CN111110922B - 一种用于3d生物打印的牙周生物模块及构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于口腔再生医学技术领域，尤其涉及一种用于3D生物打印的牙周生物模块及构建方法及应用，所述模块设有网格结构、柱状结构和生物墨水，网格结构由N个小格交织形成，小格为中空；柱状结构设有M个柱状体和底板，柱状体并列固定于底板上与底板形成一体；柱状体在底板上位置与网状结构中小格位置相对应，网状结构与柱状结构嵌合成一体；小格内壁与柱状体外壁之间设有孔隙，小格直径>柱状体直径。本发明将活性生物墨水光固化成型，构建的牙周生物模块在为细胞提供良好的粘附与生长微环境的同时，使细胞在空间和结构上具有特殊且特定的排列顺序，且可维持长期微观结构的稳定，并能在实验动物体内良好地修复牙周缺损。

Description

一种用于3D生物打印的牙周生物模块及构建方法及应用
技术领域
本发明属于口腔再生医学技术领域，尤其涉及一种用于3D生物打印的牙周生物模块及构建方法及应用。
背景技术
牙齿是人类重要的器官，承担着咀嚼、发音、维持颌面部形态等功能，牙周组织作为牙齿的支持结构，有着维持牙直立、将咀嚼压力转变为牵引力、固定牙及牙根尖、防止牙根向冠方移动等重要作用。因此，牙周组织的炎症及缺失是导致牙齿缺失的重要原因之一。各种原因导致的牙周组织的炎症及缺损已成为一个较常见的现象，对牙周组织的修复，为牙齿治疗提供了一条途径或需要。
已有临床上使用传统修复、治疗方法来应用于牙周组织缺损的修复，例如牙周骨移植、引导组织再生术、引导骨再生术、生长因子局部缓释等。但存在着在炎症控制后对牙周缺损部位组织的修复依赖于患者机体剩余的健康间充质干细胞的数量与功能的技术问题，仅适用于牙周炎症较轻或剩余健康牙周组织较多的患者。
构建结构及功能完整的牙周组织的仿生结构是修复牙周缺损的必要趋势及目标。
组织工程技术随着发展，也越来越应用于修复、治疗牙周组织的炎症及缺损，是目前应用最广泛且最有前景的，可有望实现牙周组织完全再生的技术。由于牙周组织具有复杂的组成部分及三维结构，其不仅由牙骨质、牙周膜、牙槽骨组成的“三明治”结构所构成，且其中的牙周膜纤维在微观上是由多组具有不同且特定方向的牙周膜纤维束所构成的，组织工程技术上也存在着很难模拟上述复杂的微观结构的技术问题。
有的组织工程的研究采用生物材料复合牙源性干细胞或细胞膜片的方法，成功再生出牙周组织的“三明治结构”，其中包括新生的牙槽骨、牙骨质及牙周纤维样组织。但此类新生纤维中，纤维无特定排列方向，再生效果不稳定。
又有人采用3D打印PCL支架并复合牙周膜干细胞的技术来模拟牙周纤维的排列方向，结果虽发现有按一定方向排列的纤维样组织，但其纤维结构间断、不连续，且再生后的“三明治结构”中三层结构间有明显界面产生，不能保证最终结构的完整性，制作方法复杂。而采用该方法所进行的临床试验，结果未良好地修复牙周缺损部位。
中国发明CN201910465240.1公开了一种引导牙周硬软组织再生梯度材料及其制备方法，包括3D打印支架层和静电纺丝纤维膜层，所述3D打印支架层中羟基磷灰石含量高于静电纺丝纤维膜层，所述3D打印支架层的孔径大于静电纺丝纤维膜层，所述3D打印支架层的孔径大小为100～1000μm，所述静电纺丝纤维膜层的纤维直径大小为300～5000nm，所述静电纺丝纤维膜层的结构为无规分布或取向排列或网格状结构，静电纺丝纤维膜层厚度为 0.08～1mm。方法制备工艺简单、稳定，集牙周引导组织再生膜与牙槽骨修复支架材料一体化，且具有实现临床定制化治疗的潜能。所述梯度材料具有良好的体内引导硬软组织修复效果，能更好的应用于牙槽骨及牙周组织同步再生、修复。但这个专利中需分别构建3层结构，且每层结构间存在明显界面，无法生成完整的牙周“三明治结构”；同时，未能生成定向排列的牙周纤维结构；此外，存在着制作方法繁琐技术问题。
中国发明CN201710463999.7公开了一种3D打印支架材料及其制备方法和应用，所述材料包括如下组分：基质细胞衍生因子-1(SDF-1)和骨形态发生蛋白2(BMP2)。SDF-1在牙周组织改建中发挥重要作用，对牙周支持组织中存在的BMSCs、PDLSCs等干细胞的募集及增殖起关键作用，SDF-1在BMSCs动员、迁移和募集的全过程中，发挥重要作用，不仅如此，SDF-1能升高BMP2的表达，SDF-1和BMP2两种组分协同作用，共同促进牙周组织再生。此专利中未完整构建牙周组织三层结构。
因此，同时再生具有完整“三明治结构”及其中定向排列的牙周膜纤维，即构建仿牙周纤维结构的牙周功能组织模块仍是目前所需。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种用于3D生物打印的牙周生物模块及构建方法及应用，模块仿牙周纤维结构，实现硬组织(即牙槽骨、牙骨质)及软组织(即牙周膜纤维)同时再生，且牙周膜纤维具有特定方向，新生牙周组织中三层结构整体连续，无明显界面，制备方法简单，操作性强。
解决以上技术问题的本发明中的一种用于3D生物打印的牙周生物模块，其特征在于：所述模块设有网格结构和柱状结构，网格结构由N个小格交织形成，小格为中空；柱状结构设有M个柱状体和底板，柱状体并列固定于底板上与底板形成一体；网状结构一端与底板固定，使网状结构与柱状结构嵌合成一体，且柱状体在底板上位置与网状结构中小格位置相对应，柱状体位于小格中；小格内壁与柱状体外壁之间设有孔隙，小格直径>柱状体直径。
所述柱状体与小格为一整体，两者高度相同，长度值范围模拟天然牙周膜纤维长度，即牙周膜宽度。
所述小格为正方形、长方形或圆形。
所述柱状体为圆柱体或长方体。
所述模块由活性生物墨水构成，活性生物墨水包括明胶甲基丙烯酸化水凝胶、间充质干细胞和光交联剂LAP。
所述柱状体直径＝80～180μm，小格边宽度(网格状支架宽度)＝20～50μm，模块厚度为300～600μm，优化方案中为300～500μm；孔隙为30～40μm。模块厚度就是整体厚度。
本发明中柱状体位于网状体中间，柱状体与网状体之间设有的孔隙供细胞营养交换及废物代谢。明胶甲基丙烯酸化水凝胶与间充质干细胞构成活性生物墨水，生物墨水用来打印，所以整体结构就是明胶甲基丙烯酸化水凝胶和间充质干细胞。将模块放入培养基中培养时，培养基中营养物质可充满间隙，从而保证结构中的细胞可均匀接收营养。
本发明采用直径为80～180μm的柱状结构模拟牙周膜纤维，结构中的间充质干细胞可沿柱状结构伸展、生长、增殖。随后为实现体内移植，在设计结构时，在柱状结构的基础上增加20～40μm的网格状结构作为支撑结构，同时，在网格状与柱状结构之间形成30～40μm的孔隙以利于结构内部的细胞进行营养交换。
在生物打印时，同时打印网状与柱状的复合结构，所打印的整个模块厚度为300～600μ m，以模拟人天然牙周膜宽度。整体结构的俯视观即为柱状与网格复合结构，纵向上，结构内部的细胞可沿纵向结构增殖，侧视观即为由细胞纵向增殖后形成的纤维样结构，以模拟牙周膜纤维。
本发明中牙周生物模块由基于数字光处理系统的光固化3D生物打印技术构建；由柱状结构与网格结构组成并保留营养交换孔隙。能长期维持模块内部的微观结构，具有良好的结构稳定性；长期维持间充质干细胞的较高活性，引导干细胞在空间上按一定方向增殖，使干细胞在空间和结构上具有特殊且特定的排列顺序；模拟牙周纤维的微观结构，使间充质干细胞呈纤维样增殖、排列；可在体内修复动物的牙周组织缺损，包括硬组织的缺损及具有特定方向的牙周纤维组织的缺损。
本结构俯视观为柱状与网状复合结构，但重点在于其为三维结构，纵向上柱状结构中的细胞可沿柱状结构纵向伸展、生长、增殖，从而在纵向上形成纤维样结构，从而可以引导牙周膜纤维特定方向上的生长。
间充质干细胞具有多项分化特性，即可分化为血管、神经、纤维、骨等，能同时实现三明治结构的再生。
应用本发明中模块可生成三明治结构，又可使生成的三明治结构中的纤维结构按特定方向排列。中间充质干细胞具有多项分化特性，即可分化为血管、神经、纤维、骨等，因此可生成三明治结构，此因干细胞的多向分化特性；模块结构引导细胞纵向按一定方向增殖，形成按一定方向排列的纤维，从而生成按一定方向排列的牙周膜纤维。
应用模块过程中，细胞生长、增殖，材料降解，增殖后的细胞逐渐代替原有材料结构，形成由细胞构成的具有特定结构的整体模块，从而使牙周再生。使用的水凝胶本身就是多孔结构，利于细胞粘附生长，具有良好的生物相容性，具有致密层和疏松多孔层。
本发明中一种用于3D生物打印的牙周生物模块及构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)准备间充质干细胞：所述间充质干细胞可来源于大鼠、比格犬、小型猪、人类等，所获取间充质干细胞优选牙源性干细胞或骨髓间充质干细胞，要求所获取的间充质干细胞具有良好的细胞活性及成骨、成神经、成纤维、成骨等多项分化特性；
(2)配制水凝胶溶液：避光条件下，采用细胞培养基配制质量百分比5～15％的明胶甲基丙烯酸化水凝胶溶液，再加入质量百分比0.5～1％的光交联剂LAP，置于37℃水浴中静置 10-15分钟，待明胶甲基丙烯酸化水凝胶粉末完全溶解为水凝胶溶液；配制水凝胶溶液时需避光。
质量百分比5～15％的明胶甲基丙烯酸化水凝胶溶液，这里是指水凝胶溶液中含5～15％的明胶甲基丙烯酸。明胶甲基丙烯酸，即甲基丙烯酸酐化明胶，是一种光敏的生物水凝胶材料。该材料具有优异的生物相容性，且可由紫外光或可见光激发固化反应，形成适于细胞生长与分化且有一定强度的三维结构。甲基丙烯酸是一个化学基团，也是水凝胶产生光交联反应的基础。
所述细胞培养基为含10％FBS及1％青霉素/链霉素的完全α-MEM培养基。
所述LAP光交联剂可引起水凝胶的光交联反应，即光固化3D生物打印过程。光交联剂 LAP起引起水凝胶的光交联反应的作用，光交联就是光固化。
(3)制备活性生物墨水：制备活性生物墨水：将步骤(1)中所获得的间充质干细胞离心得到间充质干细胞团并加入步骤(2)所获得的甲基丙烯酸化水凝胶，吹打，使细胞重悬，间充质干细胞均匀地混合在水凝胶溶液中，获得活性生物墨水；离心条件：转速1000rpm(每分钟转速)，时间5分钟；
所述活性生物墨水可维持步骤(2)中原明胶甲基丙烯酸化水凝胶的低粘度、可通过光固化交联等相关特性；
(4)模块结构设计：用计算机辅助设计所需牙周生物模块结构；利用计算机辅助设计功能模块的三维结构模型，所设计结构为直径约80～180μm柱状结构与宽度约20～50μm的网状结构的复合结构，且其间保留30～40μm供细胞营养交换的孔隙，厚度约为300～ 500μm。设计后将所设计结构导入生物打印机系统进行打印。
(5)3D生物打印：采用基于数字光处理系统的3D生物打印机，根据步骤(4)中设计的所需要牙周生物模块结构，将步骤(3)所获得的活性生物墨水进行光固化成型，即3D生物打印。生物墨水放到打印机上，然后光固化。
所述间充质干细胞来源于大鼠、比格犬、小型猪和人类，间充质干细胞为多能间充质细胞，具体为P2～5代干细胞；优化方案中所获取间充质干细胞为牙源性干细胞或骨髓间充质干细胞；进一步优化方案中牙源干细胞具体为牙囊干细胞、牙周膜干细胞、脱落乳牙细胞干细胞和牙髓干细胞等。
所述步骤(3)中间充质干细胞浓度＝1.3×106～2×106cells/ml。
间充质干细胞浓度低于1.3×106cells/ml时，无法保证所打印的结构中间充质干细胞均匀分布；浓度高于2×106cells/ml时，无法保证间充质干细胞良好的增殖速率与生长状态。
优化方案中所述间充质干细胞浓度＝1.8×106～2×106cells/ml。
所述DLP光固化3D生物打印机分辨率1824×1140，波长365～405nm，光源最大功率50W。
本发明构建的牙周生物模块为细胞提供良好的粘附与生长微环境的同时，使细胞在空间和结构上具有特殊且特定的排列顺序，且可维持长期微观结构的稳定，且具有牙周修复功能，能在实验动物体内良好地修复牙周缺损。
其中，应用以上任一所述方法制备得到的仿牙周纤维结构的牙周功能组织模块均属于本发明的保护范围。本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
本发明中生物打印步骤为同时打印干细胞及水凝胶，打印步骤是连续的，所打印的结构在空间上是完整且连续的整体，整体结构中无界面，干细胞可在结构中连续生长、增殖。
3D打印为打印材料或生物材料，3D生物打印为同时打印细胞及生物材料，重点在于是否打印了细胞。
附图说明
下面结合附图及具体实施方式对本发明做更进一步详细说明：
图1为本发明中牙周生物模块的俯视结构示意图
图2为本发明中牙周生物模块的立体结构示意图
图3为本发明中3D生物打印牙周功能模块的模式图和打印后的荧光实体图
图4为本发明中3D生物打印牙周功能模块的实体光镜图
图5为本发明中支架中间充质培养过程中细胞存活情况对比图
(其中图A、图B、图C分别为生物打印后的牙周功能模块中的细胞在3、7、14天时的活细胞分布)
图6为本发明中支架中牙囊细胞在第3-14天空间上的分布与空间排列图
图7为本发明中含荧光的支架中牙囊细胞在第14、21天的分布与支架之间的位置关系图
图8为本发明中3D生物打印牙周功能模块在植入SD大鼠牙周缺损后的再生情况及新生骨骨密度检测图
图9为本发明中3D生物打印牙周功能模块在植入SD大鼠牙周缺损后的再生组织的组织学检测图
图10为本发明中3D生物打印牙周功能模块在植入SD大鼠牙周缺损后的再生组织中牙周相关蛋白的表达图
图11为本发明中3D生物打印牙周功能模块对比格犬牙周缺损模型的修复图
图12为本发明中3D生物打印牙周功能模块对比格犬牙周缺损模型的修复后的牙周相关指标的临床检测图
图13和图14为本发明中细胞密度配比不同时生长情况对比图
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明：
实施例1
(1)获取P3代大鼠牙囊干细胞：选取出生后8天大鼠，取上、下颌骨，分离取出牙胚，从离体牙胚中分离牙囊组织，采用常规原代组织贴壁发获取大鼠原代牙囊干细胞，并培养至P3代；
(2)配制水凝胶溶液：采用含10％FBS及1％青霉素/链霉素的完全α-MEM培养基配制 15％明胶甲基丙烯酸化水凝胶溶液，加入1％光交联剂LAP，置于37℃水浴中静置，避光；
(3)制备活性生物墨水：将步骤(1)中所获得的间充质干细胞离心得到间充质干细胞团并加入步骤(2)所获得的甲基丙烯酸化水凝胶，吹打，使细胞重悬，间充质干细胞均匀地混合在水凝胶溶液中，获得活性生物墨水，调整细胞浓度为1.3×106cells/ml；离心条件：转速1000rpm(每分钟转速)，时间5分钟；
(4)计算机辅助结构设计：所设计结构由直径约为100μm的柱状结构与边宽度约为40μm的网状结构的复合结构构成，其间保留宽度约40μm的供细胞营养交换及及废物代谢的孔隙；
(5)光固化成型：采用波长360nm的DLP光固化3D生物打印机，根据步骤(4)设计结构，进行光固化成形，固化时间20s；
采用的DLP光固化生物打印机原理。打印过程主要为：通过电脑软件进行结构设计，将所设计的结构传入生物打印机中的数字光芯片，数字光芯片通过控制投影光学系统发出特定的光源，对基台上的水凝胶及细胞的混合生物墨水按照特定的结构进行光固化成性。
(6)通过镜下观察步骤(5)所得的仿生牙周功能模块光固化后结构与计算机所设计结构无差异；
(7)体外培养步骤(5)所得的仿生牙周功能模块14天后镜下观察，微观结构稳定；
(8)构建SD大鼠牙周缺损模型，并植入步骤(7)中体外培养后的仿生牙周功能模块：选取SD大鼠第一磨牙颊侧远中区，构建长3mm宽2mm厚700μm的牙周缺损模型并植入体外培养14天后的仿生牙周功能模块；2月后影像学检测发现大鼠牙周缺损得到良好的修复。
其中，图中A、B为所设计牙周功能模块的结构模拟示意图。后采用含有荧光的GelMA 水凝胶混合间充质干细胞后进行生物打印，图C按所设计的特定结构打印后的牙周功能模块，可清晰地看到其中的柱状纤维结构、网格状支撑结构及两者间的营养交换间隙。同时为探究所设计结构是否有效，采用将细胞及GelMA水凝胶的混合生物墨水直接固化的生物墨水块作为对照，即图D。
模块可长期维持间充质干细胞的较高活性，并引导干细胞在空间上按一定方向增殖，使干细胞在空间和结构上具有特殊且特定的排列顺序。可模拟牙周纤维的微观结构，使间充质干细胞呈纤维样增殖、排列。可在体内修复动物的牙周组织缺损，包括硬组织的缺损及具有特定方向的牙周纤维组织的缺损。
实施例2
(1)获取P3代人牙周膜干细胞：取经患者同意因正畸需要拔除的年轻恒前磨牙，采用常规组织贴壁法培养人牙周膜干细胞，并培养至第三代；
(2)配制水凝胶溶液：采用含10％FBS及1％青霉素/链霉素的完全α-MEM培养基配制甲基丙烯酸化水凝胶水凝胶溶液，加入光交联剂LAP，置于37℃水浴中静置，避光。配制包括 15％甲基丙烯酸化水凝胶、0.5％LAP光交联剂的甲基丙烯酸化水凝胶水凝胶溶液；
(3)制备活性生物墨水：将步骤(1)中所获得的间充质干细胞离心得到间充质干细胞团并加入步骤(2)所获得的甲基丙烯酸化水凝胶，吹打，使细胞重悬，间充质干细胞均匀地混合在水凝胶溶液中，获得活性生物墨水，调整细胞浓度为1.5×106cells/ml；离心条件：转速1000rpm(每分钟转速)，时间5分钟；
步骤(3)中活性生物墨水可维持步骤(2)中原甲基丙烯酸甲酯水凝胶的粘度低、可通过光固化交联相关特性。
(4)计算机辅助结构设计：所设计结构由直径约为100μm的柱状结构与边宽度约为40μm的网状结构的复合结构构成，其间保留宽度约30μm的供细胞营养交换及及废物代谢的孔隙；
(5)光固化成型：采用波长360nm的DLP光固化3D生物打印机，根据步骤(4)设计结构，进行光固化成形，固化时间20s。
通过镜下观察所得的仿生牙周功能模块光固化后结构与计算机所设计结构无差异；体外培养所得的仿生牙周功能模块14天后镜下观察，微观结构稳定；
(6)构建SD大鼠牙周缺损模型：做动物牙周缺损。植入体外培养后的仿生牙周功能模块，选取SD大鼠第一磨牙颊侧远中区，构建长3mm宽2mm厚700μm的牙周缺损模型并植入体外培养14天后的仿生牙周功能模块；2月后影像学检测发现大鼠牙周缺损得到良好的修复。
本发明将活性生物墨水置于基于数字光处理系统(DLP)的光固化3D生物打印机下通过光固化成型。构建的牙周生物模块在为细胞提供良好的粘附与生长微环境的同时，使细胞在空间和结构上具有特殊且特定的排列顺序，且可维持长期微观结构的稳定，并能在实验动物体内良好地修复牙周缺损。
实施例3
(1)获取P3代比格犬牙囊干细胞：取3月大比格犬未萌出的牙胚，从离体牙胚中分离牙囊组织，采用常规原代组织贴壁发获取大鼠原代牙囊干细胞，并培养至P3代；
(2)配制水凝胶溶液：采用含10％FBS及1％青霉素/链霉素的完全α-MEM培养基配制甲基丙烯酸化水凝胶水凝胶溶液，加入光交联剂LAP，置于37℃水浴中静置，避光。配制包括 10％甲基丙烯酸化水凝胶、0.5％LAP光交联剂的甲基丙烯酸化水凝胶水凝胶溶液；
(3)制备活性生物墨水：将步骤(1)中所获得的间充质干细胞离心得到间充质干细胞团并加入步骤(2)所获得的甲基丙烯酸化水凝胶，吹打，使细胞重悬，间充质干细胞均匀地混合在水凝胶溶液中，获得活性生物墨水，调整细胞浓度为2×106cells/ml；离心条件：转速1000rpm(每分钟转速)，时间5分钟；
(4)计算机辅助结构设计：所设计结构由直径约为100μm的柱状结构与边宽度约为30μm的网状结构的复合结构构成，其间保留宽度约30μm的供细胞营养交换及及废物代谢的孔隙；
(5)光固化成型：采用波长360nm的DLP光固化3D生物打印机，根据步骤(4)设计结构，进行光固化成形，固化时间15s。
通过镜下观察所得的仿生牙周功能模块光固化后结构与计算机所设计结构无差异；体外培养步骤(5)所得的仿生牙周功能模块14天后镜下观察，微观结构稳定；
(6)构建比格犬牙周缺损模型并植入体外培养后的仿生牙周功能模块：选取比格犬第二、三前磨牙近中牙根，构建大小约6mm×5mm×3mm的牙周缺损模型并植入体外培养14天后的仿生牙周生物模块；3月后影像学检测发现比格犬牙周缺损得到良好的修复。
实施例4
(1)获取P4代脱落乳牙干细胞：取经患者同意因乳牙滞留需要拔除的、带有牙髓组织的滞留乳牙，采用常规组织贴壁法培养人脱落乳牙细胞，并培养至第三代；
(2)配制水凝胶溶液：采用含10％FBS及1％青霉素/链霉素的完全α-MEM培养基配制甲基丙烯酸化水凝胶水凝胶溶液，加入光交联剂LAP，置于37℃水浴中静置，避光。配制包括 10％甲基丙烯酸化水凝胶、0.5％LAP光交联剂的甲基丙烯酸化水凝胶水凝胶溶液；
(3)制备活性生物墨水：将步骤(1)中所获得的间充质干细胞离心得到间充质干细胞团并加入步骤(2)所获得的甲基丙烯酸化水凝胶，吹打，使细胞重悬，间充质干细胞均匀地混合在水凝胶溶液中，获得活性生物墨水，调整细胞浓度为1.8×106cells/ml；离心条件：转速1000rpm(每分钟转速)，时间5分钟；
(4)计算机辅助结构设计：所设计结构由直径约为180μm的柱状结构与边宽度约为40μm的网状结构的复合结构构成，其间保留宽度约30μm的供细胞营养交换及废物代谢的孔隙；
(5)光固化成型：采用波长405nm的DLP光固化3D生物打印机，根据步骤(4)设计结构，进行光固化成形，固化时间10s。
通过镜下观察步骤(5)所得的仿生牙周功能模块光固化后结构与计算机所设计结构无差异；体外培养步骤(5)所得的仿生牙周功能模块14天后镜下观察，微观结构稳定；
(6)构建SD大鼠牙周缺损模型并植入体外培养后的仿生牙周功能模块：选取SD大鼠第一磨牙颊侧远中区，构建长3mm宽2mm厚700μm的牙周缺损模型并植入体外培养14天后的仿生牙周功能模块；2月后影像学检测发现大鼠牙周缺损得到良好的修复。
实施例5
(1)获取P4代人牙囊干细胞：取经患者同意因临床原因需拔除的未完全萌出的人第三磨牙，后分离牙囊，采用常规组织贴壁法培养人原代牙囊细胞，并培养至第三代；
(2)配制水凝胶溶液：采用含10％FBS及1％青霉素/链霉素的完全α-MEM培养基配制甲基丙烯酸化水凝胶水凝胶溶液，加入光交联剂LAP，置于37℃水浴中静置，避光。配制包括10％甲基丙烯酸化水凝胶、0.5％LAP光交联剂的甲基丙烯酸化水凝胶水凝胶溶液；
(3)制备活性生物墨水：将步骤(1)中所获得的间充质干细胞离心得到间充质干细胞团并加入步骤(2)所获得的甲基丙烯酸化水凝胶，吹打，使细胞重悬，间充质干细胞均匀地混合在水凝胶溶液中，获得活性生物墨水，调整细胞浓度为1.8×106cells/ml；离心条件：转速1000rpm(每分钟转速)，时间5分钟；
(4)计算机辅助结构设计：所设计结构由直径约为120μm的柱状结构与边宽度约为40μm的网状结构的复合结构构成，其间保留宽度约30μm的供细胞营养交换及及废物代谢的孔隙；
(5)光固化成型：采用波长360nm的DLP光固化3D生物打印机，根据步骤(4)设计结构，进行光固化成形，固化时间15s；
通过镜下观察步骤(5)所得的仿生牙周功能模块光固化后结构与计算机所设计结构无差异；体外培养步骤(5)所得的仿生牙周功能模块14天后镜下观察，微观结构稳定；
(6)构建SD大鼠牙周缺损模型并植入步骤(7)中体外培养后的仿生牙周功能模块：选取SD大鼠第一磨牙颊侧远中区，构建长3mm宽2mm厚700μm的牙周缺损模型并植入体外培养14天后的仿生牙周功能模块；2月后影像学检测发现大鼠牙周缺损得到良好的修复。
实施例6
本发明中模块设有网格结构和柱状结构，网格结构由N个小格交织形成，小格为中空；柱状结构设有M个柱状体和底板，柱状体并列固定于底板上与底板形成一体；网状结构一端与底板固定，使网状结构与柱状结构嵌合成一体，且柱状体在底板上位置与网状结构中小格位置相对应，柱状体位于小格中；小格内壁与柱状体外壁之间设有孔隙，小格直径>柱状体直径。
柱状体与小格为一整体，两者高度相同，长度值范围模拟天然牙周膜纤维长度，即牙周膜宽度。小格为长方形，柱状体为圆柱体。模块由活性生物墨水构成，活性生物墨水包括明胶甲基丙烯酸化水凝胶、间充质干细胞和光交联剂LAP。
柱状体直径＝100μm，小格边宽度＝30μm，模块厚度为450μm，优化方案中为300～500 μm；孔隙为35μm。模块厚度就是整体厚度。
实施例7
模块设有网格结构和柱状结构，网格结构由N个小格交织形成，小格为中空；柱状结构设有M个柱状体和底板，柱状体并列固定于底板上与底板形成一体；网状结构一端与底板固定，使网状结构与柱状结构嵌合成一体，且柱状体在底板上位置与网状结构中小格位置相对应，柱状体位于小格中；小格内壁与柱状体外壁之间设有孔隙，小格直径>柱状体直径。
柱状体与小格为一整体，两者高度相同，长度值范围模拟天然牙周膜纤维长度，即牙周膜宽度。
小格为正方形或圆形，柱状体为长方体。模块由活性生物墨水构成，活性生物墨水包括明胶甲基丙烯酸化水凝胶、间充质干细胞和光交联剂LAP。
柱状体直径＝80或180μm，小格边宽度＝20或50μm，模块厚度为300或600μm；孔隙为30或40μm。模块厚度就是整体厚度。
实施例8
模块设有网格结构和柱状结构，网格结构由N个小格交织形成，小格为中空；柱状结构设有M个柱状体和底板，柱状体并列固定于底板上与底板形成一体；网状结构一端与底板固定，使网状结构与柱状结构嵌合成一体，且柱状体在底板上位置与网状结构中小格位置相对应，柱状体位于小格中；小格内壁与柱状体外壁之间设有孔隙，小格直径>柱状体直径。
柱状体与小格为一整体，两者高度相同，长度值范围模拟天然牙周膜纤维长度，即牙周膜宽度。小格为长方形，柱状体为圆柱体。模块由活性生物墨水构成，活性生物墨水包括明胶甲基丙烯酸化水凝胶、间充质干细胞和光交联剂LAP。
柱状体直径＝120μm，小格边宽度＝45μm，模块厚度为300或500μm；孔隙为38μm。
试验一活死细胞存活率检测
对实施例5中牙周生物模块进行培养并检测。
通过荧光染色法检测了生物模块培养3、7、14天内的间充质干细胞的活性。
所使用的试剂如下：钙黄绿素CaAM(公司：Invitrogen，货号：C3100MP)，碘化丙啶核酸染料PI(公司：Invitrogen，货号：P1304MP)。
CaAM用于活细胞染色，能够对细胞酯酶进行标记，显示绿色荧光。使用方法：用10ul DMSO溶解50ug CaAM，然后添加10mlPBS并混匀。所获得的溶液中钙CaAM工作液的终浓度为5mmol/l。
PI用于死细胞染色，能够对细胞核进行标记，显示红色荧光。
使用方法：用双蒸水将PI稀释至1mg/ml，用作储存液；然后用PBS将储存液以1:3000 的比例稀释至终浓度500nM，用作工作液。
染色方法如下：
将制备的仿生牙周生物模块分别培养3、7、14天后取出，置于共聚焦培养皿中央，滴加1ml上述CaAM工作液中，于37℃孵育1h；然后加入1ml碘化丙啶核酸染料，染色 15min。之后，使用激光共聚焦显微镜，俯视观察牙周生物模块的染色结果。
培养3、7、14天后仿生模块中的hDFC细胞存活情况结果分别示于图5的A、B、C中。由图5可见，牙周生物模块中在3、7、14天时，其内部细胞均匀增殖，细胞存活率及增殖速率稳定(如图5、图6)。
试验二活细胞分布观察实验
对实施例5中牙周生物模块进行培养并检测。并设实验组和对照组，实验组为实施例 5中所设计的牙周生物模块，即内部细胞有序排列；对照组是由实施例5中相同的细胞及水凝胶的混合物直接光固化而来，无模块设计，内部细胞无序排列。
通过荧光染色法检测了实验组及对照组分别培养3、14天时间充质干细胞在生物模块中的分布。
所使用的试剂和使用方法如试验一中内容。
染色方法如下：
将制备的实验组就对照组模块分别培养3-14天后取出，置于共聚焦培养皿中央，滴加 1ml上述CaAM工作液中，于37℃孵育1h。之后，使用激光共聚焦显微镜，通过扫描并进行三维重建，后通过不同视角对牙周生物模块的不同层面的染色结果进行检测。
培养3-14天后实验组及对照组间充质干细胞的分布如图6中。由图6可见，牙周生物模块中在3-14天时，其内部细胞均匀增殖，细胞存活率及增殖速率稳定，且14天时可见实验组细胞呈纤维样分布；而对照组在3-14天时，其内部细胞不均匀增殖，且14天时细胞呈无序分布(如图6)。实验组及对照组细胞在3-14天均可保持90-95％的细胞存活率，但实验组较对照组的细胞增殖速率快(图6)。
试验三含荧光的支架中间充质干细胞在第14、21天的分布与支架之间的位置关系
将实施例4中生物模块培养14及21天后，取材。室温下，PBS清洗生物模块，使用4％多聚甲醛溶液固定15min，后用0.5％TritionX-100溶液透化处理5min，PBS洗3次，每次10min，取200μl配制好的FITC标记的鬼笔环肽(FITC标记Phalloidin)工作液，室温避光孵育30min，PBS清洗3次，每次5min，使用200μlDAPI溶液(浓度：100mM)对细胞核进行复染，约30s，PBS清洗，滴加抗荧光淬灭剂。之后，使用激光共聚焦显微镜观察生物模块的染色，结果显示长期培养下的生物模块仍可维持原有微观形状，且支架中细胞可维持良好的生长状态。如图7所示，14-21天，可见随着支架材料的降解，其内部的干细胞可代替降解的材料以维持结构原有微观形状。且在体外培养60天时可见，水凝胶支架结构完全降解后，其中的干细胞可维持原有的纤维状微观结构，并未发生变形。证明该牙周生物模块可长期维持仿生牙周纤维状结构，可保证在动物体内移植后按原有微观机构生成特定方向排列的纤维样组织。
试验四牙周功能模块在动物体内的再生情况及新生牙槽骨骨密度检测
对实施例5中牙周生物模块进行体内实验。
设实验组、对照组、空白组及天然组。实验组为植入3D生物打印构建的牙周生物模块，即内部细胞有序排列；对照组为手术后植入干细胞与水凝胶无序混合并光固化后的生物墨水块，即无模块设计，内部细胞无序排列；空白组为手术后未植入组；天然组为未手术组。
选取SD大鼠第一磨牙远中，构建3mmx2mmx1mm的牙周缺损模型，并进行实验组、对照组及空白组的植入，观察生物模块在体内的分化情况。植入8周后，取材。行Micro CT扫描。后采用SCANCO Evaluation软件选取术区进行骨密度数据分析。
如图8所示，检测结果显示植入8周后，实验组见大量牙槽骨生成，牙槽嵴得到良好的恢复，接近于天然牙槽骨的牙槽嵴高度；而对照组只见少量骨质生成；空白组则出现渐行性牙槽骨吸收，牙槽骨吸收至根尖。右图骨密度检测显示实验组平均骨密度远大于对照组及空白组。生物打印的牙周功能模块在动物体内的牙周修复取得了好的效果。
试验五再生组织的组织学检测
设实验组、对照组、空白组及天然组。实验组为植入3D生物打印构建的牙周生物模块，即内部细胞有序排列；对照组为手术后植入干细胞与水凝胶无序混合并光固化后的生物墨水块，即无模块设计，内部细胞无序排列。
选取SD大鼠第一磨牙远中，构建3mmx2mmx1mm的牙周缺损模型，并进行实验组、对照组及空白组的植入，观察生物模块在体内的分化情况。植入8周后，取材，置于4％多聚甲醛中固定，后置于EDTA中脱矿2月，流水下冲洗并过夜，后利用梯度酒精脱水(75％乙醇→85％乙醇→95％乙醇(I)→95％乙醇(II)→95％乙醇(Ⅲ)→100％乙醇(I)→100％乙醇(II)→100％乙醇(Ⅲ)→二甲苯(I)→二甲苯(II)各1小时)、石蜡包埋过夜，制备成5μm组织切片进行苏木素-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining，H&E染色)及 MASSON染色观察观察。
按以下步骤进行H&E染色:
(1)脱蜡；二甲苯(I)和二甲苯(II)中各10min；
(2)水化：无水乙醇(I)10min→无水乙醇(II)10min→95％乙醇(I)5min →95％乙醇(II)5min→85％乙醇5min→75％乙醇5min；
(3)PBS缓冲液冲洗5min，3次；
(4)染色：苏木素染色5min→水洗1min→1％盐酸酒精分化10s→流水冲洗反蓝5min→伊红上色1min→水洗30s；
(5)脱水：85％乙醇1min→90％乙醇2min→95％乙醇(I)2min→95％乙醇
(II)2min→无水乙醇(I)2min→无水乙醇(II)2min→二甲苯(I)5min→二甲苯(II)5min；
(6)封片：中性树脂封片，显微镜下观察。
采用Masson三色染色试剂盒(中国)对组织片进行染色，试剂盒组成有：Weigert铁苏木素A液、Weigert铁苏木素B液、丽春红酸性品红染液、磷钼酸溶液、苯胺蓝染液。
(1)将片子按上述步骤脱蜡至水；
(2)Weigert铁苏木素A液、Weigert铁苏木素B液等比例混合配制工作液，染片 5～10分钟，流水稍洗；
(3)1％盐酸酒精分化10s，流水冲洗；
(4)丽春红酸性品红染液染5～10分钟，流水冲洗；
(5)磷钼酸溶液处理约5分钟，随后苯胺蓝染液复染5分钟；
(6)1％冰醋酸处理2分钟，梯度酒精脱水各2分钟；
(7)二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察。
从图9中的组织学染色，HE及MASSON结果显示：实验组新生纤维呈有序排列，且与牙根角度呈一定角度，与天然组牙周膜纤维相似；而对照组的新生纤维排列杂乱。
说明实验组-3D生物打印的牙周生物模块可再生有序的牙周膜纤维，且再生后的牙周膜纤维与牙槽骨呈一定的角度，与天然牙周膜相似。证明本发明所构建的牙周生物模块不仅可是修复牙周缺损，生成牙周三明治结构，同时可再生出具有特定方向排列的牙周膜纤维，即完整的再生出了与天然牙周组织相似的新生牙周组织。
试验六再生组织的蛋白表达相关检测
设实验组、对照组及天然组。实验组为植入3D生物打印构建的牙周生物模块，即内部细胞有序排列；对照组为手术后植入干细胞与水凝胶无序混合并光固化后的生物墨水块，即内部细胞无序排列。
选取SD大鼠第一磨牙远中，构建3mmx2mmx1mm的牙周缺损模型，并进行实验组、对照组及空白组的植入，观察生物模块在体内的分化情况。植入8周后，取材，置于4％多聚甲醛中固定，后置于EDTA中脱矿2月，流水下冲洗并过夜，后利用梯度酒精脱水(75％乙醇→85％乙醇→95％乙醇(I)→95％乙醇(II)→95％乙醇(Ⅲ)→100％乙醇(I)→100％乙醇(II)→100％乙醇(Ⅲ)→二甲苯(I)→二甲苯(II)各1小时)、石蜡包埋过夜，制备成5μm组织切片行免疫荧光蛋白染色鉴定新生组织中牙周相关蛋白的表达。
按以下步骤进行免疫荧光蛋白染色:
(1)PBS缓冲液冲洗5min，3次；
(2)3％过氧化氢处理：擦去组织周围液体，滴加3％过氧化氢溶液，避光孵育20分钟；取出切片，PBS缓冲液冲洗5min，3次；
(3)抗原修复：擦去组织周围液体，滴加冰冻切片快速抗原修复液(将储存液用双蒸水1：5稀释后使用)，室温孵育8min；PBS缓冲液冲洗5min，3次；
(4)封闭：取出切片，免疫组化笔画圈，滴加山羊血清，放置于湿盒中37℃封闭30min；
(5)一抗孵育：倒掉封闭液，稍干燥后，加入配制好的一抗COL-1、Fibronectin、CAP、DSP(1％BSA 1:200稀释)，置于湿盒中4℃孵育过夜；
(6)二抗孵育：倒掉一抗，PBS清洗三次，滴加二抗，37℃避光孵育1h，PBS洗3 遍，5min/次；
(7)DAPI染色，PBS清洗三次；
(8)封片、采图：抗荧光淬灭剂封片，共聚焦显微镜下拍照采图。
从图10的再生组织中牙周相关蛋白的表达可以看出，实验组所再生的牙周组织中，可表达大量牙周相关蛋白明显表达，证明所再生的纤维样组织为牙周组织特有纤维。且蛋白表达量大于对照组，并较对照组生成更多血管，另外，实验组可见明显成神经相关蛋白的表达，对照组则仅有微小的血管及神经纤维的表达。
此实验证明本发明中3D生物打印的牙周生物模块可再生牙周组织，并促进牙周相关蛋白的表达，且可生成丰富的血管及神经。
试验七牙周生物模块对大动物比格犬牙周缺损的修复
对实施例3中牙周生物模块进行大动物体内实验。
设实验组、对照组、空白组及天然组。实验组为植入3D生物打印构建的牙周生物模块，即内部细胞有序排列；对照组为手术后植入干细胞与水凝胶无序混合并光固化后的生物墨水块，即内部细胞无序排列；空白组为手术后未植入组；天然组为未手术组。
选取比格犬第二、三前磨牙近中牙根，构建大小约6mm×5mm×3mm的牙周缺损模型，并进行实验组、对照组、空白组的植入，同时保留天然组(图11中A-D)。
移植后3月取材，进行Micro-CT扫描，结果显示实验组牙槽骨得到一定恢复，而对照组及空白组则有少量低密度骨质生成，且牙槽嵴并未得到良好的修复(图11D)，图11F 示骨密度检测中实验组的骨密度明显高于对照组及空白组。
之后，进行修复后的牙周相关指标的临床检测，如图12。临床检查显示，术后3月的比格犬牙周探诊深度均低于1.5mm，处于临床健康牙龈的龈沟探诊深度，无附着丧失，证明所构建的生物打印牙周功能模块可在临床上修复大动物的牙周缺损。
试验八
其它内容相同，设间充质细胞浓度分别为(0.5-0.8)*105cells/ml，(0.8-1.0)*106cells/ml，(1.3-1.5)*106cells/ml和(1.8-2.0)*106cells/ml的实验组，结果如图 13和图14所示。
从以上图可以看出，细胞浓度低时无法保证结构中含有适宜数量的细胞，而细胞浓度过高时，同样无法保证结构中的干细胞有适当的生长空间。
本发明采用直径为80～180μm的柱状结构模拟牙周膜纤维，结构中的间充质干细胞可沿柱状结构伸展、生长、增殖。随后为实现体内移植，在设计结构时，在柱状结构的基础上增加20～40μm的网格状结构作为支撑结构，同时，在网格状与柱状结构之间形成30～40μm的孔隙以利于结构内部的细胞进行营养交换。在生物打印时，同时打印网状与柱状的复合结构，所打印的整个模块厚度为300～600μm，以模拟人天然牙周膜宽度。整体结构的俯视观即为柱状与网格复合结构，纵向上，结构内部的细胞可沿纵向结构增殖，侧视观即为由细胞纵向增殖后形成的纤维样结构，以模拟牙周膜纤维。
本发明细胞和材料同时打印、成型，只需要5-10秒构建一个整体模块，为组织工程再生牙周组织的全新设计，为牙周组织缺损的修复提供一种新策略，以期实现模拟天然牙周组织及牙周膜纤维，实现牙周组织的完全再生。再生出来的软组织与硬组织具有特定方向，即中间的软组织纤维是垂直于上下的硬组织的平行排列的纤维。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，上述实施例和说明书所描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种用3D生物打印的牙周生物模块，其特征在于：所述模块设有网格结构和柱状结构，网格结构由N个小格交织形成，小格为中空；柱状结构设有M个柱状体和底板，柱状体并列固定于底板上与底板形成一体；网状结构一端与底板固定，使网状结构与柱状结构嵌合成一体，且柱状体在底板上位置与网状结构中小格位置相对应，柱状体位于小格中；小格内壁与柱状体外壁之间设有孔隙，小格直径>柱状体直径。
2.根据权利要求1所述的一种用3D生物打印的牙周生物模块，其特征在于：所述小格为正方形、长方形或圆形；所述柱状体为圆柱体或长方体；所述模块由活性生物墨水构成，活性生物墨水包括明胶甲基丙烯酸化水凝胶、间充质干细胞和光交联剂LAP。
3.根据权利要求1所述的一种用3D生物打印的牙周生物模块，其特征在于：所述柱状体直径=80～180μm，小格边宽度=20～50μm，模块厚度=300～500μm。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种用3D生物打印的牙周生物模块，其特征在于：孔隙=30～40μm。
5.一种构建根据权利要求1所述用3D生物打印的牙周生物模块的方法，其特征在于：包括以下步骤:
（1）准备间充质干细胞；所述间充质干细胞来源于大鼠、比格犬、小型猪和人类，间充质干细胞为多能间充质细胞，具体为P2～5代干细胞；
（2）配制水凝胶溶液：采用细胞培养基配制质量百分比5-15%的明胶甲基丙烯酸化水凝胶溶液，再加入质量百分比0.5～1%的光交联剂LAP，置于37℃水浴中静置，避光；
（3）制备活性生物墨水：将步骤（1）中所获得的间充质干细胞离心得到间充质干细胞团；并加入步骤（2）所获得的明胶甲基丙烯酸化水凝胶，吹打，使细胞重悬得活性生物墨水；间充质干细胞浓度介于1.8×106～2×106 cells/mL；
（4）模块结构设计：用计算机辅助设计和制作所需牙周生物模块结构；
（5）3D生物打印：采用基于数字光处理系统的DLP光固化3D生物打印机，根据所需要牙周生物模块结构，将步骤（3）所获得的活性生物墨水进行光固化成型，进行3D生物打印；所述DLP光固化3D生物打印机分辨率1824×1140，波长365～405nm，光源最大功率50W，固化时间为5～20s。
6.根据权利要求5中所述的一种构建用3D生物打印的牙周生物模块的方法，其特征在于：所述间充质干细胞为牙源性干细胞或骨髓间充质干细胞。
7.根据权利要求6中所述的一种构建用3D生物打印的牙周生物模块的方法，其特征在于：所述牙源干细胞具体为牙囊干细胞、牙周膜干细胞、脱落乳牙细胞干细胞和牙髓干细胞。
8.根据权利要求1所述的一种用3D生物打印的牙周生物模块的应用，其特征在于：所述模块仿牙周纤维结构，应用于牙周组织缺损的修复模块的构建。
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