CN109876193A - 一种基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料及其制备方法 - Google Patents
一种基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料及其制备方法,该牙周缺损修复材料采用均具有光交联特性的生物大分子GelMA和合成高分子PEGDMA制成。双层复合水凝胶材料能够整合GelMA纤维水凝胶层和PEGDMA水凝胶层的优势,使双层复合水凝胶材料同时具有三维纤维和连通多孔的形貌,具有良好的生物相容性,高亲水性和优异的机械性能及稳定性。其中,GelMA纤维水凝胶层能够在不添加任何生长因子的情况下,通过纤维尺寸调控牙周膜干细胞向成骨细胞分化,有效促进牙槽骨组织再生;PEGDMA水凝胶层则可有效阻挡软组织(牙龈组织)侵入缺损区域,为牙槽骨组织再生提供有效空间。同时,在发挥阻隔作用的同时不影响营养物质传输。
Description
技术领域
本发明属于牙周缺损修复材料制备技术领域,具体涉及一种基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料及其制备方法。
背景技术
牙周疾病是人类最常见的口腔疾病之一,它是一种破坏牙齿周围支持组织的慢性炎症性疾病。全国口腔健康流行病学调查报告显示,我国患有不同程度牙周病的成年人数量占全国人口总数的80%以上。患有牙周疾病后,牙龈充血水肿,牙槽骨破坏并使得其高度下降,由此在牙齿和牙根之间形成深牙周袋,使得牙周膜无法附着于正常的牙槽骨,轻则可导致牙齿松动,重则直接将导致牙齿脱落。目前,传统的牙周病临床治疗方法(如龈上下洁治术、根面平整术以及牙周翻瓣术)仅能在一定程度上控制炎症,防止或减缓牙周病变加剧,无法修复已被破坏、丧失的牙周组织,尤其是牙槽骨再生形成新附着,患牙恢复行使正常功能。因此,实现牙周组织再生、修复牙周缺损是临床治疗牙周疾病亟待解决的问题。
第一代治疗牙周缺损的策略是在传统临床牙周治疗的基础上,通过植骨术(Bonegrafts)、引导组织再生(Guided tissue regeneration,GTR)、引导骨组织再生(Guidedbone regeneration,GBR)等方法实现牙周组织再生。但这种方法在很大程度上受到骨缺损形态的影响,且植入的新骨也很容易出现吸收。第二代治疗牙周缺损的策略是基于组织工程、干细胞治疗及基因治疗等技术。其中,支架承载型策略多见于组织工程,即“工程化牙周组织”;该策略采用“有效结构的组织工程支架材料”为再生组织提供支撑,最终实现牙周缺损修复。
根据组织工程支架材料的结构组成不同,可分为单层支架材料和复层支架材料。早期研究多集中于单层支架材料对牙周组织再生的影响。这种单层支架大多由一种材料构成,是仅涉及一种结构的立体支架,其设计来源于传统的骨修复,无法完全满足牙周组织对于支架修复材料的临床需求。近年来,越来越多研究学者认为,整合多种单层材料的优点,构建复层支架修复材料,有望进一步促进组织再生,实现牙周缺损修复。因此,当前面临的技术困难在于,现有的单层牙周缺损修复材料存在组成、结构及功能单一等问题;而双层牙周缺损修复材料通常制备工艺繁琐,手术操作使用复杂。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料及其制备方法,该修复材料为双层膜结构,促牙槽骨再生效果优异,生物相容性好,机械性能和稳定性良好;该制备方法操作简单,原料来源广,适合工业化规模生产。
为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案予以实现:
本发明公开了一种基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料,该牙周缺损修复材料为双层凝胶薄膜,由明胶丙烯酸甲酯纤维水凝胶层和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯水凝胶层组成,其中:
所述明胶丙烯酸甲酯纤维水凝胶层,厚度为10~100μm,用于促进牙槽骨组织再生;
所述聚乙二醇二甲基丙烯酸酯水凝胶层,厚度为100~500μm,用于阻挡牙龈组织侵入缺损区域。
本发明还公开了一种基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料的制备方法,包括以下步骤:
1)采用静电纺丝法制备明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维,将制得的明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维剪裁后,采用紫外光交联法制备明胶丙烯酸甲酯纤维水凝胶膜;
2)将明胶丙烯酸甲酯纤维水凝胶膜置于无底的模具下方,将聚乙二醇二甲基丙烯酸酯溶液和光引发剂滴加至模具中,覆盖明胶丙烯酸甲酯纤维水凝胶膜表面,然后盖上盖玻片,进行紫外光照射处理;
3)分离样品和模具,并切除多余的单层膜部分,制得基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料。
优选地,采用静电纺丝法制备的明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维的直径为250~2000nm。
优选地,采用点式交联仪照射60~100s,光强2.9mW/cm2,距离1cm。
优选地,步骤1)中,采用静电纺丝法制备明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维,具体操作如下:
将明胶丙烯酸甲酯溶解于六氟异丙醇溶液中,制得明胶丙烯酸甲酯/六氟异丙醇溶液;将明胶丙烯酸甲酯/六氟异丙醇溶液作为静电纺丝的注射液,静电纺丝至明胶丙烯酸甲酯/六氟异丙醇溶液耗尽,将纺好的明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维,于室温下静置24~48h,挥发残余有机溶剂后,将明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维膜从锡箔纸上取下,避光保存。
进一步优选地,静电纺丝时,剪取30cm x 30cm的长方形铝箔纸,环包于接收器上,注射器针头与锡箔纸距离为10~20cm,针头接正极,铝箔纸接负极,纺丝机电压设定为18~22kv,注射泵推动速率为0.001-0.002mm/s。
优选地,步骤1)中,采用紫外光交联法制备明胶丙烯酸甲酯纤维水凝胶膜,具体操作如下:
将具有不同纤维直径的明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维分别剪成所需形状、尺寸的明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维样品;
将无水乙醇与二羟基二甲基苯丙酮溶液充分混匀,获得交联液;
吸取交联液依次滴加于上述不同纤维直径的明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维样品中,采用点式交联仪光照60-90s,光强2.9mW/cm2,距离1cm,制得明胶丙烯酸甲酯纤维水凝胶膜。
优选地,步骤2)中,聚乙二醇二甲基丙烯酸酯溶液的质量浓度为7.5%~12%。
优选地,光引发剂采用2-羟基-2-甲基苯丙酮,且体积浓度为0.1%~0.5%。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明公开的基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料,采用均具有光交联特性的生物大分子GelMA和合成高分子PEGDMA制成。双层复合水凝胶材料能够整合GelMA纤维水凝胶层和PEGDMA水凝胶层的优势,使双层复合水凝胶材料同时具有三维纤维和连通多孔的形貌,具有良好的生物相容性,高亲水性和优异的机械性能及稳定性。其中,GelMA纤维水凝胶层能够在不添加任何生长因子的情况下,通过纤维尺寸调控牙周膜干细胞向成骨细胞分化,有效促进牙槽骨组织再生;PEGDMA水凝胶层则可有效阻挡软组织(牙龈组织)侵入缺损区域,为牙槽骨组织再生提供有效空间。同时,在发挥阻隔作用的同时不影响营养物质传输。
本发明公开的上述修复材料的制备方法,所用的材料、试剂来源广,成本低廉,GelMA和PEGDMA均可通过紫外光快速交联形成水凝胶,操作简便,可用于临床牙周组织缺损的修复和治疗。
附图说明
图1为不同浓度GelMA/六氟异丙醇溶液通过静电纺丝制备的GelMA电纺丝纤维的微观结构结果;其中,(a)为扫描电子显微镜结果;(b)为纤维直径分布统计结果;
图2为不同纤维直径GelMA纤维水凝胶膜对牙周膜干细胞成骨分化的调控作用;其中,(a)为碱性磷酸酶(ALP)表达;(b)为光学显微镜观察矿化结节生成;(c)为矿化结节生成量统计结果;
图3为不同浓度PEGDMA水凝胶膜的生物相容性;其中,(a)为不同浓度PEGDMA水凝胶膜培养牙龈上皮细胞的死/活染色结果;(b)为牙龈上皮细胞成活率;
图4为不同浓度PEGDMA水凝胶膜对牙龈上皮细胞的物理阻隔性;其中,(a)为激光共聚焦显微镜观察牙龈上皮细胞在水凝胶中的迁移行为;(b)为牙龈上皮细胞的迁移深度;
图5为本发明制得的GelMA/PEGDMA双层复合水凝胶牙周缺损修复材料的物理性能表征;其中,(a)、(b)为微观结构;(c)为溶胀性;(d)为拉伸模量。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是,本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象,而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换,以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外,术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形,意图在于覆盖不排他的包含,例如,包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元,而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述:
实施例1
GelMA的制备:天平称量10.0g猪皮胶原,加入100mL去离子水中,加热至60℃,搅拌,待胶原完全溶解。在上述胶原溶液中加入8mL甲基丙烯酸酯溶液(methacrylicanhydride,MA),流速为0.5mL/min,温度80℃,搅拌,待MA溶液全部滴加后,静置3小时。随后,加入500mL去离子水,搅拌30分钟,采用12000分子量的透析袋分装。将分装好的透析袋置于离子水中,磁力搅拌,透析;每24小时更换去离子水一次,持续7天。将透析好的GelMA溶液过滤,置于大号培养皿中,贴封口膜,-80℃过夜。最后,将预冷冻的GelMA溶液置于低温冷冻干燥机,冷冻干燥5天,取出样品,避光保存。
实施例2
GelMA电纺丝纤维的制备:天平称取1g GelMA,分别加入5mL、8mL、10mL、12mL六氟异丙醇溶液,震荡至GelMA完全溶解,得到不同浓度的GelMA/六氟异丙醇溶液。取一定浓度的上述溶液吸入5mL注射器中,并将注射器固定于电纺丝机的注射泵。剪取30cm x 30cm的长方形铝箔纸,环包于接收器上,注射器针头与锡箔纸距离为10cm。针头接正极,铝箔纸接负极,纺丝机电压设定为22kv,注射泵推动速率为0.0015mm/s。静电纺丝至全部GelMA溶液耗尽,将纺好的GelMA纤维膜移出静电纺丝机并室温下静置24h,使残余的有机溶剂全部挥发。最后,将GelMA纤维膜从锡箔纸上分离,避光保存。依次取不同浓度的GelMA/六氟异丙醇溶液加入注射器中,按照上述方法进行静电纺丝,制备具有不同纤维直径的GelMA电纺丝纤维。
将实施例2中制备的具有不同纤维直径的GelMA电纺丝纤维剪成方形样品(尺寸:1cm*1cm)。采用导电胶将GelMA纤维粘在样品台上,喷金60s。采用LEO-1530场发射扫描电镜(LEO公司,德国)观察样品的微观结构。图1为不同浓度GelMA/六氟异丙醇溶液通过静电纺丝制备的GelMA电纺丝纤维的微观结构结果。图1中(a),GelMA/六氟异丙醇溶液分别为1gGelMA+12mL六氟异丙醇、1g GelMA+10mL六氟异丙醇、1g GelMA+8mL六氟异丙醇及1g GelMA+5mL六氟异丙醇。从该图中可以看出,GelMA溶液的浓度和电纺丝纤维直径之间的明显相关性。随着溶液浓度升高,GelMA电纺丝纤维的直径逐渐增大,纤维直径分别为250±12nm,508±15nm,1023±20nm,2056±26nm,参见图1中(b)。
实施例3
GelMA纤维水凝胶膜的制备:将实施例2中制备的具有不同纤维直径的GelMA电纺丝纤维剪成方形样品(尺寸:1cm*1cm)。将10mL无水乙醇与1mL二羟基二甲基苯丙酮溶液混合,置于振荡器上10分钟,获得交联液。吸取0.1ml交联液依次滴加于各个GelMA电纺丝纤维样品,点式交联仪(OmniCure,加拿大)光照90s,光强2.9mW/cm2,距离1cm,制得GelMA纤维水凝胶膜。为去除残余的交联剂,将交联后的样品至于无水乙醇中浸泡5h,待用。
将牙周膜干细胞依次接种于具有不同纤维直径的GelMA纤维水凝胶膜(细胞密度:106个/孔),采用成骨诱导培养基(包含10mM的β-甘油磷酸二钠,1×10-7M地塞米松和50μg/mL抗坏血酸)进行细胞培养,每3天换液1次,并于特定培养时间进行成骨分化检测。图2为不同纤维直径GelMA纤维水凝胶层对牙周膜干细胞成骨分化的调控作用结果。细胞培养10天,测定牙周膜干细胞的ALP活性。从图2中(a)可以看出,培养在直径较小的GelMA纤维水凝胶膜(~250nm和~500nm)上的牙周膜干细胞ALP活性明显高于对照组(p<0.01)。当牙周膜干细胞培养在直径较大的GelMA纤维水凝胶膜(~2000nm)时,其ALP活性明显低于对照组(p<0.01)。细胞培养21天,观察牙周膜干细胞生成矿化结节的情况。从图2中(b)可以看出,具有不同直径的GelMA纤维水凝胶膜上均有矿化结节生成,尤其是~250nm和~500nm GelMA纤维水凝胶膜,可见较多呈深红色矿化结节。从图2中(c)的定量结果显示,矿化结节生成量随纤维直径增大而减少。其中,~250nm组的矿化结节生成量显著高于对照组(P<0.1),~1000nm和~2000nm组的矿化结节生成量显著低于对照组(P<0.01)。综合以上结果,可以看出,GelMA纤维水凝胶膜能够在不添加任何生长因子的情况下,通过调节GelMA纤维水凝胶膜的纤维尺寸,可以有效调控牙周膜干细胞向成骨细胞分化,具有优异的促牙槽骨再生效果。
实施例4
PEGDMA水凝胶膜的制备:称量0.75g、1.00g和1.20g PEGDMA,分别溶解至10ml超纯水中,配制质量体积分数(w/v)为7.5%,10%和12%的PEGDMA溶液。随后,加入光引发剂2-羟基-2-甲基苯丙酮,浓度为0.5%(v/v)。将上述溶液滴加入模具中(长*宽*高:1cm*1cm*100μm),点式交联仪(OmniCure,加拿大)照射100s,光强2.9mW/cm2,距离1cm,制备具有不同浓度的PEGDMA水凝胶膜。
分别将牙龈上皮细胞接种于不同浓度PEGDMA水凝胶膜(细胞密度:106个/孔),37℃培养,CO2浓度为5%,每2天换液1次。牙龈上皮细胞培养5天后,采用死/活染色测定细胞的成活率。图3为不同浓度PEGDMA水凝胶膜的生物相容性表征结果。从图3中(a)可以看出,不同浓度PEGDMA水凝胶膜上培养的牙龈上皮细胞成活率均较高,显示出良好的生物相容性。尽管如此,与7.5%水凝胶膜相比,随着PEGDMA浓度升高,细胞成活率明显下降(7.5%vs.10%:p<0.1;7.5%vs.12%:p<0.01),结果如图3中(b)所示。
此外,牙龈上皮细胞培养7天后,采用激光共聚焦显微镜观察牙龈上皮细胞在不同浓度PEGDMA水凝胶中的迁移行为,表征PEGDMA水凝胶膜对牙龈上皮细胞的物理阻隔性,结果参见图4中(a)。同时,从图4中(b)可以看出,牙龈上皮细胞在不同浓度PEGDMA水凝胶中的迁移深度均小于30um,且各实验组之间无显著性差异(p>0.1),表明PEGDMA水凝胶膜具有良好的阻挡牙龈上皮细胞与牙槽骨接触的能力,且其物理阻隔性与PEGDMA水凝胶浓度无关,为缺损部位残余的牙周组织来源细胞提供有效生长空间,有助于形成新生组织。
实施例5
GelMA/PEGDMA双层复合水凝胶牙周缺损修复材料的制备:
(1)按照实施例2中所述方法,采用静电纺丝技术制备纤维直径~250nm的GelMA电纺丝纤维。
(2)按照实施例3中所述方法,采用紫外光交联GelMA电纺丝纤维(尺寸:1.5cm*1.5cm),获得GelMA纤维水凝胶膜。
(3)将GelMA纤维水凝胶膜置于正方形方框模具(模具无底面,尺寸:1cm*1cm*100μm)下方,将7.5%PEGDMA溶液滴加到模具中并覆盖GelMA纤维水凝胶膜表面,盖上盖玻片。
(4)采用点式交联仪(OmniCure,加拿大)照射60s,光强2.9mW/cm2,距离1cm。
(5)分离样品和模具,并将多余的单层膜部分切除,制得GelMA/PEGDMA双层复合水凝胶牙周缺损修复材料,浸泡在PBS溶液中,待用。
图5为GelMA/PEGDMA双层复合水凝胶牙周缺损修复材料的物理性能表征结果。采用扫描电镜分别表征各层的微观结构,从图5中(a)可以看出,GelMA纤维水凝胶层仍然保持其原有的纤维形貌,且纤维尺寸与交联前差别不大,约为250nm。而从图5中(b)可以看出,PEGDMA水凝胶层具有连通的多孔结构,孔径约为100μm。随后,采用称重法分别测试~250nmGelMA纤维水凝胶(G gel)、7.5%PEGDMA水凝胶(P gel)以及由这两种材料构成的双层复合水凝胶(G/P gel)的溶胀性。从图5中(c)可以看出,P gel吸水率明显低于G gel和G/P gel(p<0.01);G gel与G/P gel相比,吸水率无显著性差异(p>0.1)。最后,采用BOSE ELF 3200动态力学分析仪(BOSE,美国)分别测试G gel、P gel和G/P gel的拉伸模量,评价其力学性能。从图5(d)中可以看出,G gel的拉伸模量明显低于P gel和G/P gel(p<0.01)。尽管P gel的拉伸模量略高于G/P gel,但两者无统计学差异(p>0.1)。
从以上结果可以看出,双层复合水凝胶材料能够整合单层水凝胶材料的优势,保留GelMA纤维水凝胶和PEGDMA水凝胶各自本身优异的生物及物理性能,使得双层复合水凝胶材料同时具有三维纤维和连通多孔的形貌,具有良好的生物相容性,高亲水性和优异的机械性能及稳定性。复合水凝胶材料的GelMA纤维水凝胶层能够调控牙周膜干细胞向成骨细胞分化,促进牙槽骨再生;PEGDMA水凝胶层在发挥阻隔作用的同时不影响营养物质传输。因此可作为一种潜在的新型牙周缺损修复材料。
以上内容仅为说明本发明的技术思想,不能以此限定本发明的保护范围,凡是按照本发明提出的技术思想,在技术方案基础上所做的任何改动,均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料,其特征在于,该牙周缺损修复材料为双层凝胶薄膜,由明胶丙烯酸甲酯纤维水凝胶层和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯水凝胶层组成,其中:
所述明胶丙烯酸甲酯纤维水凝胶层,厚度为10~100μm,用于促进牙槽骨组织再生;
所述聚乙二醇二甲基丙烯酸酯水凝胶层,厚度为100~500μm,用于阻挡牙龈组织侵入缺损区域。
2.一种基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)采用静电纺丝法制备明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维,将制得的明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维剪裁后,采用紫外光交联法制备明胶丙烯酸甲酯纤维水凝胶膜;
2)将明胶丙烯酸甲酯纤维水凝胶膜置于无底的模具下方,将聚乙二醇二甲基丙烯酸酯溶液和光引发剂滴加至模具中,覆盖明胶丙烯酸甲酯纤维水凝胶膜表面,然后盖上盖玻片,进行紫外光照射处理;
3)分离样品和模具,并切除多余的单层膜部分,制得基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料。
3.根据权利要求2所述的基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料的制备方法,其特征在于,采用静电纺丝法制备的明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维的直径为250~2000nm。
4.根据权利要求2所述的基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料的制备方法,其特征在于,采用点式交联仪照射60~100s,光强2.9mW/cm2,距离1cm。
5.根据权利要求2所述的基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料的制备方法,其特征在于,步骤1)中,采用静电纺丝法制备明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维,具体操作如下:
将明胶丙烯酸甲酯溶解于六氟异丙醇溶液中,制得明胶丙烯酸甲酯/六氟异丙醇溶液;将明胶丙烯酸甲酯/六氟异丙醇溶液作为静电纺丝的注射液,静电纺丝至明胶丙烯酸甲酯/六氟异丙醇溶液耗尽,将纺好的明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维,于室温下静置24~48h,挥发残余有机溶剂后,将明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维膜从锡箔纸上取下,避光保存。
6.根据权利要求5所述的基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料的制备方法,其特征在于,静电纺丝时,剪取30cmx30cm的长方形铝箔纸,环包于接收器上,注射器针头与锡箔纸距离为10~20cm,针头接正极,铝箔纸接负极,纺丝机电压设定为18~22kv,注射泵推动速率为0.001-0.002mm/s。
7.根据权利要求2所述的基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料的制备方法,其特征在于,步骤1)中,采用紫外光交联法制备明胶丙烯酸甲酯纤维水凝胶膜,具体操作如下:
将具有不同纤维直径的明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维分别剪成所需形状、尺寸的明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维样品;
将无水乙醇与二羟基二甲基苯丙酮溶液充分混匀,获得交联液;
吸取交联液依次滴加于上述不同纤维直径的明胶丙烯酸甲酯电纺丝纤维样品中,采用点式交联仪光照60-90s,光强2.9mW/cm2,距离1cm,制得明胶丙烯酸甲酯纤维水凝胶膜。
8.根据权利要求2所述的基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料的制备方法,其特征在于,步骤2)中,聚乙二醇二甲基丙烯酸酯溶液的质量浓度为7.5%~12%。
9.根据权利要求2所述的基于光交联水凝胶的双层复合牙周缺损修复材料的制备方法,其特征在于,光引发剂采用2-羟基-2-甲基苯丙酮,且体积浓度为0.1%~0.5%。
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