CN113398330A - 一种可构建多层级仿生孔结构的3d打印生物墨水及其制备方法和打印方法 - Google Patents
一种可构建多层级仿生孔结构的3d打印生物墨水及其制备方法和打印方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种可构建多层级仿生孔结构的3D打印生物墨水及其制备方法和打印方法。经制备而成的生物墨水包含有可光固化水凝胶、聚环氧乙烷溶液、引发剂、无机成骨活性成分、有机成骨活性成分和骨髓间充质干细胞，且通过3D打印技术打印支架的孔隙率为46～70％，大孔尺度为300～1000μm，微观尺度为10～100μm，可使支架内留存的62‑90％的生长因子和细胞均匀分布且可通过相互贯通的孔隙进行增殖和迁移，满足支架内细胞的营养和代谢产物交换需要，促进植入体支架的骨修复重建。本发明提供的3D打印生物墨水具有良好生物相容性，分散性好，还可完全降解，使所打印的支架不仅具有良好的骨修复效果，且可以由人体自行吸收排出，不需要二次手术取出，具备较大的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物材料及其制备技术领域，尤其是3D生物打印材料和制备技术领域，特别涉及一种适合骨再生修复的含有活细胞和生长因子且可构建多层级仿生孔结构的3D打印生物墨水及其制备方法和打印方法。
背景技术
车祸、外伤、恶性肿瘤等因素导致的骨缺损是临床常见且难以解决的问题，对此，临床常用的治疗方法为植骨术。目前植骨术常用的移植物的来源包括自体骨、同种异体骨、异种骨及各种无活性的人工骨等，但这些植骨材料不仅来源有限，且会导致取骨部位并发症、二次手术、传播传染性疾病、免疫排斥等问题，或因金属、高分子聚合物等人工骨支架力学强度较高，存在降解困难、降解速率与骨生长速率不一致以及降解产物影响局部微环境等问题。
对此，组织工程学提供了解决上述问题的一个可行思路。由组织工程学衍生出来的组织工程学支架可由模仿细胞外基质(ECM)的生物材料和具有促进细胞生长或诱导分化的生长因子构成，从而为细胞附着，增殖和分化提供结构支持。这些模仿细胞外基质(ECM)的生物材料如明胶、海藻酸盐、壳聚糖、透明质酸、聚乙二醇等天然及合成的水凝胶材料，由于其具备类细胞外基质的仿生特性，高度的三维水化网络结构，高效养分和代谢物交换能力以及包裹细胞的强大能力，有利于组织再生和创伤愈合过程中细胞的迁移和生长，可提高骨组织再生和修复的速度，非常适用于作为移植细胞和生长因子缓释的载体，现已被广泛应用于制备组织工程水凝胶支架。
另外，临床骨缺损病人的缺损部位大多形状不规则，体外预制骨修复材料难以在术中完美匹配骨缺损形状，3D打印技术的出现解决了这一难题。传统的3D打印技术由于打印过程中温度过高，仅能打印完成后在支架表面接种细胞或添加生物活性成分。此类支架存在细胞接种后在支架表面分布不均匀，细胞及生物活性成分黏附不佳等问题。除制备材料本身外，组织工程支架还应该具备相互连接的孔隙结构，以允许有效氧、营养物和废物交换以及细胞增殖和舒展。但在制造孔隙技术方面，传统的组织工程支架造孔方法虽有粒子致孔法、冷冻干燥法、气体发泡法等，但这类方法由于接种的细胞或添加的生物活性成分难以承受造孔加工过程而仅适用于单纯的支架打印。
近年来出现的3D生物打印技术(Murphy,S.,Atala,A.3D bioprinting oftissues and organs.Nat Biotechnol 32,773–785(2014).)虽能将细胞及生物活性物质配制成“生物墨水”来实现精准打印、多细胞打印或复杂器官组织打印，但所使用的水凝胶类材料产生的密集生物材料网络会限制封装的细胞的扩散，迁移和增殖。如何准确控制生物材料内部孔隙率、孔径以及孔间交通结构成为限制其发展的瓶颈。
发明内容
本发明的目的首先是针对采用现有水凝胶类材料打印的支架存在限制细胞增殖和舒展的问题，提供一种可构建多层级仿生孔结构的3D打印生物墨水。
本发明的另一目的是提供一种上述可构建多层级仿生孔结构的3D打印生物墨水的制备方法。
本发明的再一目的是提供一种用上述3D打印生物墨水打印水凝胶支架的方法。
本发明提供的一种可构建多层级仿生孔结构的3D打印生物墨水，该3D打印生物墨水包含以下组分：
上述3D打印生物墨水中所述的无机成骨活性成分优选为0.5～1.5wt％，有机成骨活性成分优选为0.3～0.5μg/ml。
上述3D打印生物墨水中所述的可光固化水凝胶为甲基丙烯酸酐化明胶、甲基丙烯酸酐化透明质酸、甲基丙烯酸酐化丝素蛋白、甲基丙烯酸酐化壳聚糖中的至少一种。可光固化水凝胶低于5％浓度会使固化较为困难或固化后力学强度不佳，而高于20％wt虽力学强度较好，但对细胞的迁移、增殖和舒展会带来困难。
上述3D打印生物墨水中所述的有机成骨活性成分为骨形态发生蛋白(BMP)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和胰岛素样生长因子(IGF)中的至少一种。
上述3D打印生物墨水中所述的无机成骨活性成分为磷酸三钙、羟基磷灰石、磷酸四钙和磷酸二氢钙中的至少一种或为锶、铜、锂、铁、锌金属盐中的至少一种。
上述3D打印生物墨水中所述的无机成骨活性成分粒径＜200nm。因为纳米级粉体具有更佳的生物学作用以及在水凝胶溶液中具有更好的稳定性，可以最大程度的避免沉降导致的分散不均甚至打印失败的问题。
上述3D打印生物墨水中所述的光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)或Irgacure 2959。
本发明提供的一种上述3D打印生物墨水的制备方法，该方法的工艺步骤和条件如下：
(1)将可光固化水凝胶和光引发剂加入磷酸盐缓冲液(PBS)、DMEM培养基溶液或α-MEM培养基溶液中溶解，使水凝胶溶液中的可光固化水凝胶浓度为5～20wt％、光引发剂浓度为0.25～0.5wt％；
(2)将聚环氧乙烷粉末及光引发剂在磷酸盐缓冲液(PBS)中充分溶解，并使聚环氧乙烷溶液中的聚环氧乙烷浓度为1.0～1.6wt％，光引发剂浓度为0.25～0.5wt％；
(3)分别将水凝胶溶液及聚环氧乙烷溶液用0.22μm滤膜过滤除菌；
(4)将无菌的有机和/或无机成骨活性成分加入除菌后的水凝胶溶液中混匀得到有机/成骨活性成分的复合水凝胶溶液；
(5)将骨髓间充质干细胞消化为悬浮液后计数，离心，并以复合水凝胶溶液将离心后的骨髓间充质干细胞重悬，控制复合水凝胶溶液中的骨髓间充质干细胞浓度为1～10×106/ml，得到载生长因子及细胞的水凝胶溶液；
(6)将载生长因子及细胞的水凝胶溶液与聚环氧乙烷溶液以体积比4:1-1:1混合均匀，然后立即置入4℃冰箱放置3-5分钟即可得到3D打印生物墨水。
本发明还提供了一种用上述3D打印生物墨水打印水凝胶支架的方法，该打印方法的工艺步骤和条件如下：
(1)先用CT或MRI对骨缺损部位放置支架的部位进行扫描，然后构建目标骨缺损支架三维数字模型，并以STL格式文件导出；
(2)先将3D打印生物墨水加入3D打印机中，并将目标骨缺损支架三维数字模型STL格式文件导入3D打印机，调节打印机料筒温度、打印平台温度、打印速度和光固化时间参数，然后依次进行打印、光固化成型；
(3)将步骤(2)中得到的成型支架取下，浸入37℃磷酸盐缓冲液(PBS)、DMEM培养基溶液或α-MEM培养基中冲洗，洗去聚环氧乙烷溶液，即可得到负载细胞及生长因子并具有多层级仿生孔隙结构的水凝胶支架。
上述打印方法中所述的步骤(1)具体为：将骨缺损部位及骨缺损部位相对应的对侧健康骨骼进行CT或MRI扫描，获得的数据导入Mimics软件中，新建一个蒙版(Mask)，设置阈值范围为150～1000HU，获得两侧骨骼模型数据；将骨缺损部位与骨缺损部位相对应的对侧健康骨骼数据进行布尔运算相减，得到骨缺损部位数据，并测算孔隙率及密质骨区域、松质骨区域和松质骨中间的营养孔隙区域分布，得到目标骨缺损部位模型数据，根据上述信息进行建模，必要时添加支撑结构；最后以STL格式文件导出所构建的目标骨缺损支架三维数字模型。
上述打印方法中所述的步骤(2)所用的3D打印生物墨水是依据步骤(1)所得数据来调整3D打印生物墨水中各组分用量，计算所采用的载生长因子及细胞的水凝胶溶液与聚环氧乙烷溶液的体积比，并制备出相应的3D打印生物墨水。
上述打印方法中所述的步骤(2)中所述的3D打印机优选熔融沉积制造(FusedDeposition Modeling，FDM)技术的3D打印机或数字光处理(Digital light processing，DLP)技术的3D打印机。
上述打印方法中所采用的FDM技术的3D打印机，其料筒温度设置为13～19℃，以使其中的3D打印生物墨水能够维持为半凝胶态，打印平台温度设置为8～15℃，避免挤出后水凝胶丝融化成溶液，打印挤出速度设置为0.8～1.2mm3/s，打印速度设置为4～6mm/s，光固化时间设置为2～6s/层。
上述打印方法中所采用的DLP技术的3D打印机加料时则需提前加热3D打印生物墨水至37℃，以维持其较好的流动性；采用蓝光或紫外光光源，光照强度为5～20mW/cm2，曝光时间为5～20s。
采用以上打印方法打印获得的水凝胶支架，该支架可在实现负载生长因子及负载细胞打印的同时完成多尺度孔隙的构建，所得支架的孔隙率为46～70％，丝直径600μm、多尺度孔隙结构中三维宏观正方形大孔尺度为600～1000μm，且大孔孔壁材料内均匀分布相互贯通的微观小孔，小孔尺度为10～100μm。生长因子和细胞约有62-90％留存并均匀分布于支架内，且可通过相互贯通的孔隙进行增殖和迁移，以提供细胞增殖分化的载体和三维支撑，满足支架内细胞的营养和代谢产物交换需要。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、由于本发明提供的3D打印生物墨水所采用的材料均具有良好生物相容性，分散性好，且还可完全降解，因而不仅具有良好的骨修复效果，且可以由人体自行吸收排出，不需要二次手术取出，避免了给病人带来额外的痛苦。
2、由于本发明提供的3D打印生物墨水中不仅加入了有机和无机的成骨活性成分，还采用了聚环氧乙烷致孔剂，因而能够在打印制备的支架内形成二级微米尺度微观结构和拓扑形貌，使支架内均匀分布的生长因子和细胞可通过相互贯通的孔隙进行舒展、增殖和迁移，满足支架内细胞的营养和代谢产物交换需要，促进植入体支架的骨修复重建。
3、由于本发明是提供的3D打印技术来制备水凝胶支架，因而既能够根据患者骨缺损部位来定制个性化外形尺寸，还能设计一级宏观结构大孔生物水凝胶，并可通过调整支架内致孔剂的用量，进一步设计调控支架内的二级微米尺度的微观结构和拓扑形貌，以调控水凝胶的生物学功能与支架内调控水凝胶的生物学功能，利于细胞的长入和营养物质的交换，促进植入体支架的骨修复重建效果，满足不同的需求。
附图说明
图1是采用本发明提供的3D打印生物墨水中所使用的无机纳米羟基磷灰石扫描透射电镜图像。从图像中可以看出羟基磷灰石颗粒为纳米级颗粒，在水凝胶溶液中分散后具有较好的稳定性。
图2是采用本发明提供的3D打印生物墨水和打印方法所制备的水凝胶支架内孔隙结构的荧光染色激光共聚焦显微镜图像。从图像中可以看出在水凝胶中产生了相互连通的孔隙结构，水凝胶溶液与聚环氧乙烷溶液以不同体积比的混合可产生不同大小的孔隙结构。
图3是采用本发明提供的3D打印生物墨水和打印方法所制备的不同孔隙率水凝胶支架经培养7天的激光共聚焦显微镜图像，其中图A为纯水凝胶激光共聚焦显微镜图像，图B、C、D分别为水凝胶溶液与聚环氧乙烷溶液体积比为3:1、2:1、1:1的水凝胶激光共聚焦显微镜图像。从图像中可以看出纯水凝胶组的细胞形态仍然为球形结构，而多孔水凝胶组中的细胞已舒展为梭形，且多孔水凝胶组的细胞数量已远远超过纯水凝胶组，说明多孔水凝胶较纯水凝胶对细胞增殖和舒展有明显的促进作用。
具体实施方式
下面给出实施例以对本发明作进一步说明。有必要在此指出的是以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，如果该领域的技术熟练人员根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整，仍属于本发明保护范围。
实施例1
(1)骨缺损建模
以兔右侧股骨1cm长的节段性缺损为例，将双侧股骨全长进行CT扫描，获得的数据导入Mimics软件中，新建一个Mask，设置阈值范围为150～1000HU，获得两侧骨骼模型数据；将骨缺损部位与骨缺损部位相对应的对侧健康骨骼进行布尔运算相减，得到骨缺损部位数据，并测算孔隙率及密质骨区域、松质骨区域、松质骨中间的营养孔隙区域分布；根据上述信息进行建模，得到目标骨缺损部位模型数据，添加支撑结构数据并依据该数据调整确定3D打印墨水中各组分用量；最后以STL格式文件导出所需的目标骨缺损支架三维数字模型。
(2)3D打印生物墨水配制
将10g明胶粉末在磁力搅拌子转速为500rpm下，加入50℃100ml的PBS溶液中，待完全溶解后将5ml甲基丙烯酸酐溶液缓慢加入明胶溶液中反应3小时，加入等体积的50℃PBS溶液并继续搅拌10分钟，中止反应；将产物用滤纸过滤沉渣后将粗产物在40℃的超纯水中透析3天(透析袋截留量为12～14KDa)。随后将透析产物于冻干机中冷冻干燥3～7天得到泡沫样甲基丙烯酸酐化明胶固体。
将0.5g甲基丙烯酸酐化明胶固体和25mg光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂加入避光的离心管后，再加入5mlPBS于50℃水浴中震荡充分溶解，将充分溶解后的水凝胶溶液用0.22μm滤膜过滤除菌；将0.16g聚环氧乙烷粉末及0.05g苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂加入10mlPBS溶液中充分震荡溶解得到聚环氧乙烷质量分数为1.6％的聚环氧乙烷溶液，其中苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂的质量分数为0.5wt％。将聚环氧乙烷溶液用0.22μm滤膜过滤除菌；将骨髓间充质干细胞消化为悬液后计数，取500万个骨髓间充质干细胞并离心，用0.67ml除菌后的水凝胶溶液吹打离心的细胞，将其重新悬浮为细胞悬液，得到载细胞的水凝胶溶液；再取0.5μg骨形态发生蛋白加入载细胞的水凝胶溶液并混合均匀，得到载细胞和有机生长因子的水凝胶溶液；将0.33ml除菌后的聚环氧乙烷溶液加入载细胞和有机生长因子的水凝胶溶液混合均匀即得到体积比为2:1的3D打印生物墨水；将3D打印生物墨水立即置入4℃冰箱放置4分钟使其半凝胶化以备打印。
(3)3D打印成型骨缺损支架
将步骤(1)中得到的STL.格式文件导入FDM技术挤出式3D打印机中，将模型数据切片并依据打印机本身的性能参数选择打印针头型号，设置层高、丝间距。最终可得到不同大小的丝直径及大孔尺度。小孔尺度取决于水凝胶溶液与造孔剂的体积比。本实施例采用SUNP BIOMAKER 2桌面级3D打印机进行打印。
选择的打印针头为25G，料筒温度为17℃，打印平台温度为9℃，挤出速率为1.0mm3/s，打印速度为5mm/s，光固化时间设置为4s/层。层高0.23mm，丝间距1.25mm然后将步骤(2)得到的3D打印生物墨水加入3D打印机料筒中，待料筒内温度稳定后依次进行打印、光固化成型。
(4)打印后处理
将经上述步骤打印完成支架取出，用PBS溶液轻柔冲洗2～3次，洗去聚环氧乙烷溶液后加入完全培养基培养。
最终得到具有一级宏观尺度正方形大孔为600μm，丝直径600μm、小孔尺度为10～100μm、孔隙率约为63％(与纯水凝胶相对比的估计值)的正交网格填充式多孔载细胞及有机生长因子的水凝胶成骨支架，如图3所示，其中细胞及有机生长因子约有74％留存于支架内。
实施例2
骨缺损建模、甲基丙烯酸酐化明胶固体的制备及打印后处理同实施例1。不同之处在于，采用不同生物墨水配置方法及打印参数。
生物墨水配置具体为将骨髓间充质干细胞消化为悬液后计数，取100万个骨髓间充质干细胞并离心，用0.5ml除菌后的水凝胶溶液吹打离心的细胞，将其重新悬浮为细胞悬液，得到载细胞的水凝胶溶液；再取0.015g磷酸三钙加入载细胞的水凝胶溶液并混合均匀，得到载细胞和1.5wt％无机成骨活性成分(无机生长因子)的水凝胶溶液；将0.5ml除菌后的聚环氧乙烷溶液加入载细胞和无机生长因子的水凝胶溶液混合均匀即得到体积比为1:1的3D打印生物墨水；将3D打印生物墨水立即置入4℃冰箱放置5分钟使其半凝胶化以备打印。
打印参数具体为采用25G打印针头，料筒温度为15℃，打印平台温度为8℃，挤出速率为0.8mm3/s，打印速度为4mm/s，光固化时间设置为6s/层。层高0.23mm，丝间距1.25mm。
最终得到具有一级宏观尺度大孔为600微米，丝直径600微米、小孔尺度为10～100μm、孔隙率为70％的正交多孔载细胞水凝胶成骨支架，细胞及无机生长因子约63％留存于支架内。
实施例3
骨缺损建模、甲基丙烯酸酐化明胶固体的制备及打印后处理同实施例1。不同之处在于，采用不同生物墨水配置方法及打印参数。
生物墨水配置具体为将骨髓间充质干细胞消化为悬液后计数，取1000万个骨髓间充质干细胞并离心，用0.75ml除菌后的水凝胶溶液吹打离心的细胞，将其重新悬浮为细胞悬液，得到载细胞的水凝胶溶液；再取0.005g磷酸四钙加入载细胞的水凝胶溶液并混合均匀，得到载细胞和0.5wt％无机生长因子的水凝胶溶液；将0.25ml除菌后的聚环氧乙烷溶液加入载细胞和无机生长因子的水凝胶溶液混合均匀即得到体积比为3:1的3D打印生物墨水；将3D打印生物墨水立即置入4℃冰箱放置3.5分钟使其半凝胶化以备打印。
打印参数具体为采用25G打印针头，料筒温度为19℃，打印平台温度为10℃，挤出速率为1.2mm3/s，打印速度为6mm/s，光固化时间设置为3.5s/层。层高0.23mm，丝间距1.25mm。
最终得到具有一级宏观尺度大孔为600微米，丝直径600微米、小孔尺度为10～100μm、孔隙率约为56％的正交多孔载细胞水凝胶成骨支架，细胞及无机生长因子约82％留存于支架内。
实施例4
骨缺损建模、甲基丙烯酸酐化明胶固体的制备及打印后处理同实施例1。不同之处在于，采用不同生物墨水配置方法及打印参数。
生物墨水配置具体为将骨髓间充质干细胞消化为悬液后计数，取800万个骨髓间充质干细胞并离心，用0.8ml除菌后的水凝胶溶液吹打离心的细胞，将其重新悬浮为细胞悬液，得到载细胞的水凝胶溶液；再取0.03g磷酸二氢钙加入载细胞的水凝胶溶液并混合均匀，得到载细胞和3wt％无机生长因子的水凝胶溶液；将0.20ml除菌后的聚环氧乙烷溶液加入载细胞和无机生长因子的水凝胶溶液混合均匀即得到体积比为4:1的3D打印生物墨水；
打印参数具体为采用25G打印针头，料筒温度为21℃，打印平台温度为15℃，挤出速率为1.2mm3/s，打印速度为6mm/s，光固化时间设置为2s/层。层高0.23mm，丝间距1.25mm。
最终得到具有一级宏观尺度大孔为600微米，丝直径600微米、小孔尺度为10～100μm、孔隙率约为47％的正交多孔载细胞水凝胶成骨支架，细胞及无机生长因子约90％留存于支架内。
实施例5
骨缺损建模、甲基丙烯酸酐化明胶固体的制备及打印后处理同实施例1。不同之处在于，采用不同生物墨水配置方法及打印参数。
将1.0g甲基丙烯酸酐化明胶固体和12.5mg光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂加入避光的离心管后，再加入5mlPBS于50℃水浴中震荡充分溶解，将充分溶解后的水凝胶溶液用0.22μm滤膜过滤除菌；将0.16g聚环氧乙烷粉末及0.025g苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂加入10mlPBS溶液中充分震荡溶解得到聚环氧乙烷质量分数为1.6％的聚环氧乙烷溶液，其中苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂的质量分数为0.25wt％。将聚环氧乙烷溶液用0.22μm滤膜过滤除菌；将骨髓间充质干细胞消化为悬液后计数，取400万个骨髓间充质干细胞并离心，用0.67ml除菌后的水凝胶溶液吹打离心的细胞，将其重新悬浮为细胞悬液，得到载细胞的水凝胶溶液；再取1.0μg血管内皮细胞生长因子加入载细胞的水凝胶溶液并混合均匀，得到载细胞和有机成骨活性成分(有机生长因子)的水凝胶溶液；将0.33ml除菌后的聚环氧乙烷溶液加入载细胞和有机生长因子的水凝胶溶液混合均匀即得到体积比为2:1的3D打印生物墨水；将3D打印生物墨水立即置入4℃冰箱放置4分钟使其半凝胶化以备打印。
打印参数具体为采用25G打印针头，料筒温度为25℃，打印平台温度为10℃，挤出速率为1.2mm3/s，打印速度为6mm/s，光固化时间设置为2.5s/层。层高0.20mm，丝间距1.6mm。
具最终得到具有一级宏观尺度大孔为1000微米，丝直径600微米、小孔尺度为10～100μm、孔隙率为70％的正交多孔载细胞水凝胶成骨支架，细胞及有机生长因子约70％留存于支架内。
实施例6
骨缺损建模、甲基丙烯酸酐化明胶固体的制备及打印后处理同实施例1。不同之处在于，采用不同生物墨水配置方法及打印参数。
将0.25g甲基丙烯酸酐化明胶固体和25mg光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂加入避光的离心管后，再加入5mlPBS于50℃水浴中震荡充分溶解，将充分溶解后的水凝胶溶液用0.22μm滤膜过滤除菌；将0.16g聚环氧乙烷粉末及0.05g苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂加入10mlPBS溶液中充分震荡溶解得到聚环氧乙烷质量分数为1.6％的聚环氧乙烷溶液，其中苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂的质量分数为0.5wt％。将聚环氧乙烷溶液用0.22μm滤膜过滤除菌；将骨髓间充质干细胞消化为悬液后计数，取300万个骨髓间充质干细胞并离心，用0.67ml除菌后的水凝胶溶液吹打离心的细胞，将其重新悬浮为细胞悬液，得到载细胞的水凝胶溶液；再取0.01g碳酸锂加入载细胞的水凝胶溶液并混合均匀，得到载细胞和无机生长因子的水凝胶溶液；将0.33ml除菌后的聚环氧乙烷溶液加入载细胞和无机生长因子的水凝胶溶液混合均匀即得到体积比为2:1的3D打印生物墨水；将3D打印生物墨水立即置入4℃冰箱放置5分钟使其半凝胶化以备打印。
打印参数具体为采用25G打印针头，料筒温度为13℃，打印平台温度为8℃，挤出速率为1.0mm3/s，打印速度为5mm/s，光固化时间设置为5s/层。层高0.23mm，丝间距1.25mm。
最终得到具有一级宏观尺度大孔为600微米，丝直径600微米、小孔尺度为10～100μm、孔隙率约为68％的正交多孔载细胞水凝胶成骨支架，细胞及无机生长因子约62％留存于支架内。
实施例7
骨缺损建模、甲基丙烯酸酐化明胶固体的制备及打印后处理同实施例1。不同之处在于，采用不同生物墨水配置方法及打印参数。
生物墨水配置具体为采用1wt％的聚环氧乙烷溶液，其余参数与实施例1相同
打印参数具体为采用25G打印针头，料筒温度为19℃，打印平台温度为10℃，挤出速率为0.8mm3/s，打印速度为4mm/s，光固化时间设置为4s/层。层高0.23mm，丝间距1.25mm。
最终得到具有一级宏观尺度大孔为600微米，丝直径600微米、小孔尺度为10～100μm、孔隙率为54％的正交多孔载细胞水凝胶成骨支架，细胞及有机生长因子约70％留存于支架内。
实施例8
骨缺损建模、甲基丙烯酸酐化明胶固体的制备、生物墨水配制及打印后处理同实施例1。不同之处在于打印方式不同及参数不同，将步骤(1)中得到的STL.格式文件导入紫外波长为450nm的DLP打印机中。将加热至37℃的3D打印墨水加入DLP光固化3D打印机料槽中。光照强度设置为15mW/cm2，曝光时间设置为15s。最终得到具有一级宏观尺度大孔为600微米，丝直径600微米、小孔尺度为10～100μm、孔隙率为54％的正交多孔载细胞水凝胶成骨支架，细胞及有机生长因子约70％留存于支架内。
打印完成后取出支架，孔隙率、生长因子及细胞留存率与FDM式3D打印机相仿。
最终得到具有一级宏观尺度大孔为600微米，丝直径600微米、小孔尺度为10～100μm、孔隙率为62％的正交多孔载细胞水凝胶成骨支架，细胞及有机生长因子约71％留存于支架内。
实施例9
骨缺损建模、甲基丙烯酸酐化明胶固体的制备、生物墨水配制及打印后处理同实施例3。不同之处在于打印方式不同及参数不同，将步骤(1)中得到的STL.格式文件导入紫外波长为450nm的DLP打印机中。将加热至37℃的3D打印墨水加入DLP光固化3D打印机料槽中。光照强度设置为10mW/cm2，曝光时间设置为10s。最终得到具有一级宏观尺度大孔为600微米，丝直径600微米、小孔尺度为10～100μm、孔隙率为55％的正交多孔载细胞水凝胶成骨支架，细胞及有机生长因子约81％留存于支架内。
实施例10
骨缺损建模、甲基丙烯酸酐化明胶固体的制备、生物墨水配制及打印后处理同实施例4。不同之处在于打印方式不同及参数不同，将步骤(1)中得到的STL.格式文件导入紫外波长为450nm的DLP打印机中。将加热至37℃的3D打印墨水加入DLP光固化3D打印机料槽中。光照强度设置为5mW/cm2,曝光时间设置为5s。最终得到具有一级宏观尺度大孔为600微米，丝直径600微米、小孔尺度为10～100μm、孔隙率为46％的正交多孔载细胞水凝胶成骨支架，细胞及有机生长因子约90％留存于支架内。
实施例11
骨缺损建模、甲基丙烯酸酐化明胶固体的制备、生物墨水配制及打印后处理同实施例2。不同之处在于打印方式不同及参数不同，将步骤(1)中得到的STL.格式文件导入紫外波长为450nm的DLP打印机中。将加热至37℃的3D打印墨水加入DLP光固化3D打印机料槽中。光照强度设置为20mW/cm2,曝光时间设置为20s。最终得到具有一级宏观尺度大孔为600微米，丝直径600微米、小孔尺度为10～100μm、孔隙率为69％的正交多孔载细胞水凝胶成骨支架，细胞及有机生长因子约62％留存于支架内。
Claims (9)
1.一种可构建多层级仿生孔结构的3D打印生物墨水，其特征在于该3D打印生物墨水包含以下组分：
2.根据权利要求1所述的可构建多层级仿生孔结构的3D打印生物墨水，其特征在于该3D打印生物墨水中所述的可光固化水凝胶为甲基丙烯酸酐化明胶、甲基丙烯酸酐化透明质酸、甲基丙烯酸酐化丝素蛋白、甲基丙烯酸酐化壳聚糖中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的可构建多层级仿生孔结构的3D打印生物墨水，其特征在于该3D打印生物墨水中所述的有机成骨活性成分为骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β、血小板衍生生长因子、血管内皮细胞生长因子和胰岛素样生长因子中的至少一种；所述的无机成骨活性成分为磷酸三钙、羟基磷灰石、磷酸四钙和磷酸二氢钙中的至少一种或为锶、铜、锂、铁、锌金属盐中的至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的可构建多层级仿生孔结构的3D打印生物墨水，其特征在于该3D打印生物墨水中所述的光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂或Irgacure2959。
5.根据权利要求3所述的可构建多层级仿生孔结构的3D打印生物墨水，其特征在于该3D打印生物墨水中所述的光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂或Irgacure2959。
6.一种制备权利要求1所述可构建多层级仿生孔结构的3D打印生物墨水的方法，该方法的工艺步骤和条件如下：
(1)将可光固化水凝胶和光引发剂加入磷酸盐缓冲液、DMEM培养基溶液或α-MEM培养基溶液中溶解，使水凝胶溶液中的可光固化水凝胶浓度为5～20wt％、光引发剂浓度为0.25～0.5wt％；
(2)将聚环氧乙烷粉末及光引发剂在磷酸盐缓冲液中充分溶解，并使聚环氧乙烷溶液中的聚环氧乙烷浓度为1.0～1.6wt％，光引发剂浓度为0.25～0.5wt％；
(3)分别将水凝胶溶液及聚环氧乙烷溶液用0.22μm滤膜过滤除菌；
(4)将无菌的有机和/或无机成骨活性成分加入除菌后的水凝胶溶液中混匀得到有机/成骨活性成分的复合水凝胶溶液；
(5)将骨髓间充质干细胞消化为悬浮液后计数，离心，并以复合水凝胶溶液将离心后的骨髓间充质干细胞重悬，控制复合水凝胶溶液中的骨髓间充质干细胞浓度为1～10×106/ml，得到载生长因子及细胞的水凝胶溶液；
(6)将载生长因子及细胞的水凝胶溶液与聚环氧乙烷溶液以体积比4:1-1：1混合均匀，然后立即置入4℃冰箱放置3-5分钟即可得到3D打印生物墨水。
7.一种用权利要求1所述可构建多层级仿生孔结构的3D打印生物墨水打印水凝胶支架的方法，其特征在于该打印方法的工艺步骤和条件如下：
(1)先用CT或MRI对骨缺损部位放置支架的部位进行扫描，然后构建目标骨缺损支架三维数字模型，并以STL格式文件导出；
(2)先将3D打印生物墨水加入3D打印机中，并将目标骨缺损支架三维数字模型STL格式文件导入3D打印机，调节打印机料筒温度、打印平台温度、打印速度和光固化时间参数，然后依次进行打印、光固化成型；
(3)将步骤(2)中得到的成型支架取下，浸入37℃磷酸盐缓冲液(PBS)、DMEM培养基溶液或α-MEM培养基中冲洗，洗去聚环氧乙烷溶液，即可得到负载细胞及生长因子并具有多层级仿生孔隙结构的水凝胶支架。
8.根据权利要求7所述打印水凝胶支架的方法，其特征在于该打印方法中所述的步骤(1)具体为：将骨缺损部位及骨缺损部位相对应的对侧健康骨骼进行CT或MRI扫描，获得的数据导入Mimics软件中，新建一个蒙版，设置阈值范围为150～1000HU，获得两侧骨骼模型数据；将骨缺损部位与骨缺损部位相对应的对侧健康骨骼数据进行布尔运算相减，得到骨缺损部位数据，并测算孔隙率及密质骨区域、松质骨区域和松质骨中间的营养孔隙区域分布，得到目标骨缺损部位模型数据，根据上述信息进行建模，必要时添加支撑结构；最后以STL格式文件导出所构建的目标骨缺损支架三维数字模型。
9.根据权利要求7或8所述打印水凝胶支架的方法，其特征在于该打印方法中所述的步骤(2)所用的3D打印生物墨水是依据步骤(1)所得数据来调整3D打印生物墨水中各组分用量，计算所采用的载生长因子及细胞的水凝胶溶液与聚环氧乙烷溶液的体积比，并制备出相应的3D打印生物墨水。
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