(例如提供于第四墨盒的第一试剂)中，从而提供全部或者部分表面附着有第一组分的结构单元。
在某些优选的实施方案中，在第一墨盒中直接提供其全部或部分表面附着有所述第一组分的结构单元。
在某些优选的实施方案中，所述第一打印喷头与所述第一墨盒是流体连通的，从而，所述结构单元可被传送至所述第一打印喷头，用于后续的打印。在某些优选的实施方案中，所述第一打印喷头可移动至所述第一墨盒的位置，并从第一墨盒中吸取/抓取所述结构单元，用于后续的打印。
在某些优选的实施方案中，在进行步骤(2)-(6)期间，还利用3D生物打印机的第三打印喷头，在所产生的生物构建体的内部或外周打印提供于第三墨盒中的辅助材料(例如，用于支撑的辅助材料)。优选地，此类辅助材料能够帮助限定所产生的生物构建体的形状，和/或帮助维持或增强所产生的生物构建体的稳定性。在某些优选实施方案中，此类辅助材料是生物相容性和/或生物可降解的。在某些优选实施方案中，所述辅助材料为温敏性材料。在某些优选的实施方案中，所述温敏性材料在不同的温度下具有不同的形态。例如，所述温敏性材料(例如明胶)在较低的温度下呈固态或半固态，而在较高的温度下呈液态。在某些优选的实施方案中，所述温敏性材料的相变温度在5-40℃之间，例如5-10℃，10-15℃，15-20℃，20-25℃，25-30℃，30-35℃，35-40℃。在某些优选的实施方案中，所述温敏性材料选自明胶，聚N-异丙基丙烯酰胺-聚乙二醇嵌段共聚物，聚乙二醇共聚物(例如聚乙烯醇-聚乙二醇共聚物)，琼脂糖，Matrigel，壳聚糖/甘油磷酸钠体系，Pluronic F127，和聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)水凝胶。
在某些优选的实施方案中，所述第三打印喷头与所述第三墨盒是流体连通的，从而，所述辅助材料可被传送至所述第三打印喷头，用于后续的打印。在某些优选的实施方案中，所述第三打印喷头可移动至所述第三墨盒的位置，并从第三墨盒中吸取/抓取所述辅助材料，用于后续的打印。
在某些优选的实施方案中，所述第一打印喷头通过挤出式打印法或模块化打印法来对所述结构单元进行打印。在某些优选的实施方案中，所述第二打印喷头通过模块化打印法，挤出式打印法，或喷墨式打印法来对所述第二试剂进行打印。在某些优选的实施方案中，所述第三打印喷头通过模块化打印法，挤出式打印法，或喷墨式打印法来对所述辅助材料进行打印。
在某些优选的实施方案中，步骤(3)中使用的结构单元与步骤(5)中使用的结构单元可以是相同或不同的。在步骤(3)和步骤(5)使用不同的结构单元的情况下，可在进行步骤(5)之前，更换第一墨盒中的结构单元，或者可在额外的墨盒中提供所述不同的结构单元。如上文所描述的，在本发明的方法中，不同的结构单元可包含不同的细胞和/或附着不同的第一组分。例如，不同的结构单元可包含不同的细胞，但附着相同的第一组分。或者，不同的结构单元可包含相同的细胞，但附着不同的第一组分。或者，不同的结构单元可包含不同的细胞，且附着不同的第一组分。
类似地，如上文所描述的，本发明的方法也不限于特定的第一试剂/第一组分和第二试剂/第二组分的组合。此外，对于每一轮的图案绘制和结构单元组装(例如，步骤(2)和(3)构成一轮的图案绘制和结构单元组装，且步骤(4)和(5)构成另一轮的图案绘制和结构单元组装)，可使用相同或不同的第一试剂/第一组分和第二试剂/第二组分的组合。例如，本发明方法的步骤(2)和(3)可以使用第一试剂/第一组分和第二试剂/第二组分的第一种组合，而步骤(4)和(5)可以使用相同的组合或者不同的组合(即，第一试剂/第一组分和第二试剂/第二组分的另一种组合)。
因此，在某些优选的实施方案中，步骤(2)中使用的第二试剂与步骤(4)中使用的第二试剂可以是相同或不同的。在步骤(2)和步骤(4)使用不同的第二试剂的情况下，可在进行步骤(4)之前，更换第二墨盒中的第二试剂，或者可在额外的墨盒中提供所述不同的第二试剂。
如上文所描述的，每一次的步骤(4)和(5)的重复各自构成了一轮的图案绘制和结构单元组装。对于每一轮的图案绘制和结构单元组装，可使用相同或不同的结构单元(例如，含有相同或不同的细胞或细胞组合的结构单元)；和/或，相同或不同的第一试剂/第一组分和第二试剂/第二组分的组合；和/或，相同或不同的图案。在某些优选的实施方案中，对于每一轮的图案绘制和结构单元组装，可通过更换相应墨盒中的墨汁(例如，第一墨盒中的结构单元和第二墨盒中的第二试剂)，或者，可通过提供额外的墨盒，来实现结构单元和第二试剂的更替。
在某些优选的实施方案中，本发明方法中的生物打印步骤(例如步骤(2)-(6))是连续的和/或基本连续的。在某些优选的实施方案中，在本发明方法的步骤(2)-(6)中，连续地生物打印多层结构，以获得具有预定模式的、包含多层结构的三维构建体。在某些优选的实施方案中，在本发明方法的步骤(2)-(6)中，对于每一层结构，可使用相同或不同的结构单元来进行打印。在某些优选的实施方案中，根据预定的模式，使用一种或多种结构单元来打印多层结构。在某些优选的实施方案中，在本发明方法的步骤(2)-(6)中，连续地生物打印多个区段，以获得具有预定模式的、包含多个区段的三维构建体。在某些优选的实施方案中，在本发明方法的步骤(2)-(6)中，对于每一个区段，可使用相同或不同的结构单元来进行打印。在某些优选的实施方案中，根据预定的模式，使用一种或多种结构单元来打印多个区段。
图3展示了利用3D生物打印机来实施本发明方法，以制备条状生物构建体的示意性流程图。
在某些优选的实施方案中，本发明的制备生物构建体的方法在体内进行。在某些优选的实施方案中，在受试者(例如人受试者)上实施本发明的方法(即，制备生物构建体)。在某些优选的实施方案中，在受试者的组织(例如皮肤组织)的损伤位点实施本发明的方法(即，制备生物构建体)。在某些优选的实施方案中，所述组织因创伤，感染，疾病，或老龄化而遭致损伤。在某些优选的实施方案中，根据组织或组织损伤位点的细胞分布信息，在受试者的组织(例如皮肤组织)的损伤位点实施本发明的方法(即，制备生物构建体)。在某些优选的实施方案中，所述细胞分布信息选自，组织或组织损伤位点的各个细胞层的位置或类型，各个层的细胞的类型，各个层中不同细胞的比率，各个层中的细胞分布模式，或其任何组合。在某些优选的实施方案中，在实施本发明的方法(即，制备生物构建体)之前，获得组织或组织损伤位点的细胞分布信息。在某些优选的实施方案中，本发明的方法还包括，获得组织或组织损伤位点的细胞分布信息，然后根据所述细胞分布信息制备生物构建体。在某些优选的实施方案中，本发明方法所使用的结构单元(例如生物砖)中的细胞来源于所述受试者。在某些优选的实施方案中，本发明方法所使用的结构单元(例如生物砖)中的细胞来源于与所述受试者具有相似或相同特征(例如，物种，年龄，性别，遗传信息等)的其他受试者。在某些优选的实施方案中，本发明方法所使用的结构单元(例如生物砖)中的细胞来源于同种异体。在某些优选的实施方案中，本发明方法所使用的结构单元(例如生物砖)中的细胞来源于细胞系。在某些优选的实施方案中，本发明的制备生物构建体的方法在体外进行。
在某些优选实施方案中，所产生的生物构建体为三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官。在某些优选实施方案中，所产生的生物构建体为人工血管。
在某些优选实施方案中，所产生的生物构建体为大尺寸的构建体。例如，所产生的生物构建体具有毫米级或者厘米级或者更大的尺寸。在某些优选实施方案中，所产生的生物构建体的尺寸为至少1mm、至少2mm、至少5mm、至少1cm、至少2cm、至少5cm、至少10cm、至少20cm、或至少50cm。
本发明方法所产生的生物构建体可具有任何预定的模式，例如任何预定的形状。例如，所述生物构建体可以是片状结构(例如长方形，正方形，圆形，椭圆形，六角形或不规则形状的片状结构)，或中空管状结构，或中空三维结构(例如中空立方体，中空球体，中空的矩形棱柱体，中空圆柱体，或中空的不规则形状的三维结构)，或实心三维结构(例如实心立方体，实心球体，实心矩形棱柱体，实心圆柱体，或实心不规则形状的三维结构)，或其任何组合。在某些优选的实施方案中，所述生物构建体的形状模拟天然组织或器官的形状。
在某些优选的实施方案中，所产生的生物构建体可进行进一步的培养。因此，在某些优选的实施方案中，本发明的制备生物构建体的方法还包括步骤(7)：在允许结构单元(例如生物砖)内的细胞增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的条件下，培养所获得的生物构建体。培养条件取决于结构单元内的细胞类型，所使用的结构单元的类型，生物构建体的结构和形状，培养的目的等等。本领域技术人员能够选择合适的培养条件，例如培养基，pH，温度，CO2水平和持续时间。一般的组织和细胞培养条件可参见例如，Doyle,Alan,andJ.Bryan Griffiths,eds.Cell and tissue culture:laboratory procedures inbiotechnology.New York:Wiley,1998。在某些优选的实施方案中，培养所获得的生物构建体至少0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、或30天。在某些优选的实施方案中，培养所获得的生物构建体1-3、3-5、5-7、7-10、10-14、14-21、21-28、1-7、7-14、1-14、或14-28天。在某些优选的实施方案中，在3D培养箱中培养所获得的生物构建体。在某些优选的实施方案中，在生物反应器中培养所获得的生物构建体。在某些优选的实施方案中，在37℃，5％CO2的条件下培养所获得的生物构建体。在某些优选的实施方案中，在培养过程中对生物构建体施加物理刺激(例如压力，剪切力，光照，加热等)。在某些优选的实施方案中，在培养过程中对生物构建体施加化学刺激(例如激素，细胞因子，化学试剂等)。
在某些优选的实施方案中，所使用的结构单元为生物砖，并且在培养过程中，生物砖的核层和/或壳层中的生物可降解材料至少一部分被降解。优选地，此类生物可降解材料的降解产物为生物砖中的细胞提供了营养物质和/或细胞外基质。在某些优选的实施方案中，生物砖的核层和/或壳层的生物可降解材料被降解至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。
在某些优选的实施方案中，生物构建体中的细胞在培养过程中分泌分泌物，并且这些分泌物整合入生物构建体中。在某些优选的实施方案中，结构单元(例如生物砖)内的细胞在培养过程中彼此连接。在某些优选的实施方案中，结构单元(例如生物砖)之间的细胞在培养过程中彼此连接。在某些优选的实施方案中，所述生物构建体在培养后具有高细胞密度(例如至少100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、或100000细胞/mm3)。在某些优选的实施方案中，结构单元(例如生物砖)内的细胞在培养后增殖至少2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10000、20000、50000、或100000倍。
在某些优选实施方案中，所产生的生物构建体被直接应用于下游应用，而不进行进一步的培养。因此，在某些优选实施方案中，本发明的方法在产生生物构建体后，不再包含培养所述生物构建体的步骤。
在另一个方面，本申请还涉及，通过上述方法制备的生物构建体(例如三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官)。
根据本发明方法制备的生物构建体可用于各种应用，例如用于研究领域或医药领域的应用。例如，本发明方法制备的生物构建体可用于研究干细胞(例如MSC细胞)分化，用于药物发现，用于药物筛选，用于体内或体外测定，用于植入宿主体内，用于组织工程或用于组织再生。本发明方法制备的生物构建体还可用于制备试剂盒，所述试剂盒用于各种应用，例如用于研究领域或医药领域的应用。例如，本发明的含有生物构建体的试剂盒可用于研究干细胞(例如MSC细胞)分化，用于药物发现，用于药物筛选，用于体内或体外测定，用于植入宿主体内，用于组织工程或用于组织再生。
在另一个方面，本申请还涉及，根据本发明所述的试剂盒或套盒用于制备生物构建体(例如三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官)的用途。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明的方法能够快速、多向、精确地组装含有细胞的结构单元(例如生物砖)，并由此制备得到大尺寸的生物构建体。
(2)本发明的方法适合用于组织工程中“从下到上”的组织构建方式，更为简便、快捷。
(3)本发明的方法特别适合用于通过3D生物打印技术来打印/制备大尺寸的生物构建体，易于实现自动化和工业化。
3D生物打印技术的目标在于，按照靶组织的原位组成结构精确排布细胞，并由此构建三维的复杂人工组织和器官。为此目的，3D生物打印技术通常要求：用于打印的材料能够快速稳定成型；用于打印的材料能够在任意方向上成型，例如其不但能够用于进行二维平面逐层打印，还能够用于在三维空间进行点打印；用于打印的包含细胞的材料能够在三维空间上进行精确打印定型，以符合靶组织中的细胞排列和分布。本发明的方法完全符合3D生物打印技术的上述要求。第一，在本发明的方法中，首先将第一试剂(第一组分)附着至结构单元表面，而后将其与绘制成预设图案的第二试剂(第二组分)接触，并使二者发生快速的相互作用(例如化学反应)，从而能够将结构单元快速定位并彼此连接。第二，在本发明的方法中，第一试剂(第一组分)与第二试剂(第二组分)能够发生强烈相互作用，将结构单元彼此牢固连接，从而能够实现将结构单元在任意方向进行组装/连接。第三，在本发明的方法中，使用第二试剂(第二组分)来绘制精确的图案，由此，当将结构单元打印/放置于所述图案上时，能够实现对结构单元的精确定位。因此，本发明的方法特别适合用于通过3D生物打印技术来打印/制备大尺寸的生物构建体，易于实现自动化和工业化。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
实施例中未指明其来源的试剂、试剂盒或仪器均为市场上商购可得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.利用生物砖、纤维蛋白原和凝血酶来制备三维构建体
在本实施例中，利用纤维蛋白原和凝血酶的凝血反应来实现生物砖的快速连接和组装，并由此制备了预设的三维构建体。
实验材料：生物砖(根据中国专利申请201610211570.4中描述的方法制备)、纤维蛋白原(牛源)、凝血酶(牛源)、生理盐水(医用级)、CaCl2、无菌水、和明胶(猪源)；
其中，所述生物砖包含鼠骨髓间充质干细胞，且其核层包含胶原，壳层包含海藻酸钠；并且其制备方法如中国申请201610211570.4中所述。
实验步骤：
1.配制纤维蛋白原溶液(5wt％)：称取纤维蛋白原0.1g，将其溶解于2mL生理盐水中(如果需要，可以在37℃水浴中充分溶解)；随后，将纤维蛋白原溶液通过0.22um滤器，进行过滤灭菌；将经过滤的纤维蛋白原溶液(用作第一试剂)保存，备用。
2.配制凝血酶溶液(2000u/mL)：称取0.0011g CaCl2，加入2000u凝血酶中(Ca2+浓度为10mmol/mL)，然后加入1mL生理盐水充分溶解；随后，将凝血酶溶液通过0.22um滤器，进行过滤灭菌；保存，备用。
3.配制明胶溶液(10wt％)：称取1g明胶，加入10mL无菌水，于37℃水浴中充分溶解；随后，将明胶溶液通过0.22um滤器，进行过滤灭菌；保存，备用。
4.将1mL凝血酶溶液和1mL明胶溶液均匀混合，然后置于37℃水浴中备用，即第二试剂。
5.将生物砖浸入第一试剂10min，以在其表面附着/组装纤维蛋白原分子(如果需要，可以进行温和摇晃，以便于组装)。然后将生物砖浸于细胞培养基5min，以洗去其表面未组装的纤维蛋白原分子，从而得到经浸渍的结构单元(下文简称为，组装单元)。
6.利用纤维蛋白原和凝血酶的凝血反应来连接和组装生物砖，以形成预设的三维结构。以管状结构为例，构建步骤如下：
a.在0℃冰浴条件下，在玻璃平皿中用第二试剂绘制圆环图案(如果需要，可以在圆环外填充明胶溶液，作为构建管状结构的辅助材料)；
b.将组装单元沿圆环图案放置并静置3s，形成由生物砖构成的圆环状结构(第一层)；
c.在圆环状结构的上表面滴加第二试剂，绘制圆环图案；
d.将组装单元沿圆环图案放置并静置3s，形成由生物砖构成的圆环状结构(第二层)；
e.根据需要，重复步骤c-d，形成不同层数的由生物砖构成的圆环状结构，即预设的管状结构(如果需要，可以将含有辅助材料的管状结构置于37℃环境中，并洗去辅助材料)。
图4展示了利用生物砖、纤维蛋白原和凝血酶来制备管状三维构建体的实验步骤和实验结果；其中，图4A显示的是，在生物砖表面附着/组装纤维蛋白原；图4B显示的是，用辅助材料构建环状辅助结构(任选的步骤)；图4C显示的是，沿环状辅助结构滴加第二试剂，绘制圆环图案；图4D显示的是，将组装单元沿圆环图案放置形成环状结构；图4E显示的是，在环状结构的上表面用第二试剂绘制圆环图案，然后将组装单元沿圆环图案放置(任选地，可以重复该步骤一次或多次，以构建含有多层结构的构建体)；图4F显示的是，构建得到的管状结构；图4G显示的是，去除辅助结构(任选的步骤)。
此外，参考GB/T228.1-2010，在电子拉力测试仪(Model 5967,Instron)上测试所获得的生物构建体的拉伸模量，其中，载荷为10N，拉伸速度为20mm/min，温度为25℃，并且在测试过程中，保持样品润湿状态。测量结果显示，所获得的管状结构的拉伸模量为1.25KPa。
还使用OLYMPUS IX83显微镜来观察刚刚制备获得的管状结构。观察结果示于图5A(Bar，200μm)。结果显示，在刚刚制备获得的管状结构中，生物砖尚未发生相互融合，细胞在各自的生物砖中均匀分布。将该管状结构在DMEM高糖培养基中培养3天，随后再次使用OLYMPUS IX83显微镜进行观察。观察结果示于图5B(Bar，200μm)。结果显示，在经培养的管状结构中，生物砖已完全相互融合，紧密连接在一起，形成了完整的生物构建体。这些结果表明，管状结构中的细胞能够正常生长，并且可以迁移通过生物砖之间的粘合部位，并最终实现生物砖的融合。
上述实验结果显示，本发明的方法可用于快速、多向、精确地构建管状三维构建体。
实施例2.利用生物砖、海藻酸钠和Ca2+来制备三维构建体
在本实施例中，利用海藻酸钠和Ca2+之间的反应来实现生物砖的快速连接和组装，并由此制备了预设的三维构建体。
实验材料：生物砖(根据中国专利申请201610211570.4中描述的方法制备)、海藻酸钠、细胞培养基、CaCl2、明胶(猪源)；
其中，所述生物砖包含兔脂肪干细胞，且其核层包含胶原，壳层包含透明质酸；并且其制备方法如中国申请201610211570.4中所述。
实验步骤：
1.配制海藻酸钠溶液(1wt％)：称取海藻酸钠0.05g，将其溶解于5mL细胞培养基中；随后，将海藻酸钠溶液通过0.22um滤器，进行过滤灭菌；将经过滤的海藻酸钠溶液(用作第一试剂)保存，备用。
2.配制明胶溶液(10wt％)：称取1g明胶，加入10mL无菌水，于37℃水浴中充分溶解；随后，将明胶溶液通过0.22um滤器，进行过滤灭菌；保存，备用。
3.配制Ca2+溶液(0.1wt％)：称取0.005g CaCl2，加入5mL明胶溶液中充分溶解；随后，将该含有Ca2+的溶液(用作第二试剂)通过0.22um滤器，进行过滤灭菌；保存，备用。
4.将生物砖浸入第一试剂10min，以在其表面附着/组装海藻酸钠分子(如果需要，可以进行温和摇晃，以便于组装)。然后将生物砖浸于细胞培养基5min，以洗去其表面未组装的海藻酸钠分子，从而得到经浸渍的结构单元(下文简称为，组装单元)。
5.利用海藻酸钠和Ca2+的反应来连接和组装生物砖，以形成预设的三维结构。以条状结构为例，构建步骤如下：
a.在0℃冰浴条件下，在玻璃平皿中用第二试剂绘制线型图案；
b.将组装单元沿线型图案放置并静置2s，形成由生物砖构成的条状结构(第一层)；
c.在条状结构上表面滴加第二试剂，绘制线型图案；
d.将组装单元沿线型图案放置并静置2s，形成由生物砖构成的条状结构(第二层)；
e.根据需要，重复步骤c-d，形成不同层数的由生物砖构成的条状结构。
图6展示了利用生物砖、海藻酸钠和Ca2+来制备条状三维构建体的实验步骤和实验结果；其中，图6A显示的是，表面附着/组装了第一试剂/第一组分的生物砖；图6B显示的是，用第二试剂绘制线型图案；图6C显示的是，沿线型图案放置组装单元；图6D显示的是，用组装单元构建得到的条状结构。此外，参考GB/T228.1-2010，在电子拉力测试仪(Model 5967,Instron)上测试所获得的生物构建体的拉伸模量，其中，载荷为10N，拉伸速度为20mm/min，温度为25℃，并且在测试过程中，保持样品润湿状态。测量结果显示，所获得的条状结构的拉伸模量为1.12MPa。这些实验结果显示，本发明的方法可用于快速、多向、精确地构建条状三维构建体。
实施例3.利用生物砖、α-氰基丙烯酸酯和含阴离子物质来制备三维构建体
在本实施例中，利用α-氰基丙烯酸酯和阴离子之间的反应来实现生物砖的快速连接和组装，并由此制备了预设的三维构建体。
实验材料：生物砖(根据中国专利申请201610211570.4中描述的方法制备)、α-氰基丙烯酸正辛酯(白云医用胶；广州白云医用胶有限公司)、DMEM细胞培养基(HyClone公司，用作含有阴离子的物质)；
其中，所述生物砖包含猴脂肪干细胞，且其核层包含胶原，壳层包含纤维素；并且其制备方法如中国申请201610211570.4中所述。
实验步骤：
1.将生物砖浸入DMEM细胞培养基(第一试剂)中10min，以在其表面附着/组装阴离子，从而得到经浸渍的结构单元(下文简称为，组装单元)。
2.利用α-氰基丙烯酸酯(第二试剂)和含阴离子物质(第一试剂)之间的反应来实现生物砖的快速连接和组装，以形成预设的三维结构。以环状结构为例，构建步骤如下：
a.在玻璃平皿中用第二试剂绘制环形图案；
b.将组装单元沿圆环图案放置并静置4s，形成由生物砖构成的环状结构(第一层)；
c.在圆环状结构的上表面滴加第二试剂，绘制环形图案；
d.将组装单元沿圆环图案放置并静置4s，形成由生物砖构成的环状结构(第二层)；
e.根据需要，重复步骤c-d，形成不同层数的由生物砖构成的环状结构，即预设的环状结构。
图7展示了利用生物砖、α-氰基丙烯酸酯和含阴离子物质来制备环状三维构建体的实验步骤和实验结果；其中，图7A显示的是，表面附着/组装了第一试剂/第一组分的生物砖；图7B显示的是，用第二试剂绘制环型图案；图7C显示的是，沿环型图案放置组装单元；图7D显示的是，用组装单元构建得到的环状结构。此外，参考GB/T228.1-2010，在电子拉力测试仪(Model 5967,Instron)上测试所获得的生物构建体的拉伸模量，其中，载荷为10N，拉伸速度为20mm/min，温度为25℃，并且在测试过程中，保持样品润湿状态。测量结果显示，所获得的环状结构的拉伸模量为3.73MPa。这些实验结果显示，本发明的方法可用于快速、多向、精确地构建环状三维构建体。
实施例4.利用生物砖、纤维蛋白原和α-氰基丙烯酸酯来制备三维构建体
在本实施例中，利用纤维蛋白原和α-氰基丙烯酸酯之间的反应来实现生物砖的快速连接和组装，并由此制备了预设的三维构建体。
实验材料：生物砖(根据中国专利申请201610211570.4中描述的方法制备)、纤维蛋白原(牛源)、生理盐水(医用级)、α-氰基丙烯酸正辛酯(白云医用胶；广州白云医用胶有限公司)；
其中，所述生物砖包含狗脐带血干细胞，且其核层包含胶原，壳层包含粘多糖；并且其制备方法如中国申请201610211570.4中所述。
实验步骤：
1.配制纤维蛋白原溶液(5wt％)：称取纤维蛋白原0.1g，将其溶解于2mL生理盐水中(如果需要，可以在37℃水浴中充分溶解)；随后，将纤维蛋白原溶液通过0.22um滤器，进行过滤灭菌；将经过滤的纤维蛋白原溶液(含阴离子物质，用作第一试剂)保存，备用。
2.将生物砖浸入第一试剂10min，以在其表面附着/组装纤维蛋白原分子(如果需要，可以进行温和摇晃，以便于组装)。然后将生物砖浸于细胞培养基5min，以洗去其表面未组装的纤维蛋白原分子，从而得到经浸渍的结构单元(下文简称为，组装单元)。
3.利用α-氰基丙烯酸酯(第二试剂)和纤维蛋白原(第一试剂)之间的反应来连接和组装生物砖，以形成预设的三维结构。以十字结构为例，构建步骤如下：
a.在玻璃平皿中用第二试剂绘制十字型图案；
b.将组装单元沿十字型图案放置并静置3s，形成由生物砖构成的十字结构(第一层)；
c.在十字结构的上表面滴加第二试剂，绘制十字型图案；
d.将组装单元沿十字型图案放置并静置3s，形成由生物砖构成的十字结构(第二层)；
e.根据需要，重复步骤c-d，形成不同层数的由生物砖构成的十字结构。
图8展示了利用生物砖、纤维蛋白原和α-氰基丙烯酸酯来制备十字三维构建体的实验步骤和实验结果；其中，图8A显示的是，表面附着/组装了第一试剂/第一组分的生物砖；图8B显示的是，用第二试剂绘制十字型图案；图8C显示的是，沿十字型图案放置组装单元；图8D显示的是，用组装单元构建得到的十字结构。此外，参考GB/T228.1-2010，在电子拉力测试仪(Model 5967,Instron)上测试所获得的生物构建体的拉伸模量，其中，载荷为10N，拉伸速度为20mm/min，温度为25℃，并且在测试过程中，保持样品润湿状态。测量结果显示，所获得的十字结构的拉伸模量为4.22MPa。这些实验结果显示，本发明的方法可用于快速、多向、精确地构建十字三维构建体。
实施例5.微结构的组装和连接
本发明的方法还可以用于组装和连接微结构，从而构建大尺寸的三维构建体。在本实施例中，利用纤维蛋白原和凝血酶的凝血反应来实现微结构的快速连接和组装，并由此制备了预设的三维构建体。
实验材料：微结构、纤维蛋白原(牛源)、凝血酶(牛源)、生理盐水(医用级)、CaCl2、无菌水、和明胶(猪源)。
其中，微结构是利用生物砖制备的；其中，所述生物砖含有恒河猴脂肪间充质干细胞，其核层包含胶原，壳层包含聚赖氨酸；并且生物砖的制备方法如下。
(a)制备U型底超疏水孔板：在超净室内将U型底孔板用酒精清洗干净后，将U型底孔板置入过氧化氢/浓硫酸溶液(30％(v/v)，H2O2:H2SO4＝1:3)中，80℃反应1小时，以进行羟基化处理。将羟基化的U型底孔板放入浓度为1％的1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基硅烷(Sigma)溶液中12小时，再在100℃烘箱中加热4小时，以进行硅化处理。最后，清洗U型底孔板并风干。
(b)制备含种子细胞的胶原溶液：将45μl NaOH溶液(4mol/L)与1ml I型胶原(4mg/mL)混合，配置成pH＝7的胶原溶液。将该溶液与恒河猴脂肪间充质干细胞混合，形成细胞悬液(细胞总浓度为2x107/ml)。
(c)制备聚赖氨酸溶液：将聚赖氨酸(Sigma，数均分子量Mn为150,000-300,000)溶于pH7.2的DMEM高糖培养基，得到浓度为1wt％的聚赖氨酸溶液。
(d)胶原滴加(形成核层结构)：采用能够吸取和排出纳升级液体的电子式吸取装置(例如Eppendorf Xplorer 0.5-10μL或Transferpette Electronic 0.5-10μL，其分液量最低可达0.1μl；或者采用SGE自动进样器1μl或0.5μl，其分别可实现10次和5次的0.1μl液体滴定)精密吸取0.1μl步骤(b)制备的I型胶原溶液，滴入步骤(a)制备的U型底超疏水孔板中，形成液滴，在37℃恒温保持30分钟，使其成型。
(e)滴加聚赖氨酸溶液(壳层结构)：更换吸头后，精密吸取0.5μl步骤(c)制备的聚赖氨酸溶液，在超疏水孔板中央位置将其滴入步骤(d)中成型的核层表面，反应10分钟，以形成包含恒河猴脂肪干细胞的生物砖。所获得的生物砖的尺寸为约1mm。
实验步骤：
1.配制纤维蛋白原溶液(5wt％)：称取纤维蛋白原0.1g，将其溶解于2mL生理盐水中(如果需要，可以在37℃水浴中充分溶解)；随后，将纤维蛋白原溶液通过0.22um滤器，进行过滤灭菌；将经过滤的纤维蛋白原溶液(用作第一试剂)保存，备用。
2.配制凝血酶溶液(2000u/mL)：称取0.0011g CaCl2，加入2000u凝血酶中(Ca2+浓度为10mmol/mL)，然后加入1mL生理盐水充分溶解；随后，将凝血酶溶液通过0.22um滤器，进行过滤灭菌；保存，备用。
3.配制明胶溶液(10wt％)：称取1g明胶，加入10mL无菌水，于37℃水浴中充分溶解；随后，将明胶溶液通过0.22um滤器，进行过滤灭菌；保存，备用。
4.将1mL凝血酶溶液和1mL明胶溶液均匀混合，然后置于37℃水浴中备用，即第二试剂。
5.制备微结构：将如上制备的生物砖浸入第一试剂10min，以在其表面附着/组装纤维蛋白原分子(如果需要，可以进行温和摇晃，以便于组装)。然后，将生物砖浸于细胞培养基5min，以洗去其表面未组装的纤维蛋白原分子，从而得到经浸渍的生物砖。随后，利用纤维蛋白原和凝血酶的凝血反应来连接和组装两个或更多个经浸渍的生物砖，以构建微结构。微结构的构建步骤如下：5a.在0℃冰浴条件下，在玻璃平皿中用第二试剂绘制线型图案(或其他期望的图案)；5b.将两个或更多个生物砖(长度为约1mm)沿所绘制的图案放置并静置2s，从而形成包含生物砖的微结构。可根据需要，重复步骤5a和5b，以构建更大尺寸的微结构。
6.将步骤5获得的微结构浸入第一试剂10min，以在其表面附着/组装纤维蛋白原分子(如果需要，可以进行温和摇晃，以便于组装)。然后将微结构浸于细胞培养基5min，以洗去其表面未组装的纤维蛋白原分子，从而得到经浸渍的微结构。
7.利用纤维蛋白原和凝血酶的凝血反应来连接和组装微结构，以形成预设的三维结构。以条状结构为例，构建步骤如下：
a.在0℃冰浴条件下，在玻璃平皿中用第二试剂绘制线型图案；
b.将微结构(长度为约3mm)沿线型图案放置并静置2s，形成由微结构构成的条状结构；
c.任选地，通过相同的方法，在条状结构上继续连接/组装微结构，或者，将两个或者更多个条状结构连接/组装成更大尺寸的条状结构。
图9展示了利用生物砖、微结构、纤维蛋白原和凝血酶来制备条状结构的实验结果；其中，图9A显示了连接/组装前的两个生物砖；图9B显示了连接/组装后的两个生物砖(其构成了一个条状微结构)；图9C显示了由生物砖制备的更大尺寸的条状微结构；图9D显示了连接/组装前的两个条状微结构(其长度各自为约3mm)；图9E显示了用两个条状微结构构建得到的更大尺寸的条状结构(其长度为约6mm)；图9F显示了被提拉的条状结构(其长度为约6mm)。实验结果显示，本发明的方法能够在5s内将两个生物砖或者两个微结构连接/组装在一起，从而可用于快速、多向、精确地构建大尺寸的三维构建体。此外，参考GB/T228.1-2010，在电子拉力测试仪(Model 5967,Instron)上测试所获得的生物构建体的拉伸模量，其中，载荷为10N，拉伸速度为20mm/min，温度为25℃，并且在测试过程中，保持样品润湿状态。实验结果显示，所获得的条状结构(图9E)的拉伸模量为2.26KPa，其即使处于提拉状态下也不会断裂分开(图9F)。这表明通过本发明方法获得的三维构建体是稳固的，具有足够的力学强度。
另外，还通过类似的方法，使用如上构建的生物砖，制备了柱状构建体。图10展示了利用生物砖、纤维蛋白原和凝血酶制备的柱状三维构建体；该柱状三维构建体的直径为约5mm(图10A)，高度为约8mm(图10B)，并且可以在任意方向上进行进一步的精确组装，形成更大尺寸的规则或者不规则结构(图10C)。这些实验结果证实，本发明方法可以用于快速、多向、精确地构建大尺寸的三维构建体。
进一步，还对如上构建的柱状三维构建体进行300rpm振荡处理。结果显示，所制备的柱状三维构建体在经过300rpm振荡处理后仍然稳定存在，不会断裂分开(图11)。这表明，通过本发明方法获得的三维构建体是稳固的，具有足够的力学强度。
此外，还通过类似的方法，使用如上构建的生物砖，制备了管状构建体。并且，还在不使用纤维蛋白原或者不使用凝血酶的条件下重复了上述实验方案，以用作对照。实验结果示于图12中。结果显示，本发明的方法可用于制备稳定的管状三维构建体，其能够在溶液中稳定存在。相比之下，在不使用纤维蛋白原或者不使用凝血酶的情况下，溶液中仅离散分布有未组装的微结构，而无法形成稳定的管状三维构建体。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (107)

1.一种用于制备生物构建体的试剂盒，所述试剂盒包含彼此分离的第一试剂和第二试剂，其中，所述第一试剂含有第一组分，所述第二试剂含有第二组分，并且当所述第一组分与第二组分接触时，能够产生粘连效果，实现粘合作用；所述试剂盒还包含含有细胞的结构单元，所述粘连效果能够将两个所述结构单元粘合在一起，形成构建体；
所述含有细胞的结构单元为生物砖，所述生物砖包括：细胞，包裹细胞的核层，和，封装核层的壳层；其中，所述核层和壳层各自独立地由生物可降解材料制成；或者，所述含有细胞的结构单元为包含生物砖或者用生物砖制成的微结构，所述生物砖包括：细胞，包裹细胞的核层，和，封装核层的壳层；其中，所述核层和壳层各自独立地由生物可降解材料制成；
所述第一组分和/或第二组分为生物相容性材料；为来源于生物的材料；和/或，为生物可降解材料。
2.权利要求1的试剂盒，所述试剂盒具有以下特征中的一个或两个：
(1)所述生物构建体为三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官；
(2)所述构建体的拉伸模量为10-20Pa，20-30Pa，30-40Pa，40-50Pa，50-60Pa，60-70Pa，70-80Pa，80-90Pa，90-100Pa，100-200Pa，200-300Pa，300-400Pa，400-500Pa，500-600Pa，600-700Pa，700-800Pa，800-900Pa，900-1000Pa，或不低于1000Pa。
3.权利要求1的试剂盒，其中，所述第一组分和第二组分是选自下列的组合：
(1)纤维蛋白原和凝血酶；
(2)海藻酸盐或氧化的海藻酸盐和含有Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+、或Fe3+的物质；
(3)含马来酰亚胺基团的分子和含自由巯基的分子；
(4)含有阴离子的物质和α-氰基丙烯酸酯；
(5)纤维蛋白原和α-氰基丙烯酸酯；
(6)血清白蛋白和戊二醛；
(7)含氨基甲酸酯基团或异氰酸酯基团的分子和含活泼氢的分子；
(8)明胶-间苯二酚和戊二醛；
(9)碳化二亚胺交联明胶和聚L-谷氨酸；和
(10)胺基化明胶和醛基化多糖。
4.权利要求3的试剂盒，所述试剂盒具有以下特征中的一个或多个：
(1)所述海藻酸盐为海藻酸钠；
(2)所述氧化的海藻酸盐为氧化的海藻酸钠；
(3)所述含有Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+、或Fe3+的物质为含有Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+、或Fe3+的溶液或半固体；
(4)所述含马来酰亚胺基团的分子为含有马来酰亚胺基团的聚乙二醇；
(5)所述含自由巯基的分子为含有自由巯基的聚乙二醇；
(6)所述含有阴离子的物质为含有阴离子的溶液或半固体；
(7)所述组合(4)中的α-氰基丙烯酸酯选自：α-氰基丙烯酸甲酯，α-氰基丙烯酸乙酯，α-氰基丙烯酸异丁酯，α-氰基丙烯酸异己酯，α-氰基丙烯酸正辛酯；
(8)所述组合(5)中的α-氰基丙烯酸酯选自：α-氰基丙烯酸甲酯，α-氰基丙烯酸乙酯，α-氰基丙烯酸异丁酯，α-氰基丙烯酸异己酯，α-氰基丙烯酸正辛酯；
(9)所述血清白蛋白为牛血清白蛋白；
(10)所述含氨基甲酸酯基团或异氰酸酯基团的分子为含氨基甲酸酯基团的聚乙二醇或含异氰酸酯基团的聚乙二醇；
(11)所述含活泼氢的分子为含羧基的聚乙二醇。
5.权利要求3的试剂盒，所述试剂盒具有以下特征中的一个或两个：
(1)所述含有Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+、或Fe3+的物质为含有Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+、或Fe3+的凝胶；
(2)所述含有阴离子的物质为含有阴离子的凝胶。
6.权利要求1的试剂盒，其中，所述第一组分为纤维蛋白原，且第二组分为凝血酶；或者，
所述第一组分为海藻酸盐或氧化的海藻酸盐，且第二组分为含有Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+、或Fe3+的物质；或者，
所述第一组分为含马来酰亚胺基团的分子，且第二组分为含自由巯基的分子；或者，
所述第一组分为含有阴离子的物质，且第二组分为α-氰基丙烯酸酯；或者
所述第一组分为纤维蛋白原，且第二组分为α-氰基丙烯酸酯；或者
所述第一组分为血清白蛋白，且第二组分为戊二醛；或者
所述第一组分为含氨基甲酸酯基团或异氰酸酯基团的分子，且第二组分为含活泼氢的分子；或者
所述第一组分为明胶-间苯二酚，且第二组分为戊二醛；或者
所述第一组分为碳化二亚胺交联明胶，且第二组分为聚L-谷氨酸；或者
所述第一组分为胺基化明胶，且第二组分为醛基化多糖。
7.权利要求6的试剂盒，所述试剂盒具有以下特征中的一个或多个：
(1)所述海藻酸盐为海藻酸钠；
(2)所述氧化的海藻酸盐为氧化的海藻酸钠；
(3)所述含有Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+、或Fe3+的物质为含有Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+、或Fe3+的溶液或半固体；
(4)所述含马来酰亚胺基团的分子为含有马来酰亚胺基团的聚乙二醇；
(5)所述含自由巯基的分子为含有自由巯基的聚乙二醇；
(6)所述含有阴离子的物质为含有阴离子的溶液或半固体；
(7)所述α-氰基丙烯酸酯选自：α-氰基丙烯酸甲酯，α-氰基丙烯酸乙酯，α-氰基丙烯酸异丁酯，α-氰基丙烯酸异己酯，α-氰基丙烯酸正辛酯；
(8)所述血清白蛋白为牛血清白蛋白；
(9)所述含氨基甲酸酯基团或异氰酸酯基团的分子为含氨基甲酸酯基团的聚乙二醇或含异氰酸酯基团的聚乙二醇；
(10)所述含活泼氢的分子为含羧基的聚乙二醇。
8.权利要求6的试剂盒，所述试剂盒具有以下特征中的一个或两个：
(1)所述含有Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+、或Fe3+的物质为含有Ca2+、Mg2+、Ba2+、Sr2+、或Fe3+的凝胶；
(2)所述含有阴离子的物质为含有阴离子的凝胶。
9.权利要求1-8任一项的试剂盒，其中，按重量计,在所述第一试剂中，第一组分的浓度为0.01-50wt％；和，
按重量计,在所述第二试剂中，第二组分的浓度为0.01-50wt％。
10.权利要求9的试剂盒，其中，按重量计，在所述第一试剂中，第一组分的浓度为0.01-0.05wt％，0.05-0.1wt％，0.1-0.5wt％，0.5-1wt％，1-5wt％，5-10wt％，10-15wt％，15-20wt％，20-25wt％，25-30wt％，30-35wt％，35-40wt％，40-45wt％，或者45-50wt％；和，
按重量计,在所述第二试剂中，第二组分的浓度为0.01-0.05wt％，0.05-0.1wt％，0.1-0.5wt％，0.5-1wt％，1-5wt％，5-10wt％，10-15wt％，15-20wt％，20-25wt％，25-30wt％，30-35wt％，35-40wt％，40-45wt％，或者45-50wt％。
11.权利要求1-8任一项的试剂盒，其中，所述第二试剂为液体或半固体。
12.权利要求11的试剂盒，所述试剂盒具有以下特征中的一个或两个：
(1)所述第二试剂为凝胶；
(2)所述第二试剂的粘度为1-1000Pa·s。
13.权利要求11的试剂盒，所述第二试剂的粘度为1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-12、12-14、14-16、16-18、18-20、20-25、25-30、30-50、50-80、80-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-800、或800-1000Pa·s。
14.权利要求1-8任一项的试剂盒，其中，所述第二试剂还含有第三组分，所述第三组分为粘性剂。
15.权利要求14的试剂盒，所述试剂盒具有以下特征中的一个或多个：
(1)所述第三组分为生物相容性材料；为来源于生物的材料；为生物可降解材料；和/或，为温敏性材料；
(2)所述第三组分选自明胶、嵌段聚合物F-127、琼脂糖、聚乙二醇、瓜尔胶、聚乙烯醇、壳聚糖、胶原、透明质酸、甲壳素、纤维素及其衍生物、聚氨基酸、聚N-异丙基丙烯酰胺-聚乙二醇嵌段共聚物、聚乙二醇共聚物、海藻酸盐、改性的海藻酸盐、Matrigel、壳聚糖/甘油磷酸钠体系、和聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶；
(3)按重量计，所述第三组分的浓度为0.01-50wt％。
16.权利要求15的试剂盒，所述试剂盒具有以下特征中的一个或多个：
(1)所述纤维素衍生物为羟丙基纤维素；
(2)所述聚乙二醇共聚物为聚乙烯醇-聚乙二醇共聚物；
(3)所述海藻酸盐为海藻酸钠；
(4)所述改性的海藻酸盐为氧化的海藻酸盐；
(5)按重量计，所述第三组分的浓度为0.01-0.05wt％，0.05-0.1wt％，0.1-0.5wt％，0.5-1wt％，1-5wt％，5-10wt％，10-15wt％，15-20wt％，20-25wt％，25-30wt％，30-35wt％，35-40wt％，40-45wt％，或者45-50wt％。
17.权利要求16的试剂盒，所述氧化的海藻酸盐为氧化的海藻酸钠。
18.权利要求1-8任一项的试剂盒，所述试剂盒具有以下特征中的一个或两个：
(1)所述试剂盒还包含辅助材料；
(2)所述微结构具有微米至厘米级别的尺寸。
19.权利要求18的试剂盒，所述试剂盒具有以下特征中的一个或两个：
(1)所述辅助材料是生物相容性和/或生物可降解的；
(2)所述辅助材料是温敏性材料。
20.权利要求19的试剂盒，所述温敏性材料选自明胶，聚N-异丙基丙烯酰胺-聚乙二醇嵌段共聚物，聚乙二醇共聚物，琼脂糖，Matrigel，壳聚糖/甘油磷酸钠体系，PluronicF127，和聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶。
21.权利要求20的试剂盒，所述聚乙二醇共聚物为聚乙烯醇-聚乙二醇共聚物。
22.权利要求1-8任一项的试剂盒，其中，所述微结构的尺寸为100μm-10cm。
23.权利要求1-8任一项的试剂盒，其中，所述微结构的尺寸为100μm-200μm，200μm-300μm，300μm-400μm，400μm-500μm，500μm-600μm，600μm-700μm，700μm-800μm，800μm-900μm，900μm-1mm，1mm-2mm，2mm-3mm，3mm-4mm，4mm-5mm，5mm-6mm，6mm-7mm，7mm-8mm，8mm-9mm，9mm-10mm，10mm-20mm，20mm-30mm，30mm-40mm，40mm-50mm，50mm-60mm，60mm-70mm，70mm-80mm，80mm-90mm或90mm-100mm。
24.一种用于制备生物构建体的套盒，其包含一个或多个权利要求1-23任一项的试剂盒。
25.权利要求24的套盒，所述生物构建体为三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官。
26.一种用于制备生物构建体的方法，其包括使用权利要求1-23任一项的试剂盒，或者权利要求24或25的套盒。
27.权利要求26的方法，所述生物构建体为三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官。
28.一种用于制备生物构建体的方法，其包括下述步骤：
步骤(1)：提供一种或多种含有细胞的结构单元，其全部或者部分表面附着有第一组分；所述第一组分包含于第一试剂中；
步骤(2)：在支持物上用含有第二组分的第二试剂绘制预设的图案；其中，当所述第一组分与第二组分接触时，能够产生粘连效果，实现粘合作用；
步骤(3)：根据步骤(2)绘制的图案来放置步骤(1)中所述的结构单元，使所述结构单元表面上的第一组分与所述图案中的第二组分接触，产生粘连效果，从而将所述结构单元组装成生物构建体；
所述含有细胞的结构单元为生物砖，所述生物砖包括：细胞，包裹细胞的核层，和，封装核层的壳层；其中，所述核层和壳层各自独立地由生物可降解材料制成；或者，所述含有细胞的结构单元为包含生物砖或者用生物砖制成的微结构，所述生物砖包括：细胞，包裹细胞的核层，和，封装核层的壳层；其中，所述核层和壳层各自独立地由生物可降解材料制成；
所述第一组分和/或第二组分为生物相容性材料；为来源于生物的材料；和/或，为生物可降解材料。
29.权利要求28的方法，所述方法还包括下述步骤：
步骤(4)：在前一步骤获得的生物构建体上，用第二试剂绘制预设的图案；
步骤(5)：根据前一步骤绘制的图案来放置步骤(1)中所述的结构单元，使所述结构单元表面上的第一组分与所述图案中的第二组分接触，产生粘连效果，从而将所述结构单元组装到前一步骤的生物构建体上，形成新的生物构建体。
30.权利要求29的方法，所述方法还包括步骤(6)：重复步骤(4)和(5)一次或多次，从而，制备得到生物构建体。
31.权利要求28的方法，所述方法具有以下特征中的一个或两个：
(1)所述生物构建体为三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官；
(2)所述组装为粘合。
32.权利要求28的方法，所述微结构的尺寸为100μm-10cm。
33.权利要求28的方法，所述微结构的尺寸为100μm-200μm，200μm-300μm，300μm-400μm，400μm-500μm，500μm-600μm，600μm-700μm，700μm-800μm，800μm-900μm，900μm-1mm，1mm-2mm，2mm-3mm，3mm-4mm，4mm-5mm，5mm-6mm，6mm-7mm，7mm-8mm，8mm-9mm，9mm-10mm，10mm-20mm，20mm-30mm，30mm-40mm，40mm-50mm，50mm-60mm，60mm-70mm，70mm-80mm，80mm-90mm或90mm-100mm。
34.权利要求28-30任一项的方法，其中，在步骤(1)中，全部或者部分表面附着有第一组分的结构单元是通过将所述结构单元在包含所述第一组分的第一试剂中浸渍而获得的。
35.权利要求34的方法，所述方法具有以下特征中的一个或多个：
(1)步骤(1)包括，将所述结构单元在所述第一试剂中进行浸渍，从而提供全部或者部分表面附着有所述第一组分的结构单元；
(2)将所述结构单元在第一试剂中浸渍0.1-30min；
(3)在摇晃或振荡的条件下，将所述结构单元在第一试剂中浸渍；
(4)浸渍步骤是在4-37℃下进行的；
(5)步骤(1)还包括，在浸渍于第一试剂中后，洗涤所述结构单元。
36.权利要求35的方法，所述方法具有以下特征中的一个或多个：
(1)将所述结构单元在第一试剂中浸渍0.1-0.2min，0.2-0.3min，0.3-0.4min，0.4-0.5min，0.5-0.6min，0.6-0.7min，0.7-0.8min，0.8-0.9min，0.9-1min，1-2min，2-3min，3-4min，4-5min，5-6min，6-7min，7-8min，8-9min，9-10min，10-15min，15-20min，20-25min，或25-30min；
(2)浸渍步骤是在室温条件下或者在低温条件下进行，所述室温条件是15-37℃，所述低温条件是4-15℃；
(3)使用缓冲液或培养基溶液来洗涤所述结构单元；
(4)在浸渍于第一试剂中后，通过将所述结构单元浸于缓冲液或培养基溶液中来洗涤所述结构单元；
(5)洗涤步骤进行0.1-10min；
(6)洗涤步骤是在4-37℃下进行的。
37.权利要求36的方法，所述方法具有以下特征中的一个或多个：
(1)所述特征(3)中的缓冲液为生理缓冲溶液；
(2)所述特征(4)中的缓冲液为生理缓冲溶液；
(3)洗涤步骤进行0.1-0.2min，0.2-0.3min，0.3-0.4min，0.4-0.5min，0.5-0.6min，0.6-0.7min，0.7-0.8min，0.8-0.9min，0.9-1min，1-2min，2-3min，3-4min，4-5min，5-6min，6-7min，7-8min，8-9min或9-10min；
(4)洗涤步骤是在室温条件下或者在低温条件下进行，所述室温条件是15-37℃，所述低温条件是4-15℃。
38.权利要求28-30任一项的方法，其中，在步骤(1)中，全部或部分表面附着有第一组分的结构单元是通过将包含所述第一组分的第一试剂涂布于所述结构单元的表面而获得的。
39.权利要求38的方法，步骤(1)包括，将所述第一试剂涂布于所述结构单元的全部或部分表面，从而提供全部或部分表面附着有所述第一组分的结构单元。
40.权利要求29的方法，所述方法具有以下特征中的一个或两个：
(1)步骤(2)中预设的图案与步骤(4)中预设的图案相同或者不同；
(2)将步骤(2)和/或步骤(4)中的图案预设为点状图案，线形图案，条形图案，三角形图案，四边形图案，环形图案，圆形图案，十字形图案，不规则图案，或其任何组合。
41.权利要求28-30任一项的方法，所述方法具有以下特征中的一个或多个：
(1)步骤(2)中的支持物是固体或半固体；
(2)步骤(2)中的支持物为平台或生物构建体；
(3)步骤(2)中的支持物为生物构建体，并且，在步骤(3)中，由所述结构单元与步骤(2)中的支持物共同组装成生物构建体。
42.权利要求41的方法，所述方法具有以下特征中的一个或多个：
(1)步骤(2)中的支持物是凝胶；
(2)所述平台为打印平台；
(3)所述生物构建体为使用权利要求28-31任一项的方法构建的生物构建体。
43.权利要求28-30任一项的方法，所述方法具有以下特征中的一个或两个：
(1)在步骤(3)中，在放置所述的结构单元后，静置0.1-60s；
(2)步骤(3)是在4-37℃下进行的。
44.权利要求28-30任一项的方法，所述方法具有以下特征中的一个或两个：
(1)在步骤(3)中，在放置所述的结构单元后，静置0.1-1s，1-2s，2-3s，3-4s，4-5s，5-10s，10-15s，15-20s，20-25s，25-30s，30-35s，35-40s，40-45s，45-50s，50-55s，或55-60s；
(2)步骤(3)是在室温条件下或者在低温条件下进行，所述室温条件为25-37℃，所述低温条件为4-15℃。
45.权利要求29或30的方法，所述方法具有以下特征中的一个或两个：
(1)在步骤(5)中，在放置所述的结构单元后，静置0.1-60s；
(2)步骤(5)是在4-37℃下进行的。
46.权利要求29或30的方法，所述方法具有以下特征中的一个或两个：
(1)在步骤(5)中，在放置所述的结构单元后，静置0.1-1s，1-5s，5-10s，10-15s，15-20s，20-25s，25-30s，30-35s，35-40s，40-45s，45-50s，50-55s，或55-60s；
(2)步骤(5)是在室温条件下或者在低温条件下进行，所述室温条件为25-37℃，所述低温条件为4-15℃。
47.权利要求29或30的方法，其中，步骤(3)中使用的结构单元与步骤(5)中使用的结构单元是相同或者不同的。
48.权利要求29或30的方法，所述方法具有以下特征中的一个或两个：
(1)步骤(3)中的结构单元所包含的细胞与步骤(5)中的结构单元所包含的细胞是相同或不同的；
(2)在步骤(3)和步骤(5)中使用包含相同细胞的结构单元；或者，在步骤(3)和步骤(5)中使用两种或更多种的结构单元，其各自包含不同的细胞或细胞组合。
49.权利要求28-30任一项的方法，其中，对于每一轮的图案绘制和结构单元组装，使用相同或不同的第一试剂和第二试剂的组合。
50.权利要求28-30任一项的方法，其中，对于每一轮的图案绘制和结构单元组装，使用相同或不同的第一组分和第二组分的组合。
51.权利要求29或30的方法，其中，步骤(2)和(3)使用第一试剂和第二试剂的第一种组合，并且步骤(4)和(5)使用相同的组合或者不同的组合。
52.权利要求29或30的方法，其中，步骤(2)和(3)使用第一组分和第二组分的第一种组合，并且步骤(4)和(5)使用相同的组合或者不同的组合。
53.权利要求29或30的方法，所述方法具有以下特征中的一个或两个：
(1)步骤(4)中的所述生物构建体是三维的；
(2)在步骤(4)中，在所述生物构建体的任一个或多个表面上，用第二试剂绘制预设的图案。
54.权利要求30的方法，所述方法具有以下特征中的一个或两个：
(1)在步骤(6)中，重复步骤(4)和(5)一次或多次；
(2)在步骤(6)中，对于每一次的步骤(4)和(5)的重复，使用相同或不同的结构单元；和/或，相同或不同的第一试剂和第二试剂的组合；和/或，相同或不同的图案。
55.权利要求30的方法，所述方法具有以下特征中的一个或两个：
(1)在步骤(6)中，重复步骤(4)和(5)1-2次，2-3次，3-4次，4-5次，5-6次，6-10次，10-15次，15-20次，20-30次，30-40次，40-50次，50-100次，100-200次，200-500次，或更多次；
(2)在步骤(6)中，对于每一次的步骤(4)和(5)的重复，使用含有相同或不同的细胞或细胞组合的结构单元；和/或，相同或不同的第一组分和第二组分的组合；和/或，相同或不同的图案。
56.权利要求30的方法，其中，在进行步骤(2)-(6)期间，还在所产生的生物构建体的内部或外周添加辅助材料。
57.权利要求56的方法，所述方法具有以下特征中的一个或多个：
(1)所述辅助材料为用于支撑的辅助材料；
(2)所述辅助材料不包含细胞；
(3)所述辅助材料是生物相容性和/或生物可降解的；
(4)所述辅助材料是为温敏性材料。
58.权利要求28-30任一项的方法，其中，所述生物构建体为条状生物构建体，并且所述方法包括下述步骤：
(1)提供含有细胞的结构单元，其全部或者部分表面附着有第一组分；所述第一组分包含于第一试剂中；
(2)在支持物上用含有第二组分的第二试剂绘制线形或条形图案；其中，当所述第一组分与第二组分接触时，能够产生粘连效果，实现粘合作用；
(3)根据步骤(2)绘制的图案来放置步骤(1)中所述的结构单元，使所述结构单元表面上的第一组分与所述图案中的第二组分接触，产生粘连效果，从而将所述结构单元组装成生物构建体；
(4)在前一步骤获得的生物构建体上，用所述第二试剂绘制线形或条形图案；
(5)根据前一步骤绘制的图案来放置步骤(1)中所述的结构单元，使所述结构单元表面上的第一组分与所述图案中的第二组分接触，产生粘连效果，从而将所述结构单元组装到前一步骤的生物构建体上，形成新的生物构建体。
59.权利要求58的方法，所述方法具有以下特征中的一个或多个：
(1)所述组装为粘合；
(2)所述步骤(3)形成的生物构建体为第一层条状结构；
(3)所述步骤(5)包括：在前一步骤的条状结构上，将所述结构单元组装成另一层条状结构；
(4)所述方法还包括步骤(6)：重复步骤(4)和(5)一次或多次，从而，制备得到条状生物构建体。
60.权利要求56的方法，其中，所述方法通过生物打印法来实施。
61.权利要求60的方法，所述方法具有以下特征中的一个或多个：
(1)使用打印机来进行生物打印法；或者，使用自动化或非自动化机械过程来进行生物打印法；或者，通过使用手工放置或手工沉积法来进行生物打印法；
(2)通过挤出式打印法或模块化打印法来对结构单元进行打印；
(3)使用模块化打印法，挤出式打印法，或喷墨式打印法来对所述第二试剂进行打印；
(4)使用模块化打印法，挤出式打印法，或喷墨式打印法来对所述辅助材料进行打印。
62.权利要求61的方法，所述方法具有以下特征中的一个或两个：
(1)所述打印机为3D生物打印机；
(2)所述手工沉积法为使用移液器。
63.权利要求28-30任一项的方法，其中，使用3D生物打印机来制备生物构建体。
64.权利要求63的方法，所述3D生物打印机包含：第一墨盒，其用于提供含有细胞的结构单元；第二墨盒，其用于提供第二试剂；第一打印喷头；以及，连接至第二墨盒的第二打印喷头。
65.权利要求64的方法，所述方法具有以下特征中的一个或多个：
(1)所述含有细胞的结构单元为生物砖；
(2)所述3D生物打印机还包含：第三墨盒，其用于提供辅助材料；以及，第三打印喷头；
(3)所述3D生物打印机还包含：用于提供第一试剂的第四墨盒。
66.权利要求65的方法，所述方法包括下述步骤：
步骤(1)：在3D生物打印机的第一墨盒中提供含有细胞的结构单元，其全部或者部分表面附着有第一组分，并且在3D生物打印机的第二墨盒中提供含有第二组分的第二试剂；其中，当所述第一组分与第二组分接触时，能够产生粘连效果，实现粘合作用；
步骤(2)：通过3D生物打印机的连接至第二墨盒的第二打印喷头，在打印平台上用所述第二试剂绘制预设的图案；
步骤(3)：通过3D生物打印机的第一打印喷头，将步骤(1)中的结构单元打印至步骤(2)绘制的图案上，使所述结构单元表面上的第一组分与所述图案中的第二组分接触，产生粘连效果，从而将所述结构单元组装成生物构建体。
67.权利要求66的方法，所述方法具有以下特征中的一个或多个：
(1)步骤(1)中的含有细胞的结构单元为生物砖；
(2)步骤(2)中的图案为线形或条形图案；
(3)步骤(3)中的组装为粘合；
(4)步骤(3)中的生物构建体为条状结构。
68.权利要求66的方法，所述方法还包括下述步骤：
步骤(4)：通过所述第二打印喷头，在前一步骤获得的生物构建体上，用所述第二试剂绘制预设的图案；
步骤(5)：通过所述第一打印喷头，将步骤(1)中的结构单元打印至前一步骤绘制的图案上，使所述结构单元表面上的第一组分与所述图案中的第二组分接触，产生粘连效果，从而将所述结构单元组装到前一步骤的生物构建体上，形成新的生物构建体。
69.权利要求68的方法，所述方法具有以下特征中的一个或多个：
(1)步骤(4)中，所述前一步骤获得的生物构建体为条状结构；
(2)步骤(4)中的图案为线形或条形图案；
(3)步骤(5)包括：在前一步骤的条状结构上，将所述结构单元组装成另一层条状结构。
70.权利要求68的方法，所述方法还包括步骤(6)：重复步骤(4)和(5)一次或多次，从而，制备得到生物构建体。
71.权利要求70的方法，步骤(6)得到的生物构建体为条状生物构建体。
72.权利要求66的方法，在步骤(1)中，全部或者部分表面附着有第一组分的结构单元是通过将所述结构单元在包含所述第一组分的第一试剂中浸渍而获得的。
73.权利要求66的方法，步骤(1)包括，将第一试剂注入第一墨盒中，以将所述结构单元在所述第一试剂中进行浸渍，从而提供全部或者部分表面附着有所述第一组分的结构单元；或者，使用第一打印喷头从第一墨盒中吸取/抓取含有细胞的结构单元，然后将其浸渍于第一试剂中，从而提供全部或者部分表面附着有第一组分的结构单元。
74.权利要求73的方法，所述方法具有以下特征中的一个或多个：
(1)所述第一试剂为提供于第四墨盒的第一试剂；
(2)所述含有细胞的结构单元为生物砖；
(3)在第一墨盒中直接提供其全部或部分表面附着有所述第一组分的结构单元；
(4)所述第一打印喷头与所述第一墨盒是流体连通的，从而，所述结构单元可被传送至所述第一打印喷头，用于后续的打印；或者，所述第一打印喷头能够移动至所述第一墨盒的位置，并从第一墨盒中吸取/抓取所述结构单元，用于后续的打印。
75.权利要求70的方法，所述方法具有以下特征中的一个或多个：
(1)在进行步骤(2)-(6)期间，还利用3D生物打印机的第三打印喷头，在所产生的生物构建体的内部或外周打印提供于第三墨盒中的辅助材料；
(2)步骤(2)-(6)是连续的和/或基本连续的；
(3)在步骤(2)-(6)中，连续地生物打印多层结构和/或多个区段，以获得具有预定模式的、包含多层结构和/或多个区段的三维构建体。
76.权利要求75的方法，所述辅助材料为用于支撑的辅助材料。
77.权利要求76的方法，所述方法具有以下特征中的一个或多个：
(1)所述辅助材料不包含细胞；
(2)所述辅助材料是生物相容性和/或生物可降解的；
(3)所述辅助材料为温敏性材料。
78.权利要求28-30任一项的方法，其中，所述方法还包括，获得组织或组织损伤位点的细胞分布信息。
79.权利要求78的方法，所述细胞分布信息选自，组织或组织损伤位点的各个细胞层的位置或类型，各个层的细胞的类型，各个层中不同细胞的比率，各个层中的细胞分布模式，或其任何组合。
80.权利要求28-30任一项的方法，其中，所产生的生物构建体为三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官。
81.权利要求28-30任一项的方法，其中，所产生的生物构建体为人工血管。
82.权利要求28-30任一项的方法，其中，所产生的生物构建体为具有毫米级或者厘米级或者更大的尺寸的构建体。
83.权利要求28-30任一项的方法，其中，所产生的生物构建体的尺寸为1-2mm、2-5mm、5mm-1cm、1-2cm、2-5cm、5-10cm、10-20cm、20-50cm、或至少50cm。
84.权利要求28-30任一项的方法，其中，所产生的生物构建体是片状结构，或中空管状结构，或中空三维结构，或实心三维结构，或其任何组合。
85.权利要求84的方法，所述方法具有以下特征中的一个或多个：
(1)所述片状结构为长方形、正方形、圆形、椭圆形、六角形或不规则形状的片状结构；
(2)所述中空三维结构为中空立方体、中空球体、中空的矩形棱柱体、中空圆柱体、或中空的不规则形状的三维结构；
(3)所述实心三维结构为实心立方体、实心球体、实心矩形棱柱体、实心圆柱体、或实心不规则形状的三维结构。
86.权利要求28-30任一项的方法，所述生物构建体的形状模拟天然组织或器官的形状。
87.权利要求28-30任一项的方法，其中，所述方法还包括步骤(7)：在允许结构单元内的细胞增殖、分化、迁移、分泌和/或新陈代谢的条件下，培养所获得的生物构建体。
88.权利要求87的方法，所述方法具有以下特征中的一个或多个：
(1)培养所获得的生物构建体1-3、3-5、5-7、7-10、10-14、14-21或21-28天；
(2)在3D培养箱中或在生物反应器中培养所获得的生物构建体；
(3)所述结构单元为生物砖。
89.权利要求28-30任一项的方法，其中，所产生的生物构建体被直接应用于下游应用，而不进行进一步的培养。
90.权利要求1-23任一项的试剂盒或权利要求24或25的套盒用于制备生物构建体的用途。
91.权利要求90的用途，所述生物构建体为三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官。
92.一种生物构建体，其通过权利要求28-89任一项的方法制备。
93.权利要求92的生物构建体，其为三维构建体，组织前体，人工组织或人工器官。
94.权利要求92或93的生物构建体的用途，其用于研究干细胞分化，所述用途用于非诊断或治疗目的。
95.权利要求94的用途，所述干细胞为MSC细胞。
96.权利要求92或93的生物构建体的用途，其用于药物发现，所述用途用于非诊断或治疗目的。
97.权利要求92或93的生物构建体的用途，其用于药物筛选，所述用途用于非诊断或治疗目的。
98.权利要求92或93的生物构建体的用途，其用于体外测定，所述用途用于非诊断或治疗目的。
99.权利要求92或93的生物构建体的用途，其用于组织工程，所述用途用于非诊断或治疗目的。
100.权利要求92或93的生物构建体的用途，其用于组织再生，所述用途用于非诊断或治疗目的。
101.权利要求92或93的生物构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于研究干细胞分化。
102.权利要求92或93的生物构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于药物发现。
103.权利要求92或93的生物构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于药物筛选。
104.权利要求92或93的生物构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于体外测定，所述用途用于非诊断或治疗目的。
105.权利要求92或93的生物构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于组织工程，所述用途用于非诊断或治疗目的。
106.权利要求92或93的生物构建体的用途，其用于制备试剂盒，所述试剂盒用于组织再生，所述用途用于非诊断或治疗目的。
107.权利要求101的用途，所述干细胞为MSC细胞。
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