CN107281550A - 一种促进软骨损伤修复的共交联双网络水凝胶支架的制备方法 - Google Patents
一种促进软骨损伤修复的共交联双网络水凝胶支架的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种促进软骨修复、生长的共交联双网络水凝胶支架的制备方法。包括如下步骤：（1）GelMA的制备；（2）可光交联HSNGLPL多肽的制备；（3）水凝胶支架的制备：将 GelMA和可光交联HSNGLPL在光引发剂作用下制得水凝胶支架。本发明制备的水凝胶支架有明显的促进新生软骨的生成、软骨缺损愈合的作用，可调控损伤组织周围正常软骨细胞的软骨基质分泌、间充干细胞迁徙至损伤处及其成软骨分化；水凝胶支架的多孔状结构，可使HSNGLPL共交联于多孔支架表面，有效地吸附内源性TGF‑β1，提高局部TGF‑β1浓度，实现生物支架在软骨缺损、软骨损伤等骨科领域的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种促进软骨损伤修复的共交联双网络水凝胶支架的制备方法。
背景技术
据文献报道，随着经济的发展，运动维持健康意识的提高，关节软骨组织发生损伤及其他软骨组织疾病导致的软骨缺损手术量急剧增加，如微裂缝、骨软骨移植、软骨细胞移植以及感染和创伤引起的软骨缺损，软骨自身的缺乏血管、神经等生理特性导致软骨损伤后软骨的再生和自我修复平衡收到巨大的挑战。临床上用于软骨缺损修复的常用方法包括关节置换、微骨折、骨膜和软骨膜移植、软骨与骨软骨移植、软骨细胞或间充质干细胞移植术以及转化生长因子β1（transforming growth factor，TGF-β1）的体外注射等。但这些方法均有各自不足，如自体软骨来源有限、手术时间长、术中失血增多、同种异体软骨免疫排斥、软组织肿胀、脊髓神经根炎、炎症、疾病传播、成本高等，种种缺点限制了这些方法在软骨缺损领域的应用。为了避免这些问题，人们不断探索、研究新的医学材料以达到软骨损伤组织的修复、再生效果。
细胞因子在软骨组织再生修复中发挥不可替代的作用, 例如转化生长因子超家族等的参与。生长因子与软骨的再生、修复密切相关，可影响软骨、骨膜、上皮、结缔组织细胞的增殖、迁移及分化。软骨修复中的研究热点转化生长因子超家族的生长因子对软骨的发展具有重要作用，其中TGF-β1备受关注，因为关节软骨是TGF-β1的主要组织来源之一，同时TGF-β1对靶器官的双重调控作用与关节软骨的生物学相适应。TGF-β1通过调控Smad2/3信号通路诱导间充质干细胞向软骨分化，早期其可以提高骨髓间充质干细胞成软骨分化的能力，已证实骨微环境中TGF-β1对于软骨重建过程具有十分重要的作用，对软骨代谢的主要作用是促进软骨特异性基质的合成，刺激软骨细胞的蛋白多糖以及蛋白酶抑制剂的产生，保护软骨基质不被水解破坏，Qureshi等研究发现TGF-β1通过PI3K/Akt通路诱导金属蛋白酶抑制因子的表达，有效地阻止关节软骨的降解，同时还可诱导软骨滑膜中的间充质干细胞持续迁入软骨损伤处。在促进细胞增殖方面，TGF-β1能显著促进原代软骨细胞的增殖。
但是，仅通过损伤部位的TGF-β1难以更好的促进软骨的修复，同样通过注射一定剂量的外源性的TGF-β1存在成本高、反复注射、增加病人痛苦、注射导致的正常组织的损伤等缺点，本发明采用了胶原水解产物明胶，并对其进行甲基丙烯酸酐接枝改性，同时将可光交联的HSNGLPL多肽引入明胶中，形成一种可自主吸附内源性TGF-β1的共交联双网络水凝胶支架，从而在促进软骨损伤修复中发挥重要作用。HSNGLPL多肽是在海洋生物中发现的，其是TGF-β1受体中与TGF-β1紧密结合的重要肽段，主要结构是一个七肽氨基酸序列，其氨基酸序列为组氨酸（His）-丝氨酸（Ser）-天冬氨酸（Asp）-甘氨酸（Gly）-亮氨酸（Leu）-脯氨酸（Pro）-亮氨酸（Leu）。 与注射外源性TGF-β1相比，具有经济成本低、细胞因子半衰期长、活性稳定等，又可以避免剂量过高造成的浪费以及副作用。
Van Den Bulcke等首次介绍了甲基丙烯酸酯改性的明胶(GelMA)，它应用广泛，可用于骨、软骨和血管等。明胶具有优良的理化性能，如亲水性强、侧链反应活性高等，且明胶来源广泛、价格低廉、生物相容性好、生物可降解等优点，被广泛用于组织工程支架材料。明胶最重要的氨基酸序列是精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（RGD）序列，此序列可促进细胞粘附、增殖和分化。美国食品和药物管理局（FDA）认定明胶安全，且已将明胶用做等离子膨胀剂和稳定剂，包括疫苗等。不仅如此，GelMA不仅具有明胶的生物学活性，还具有光交联水凝胶的理化定制能力。
原位形成可生物降解水凝胶化合物主要包括交联聚合等。由于凝胶化速度快、反应条件温和、凝胶时间和空间可控，原位光交联法引起了人们广泛关注。GelMA一般是在pH7.5的磷酸盐缓冲液中，由明胶与甲基丙烯酸酐反应合成。光交联法合成的GelMA，可在体温下作为支架发挥作用。此外，GelMA还可以作为药物载体负载各种药物，实现药物的装载和释放。但是，该类水凝胶材料在体液中存在药物释放快、水凝胶强度下降等问题。因此，构建一种和GelMA水凝胶共同交联的载药体系，有望在维持或者增加水凝胶强度的前提下，实现药物的负载和缓慢释放。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进软骨损伤修复的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，GelMA在光引发剂的作用下，可发生自交联的单网络结构水凝胶，同时，引入可光交联的能与TGF-β1自主结合的HSNGLPL多肽，可发生GelMA-HSNGLPL的共交联，从而制备出稳定性高的可自主结合TGF-β1的多肽、明胶共交联双网络水凝胶，并在体内及体外试验中进行研究，从而为GelMA-HSNGLPL在软骨缺损治疗中的应用奠定实验基础。
为了实现上述目的，本发明构建一种共交联的双网络水凝胶支架，将可光交联的能与TGF-β1自主结合的HSNGLPL多肽和GelMA共同混合后，复合PI交联剂，其中，HSNGLPL多肽和GelMA发生共交联，形成网络结构，GelMA之间发生交联形成网络结构，通过GelMA-HSNGLPL和GelMA-GelMA形成双网络结构的水凝胶，从而维持该水凝胶力学强度和对内源性TGF-β1的吸附功能。其发明的机理主要包括如下过程：
1）制备甲基丙烯酸酯改性明胶GelMA；
2）通过甲基丙烯酸酯改性明胶得到GelMA的路线，合成具有甲基丙烯酸酯改性的具有光交联特性的HSNGLPL，即HSNGLPL-MA；
3）溶液中少量的HSNGLPL-MA和GelMA共同混合后，在PI光引发剂作用下，发生光交联形成HSNGLPL的交联网络水凝胶；
4）在该水凝胶中大量的GelMA和GelMA也发生交联，形成交联网络水凝胶，从而整个体系形成GelMA-GelMA和GelMA-HSNGLPL的共交联双网络水凝胶支架 GelMA-HSNGLPL-GelMA。
为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种促进软骨损伤修复的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，包括如下步骤：
一种促进软骨损伤修复的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，步骤如下：
（1）甲基丙烯酸酯改性明胶的制备
向20g明胶中加入200mL 0.01M pH 7.5的磷酸盐缓冲液，在60℃的环境下持续搅拌2小时；将上述明胶溶液缓慢透过0.22μm水系滤膜，再在60℃搅拌的条件下每4分钟添加lmL甲基丙烯酸酐于明胶混合液中，共添加16次，然后继续搅拌2小时，形成甲基丙烯酸酯改性的明胶；将制得的甲基丙烯酸酯改性明胶溶液置于800mL预热过的0.01M pH 7.5的磷酸盐缓冲液中进行稀释，并持续缓慢搅拌15分钟，将稀释后的溶液置于截留分子量为10KD的透析袋中，以去离子水为透析液进行透析，每天更换两次透析液以去除未反应的甲基丙烯酸酐，持续透析一周；透析后，将溶液置于-80℃冰箱中，两天后放入冻干机冻干。
（2）可光交联HSNGLPL多肽的制备
使用甲基丙烯酸酐与HSNGLPL多肽反应制得末端含有可光交联的甲基丙烯酰基的HSNGLPL多肽HSNGLPL-MA。
（3）共交联双网络水凝胶支架的制备
将20mg步骤（1）制备的甲基丙烯酸酯改性明胶和14.5mg步骤（2）制备的可光交联HSNGLPL多肽溶解于1mL 0.01M pH 7.5的磷酸盐缓冲液中，混合均匀后，在搅拌的状态下加入10mg的2-羟基-4’-（2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮光引发剂659，将溶液均匀混合后，在紫外光下照射，制得共交联双网络水凝胶支架。
进一步的，所述HSNGLPL多肽的纯度为95.74%。
进一步的，所述步骤（3）中紫外光下照射的条件为：波长为360nm光强为10Mw/cm3的紫外灯下照射10min。
一种应用本发明所述的制备方法制备的促进软骨损伤修复的共交联双网络水凝胶支架。
有益效果：本发明通过可光交联的HSNGLPL-MA和GelMA在光引发剂的作用下发生光交联形成GelMA-GelMA、GelMA-HSNGLPL共交联双网络结构的水凝胶支架GelMA-HSNGLPL-GelMA。益处为，一方面可以保留GelMA的RGD基团，保留其促进生物组织与材料支架黏附的能力，通过GelMA的RGD序列，增强支架材料与周围组织细胞的吸附聚集功能，同时光交联复合物有明显的促进软骨缺损愈合的作用，交联与TGF-β1自主结合的HSNGLPL多肽后可显著调节软骨细胞的增殖分化、二型胶原以及蛋白多糖的沉积。同时，TGF-β1与胰岛素样生长因子（IGF-I）可联合培养间充质干细胞对其成软骨分化有促进作用调控转化生长因子。此外，TGF-β1还可以降低白介素-1（IL-1）的代谢活动，而IL-1是软骨细胞自分泌的用来降解外基质而抑制软骨修复的细胞因子。另一方面GelMA-HSNGLPL光交联复合物不会影响GelMA材料多孔结构，无细胞毒性、对细胞活性亦无影响，光交联后，且可实现HSNGLPL多肽自主结合TGF-β1并维持其生物学活性，局部提高TGF-β1并缓慢释放，最终实现生物支架在软骨缺损、新生软骨的融合等骨科领域的作用，因此，本发明为软骨磨损、缺损、软骨融合技术在临床上的应用提供了一种新的方法。
附图说明
图1 HSNGLPL多肽结合TGF-β1促进软骨损伤修复示意图。
图2 甲基丙烯酸酯改性的明胶的制备流程图。
图3 共交联双网络结构的水凝胶支架的制备示意图。
图4 GelMA和GelMA-HSNGLPL的扫描电镜图。
图5 人间充质干细胞（MSC）种植于GelMA和GelMA-HSNGLPL的扫描电镜图。
图6 培养5天活死细胞染色荧光显微图。
图7 CCK-8检测，对照组、GelMA组、GelMA-HSNGLPL组在培养第1、3、5、7天对细胞增殖的影响。
图8吸附TGF-β1后荧光免疫组化显微图。
图9 番红O快绿染色图。
图10 RT-PCR检测间充质干细胞成软骨分化相关基因（sox-9、col2、agg、col1、col10），（* P＜0.05）。
图11在股骨远端内髁负重面制备直径为4mm×深度3mm圆柱形缺损的实验图。
图12术后4周和8周股骨远端内髁负重面缺损肉眼观察图。
图13股骨远端内髁负重面缺损术后4周和8周三维重建图，分别为假手术组（sham）、造模组（operation）、GelMA支架组（GelMA）、GelMA-HSNGLPL（GelMA/HSNGLPL）支架组。
图14术后4周和8周时软骨体积/组织体积比，分别为假手术组（sham）、造模组（operation）、GelMA支架组（GelMA）、GelMA-HSNGLPL（GelMA/HSNGLPL）支架组,（* P＜0.05）。
图 15 术后4周和8周时软骨密度，分别为假手术组（sham）、造模组（operation）、GelMA支架组（GelMA）、GelMA-HSNGLPL（GelMA/HSNGLPL）支架组，（* P＜0.05）。
图 16股骨远端股骨内侧髁负重面软骨缺损处HE染色图，箭头指示的是原软骨缺损位置。
图17股骨远端股骨内侧髁负重面软骨缺损处甲苯胺蓝染色图，箭头指示的是原软骨缺损位置。
图18股骨远端股骨内侧髁负重面软骨缺损处二型胶原免疫组化染色图，箭头指示的是原软骨缺损位置。
图19股骨远端股骨内侧髁负重面软骨缺损处ICRS组织学评分，分别为假手术组（sham）、造模组（operation）、GelMA支架组（GelMA）、GelMA-HSNGLPL（GelMA/HSNGLPL）支架组,（* P＜0.05）。
图20 对比例中人间充质干细胞（MSC）种植于PEG水凝胶上的扫描电镜图。
图21对比例中培养5天活死细胞染色荧光显微图。
图22 对比例中PEG水凝胶的流变数据图。
图23 GelMA水凝胶的流变数据图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更全面地理解本发明，以下结合实施例和附图对本发明的技术方案进行说明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1促进软骨损伤修复的共交联双网络水凝胶支架的制备
具体步骤为：
1）甲基丙烯酸酯改性的明胶的制备
图2为甲基丙烯酸酯改性明胶的制备流程图，向20g明胶中加入200mL磷酸盐缓冲液，在60℃的环境下持续搅拌2小时；将上述明胶溶液缓慢透过水系滤膜，再在60℃搅拌的条件下每4分钟添加lmL甲基丙烯酸酐于明胶混合液中，共添加16次，并持续搅拌2小时，形成甲基丙烯酸酯改性的明胶；将制得的甲基丙烯酸酯改性的明胶溶液置于800mL预热过的磷酸盐缓冲液中进行稀释，并持续缓慢搅拌15分钟，将稀释后的溶液置于透析袋中，透析袋的截留分子量为10KD，浸泡于纯水溶液中，每天更换两次透析液以去除未反应的甲基丙烯酸酐，持续透析一周；透析后，将溶液置于-80℃冰箱中，两天后放入冻干机冻干，将冻干样品于4℃条件下保存。
2）可光交联的能与TGF-β1自主结合的HSNGLPL多肽的制备
使用甲基丙烯酸酐与能与TGF-β1自主结合的HSNGLPL多肽反应制得末端含有可光交联的HSNGLPL-MA，HSNGLPL多肽由上海强耀生物科技有限公司合成，纯度为95.74%。
3）共交联双网络水凝胶支架的制备
图3为共交联双网络结构的水凝胶支架的制备示意图，将20mg步骤（1）制备的甲基丙烯酸酯改性的明胶和14.5mg步骤（2）制备的可光交联的能与TGF-β1自主结合的HSNGLPL多肽溶解于1mL磷酸盐缓冲液中，混合均匀后，在搅拌的状态下加入10mg的PI光引发剂659，将溶液均匀混合后，在波长为360nm光强为10Mw/cm3的紫外灯下照射10min，制得共交联双网络水凝胶支架。
将GelMA和GelMA-HSNGLPL冷冻干燥、真空下表面喷金等程序后，应用扫描电镜观察支架结构，GelMA和GelMA-HSNGLPL具有明显的多孔连通的结构，孔的外观呈现不规则状，多为长梭形，孔径大小80～120μm，孔隙内部连通性良好（图4）。
将hMSCs分别种植到GelMA、GelMA-HSNGLPL上，扫描电镜观察可见hMSCs清晰可见，细胞与材料紧密粘附，细胞在支架孔隙中伸展良好，细胞排列呈长梭形伸展状，结构相对规则，细胞生长情况良好（图5）。
实施例2 GelMA、GelMA-HSNGLPL生物相容性检测观察
实验分组： GelMA支架组、GelMA-HSNGLPL支架组。
先将GelMA，GelMA-HSNGLPL支架置入96孔板中，再将hMSCs重悬、计数，种植到两组96孔板中的支架上（每孔2×103 细胞），每组五个复孔，加入配置好的DMEM-L培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养，每两天更换DMEM-L培养基，分别培养5天进行活死细胞染色，荧光显微镜下观察。
活死细胞染色步骤为：吸出培养液→用PBS清洗两次→添加50 ul混合液至每孔（1μL A+1μL B+2mL PBS组成混合液）→放置培养箱中反应30分钟→荧光显微镜下观察。
细胞在避光染色30分钟后于荧光显微镜观察，红色荧光的死细胞及绿色荧光的活细胞清晰可见，两组支架对细胞的影响差异不大（图6）。
实施例3 hMSCs增殖活性检测
实验分组：对照组，GelMA支架组 、GelMA-HSNGLPL支架组。
重悬hMSCs细胞，种植至96孔板中（3块板，每孔2×103 细胞），加入DMEM-L培养基或GelMA组或GelMA-HSNGLPL组浸出液，置于培养箱培养至细胞充分贴壁生长。3块板分别于细胞贴壁后第1、3、5、7天进行CCK-8检测。
CCK-8检测步骤： 在96孔板的孔中加入10ul CCK-8反应液（3组，每组3个复孔）（避免孔中出现气泡）→在恒温箱中培养2h→用酶标仪测量吸光度（450nm）。
CCK-8检测GelMA、GelMA-HSNGLPL材料对hMSCs增殖的影响。结果显示（图8），GelMA、GelMA-HSNGLPL材料浸出液未影响细胞的生长，材料具有很好的生物相容性。
实施例4 自主结合TGF-β1能力检测
实验分组： GelMA支架组 、GelMA-HSNGLPL支架组。
为了检测两组水凝胶是否具有吸附TGF-β1的生物学性能，分别将两组水凝胶GelMA和GelMA-HSNGLPL与1μg/mL TGF-β1（溶于4mM HCl并加有1% BSA），孵育1小时并轻微震荡，去掉上清液并用PBS清洗3次，进行TGF-β1免疫荧光组化染色，步骤如下；
孵育结束后→用PBS 清洗凝胶3次→福尔马林固定15min→PBS 清洗3次→封闭液（PBS，2%BSA，0.01%叠氮钠）封闭1小时→PBS清洗3次→室温孵育小鼠TGF-β1单克隆抗体（1:1000）2小时→PBS清洗3次→室温避光孵育羊抗小鼠荧光二抗（1:200）1小时→PBS清洗3次后立即镜检。
TGF-β1免疫荧光组化染色结果如图8所示，GelMA组水凝胶除了边缘位置有微量荧光的出现，其余部分均无荧光；GelMA-HSNGLPL组水凝胶则表现为强烈绿荧光的出现，说明HSNGLPL成功地交联入GelMA水凝胶中并能自主结合TGF-β1的能力。
实施例5 hMSCs成软骨分化能力的检测
实验分组： GelMA组、GelMA-HSNGLPL支架组。
先分别将GelMA-HSNGLPL，GelMA材料分别放入24孔板中（共3板），对照组即不放材料。分别加入0ng/mL（PBS溶液代替），0.1ng/mL和1ng/mL TGF-β1吸附1小时后，PBS清洗2次，再将hMSCs细胞消化、离心、重悬、计数，分别以1×105 /孔种植到三个24孔板中的支架材料上（共6组，每组3个复孔），在培养箱中培养至细胞充分贴壁生长。每两天更换不完全成软骨诱导培养基（无TGF-β）。7天后分别对不同组进行番红O快绿染色。
番红O快绿染色步骤： 吸出培养基→用PBS清洗2次→用多聚甲醛固定15min→用蒸馏水清洗3次→配置新鲜Weigert染色液（现配现用），取Weigert（A）和Weigert（B）等体积混合均匀，染色3min→酸性乙醇分化液分化15s→去离子水清洗1min→固绿染色液浸染1.5-3min→去离子水冲洗1min→Safranin O stain 浸染3min→去离子水清洗1min→乙酸溶液洗涤1.5min→去离子水清洗1min→95%乙醇、无水乙醇一次脱水各1min→显微镜下观察。
茜素红染色步骤：吸出培养基→用PBS清洗5次→用多聚甲醛固定10min→用蒸馏水清洗3次→加入茜素红工作液→常温避光培养30min→终止显色反应→干燥和封片→荧光显微镜下观察。
番红O快绿染色结果（图9）可见，GelMA-HSNGLPL支架组吸附后有明显的软骨基质生成（红色），且吸附的1ng/mL TGF-β1较0.1ng/mL TGF-β1浓度有更多的软骨基质生成，但GelMA支架组几乎都没有软骨基质的生成，因此证明GelMA-HSNGLPL支架组成功交联了能与TGF-β1自主结合的HSNGLPL多肽，且吸附后的TGF-β1仍然具有生物学活性。
实施例6成软骨相关基因检测
耗材去RNA酶化：先配置0.1%DEPC溶液1L，将Eppendorf（EP）管及移液枪头在0.1%DEPC溶液中浸泡过夜，并弃浸泡液，然后经高压灭菌后，80°C烘干备用。
a)各基因引物序列及反应条件
b)总RNA提取：成软骨诱导3天后提取细胞总RNA
1)将细胞沉淀和1 mL Trizol加入1.5mL EP管中，充分震荡和裂解细胞，工作台上静置10分钟；
2)加入200μL氯仿，漩涡震荡15s，室温下静置5min，4 ℃，12，000g 10min高速离心；
3)弃上清，70%乙醇洗涤一次，4 ℃，12，000g 15min高速离心；
4)弃上清，无水乙醇洗涤一次，4 ℃，10，000g 10min高速离心；
5)弃上清，置于工作台上至沉淀干燥，取20μL DEPC溶解沉淀RNA；
6)按照A260/A280计算RNA纯度，1.8～2.0代表纯度较高；
7）计算样品RNA浓度
计算公式：RNA=每个样品△260 ×2μg/μL ，然后向每个样品的RNA溶液中加入适量的DEPC水稀释至1μg/μL，-80℃保存，待逆转录。
8)RNA逆转录反应合成cDNA；
9)荧光定量PCR检测各基因mRNA的表达量。
RT-PCR结果（图10）显示，GelMA-HSNGLPL组，相比对照组及GelMA组，GelMA-HSNGLPL组软骨相关基因表达量较高，只有sox9基因表达量偏低；右图为在1ng/mL TGF-β1作用下相关基因的检测结果，由图可见，加入1ng/mL TGF-β1较0.1ng/mL TGF-β1趋势相同，但是二型胶原以及蛋白聚糖的表达量相对更高，说明在1ng/mL TGF-β1浓度下有更好的促进MSC成软骨分化的作用。
总体结果表明，GelMA-HSNGLPL支架组和GelMA组及对照组相比，对间充质干细胞成软骨分化作用更明显，且1ng/mL较0.1ng/mL有更好的成软骨作用。
实施例7 建立兔膝关节股骨远端内侧髁软骨缺损模型
该动物实验方案已通过苏州大学动物伦理委员会的批准。
一、实验分组
1. 假手术组（8只）：仅行麻醉并打开关节后缝合；
2．对照组（8只）：制备股骨远端内侧髁软骨缺损4mm×3mm，不植入材料；
3．GelMA组（8只）：制备股骨远端内侧髁软骨缺损同2，并植入GelMA组支架；
4． GelMA-HSNGLPL组（8只）：制备股骨远端内侧髁软骨缺损同2，并植入GelMA-HSNGLPL组支架；
二、术前准备
兔术前喂养在25℃恒温、恒湿的环境，每12小时昼夜交替，供给充足的饲料与饮水，持续观察一周。术前准备的耗材包括：台布、无菌手术衣、无菌纱布、无菌手套、医用口罩、医用帽子、洞巾、一次性注射器（1mL，5mL，20mL）、缝合针、缝合线、生理盐水、乙醇、安尔碘、数码照相机。手术操作器械：显微钳、弯止血钳、直止血钳、持针器、有齿镊、刀片、直剪、弯剪。术前先给兔称重，按照1mg/kg 将3%戊巴比妥钠溶液肌肉注射入。待麻醉成功，将其仰位固定于手术操作台上，下肢手术区备皮、消毒、铺巾，戴无菌手套、帽子、口罩、穿手术衣。
三、手术操作
所有手术操作均由同一实验员主刀完成。用75%乙醇将手术台周围以及手套消毒，铺无菌手术布，兔子麻醉后，用剃毛机进行局部去毛，将四肢仰卧位固定，铺无菌洞巾。将手术部位的皮肤用安尔碘消毒消毒三次，用手术刀片分别在取左、右腿膝关节内侧绕髌骨切口，尽量切口小一点，逐层切开皮肤、皮下以及深筋膜，暴露关节；屈膝90°并外翻髌骨充分暴露股骨内侧髁负重区；用0.9%生理盐水轻微冲洗，用医用电钻加装4mm直径钻头在股骨远端内侧髁关节负重面上垂直钻取4mm（孔径）*3mm（深度）的圆柱形缺损区域，以缺损区出现渗血为好，即制备关节软骨全层缺损模型（如图11）。术后用无菌生理盐水反复冲洗缺损 2-3 次，无菌纱布拭干，将事先备好的经过紫外线灭菌的支架材料填入软骨缺损内，逐层缝合皮下组织及皮肤。术后，连续三天肌肉内注射青霉素（160万单位青霉素加2mL生理盐水稀释后，肌肉注射，平均每只老鼠大约80万单位/天）预防性抗感染治疗，术后维持生长环境25℃恒温、恒湿，及时补给饲料、预防自食，密切观察兔的情况。术后第4周和第8周，分别耳缘静脉空气栓塞法处死大白兔，取股骨远端膝关节，剔除表面肌肉、筋膜等软组织，行肉眼观察分析后浸泡于10%福尔马林中，待Micro-CT分析、组织学染色以及组织学评分检测。
实施例8 兔膝关节股骨远端大体观察及Micro-CT分析
（1）将术后4周和8周的兔膝关节股骨远端离体后，分别将同一时间点四组离体样本分别置于同一蓝色背景下，由同一实验员进行拍摄。
（2）对术后4周和8周离体后的兔膝关节股骨远端进行Micro-CT扫描分析。Micro-CT机器参数设定如下：电压：65KV，电流：385μA，分辨率：18μm，转角度：0.7°。在工作站配套软件中，进行股骨远端表面三维重建。并在股骨远端软骨缺损区域选取直径为5mm的圆柱形、高度为180层进行CT分析，记录BV（骨体积）、TV（组织体积）、BV/TV（骨体积/组织体积比）、BMD（软骨密度）等参数，进行统计学分析。
股骨远端软骨缺损的肉眼观察图（图12）和三维重建模型（图13）结果显示，术后GelMA-HSNGLPL支架组较GelMA支架组及对照组，新生软骨量更多，但四组均有明显的凹陷，且与周围正常组织有明显界线；术后8周GelMA-HSNGLPL支架组软骨手术缺损区完全被较透明的类软骨组织覆盖，表面光滑，有光泽，与周围正常组织的颜色很接近且与周围组织融合较好，无分界限，用血管钳轻轻按压修复区，有较好的弹性，GelMA支架组几乎被新生组织覆盖，但表面凹凸不平，并于周围组织有界限；对照组则仍有凹陷且修复组织主要为纤维组织，颜色较正常软骨组织暗淡，粗糙不平，与周围软骨组织的界限仍然可见。
Micro-CT配套软件分析显示，BV/TV（骨组织体积/组织体积）的结果如图14所示，BMD（骨密度）的结果如图15所示。结果显示：术后4周，三组手术组与假手术组均有显著性差异，且对照组数值最低，GelMA-HSNGLPL支架组最高；术后8周，GelMA-HSNGLPL支架组与假手术组没有显著性差异，但仍偏低，而较其他两组有更好的软骨损伤修复效果。
实施例9 组织学染色
（1）取材与脱钙：将兔处死，在无菌条件下，将兔膝关节股骨远端离体，去除肌肉、筋膜、肌腱等软组织，保留骨性结构，置于EDTA脱钙液中进行脱钙一个月以上，保留组织中有机质及细胞和组织的形态、结构和理化性质。
（2）脱水：用低浓到高浓度酒精作为脱水剂，依次在80%、95%、100%酒精中分别浸泡3h、12h、2h、3h，逐渐脱去组织标本中的水分，再将组织放于正丁醇浸泡8-12小时，置换出组织中浸入的酒精。
（3）包埋：将处理好的股骨远端骨组织放置于熔化的的石蜡中，放入45℃石蜡箱中保温1.5 h，再放入65℃的石蜡箱中保温3h，待石蜡完全浸入股骨远端骨组织后，进行组织的包埋。把浸透了石蜡的股骨远端骨组织块放进包埋盒中，然后冷却凝固。
（4）切片与贴片：把包埋好的标本固定于切片机上，切成5µm的薄片。
将切下的薄片放于42℃温水中捞片，然后将薄片均匀舒展的贴附在载玻片上，在恒温箱（60℃）中烘干。
（5）进行 HE 组织染色、甲苯胺蓝染色以及II型胶原免疫组化染色：
HE 组织染色：
①将石蜡切片放在60℃的恒温箱中融化，然后用二甲苯脱蜡时间为30min。
②将切片依次放入以下溶液中浸泡行复水处理：95%乙醇3min→80%乙醇1min→70%乙醇1min→60%乙醇1min。
③Harris苏木素浸染切片10min，再用去离子水洗净。
④1%盐酸水分色处理10s。
⑤使用灭菌纯化水浸泡切片大约15-30min。
⑥氨水反蓝5min。
⑦0.5%伊红中染色2min。
⑧常规酒精脱水处理：100%酒精（2次），5min/次
⑨二甲苯脱蜡10min
⑨晾干，封片，待镜检。
甲苯胺蓝染色：
①二甲苯脱蜡30min，用梯度酒精95%、80%、70%、60%复水；
②浸染甲苯胺染液30min；
③自来水清洗1min；
④冰醋酸液分化，自来水冲洗后风干；
⑤二甲苯透明2次，每次2min；
⑥晾干，封片，镜检。
II型胶原免疫组化染色：
②将石蜡切片放在60℃的恒温箱中融化，然后用二甲苯脱蜡时间为30min。
②将切片依次放入以下溶液中浸泡行复水处理：95%乙醇3min→80%乙醇1min→70%乙醇1min→60%乙醇1min，并PBS清洗。
③滴定3%过氧化氢溶液10min以封闭内源性过氧化去酶，再用PBS清洗3次，每次5min
④37℃下，加入0.4%蛋白酶消化30min修复抗原，PBS清洗3次，每次5min。
⑤加牛血清与1% BSA 1:10混合液孵育室温30min，封闭非特异性抗原；加入抗兔II型胶原单克隆抗体孵育（用1% BSA 1:200稀释 ），4℃过夜。
⑥加入HRP&DAB标记的羊抗鼠II抗，37℃孵育30min；PBS漂洗3次，每次5min。
⑦显色合适时，将切片放入水中终止反应。
⑧再用苏木素染片盐酸分化、流水漂洗。
⑨脱水，晾干，封片，待镜检。
（6）显微镜下观察：细胞胞浆及纤维组织为的红色，胞核为深蓝色。
HE组织染色（图16）、甲苯胺蓝染色（图17）是软骨组织损伤修复检测最常用的方法，通过染色可直观的在显微镜下观察新生组织情况。术后四周，对照组有很明显的缺损凹陷，修复新生组织大多为纤维样组织，细胞大多为梭形纤维细胞为主，基质量少且颜色较浅，新生组织与周围正常组织有明显间隔，可能是部分残余材料的存在，甲苯胺蓝不均匀且颜色很浅，与正常组织周围边界清晰可见； GelMA支架组仍有一定程度的凹陷，修复组织也以纤维组织为主，基质染色较浅，但较支架组稍好；甲苯胺蓝染色也染色不均一，与正常组织存在裂缝。GelMA-HSNGLPL支架组大部分被新生组织覆盖，修复组织以透明软骨样细胞为主，几个软骨细胞位于细胞窝，随机排列，基质染色接近正常软骨组织，但仍与周围正常组织有界限以及微裂缝。术后8周，对照组仍存在不同程度的凹陷，表面高低不平，上层新生修复组织为纤维组织，下层有部分类软骨基质，着色较浅，有少量的软骨窝里附有软骨细胞，甲苯胺蓝染色仍然不均匀，着色较正常软骨组织浅； GelMA支架组凹陷已不明显，修复组织中有少见的透明样软骨细胞，基质染色接近正常软骨，甲苯胺蓝染色相对较均一，但与周围正常组织仍有边界，但裂缝基本消失，说明材料基本全部降解； GelMA-HSNGLPL支架组缺损处被新生组织全部覆盖，表面相对较光滑、平坦，有较多的软骨样细胞位于陷窝中，且深层组织中软骨细胞体积变大，修复组织基本与周围组织相融合，界限较模糊，甲苯胺蓝染色显示软骨细胞较其他两组有深蓝色着色，与正常软骨组织甲苯胺蓝染色接近。
二型胶原免疫组化染色（图18），结果显示，术后4周对照组软骨缺损区仍然有凹陷，且没有明显软骨组织特异性细胞外基质二型胶原的表达，与正常组织之间会有断开处，没有连续的基质染色； GelMA支架组也同样存在一定程度的凹陷，有少量二型胶原存在，但分布不均匀、不连续； GelMA-HSNGLPL支架组有较多的二型胶原，但较正常软骨组织外基质层较薄，且分布不均。术后8周，对照组缺损处几乎不存在，但新生的组织有二型胶原的存在，排列不整齐、不连续； GelMA支架组和GelMA-HSNGLPL支架组二型胶原染色均呈阳性，但GelMA-HSNGLPL支架组较GelMA支架组形态更完整，表面更光滑，且分布连续，更接近正常的软骨组织染色，且与周边正常组织结合较好，着色更深，说明新生组织更加成熟。
实施例10 组织学评分
对术后八周的样本采用临床上用于评估宏观软骨缺损修复结果的国际软骨组织协会（ICRS）肉眼组织学评估标准（Visual Histological Assessment Scale），简称ICRSScore。
组织学评分结果如图19所示，评分结果如下：假手术组得分为25.4±1.356，对照组得分为14.8±1.167，GelMA支架组得分为19.2±0.718 ，GelMA-HSNGLPL支架组得分为23.2±0.748；GelMA-HSNGLPL支架组与正常组无显著学差异（P=0.065），其他各组之间均有统计学差异，P值<0.05。
| 分组 | 得分 | p值 | p值 | p值 |
| A（正常组） | 25.4±1.356 | - | - | - |
| B（造模组） | 14.8±1.167 | <0.01a | - | - |
| C（GelMA组） | 19.2±0.718 | <0.01 a | <0.01b | - |
| D（GelMA/HSNGLPL组） | 23.2±0.748 | 0.065 a | <0.01b | <0.01c |
综上所述，光交联甲基丙烯酸酯明胶能与TGF-β1自主结合的HSNGLPL多肽支架对hMSCs细胞的贴附、增殖无抑制作用，并可促进细胞黏附、伸展，生物相容性良好；光交联的GelMA-HSNGLPL支架中成功接枝入HSNGLPL多肽且能有效的吸附TGF-β1，在体外可以诱导hMSCs细胞的增殖和成软骨分化；体内能够促进兔膝关节股骨远端内侧髁软骨缺损的修复，是一种有效的软骨修复材料，在临床医学上有广阔的而应用前景。
硕士学位论文《可自募集TGF-β 的水凝胶应用于兔膝关节软骨缺损的实验研究》公开了一种以PEG水凝胶为基础制备的可自募集TGF-β 的水凝胶支架，图20为PEG水凝胶上种植人间充质干细胞（MSC）的扫描电镜图，图21为细胞培养5天后活死细胞染色荧光显微图，将图20和图21分别与图5和图6相比得出：本发明制备的水凝胶支架更利于细胞生长与存活，从而说明本发明制备的水凝胶支架与对比例中PEG水凝胶支架相比具有更好的生物相容性。图22为对比例中PEG水凝胶的流变数据图，图23为本发明制备的水凝胶支架的流变数据图，从流变数据图中可以看出，本发明制备的水凝胶支架具有更好的稳定性。良好的生物相容性和稳定性使得本发明制备的水凝胶支架与对比例制备的PEG水凝胶支架相比具有更好的软骨修复效果，同时本发明制备的支架接入光交联基团，减少了化学交联试剂的使用，更具有生物安全性，因此，本发明制备的水凝胶支架在软骨损伤修复方面具有更好的应用前景。
Claims (7)
1.一种促进软骨损伤修复的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，步骤如下：
（1）甲基丙烯酸酯改性明胶的制备；
（2）可光交联HSNGLPL多肽的制备
所述HSNGLPL多肽能与转化生长因子β1自主结合；
（3）共交联双网络水凝胶支架的制备
将20mg步骤（1）制备的甲基丙烯酸酯改性明胶和14.5mg步骤（2）制备的可光交联HSNGLPL多肽溶解于1mL 0.01M pH 7.5的磷酸盐缓冲液中，混合均匀后，在搅拌的状态下加入10mg的2-羟基-4’-（2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮光引发剂659，将溶液均匀混合后，在紫外光下照射，制得共交联双网络水凝胶支架。
2.根据权利要求1所述的一种促进软骨损伤修复的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸酯改性明胶的制备方法为：向20g明胶中加入200mL 0.01MpH 7.5的磷酸盐缓冲液，在60℃的环境下持续搅拌2小时；将上述明胶溶液缓慢透过0.22μm水系滤膜，再在60℃搅拌的条件下每4分钟添加lmL甲基丙烯酸酐于明胶混合液中，共添加16次，然后继续搅拌2小时，形成甲基丙烯酸酯改性的明胶；将制得的甲基丙烯酸酯改性的明胶溶液进行透析冻干后，于4℃条件下保存。
3.根据权利要求2所述的一种促进软骨损伤修复的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述透析冻干的具体步骤为：将步骤（1）制得的甲基丙烯酸酯改性的明胶溶液置于800mL预热过的0.01M pH 7.5的磷酸盐缓冲液中进行稀释，并持续缓慢搅拌15分钟，将稀释后的溶液置于截留分子量为10KD的透析袋中，以去离子水为透析液进行透析，每天更换两次透析液以去除未反应的甲基丙烯酸酐，持续透析一周；透析后，将溶液置于-80℃冰箱中，两天后放入冻干机冻干。
4.根据权利要求1所述的一种促进软骨损伤修复的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述可光交联HSNGLPL多肽的末端含有可光交联的甲基丙烯酰基。
5.根据权利要求1所述的一种促进软骨损伤修复的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，其特征在于， 所述HSNGLPL多肽的纯度为95.74%。
6.根据权利要求1所述的一种促进软骨损伤修复的共交联双网络水凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中紫外光下照射的条件为：波长为360nm光强为10Mw/cm3的紫外灯下照射10min。
7.一种应用权利要求1~6任一项所述的制备方法制备的促进软骨损伤修复的共交联双网络水凝胶支架。
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