CN109758610A - Igf-1-sf-cs三维支架及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于再生工程技术领域，涉及IGF‑1‑SF‑CS三维支架及其制备方法和应用。该制备方法包括以下步骤：(1)分别制备丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液；(2)将丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液混合后透析，得到透析液；(3)将透析液与IGF‑1溶液混合、在‑50℃至‑30℃下冷冻干燥，制得所述IGF‑1‑SF‑CS三维支架。本发明提供的三维支架可确保从SF‑CS支架释放的IGF‑1处于治疗水平并增强基质产生。
Description
技术领域
本发明属于再生工程技术领域，更具体地，涉及IGF-1-SF-CS三维支架及其制备方法和应用。
背景技术
组织工程是身体通过细胞，生物分子和支架的递送来自我愈合的一种说法。诸如组织工程支架的生物材料可以提供骨损伤的功能性再生的途径。生长因子具有短的半衰期并且可以从组织中快速清除。因此，已经提出使用支架的递送方法来保护生长因子免于降解并在更长的时间内递送它们。然而，为骨组织工程和骨修复目的而向细胞递送生长因子的最佳策略仍然是本领域的巨大挑战。
支架的作用是充当人工细胞外基质(ECM)；因此，它必须是高度多孔的并且具有足够的表面积和机械强度以实现该功能。基于支架的系统为骨修复提供了3D微环境的潜力，但许多结构的生物分子和机械特征需要优化。SF-CS支架因其可生物降解，生物相容性和具有骨传导性质而被公认为用于整形外科和颌面外科的优良材料。在申请人之前的研究中，将丝素蛋白(SF)和壳聚糖(CS)混合到3D支架中，提供独特的化学结构和机械性质，可用于骨组织工程和再生应用。
生长因子是刺激细胞增殖和分化的可溶性蛋白质，可用于帮助细胞迁移，并增加基质的产生。增强生长因子的体外和体内功效的一种选择是将它们掺入聚合物生物材料中以维持其稳定性并控制其释放动力学。生长因子可以直接掺入聚合物支架中，以在支架制造后用于组织形成。生长因子补充策略已经在骨组织再生的背景下显示出显著的功能价值。因此，这些蛋白质在体外组织工程中发挥重要作用，可能需要外源添加以实现最佳组织修复。
在先前的研究中，制备含有生长因子的支架的方法是：将生长因子添加到培养基中，然后将混合溶液中的生长因子掺入形成的聚合物支架中，并且生长因子的持续释放促进体外和体内骨再生，其缺点是这些支架系统中生长因子的剂量和空间分布不受控制，在早期阶段发生快速药物递送。当药物被释放时，它或者接近表面，或者很容易从大部分材料中扩散出来，并且当药剂耗尽时以较低的释放速率结束。
因此，需要开发一种新的具有生长因子的支架，其中生长因子的剂量和空间分布可控。
发明内容
为了解决该问题，本发明提出的新策略是在SF-CS支架制造期间将生物活性分子(IGF-1)直接模式化和固定到SF-CS支架上，得到IGF-1-SF-CS三维支架，继而提供一种具有生物活性分子(IGF-1)和细胞(BMSC)的SF-CS三维支架，以增强骨再生。本发明提供的三维支架可确保从SF-CS支架释放的IGF-1处于治疗水平并增强基质产生。
IGF-1是一种参与骨发育和体内平衡的合成代谢生长因子，已被广泛研究用于骨修复。先前的研究已经证明，稳定或每日生长因子作用将是有利的，并且10μg/mL IGF-1足以刺激体外培养的软骨细胞的增殖和代谢活性。因此，本发明选择该生长因子作为选择生长因子，将IGF-1添加到SF-CS支架中。
BMSCs是多能祖细胞，具有分化为间充质谱系的能力，包括成骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞。BMSCs的分化和功能可以通过IGF-1调节。例如，IGF-1刺激BMSCs的增殖并促进它们分化成软骨细胞。此外，IGF-1在成骨细胞分化的早期阶段通过成骨细胞增强细胞外骨基质蛋白的产生。BMSCs在移植前用成骨培养基诱导成成骨细胞样细胞。来源于BMSCs的成骨细胞样细胞与成骨细胞具有相似的特征。成骨细胞样细胞具有良好的生长和增殖能力，并且在几次传代后保持其生物学特性恒定。此外，类骨质细胞可以分泌大量骨基质，形成钙盐沉积的成熟骨，并在骨生成和骨再生中发挥重要作用。移植前BMSCs的体外骨分化可以提高植入效率。
本发明评估了BMSCs和BMSCs分化的成骨细胞样细胞在IGF-1-SF-CS支架和丝素蛋白-壳聚糖(SF-CS)支架中的重建效果，并分析了IGF-1在SF-CS中的作用。首次针对符合骨组织工程要求的IGF-1-SF-CS支架的应用和生物相容性进行了讨论。探索了SF-CS支架固定化IGF-1在IGF-1-SF-CS支架中驱动IGF-1生物活性的能力，IGF-1的持续递送具有可生物降解的SF-CS的机械特性。本发明的支架对骨修复和再生更有利，可为骨组织工程提供理想的IGF-1-SF-CS支架。
本发明的第一方面提供一种IGF-1-SF-CS三维支架的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)分别制备丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液；
(2)将丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液混合后透析，得到透析液；
(3)将透析液与IGF-1溶液混合、在-50℃至-30℃下冷冻干燥，制得所述IGF-1-SF-CS三维支架。
本发明中，SF和CS可通过本领域常规的方法制得或者通过商购获得。
根据本发明一种优选实施方式，该方法还包括，将冷冻干燥后的IGF-1-SF-CS三维支架在浓度为10％以下的甲醇溶液中处理，然后再次进行冷冻干燥以除去过量的甲醇。
根据本发明，优选地，所述透析液中，丝素蛋白与壳聚糖的重量比为1：0.8-1.2，最优选为1：1。
本发明的方法可以根据需要调节三维支架中IGF-1的含量和分布，根据本发明一种具体实施方式，所述IGF-1-SF-CS三维支架中，IGF-1与SF的重量比为1：105-103。
本发明的方法中，丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液的浓度可根据需要在本领域已知的范围内选择，优选地，丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液的浓度各自为1-10wt％。在满足上述重量比的前提下，所述IGF-1溶液的浓度优选为5-15μg/mL。
根据本发明，选择合适的冷冻干燥温度可进一步保障三维支架的结构不被破坏，优选地，冷冻干燥的温度为-50℃至-30℃。
本发明的方法中，透析的条件可采用本领域常规的条件，优选地，所述透析的条件包括：在纤维素透析管中对蒸馏水进行透析。所述纤维素透析管的截留尺寸可根据目标物分子量选择，例如MWCO＝50000。
本发明的第二方面提供由上述制备方法制得的IGF-1-SF-CS三维支架。
本发明的第三方面提供上述IGF-1-SF-CS三维支架的应用，特别是作为骨组织工程生物材料的应用。
本发明建立了SF-CS支架与IGF-1结合的IGF-1-SF-CS三维支架，可作为骨再生医学应用的生物材料系统，具有良好的应用前景。实验结果证实，IGF-1-SF-CS三维支架中的IGF-1对BMSCs的直接作用是增殖，迁移，分化和存活。IGF-1-SF-CS支架是生物相容的，并且在体外对BMSC没有负面影响。因此，IGF-1-SF-CS支架具有生长因子递送能力，可在骨组织工程应用中提供功能益处。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1A-图1D示出了倒置光学显微镜观察骨髓间充质干细胞的形态。图1A：原代细胞；图1B：培养3天；图1C：培养12天；图1D：第三代骨髓间充质干细胞。
图2A-图2E示出了体外诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究结果。图2A：骨髓间充质干细胞成骨诱导14天后中的表达。图2B：无成骨诱导骨髓间充质干细胞培养14天后碱性磷酸酶中的表达表达。图2C和2D：Von Kossa法比较培养18天后骨髓基质细胞经成骨诱导组和未经成骨诱导组钙结节显示。图2E：骨髓间充质干细胞成骨诱导组与未成骨诱导组比较钙结节的定量分析。*p<0.05。
图3示出了骨髓间充质干细胞在不同支架材料和对照组中的粘附率，*表示与对照组相比P＜0.05。
图4A-图4D为IGF-1-SF-CS支架中培养的骨髓间充质干细胞的SEM图像。图4A：IGF-1-SF-CS支架具有多孔结构；图4B：IGF-1-SF-CS支架的孔壁表面和截面；图4C：IGF-1-SF-CS支架在第3天培养的骨髓间充质干细胞；图4D：IGF-1-SF-CS支架在第7天培养的骨髓间充质干细胞。
图5示出了CCK-8法检测支架和对照组中骨髓间充质干细胞增殖情况。IGF-1-SF-CS支架可在第三天后促进骨髓间充质干细胞增殖。*表示与SF-CS组相比，P＜0.05。
图6示出了ALP法检测支架和对照组骨髓基质细胞的增殖情况。IGF-1-SF-CS支架可在第四天后促进骨髓间充质干细胞的增殖。*表示与SF-CS组相比P＜0.05。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
动物和道德声明。
组织工程技术修复下颌骨缺损的研究。该研究使用动物实验模型。健康的新西兰白兔获自中国医科大学(中国沈阳)的实验动物中心，其国家动物使用许可证号为SCXK-LN2011-0009。动物使用已经中国医科大学动物使用与护理委员会批准，协议号为CMU62043006。所有实验和外科手术均经中国医科大学动物护理和使用委员会批准，该委员会符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南。所有努力都是为了尽量减少使用的动物数量和他们的痛苦。
实施例1
材料
三只健康的新西兰白兔，体重约3.0公斤。生丝购自Nancong(中国四川)。壳聚糖购自同兴公司(江苏，中国)。IGF-1(10μg/mL)购自PROSPEC(以色列)。NaHCO3，CaCl2和乙醇购自南京(中国)。除非特别说明，否则所有其他化学品和试剂均为分析纯。
BMSC分离，培养和分化
对于外科手术，将兔子用10％水合氯醛(0.35mL/100g)腹膜内麻醉。使用肝素化注射器从兔股骨中提取骨髓(3-5mL)，然后离心并用PBS洗涤。用Percoll淋巴细胞分离培养基离心细胞悬浮液，收集中间的象牙白色层，PBS洗涤并在完全低葡萄糖DMEM中培养。将细胞以1.0×104个细胞/cm2接种在培养瓶中，并在37℃，含5％CO2的潮湿气氛中培养。24小时后更换一半培养基，48小时后完全更换，然后每2-3天更换培养基。通过刷新培养基丢弃未附着的细胞。用胰蛋白酶消化，离心并以1：2的比例传代85％汇合的细胞。诱导第三代细胞分化为成骨诱导液(0.1μmol/L地塞米松，50μmol/mL维生素C，10mmol/Lβ-甘油磷酸盐和含10％胎牛血清葡萄糖DMEM)，然后每2-3天更换一次培养基。
碱性磷酸酶染色
在成骨诱导后14天和没有成骨诱导的那些(对照组)评估BMSC的碱性磷酸酶活性。将细胞在4℃下固定10分钟，并与2％硝酸钴和1％硫化铵(ALP试剂盒，虹桥，中国上海)一起温育。染成褐色的区域被指定为阳性。
Von Kossa测定
在没有成骨诱导的那些(对照组)中，在成骨诱导后18天，将在6孔板中铺板的BMSC固定在70％乙醇中。用von Kossa银染色细胞并置于紫外光下10分钟。然后用5％NaS2O3处理细胞2分钟，并用蒸馏水洗涤。通过光倒置显微镜观察直径大于1mm的钙结节。
IGF-1-SF-CS和SF-CS支架的制备
将家蚕丝纤维用0.5％(w/w)NaHCO3溶液在100℃处理两次，每次30分钟，然后用70℃蒸馏水冲洗，除去丝胶蛋白30分钟。然后恒温干燥。将脱胶的丝在7℃下在CaCl2(44.4g)/CH3CH2OH(46mL)/H2O(57.5mL)(摩尔比为1：2：8)的混合溶剂体系中溶解6小时并过滤得到SF溶液。在纤维素透析管(MWCO＝50000)中对蒸馏水透析3天后，每12小时换水一次。所用SF的最终浓度为8％。
通过将高分子量CS(82.7％脱乙酰化；Tongxing China)溶于3.66％(w/v)的2％乙酸中制备CS溶液。所用CS的最终浓度为2％。
通过将10μg IGF-1溶解在1mL去离子无菌水中来制备IGF-1溶液(10μg/mL)。
在相同的溶剂体系中以10wt％(CS和SF的总重量)制备SF/CS重量比为5：5的SF/CS共混物溶液(100mL)。在纤维素透析管(MWCO＝50000)中对蒸馏水透析3天，每12h换水，得到CS和SF溶液。然后加入1mL IGF-1溶液，在磁力搅拌器中搅拌50分钟。将CS，SF和IGF-1溶液倒入24孔聚四氟乙烯培养板中。将CS，SF和IGF-1溶液冻干(VFD-2000，Boyikang，PRChina)以获得IGF-1-SF-CS支架。然后用相同的方法制备SF-CS支架。
为了改善水稳定性，将干燥的IGF-1-SF-CS和SF-CS支架在甲醇溶液(浓度<10％)中处理2小时以使SF含量结晶并中和CS含量。冻干IGF-1-SF-CS和SF-CS支架以除去过量的甲醇。
孔隙率和吸水性评估
使用己烷置换评估IGF-1-SF-CS和SF-CS支架的孔隙率(Kim UJ,Park J,Kim H,Wada M and Kaplan DL.Three-dimensional aqueousderived biomaterial scaffoldsfrom silk fibroin.Biomaterials 26:2775–2785,2005.)。简而言之，将支架浸入已知体积(V1)的己烷中。将己烷和己烷浸渍的支架的总体积记录为V2。体积差(V2-V1)是聚合物支架的体积。然后除去己烷浸渍的支架，并将残留的己烷体积记录为V3。IGF-1-SF-CS和SF-CS支架的孔隙率计算为(V1-V3)/(V2-V3)×100％。
IGF-1-SF-CS和SF-CS支架的吸水性通过在PBS(pH 7.4)中37℃浸渍24小时来测定。在预定的时间，小心地将样品吸干以除去过量的水并浓缩。测量湿重(W1，溶胀重量)和干重(W2，在37℃下干燥过夜)。然后，使用下式测量支架的吸水性：吸水率＝(W1-W2)/W2×100％。
通过在37℃(pH 7.4)中浸渍24小时测定IGF-1-SF-CS和SF-CS支架的溶胀性质。测量湿体积(S1，溶胀体积)和干燥体积(S2，在37℃下干燥过夜)。然后，使用以下公式测量支架的溶胀吸收：溶胀指数＝(S1-S2)/S2×100％。
BMSCs接种
将支架在75％乙醇中在紫外光下灭菌过夜，然后用无菌PBS彻底冲洗三次。在细胞培养之前，将支架通过在37℃培养箱中浸泡在DMEM中12小时进行预润湿。
将BMSCs培养在IGF-1-SF-CS支架，SF-CS支架和24孔组织培养板孔(对照组；n＝3；直径15mm；高13mm)上，在成骨诱导后3和6天培养。培养条件为：5％CO2和95％空气的气氛下，37℃，原始细胞培养密度为4,000个细胞/孔。
骨髓间充质干细胞在支架上的形态学研究
在第3天和第7天通过SEM观察在IGF-1-SF-CS支架和SF-CS支架上成骨诱导后BMSC的形态。用PBS洗涤样品，并用3.0％戊二醛在4℃下固定4小时。随后，将它们通过一系列梯度乙醇(30％，50％，70％，80％，90％，95％和100％)脱水，空气干燥过夜，并用金溅射用于SEM观察。评估贴壁细胞形态，关于IGF-1-SF-CS支架和SF-CS支架的结构特征的细胞粘附模式，细胞-细胞相互作用和贴壁细胞密度。
BMSCs在支架上的粘附
收集IGF-1-SF-CS支架，SF-CS支架和对照组成骨诱导后的骨髓间充质干细胞，浓度调整至1×104/mL。将细胞置于预先涂有IGF-1-SF-CS支架和SF-CS支架的细胞培养板中，每孔1mL。在没有支架的培养板中培养的细胞用作对照。每组使用6个平行孔。将细胞在37℃，5％CO2的培养箱中培养。在第1、2、4、8和24小时定量未粘附细胞的数量。
细胞粘附率(％)＝(接种细胞数-未附着细胞数)/接种细胞数×100％。
BKC在支架上的CCK-8测试
为了检查移植细胞是否存活，通过使用CCK-8测定细胞活力和增殖。简而言之，在样品培养1、3、5和7天后，用含有CCK-8(0.5mg/mL)的无血清培养基替换培养基。培养4小时，将样品转移到96孔板中。使用ELISA读数器(Bio-Rad Model 550，USA)在450nm下测量吸光度。
MSCs在支架上的碱性磷酸酶(ALP)活性。使用ALP测量试剂盒(JianchengBiotechnology Institute，Nanjing，China)测量支架和对照组中的细胞内ALP活性。简而言之，将样品培养1、4、7和10天，然后用PBS洗涤3次。将具有BMSC的样品和对照组浸入含有0.1％Triton X-100和5mM MgCl2的500μl细胞裂解溶液中过夜。将整个溶液转移到管中并在4℃以13,000rpm离心10分钟。通过将50μl上清液与50μl对硝基苯基磷酸盐(5mM)在150mM2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲溶液中在室温下在黑暗中混合30分钟来测量ALP活性。孵育期后，通过加入50μl 0.2N NaOH使反应停止以使ALP变性，并使用ELISA读数器(Bio-RadModel 550，USA)在520nm下测量OD。
统计分析
所有定量数据均表示为平均值±SD。使用统计程序SPSS17.0进行统计分析。通过单向ANOVA和Student's t-检验分析结果。概率值小于0.05被认为具有统计学意义。在通过单因素方差分析分析结果之前，所有定量数据均遵循正态分布。
结果
孔隙率和吸水性
加入IGF-1后，SF-CS支架的孔径和孔隙率增加，但差异不显著(p>0.05)。己烷置换实验证明IGF-1-SF-CS支架的孔隙率(90.4±3.2)％，孔径(232±65)μm，可促进营养物和废物进出支架。
吸水和溶胀能力以及保留能力是决定生物材料有用性的其他重要因素。根据平衡时的溶胀度测量IGF-1-SF-CS和SF-CS支架的吸收能力。发现支架的溶胀度在其干重的(24-26)％范围内，并且添加的IGF-1没有显著差异(p>0.05)。表现出高度溶胀和吸水性的IGF-1-SF-CS和SF-CS支架在浸入PBS(pH7.4)中24小时后也保持其结构。
细胞形态
使用光倒置显微镜研究细胞形态(图1A-图1D)，BMSC显示出良好的存活率和快速增殖。
在原代细胞中，BMSC是圆形形态。12小时后，将BMSC稀疏地附着在培养瓶上，并显示出成纤维细胞样的纺锤形形态(图1A)。孵育3-4天后，细胞数量增加，细胞继续生长，细胞开始增殖，细胞逐渐长成小菌落，呈梭形细长，细胞生长良好，活跃增殖，呈梭形，成纤维细胞形态(图1B)。10-12天后，大部分细胞附着并获得大的，扁平的或多层生长形态(图1C)，并且在不同的传代中没有变化(图1D)。
骨髓间充质干细胞的成骨分化
两周后，成骨诱导后BMSCs中的碱性磷酸酶染色更强(图2A)，没有成骨诱导的那些如图2B所示。此外，在成骨诱导后2周，von Kossa染色(图2C)显示与没有成骨诱导组的那些相比，钙结节显著增加(图2D)，图2E也示出了骨髓间充质干细胞成骨诱导组与未成骨诱导组比较钙结节的定量分析。
BMSCs的粘附率
1h，3h和6h后，细胞粘附率随时间延长而增加。IGF-1-SF-CS组和SF-CS组的粘附率均高于对照组(P<0.01)。如图3所示，1h内，SF-CS支架的粘附率与IGF-1-SF-CS支架的粘附率基本相同，支架组间差异无统计学意义(P>0.05)。3小时后，与1小时相比，贴壁细胞显著增加。IGF-1-SF-CS组和SF-CS组的粘附率显著高于对照组(P<0.01)，但支架组之间仍无显著差异(P>0.05)。证明SF-CS支架可以增加BMSCs的粘附。
IGF-1-SF-CS支架和BMSC的SEM图像。
如图4A-图4D中的SEM所示，所有IGF-1-SF-CS支架都显示出多孔结构。通过均相方法很好地混合IGF-1-SF-CS支架的复合物。IGF-1-SF-CS支架从表面到内部显示出良好取向的多孔结构，这可能有利于细胞接种和分布。具有完全多孔结构的IGF-1-SF-CS支架可促进均匀的细胞接种和营养递送，这对于3D多孔支架中的细胞生长是重要的(图4A)。图4B显示了IGF-1-SF-CS支架的孔壁表面和切片形态的SEM图像。孔壁具有光滑的表面形态。孔壁的宽度约为1-2μm。
均匀孔壁截面形态表明，即使在纳米尺度下，IGF-1，SF和CS也很好地相容。该结果暗示IGF-1，SF和CS可以组合以产生具有这两种天然衍生生物材料和生长因子的优点的复合支架。
SEM图像显示在IGF-1-SF-CS支架的表面或内部随机分布的细胞。在第3天，大量细胞粘附在支架的表面和孔上。细胞聚集体变得扩大并且活跃地增殖。SEM结果显示BMSCs扩散到支架表面并且具有扁平和细长形态的孔。在细胞周围观察到颗粒状和丝状物质。细胞微丝和伪足与支架紧密连接(图4C)。在第7天，与3天相比，增加数量的细胞附着于支架的表面和孔，并且细胞生长和增殖良好。它们表现出典型的成骨细胞形态，并通过形成片状伪足和丝状伪足而紧密地粘附在支架表面或内部。通过连接两个BMSC之间的纤维延伸，也观察到IGF-1-SF-CS和SF-CS支架的细胞-细胞相互作用，在遍布支架的更多细胞中观察到类似的细胞扩散和细胞-细胞相互作用，这对体外BMSCs的活力和功能至关重要(图4D)。
CCK-8测试
通过CCK-8测定比较BMSC在IGF-1-SF-CS支架，SF-CS支架和培养1、3、5和7天的对照组的增殖。可以看出，随着培养时间的增加，三组的吸光度指数增加，表明两种支架内的细胞生长显著。数据显示在图5中，还包括没有支架培养的BMSC的数据。BMSCs在IGF-1-SF-CS支架和SF-CS支架中均增殖良好，与对照组培养的细胞在第1天无显著差异(p>0.05)。但3天后，在IGF-1-SF-CS支架中培养的BMSCs数据高于SF-CS支架培养的细胞，两种支架培养的BMSCs数据均明显高于无支架培养的BMSCs，具有统计学意义差异(p<0.05)。这些结果表明，与SF-CS支架相比，IGF-1-SF-CS支架显著促进了BMSC的附着和增殖。
碱性磷酸酶(ALP)活性
为了评估IGF-1-SF-CS支架，SF-CS支架中间充质干细胞的成骨细胞分化，使用分光光度法测量碱性磷酸酶(ALPase)活性。在IGF-1-SF-CS支架，SF-CS支架和对照组中培养的BMSC的ALP活性如图6所示。在第1天的培养期间，总ALP活性测量，OD值没有显著差异。在IGF-1-SF-CS，SF-CS和对照组之间(P>0.05)，但从第4天到第10天，在支架组和对照组之间发现OD值的显著差异(p<0.01)。IGF-1-SF-CS组中的OD值最高。这表明IGF-1对BMSC活性的影响。随着培养时间从第4天到第10天，三组OD值的增长趋势迅速增加。OD值在10d达到峰值。这意味着IGF-1-SF-CS支架对于延长的培养系统是稳定的，并且稳定的IGF-1极大地增强了碱性磷酸酶活性。
实验结论
组织工程通常寻求将合适的支架材料与重要的信号分子组合以促进健康的组织再生。为了增强细胞浸润到支架内并在支架内存活并指导原位内源和外源干细胞群的原位分化，已将诸如生长因子和粘附分子的试剂掺入支架中以控制释放。通过吸附将IGF-1掺入SF-CS支架中，目的是实现释放IGF-1的治疗性释放，其将在体外产生细胞。在本发明中，通过在SF-CS支架制造期间而非支架制造之后掺入IGF-1来增加BMSC的成骨。该方法简便，方便，成功率高，易于控制生长因子的含量，可以改善SF-CS支架上IGF-1的负载量和负载效率。此外，还可评估该支架作为生长因子递送装置并评估成骨细胞增殖和分化方面的生物反应。本发明提出的新策略是在SF-期间将IGF-1结合到SF-CS支架上，应用这种策略来模拟和固定生长因子至SF-CS支架。CS支架制造并允许BMSC根据需要感知和激活IGF-1。
SF-CS支架具有随机多孔微结构，多孔结构允许支架与细胞的最佳相互作用。孔径决定了细胞进入支架的效率。支架应具有足够的孔隙度，包括孔隙度，孔径分布和互连性。孔径大于100μm且小于400μm通常被认为是骨传导的最佳选择。在本发明中，IGF-1-SF-CS支架具有开放且相互连接的孔网络和高度的孔隙度。支架的内部孔径为约10至300微米，这导致支架内的均匀细胞分布。本发明的3D支架是与骨组织相互作用和整合的理想支架。并且，尽管在SF-CS支架中添加了IGF-1，但支架的孔隙率和溶胀率在形状和结构上没有明显变化，支架的形态没有显著改变。
本发明的实验结果表明，IGF-1可通过离子相互作用和共价键固定在SF-CS支架中。将IGF-1吸附到SF-CS支架上的有效性可能是由于保护分子免受蛋白水解消化，从而允许IGF-1随时间更持续释放。这表明生长因子在基质内长时间保持生物活性。
支架可用于可逆地结合生长因子，将它们的释放限制在缺损位置以限制任何可能的副作用，并确保它们在释放时保持其生物活性。在制造用于骨组织工程的IGF-1-SF-CS支架时，关键部分是在制造IGF-1-SF-CS支架中维持IGF-1的生物活性，在该制造过程中，IGF-1生物活性主要会在冻干和甲醇交联中被破坏。在冻干过程中，使用冷冻保护剂可以减少甚至防止压力对蛋白质活性的影响。丝蛋白和壳聚糖可用作冷冻保护剂以很好地维持IGF-1的活性。
本发明采取以下措施制造IGF-1-SF-CS支架以防止IGF-1生物活性被破坏：1、将冷冻干燥温度设定在-40℃，并使用丝和chitsan作为冷冻保护剂，以进一步维持IGF-1活性。2、甲醇浓度<10％。3、整个IGF-1-SF-CS制造过程被设计为物理过程。通过ALP和CCK-8测试结果，可以从根本上确认IGF-1生物活性没有明显降解，IGF-1-SF-CS支架显示出优异的生物活性。在目前的研究中，在药物递送的前两周研究了IGF-1生物活性。已经显示掺入SF-CS支架中的IGF-1可以在至少2周内保持生物活性，这表明长期维持生物活性是可行的。
将IGF-1吸附至支架可部分保护生长因子免于降解或失活，从而允许更长的合成代谢作用。将IGF-1吸附到支架上的有效性可能是由于保护分子免受蛋白水解消化，从而允许IGF-1随时间更持久地释放。在该实验中，SF-CS支架在水溶液中制造并且可以包裹活性IGF-1分子而不损害IGF-1活性。Mandal和Kundu利用冻干法制备用牛血清白蛋白包裹的3D丝纤维支架，然后检查其体外释放和性能。通过ALP和CCK-8检测结果，可以确定在IGF-1-SF-CS支架中，IGF-1可以在一定时间内均匀连续释放。
SEM分析证实，贴壁细胞利用亚细胞微绒毛和角膜缘扩展来建立与SF-CS底物的锚定前沿。另外，进行BMSC生长分化研究以进一步评估这些支架的生物相容性。在IGF-1-SF-CS支架上接种BMSC导致完全平坦和延长的细胞形态，类似于在标准细胞培养瓶中通常观察到的。这些观察证实了IGF-1-SF-CS支架上的长期细胞存活和增殖，确保了其生物相容性。
在骨生成诱导后，在BMSC之间观察到细胞粘附的标称差异。另外，这些结果表明SF-CS支架适合于所提出的体外研究，因为它促进BMSC初始附着到表面上，扩散和随后的生长。骨髓间充质干细胞在IGF-1-SF-CS组和SF-CS组的粘附率显著高于对照组(P<0.05)，但在IGF-1-SF-CS组和SF-CS组之间无统计学差异(p>0.05)。
将第1天(细胞附着24小时后)的活细胞数作为参考点，比较BMSC在IGF-1-SF-CS和SF-CS支架上的生长和增殖速率。可以看出，受试组的吸光度指数随培养时间的增加而增加，但表现出支架对细胞增殖率的IGF-1依赖性影响。在第1天，活细胞数在三组之间没有显著差异，表明细胞与支架的附着是相似的。细胞生长后，从第3天开始，在支架组和对照组之间以及IGF-1-SF-CS支架组和SF-CS支架组之间观察到细胞数量的显著差异(p<0.05)。这些结果表明，IGF-1促进成骨诱导后BMSCs的生长和增殖。体外实验证据也说明，IGF-1可通过在成骨诱导后直接作用于BMSC来调节骨形成。结果表明，不同类型的支架中BMSCs的活性不同。可能是由于：(1)IGF-1-SF-CS支架以持续方式释放IGF-1，释放的IGF-1可以更快速和均匀地到达细胞。(2)IGF-1在从IGF-1-SF-CS支架释放后保持其生物活性。
IGF-1-SF-CS支架作为时间的函数支持BMSC的活力和增殖的能力证明了骨组织工程应用的细胞相容性和可行性。IGF-1在早期没有明显促进骨髓间充质干细胞的活性和增殖，但在后期(第3-10天)培养时效果明显，证明了IGF-1促进骨髓间充质干细胞活性和增殖的作用。BMSCs是时间依赖性的。这些结果表明正确的IGF-1递送策略极大地影响成骨分化，并且在设计递送系统时应该予以考虑。期望的IGF-1递送的理想持续时间取决于药物递送应用。例如，骨愈合的缓慢进展，导致患者症状和/或疾病状况的持续改善的控释制剂允许更方便的剂量和增加的治疗依从性。
由于IGF-1在SF-CS支架中的快速固定，在多孔IGF-1-SF-CS支架中接种BMSCs后，有效地持续局部释放生长因子，如预期的那样，BMSCs的增殖和分化水平得到控制通过IGF-1的存在，从体外ALP和CCK-8测试结果获得的结果显示IGF-1-SF-CS支架不含对细胞有毒的产物，并且支架上BMSCs的增殖定期增加。SEM图像显示附着细胞的纺锤状形状，具有丝状伪足延伸，附着有支架并连接到相邻的BMSC。细胞间相互作用和细胞扩散的证据可被视为健康BMSCs的迹象，并指示细胞对支持材料的非细胞毒性反应。在目前的研究中，在药物递送的前两周研究了IGF-1生物活性。已经显示掺入SF-CS支架中的生长因子IGF-1可以在至少2周内保持生物活性，表明生物活性的长期维持是可行的。
数据表明，IGF-1在SF-CS支架上的锚定可以实现预期的天然构型，IGF-1保持受保护并且可用于活化。IGF-1-SF-CS支架对基质产生和BMSCs增殖和分化具有积极作用。数据支持SF-CS作为生物相容性支架的潜在用途。研究结果表明，IGF-1-SF-CS支架是骨组织工程的合适底物，IGF-1赋予加速重建的潜在生理学益处。本发明的材料也可能用作骨组织工程的3D模板。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
Claims (10)
1.一种IGF-1-SF-CS三维支架的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
(1)分别制备丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液；
(2)将丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液混合后透析，得到透析液；
(3)将透析液与IGF-1溶液混合、在-50℃至-30℃下冷冻干燥，制得所述IGF-1-SF-CS三维支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，该方法还包括，将冷冻干燥后的IGF-1-SF-CS三维支架在浓度为10％以下的甲醇溶液中处理，然后再次进行冻干以除去过量的甲醇。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述透析液中，丝素蛋白与壳聚糖的重量比为1：0.8-1.2。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述IGF-1-SF-CS三维支架中，IGF-1与SF的重量比为1：105-103。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，丝素蛋白溶液和壳聚糖溶液的浓度各自为1-10wt％。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，，所述IGF-1溶液的浓度为5-15μg/mL。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述透析的条件包括：在纤维素透析管中对蒸馏水进行透析。
8.由权利要求1-7中任意一项所述的制备方法制得的IGF-1-SF-CS三维支架。
9.权利要求8所述的IGF-1-SF-CS三维支架的应用。
10.权利要求8所述的IGF-1-SF-CS三维支架作为骨组织工程生物材料的应用。
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