CN114129775B - 一种仿生含细胞大块骨软骨生物支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种仿生含细胞大块骨软骨生物支架及其制备方法，属于生物医学组织工程技术领域。本发明采用含细胞挤出3D打印技术、含细胞静电纺丝技术、含细胞电流体动力学直写技术和牺牲材料方法的复合工艺，不仅能够实现具有仿生人体骨软骨组织结构的一体化骨软骨支架成形，而且可以实现含细胞的骨软骨支架的制备，为大块骨软骨生物支架的构建提供了解决方案，促进骨软骨组织一体化修复和重建。

Description

一种仿生含细胞大块骨软骨生物支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学组织工程技术领域，尤其涉及一种仿生含细胞大块骨软骨生物支架及其制备方法。
背景技术
由于创伤、事故、肥胖、劳损、肿瘤、关节先天性异常和关节畸形，以及老年退化性骨关节病等造成关节骨软骨缺损的患者日益增多，目前已成为肢体残障的主要原因之一。其中，关节软骨损伤极易引起软骨下骨的联合病变，导致损伤的关节骨软骨组织自我修复非常困难，因此成为目前骨科临床中亟待解决的世界难题之一。目前临床上主要采用自体或异体组织、人工支架等植入物进行修复，其中自体骨软骨组织来源有限，难以修复大块组织缺损，且易造成二次损伤，异体骨软骨组织存在免疫排斥反应、疾病传播和外形匹配难度高等难题。随着组织工程与再生医学的迅速发展，为关节骨软骨损伤的再生修复提供了新的解决方案。
关节骨软骨由软骨层、钙化层和软骨下骨层构成；其中软骨层呈现梯度结构，分为浅表层、中间层和深层，其中表层结构呈现弧形的曲面结构。钙化层为软骨组织与软骨下骨组织的过渡区域，软骨区和软骨下骨区之间有一层薄且致密的潮线层，将软骨区与软骨下骨区进行分隔，防止软骨区域的钙化及血管长入。软骨下骨区为皮质骨终端，内有血管及神经组织，为软骨下骨组织部分提供营养物质、氧气及代谢废物的排出。针对如此复杂结构的骨软骨组织结构，制备具有仿生结构的骨软骨支架一直倍受关注。
近年来，国内外研究学者提出不同的方法制备骨软骨一体化支架，主要围绕单层、双层、三层等多层结构的骨软骨支架结构展开研究，其中较多聚焦在更能模拟骨软骨组织的三层结构上。但目前骨软骨支架结构比较简单和单一，无法满足天然骨软骨的软骨表层结构要求以及大块骨软骨组织的功能需求，植入后也无法与周围组织相契合，存在大块骨软骨组织的供养、血管网络通道和细胞诱导分化相互影响的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种仿生含细胞大块骨软骨生物支架及其制备方法，能够实现软骨下骨层的血管网络通道、钙化层的隔离功能、软骨层的梯度结构渐变且复杂表层形态结构的大块关节骨软骨支架的一体化制备。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种仿生含细胞大块骨软骨生物支架的制备方法，包括以下步骤：
将含骨髓间充质干细胞的软骨下骨材料进行第一挤出3D打印，在所形成的软骨下骨支架结构中采用含人脐静脉内皮细胞的牺牲材料进行第二挤出3D打印，依次交替进行所述第一挤出3D打印和第二挤出3D打印，得到含预制血管化网络结构的软骨下骨层；
采用含骨髓间充质干细胞的电纺材料，在所述软骨下骨层进行静电纺丝，在所述软骨下骨层上表面形成含细胞纳米纤维隔离膜；
继续采用所述含骨髓间充质干细胞的电纺材料在所述含细胞纳米纤维隔离膜上进行电流体动力学直写3D打印，在所述含细胞纳米纤维隔离膜上形成钙化层；
采用含骨髓间充质干细胞的软骨材料在所述钙化层上依次进行第三挤出3D打印和空间挤出打印，在所述钙化层上形成具有梯度孔隙结构和弧形曲面结构的软骨层，得到大块骨软骨支架；
将所述大块骨软骨支架置于细胞培养液中，进行体外培养，得到仿生含细胞大块骨软骨生物支架。
优选的，所述含骨髓间充质干细胞的软骨下骨材料的制备原料包括骨髓间充质干细胞、骨材料和第一溶剂；所述骨材料包括明胶、胶原、海藻酸钠、壳聚糖、甲基丙烯酰化明胶、羟基磷灰石和磷酸三钙中的一种或几种；所述第一溶剂包括PBS缓冲液、HBSS溶液或培养基。
优选的，所述含人脐静脉内皮细胞的牺牲材料的制备原料包括人脐静脉内皮细胞、牺牲材料和第二溶剂；所述牺牲材料包括胶原、海藻酸钠、PVA和聚(N-异丙基丙烯酰胺)中的一种或几种。
优选的，所述预制血管化网络结构中预血管化通道直径为100～500μm。
优选的，所述含骨髓间充质干细胞的电纺材料的制备原料包括骨髓间充质干细胞、电纺材料和第三溶剂；所述电纺材料包括胶原、明胶、海藻酸盐、PVA、PEO和PEG中的一种或几种。
优选的，所述含细胞纳米纤维隔离膜中纳米纤维直径≤200nm，所述含细胞纳米纤维隔离膜的孔隙≤50μm。
优选的，所述钙化层为微米级纤维丝结构，所述微米级纤维丝的直径为100～300μm。
优选的，所述含骨髓间充质干细胞的软骨材料的制备原料包括骨髓间充质干细胞、软骨材料和第四溶剂；所述软骨材料包括胶原、明胶、海藻酸盐、壳聚糖、透明质酸和甲基丙烯酰化明胶中的一种或几种。
优选的，所述软骨层的梯度孔隙结构中自软骨层的底层至高层，梯度孔隙结构的孔隙依次增大。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的仿生含细胞大块骨软骨生物支架，包括软骨下骨层、钙化层和软骨层，以及位于所述软骨下骨层和钙化层之间的含细胞纳米纤维隔离膜。
本发明提供了一种仿生含细胞大块骨软骨生物支架的制备方法，本发明采用含细胞挤出3D打印技术、含细胞静电纺丝技术、含细胞电流体动力学直写技术和牺牲材料方法的复合工艺，使用含细胞挤出3D打印技术和牺牲材料方法制备具有预血管化网络的软骨下骨层，防止支架中心坏死；采用含细胞静电纺丝技术在软骨下骨层与钙化层之间制备含细胞的纳米级纤维隔离膜，用于隔离软骨和骨组织，防止血管长入软骨，防止软骨下骨区影响软骨层钙化和软骨下骨层血管长入软骨层；采用含细胞挤出3D打印技术及空间挤出打印方法仿生制备具有梯度孔隙结构且软骨表层为弧形曲面结构的软骨层，保证能够与骨软骨缺损部位完美契合。本发明的方法不仅能够实现具有仿生人体骨软骨组织结构的一体化骨软骨支架成形，而且可以实现含细胞的骨软骨支架的制备，为大块骨软骨生物支架的构建提供了解决方案，促进骨软骨组织一体化修复和重建。
本发明可一体化成形具有仿生结构的含细胞大块骨软骨生物支架，该制备方法可实现含细胞生物材料的打印，制备的骨软骨支架含有骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞，有助于加快骨软骨缺损区域的修复。
本发明制备的仿生含细胞大块骨软骨生物支架包括软骨下骨层、钙化层和软骨层，以及位于所述软骨下骨层和钙化层之间的含细胞纳米纤维隔离膜；软骨下骨层具有预血管化通道网络，为软骨下骨区细胞提供氧气、营养物质交换和废物排泄，促进组织血管化，加快骨组织重建及修复，有利于软骨下骨部分营养物质、氧气交换及代谢废物的排出，防止大块软骨下骨中心坏死。此外，软骨下骨层含有骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞，其共培养有助于促进骨髓间充质干细胞向骨组织分化。
本发明所制备的仿生含细胞大块骨软骨生物支架，采用含细胞静电纺丝技术制备仿潮线结构的含细胞纳米纤维隔离层结构，其致密的纳米纤维膜结构可防止软骨层和软骨下骨层的相互渗透影响，已经软骨下骨层血管长入软骨区域，造成软骨区钙化。
本发明所制备的仿生含细胞大块骨软骨生物支架，其钙化层采用含细胞直写技术制备微米级形状可控的纤维丝结构，该制备方法有助于调控钙化层的空隙结构，有助于钙化层组织的成形。
本发明所制备的仿生含细胞大块骨软骨生物支架，其软骨层梯度结构打印有助于细胞仿生结构生长，促进软骨组成的生成；软骨表层结构采用空间打印成形弧形曲面结构，保障植入后与周围组织相契合，且沿弧形表面打印，定向纤维丝结构有助于诱导细胞沿打印方向生长，有助于诱导细胞按人体软骨表层细胞形态生长。
本发明提出的仿生含细胞大块骨软骨生物支架的制备方法，整个制备过程均为含细胞打印，制备的骨软骨支架中的细胞数量多，有助于加快组织的生长及骨软骨缺损的修复。本发明提供了一种一体化成形，高效的大块骨软骨支架的制备方法，易于推广应用，对骨软骨缺损的修复与重建具有重大意义。
附图说明
图1为本发明实施例1制备仿生含细胞大块骨软骨生物支架的过程示意图；
图2为本发明实施例1制备的仿生含细胞大块骨软骨生物支架示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种仿生含细胞大块骨软骨生物支架的制备方法，包括以下步骤：
将含骨髓间充质干细胞的软骨下骨材料进行第一挤出3D打印，在所形成的软骨下骨支架结构中采用含人脐静脉内皮细胞的牺牲材料进行第二挤出3D打印，依次交替进行所述第一挤出3D打印和第二挤出3D打印，得到含预制血管化网络结构的软骨下骨层；
采用含骨髓间充质干细胞的电纺材料，在所述软骨下骨层进行静电纺丝，在所述软骨下骨层上表面形成含细胞纳米纤维隔离膜；
继续采用所述含骨髓间充质干细胞的电纺材料在所述含细胞纳米纤维隔离膜上进行电流体动力学直写3D打印，在所述含细胞纳米纤维隔离膜上形成钙化层；
采用含骨髓间充质干细胞的软骨材料在所述钙化层上依次进行第三挤出3D打印和空间挤出打印，在所述钙化层上形成具有梯度孔隙结构和弧形曲面结构的软骨层，得到大块骨软骨支架；
将所述大块骨软骨支架置于细胞培养液中，进行体外培养，得到仿生含细胞大块骨软骨生物支架。
在本发明中，若无特殊说明，所需原料或设备均为本领域技术人员熟知的市售商品。
为保证细胞活性，本发明的整个制备过程优选在无菌和适当的温度环境(25～37℃)下进行。
本发明将含骨髓间充质干细胞的软骨下骨材料进行挤出3D打印，在所形成的软骨下骨支架结构中采用含人脐静脉内皮细胞的牺牲材料进行挤出3D打印，得到含预制血管化网络结构的软骨下骨层。在本发明中，所述含骨髓间充质干细胞的软骨下骨材料(骨干细胞生物墨水)的制备原料优选包括骨髓间充质干细胞、骨材料和第一溶剂；本发明对所述骨髓间充质干细胞的来源没有特殊的限定，按照本领域熟知的方式获取即可。
在本发明中，所述骨材料优选包括明胶、胶原、海藻酸钠、壳聚糖、甲基丙烯酰化明胶、羟基磷灰石和磷酸三钙中的一种或几种；当所述骨材料为上述中的几种时，本发明对不同种类骨材料的配比没有特殊的限定，任意配比均可。
在本发明中，所述第一溶剂优选包括PBS缓冲液、HBSS溶液或培养基。本发明对所述PBS缓冲液和HBSS溶液(Hank's平衡盐溶液)没有特殊的限定，本领域熟知的市售商品即可。在本发明中，所述培养基优选为RMPI培养基或DME/F-12培养基。
在本发明中，所述骨材料在骨干细胞生物墨水中的质量浓度优选为10～20％，更优选为15～17％；所述骨髓间充质干细胞在骨干细胞生物墨水中的浓度优选为(1～5)×106cells/g。
在本发明中，所述含骨髓间充质干细胞的软骨下骨材料优选还添加有BMP-2蛋白，有助于促进软骨下骨层骨髓间充质干细胞向骨组织分化。在本发明中，所述BMP-2蛋白的质量优选为所述骨干细胞生物墨水质量的5～30％，更优选为10～20％。
本发明对所述含骨髓间充质干细胞的软骨下骨材料的制备过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程将骨髓间充质干细胞、骨材料和第一溶剂混合均匀即可。
在本发明中，所述含人脐静脉内皮细胞的牺牲材料(含细胞牺牲材料)的制备原料优选包括人脐静脉内皮细胞、牺牲材料和第二溶剂；本发明对所述人脐静脉内皮细胞的来源没有特殊的限定，按照本领域熟知的方式获取即可。
在本发明中，所述牺牲材料优选包括胶原、海藻酸钠、PVA和聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)中的一种或几种；当所述牺牲材料优选为上述中的几种时，本发明对不同种类牺牲材料的配比没有特殊的限定，任意配比均可。
在本发明中，所述第二溶剂的种类优选与第一溶剂种类相同，在此不再赘述。
在本发明中，所述人脐静脉内皮细胞在含细胞牺牲材料中的浓度优选为(1～5)×106cells/g；所述牺牲材料在含细胞牺牲材料中的质量浓度优选为15～40％，更优选为16～30％。
本发明对所述含人脐静脉内皮细胞的牺牲材料的制备过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程将人脐静脉内皮细胞、牺牲材料和第二溶剂混合均匀即可。
本发明采用含骨髓间充质干细胞的软骨下骨材料进行挤出打印制备软骨下骨的支架结构，然后采用含人脐静脉内皮细胞的牺牲材料在软骨下骨层所需位置打印预血管化网络结构，依次交替进行所述第一挤出3D打印和第二挤出3D打印；本发明对所述交替进行第一挤出3D打印和第二挤出3D打印的过程没有特殊的限定，采用本领域熟知的过程调节3D打印参数按照人体骨软骨结构中软骨下骨的形状进行打印，或者根据病人缺损结构设计生成结构进行打印，得到对应软骨下骨的形状即可。
在本发明中，所述预制血管化网络结构中预血管化通道直径优选为100～500μm。
得到含预制血管化网络结构的软骨下骨层后，本发明采用含骨髓间充质干细胞的电纺材料，在所述软骨下骨层进行静电纺丝，在所述软骨下骨层上表面形成含细胞纳米纤维隔离膜。在本发明中，所述含骨髓间充质干细胞的电纺材料(含干细胞电纺材料)的制备原料包括骨髓间充质干细胞、电纺材料和第三溶剂；本发明对所述骨髓间充质干细胞的来源没有特殊的限定，按照本领域熟知的方式获取即可。
在本发明中，所述电纺材料优选包括胶原、明胶、海藻酸盐、PVA(聚乙烯醇)、PEO(聚氧化乙烯)和PEG中的一种或几种；当所述电纺材料优选为上述中的几种时，本发明对不同种类电纺材料的配比没有特殊的下限定，任意配比均可。
在本发明中，所述第三溶剂优选为三重蒸馏水、PBS缓冲液或HBSS溶液(Hank's平衡盐溶液)。本发明对所述PBS缓冲液和HBSS溶液(Hank's平衡盐溶液)没有特殊的限定，本领域熟知的市售商品即可。
在本发明中，所述电纺材料在含干细胞电纺材料中的质量浓度优选为5～25％，更优选为10～20％；所述骨髓间充质干细胞在含干细胞电纺材料中的浓度优选为(1～5)×106cells/g。
在本发明中，所述含细胞纳米纤维隔离膜中纳米纤维直径优选≤200nm，所述含细胞纳米纤维隔离膜的孔隙优选≤50μm。在本发明中，所述静电纺丝的电压优选为15～25kV，更优选为20kV。本发明对所述静电纺丝的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程调节纺丝参数得到上述结构参数的含细胞纳米纤维隔离膜即可。
本发明利用含细胞纳米纤维隔离膜防止软骨下骨区影响软骨层钙化和软骨下骨层血管长入软骨层。
形成含细胞纳米纤维隔离膜后，本发明继续采用所述含骨髓间充质干细胞的电纺材料在所述含细胞纳米纤维隔离膜上进行电流体动力学直写3D打印，在所述含细胞纳米纤维隔离膜上形成钙化层。
在本发明中，所述钙化层优选为微米级纤维丝结构，所述微米级纤维丝的直径优选为100～300μm。本发明对所述电流体动力学直写3D打印的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程调节打印参数得到上述结构的钙化层即可。本发明优选通过调整电流体动力学直写3D打印的参数控制纤维丝的位置，优选根据不同人体的骨软骨结构，设计打印不同的骨软骨结构。
形成钙化层后，采用含骨髓间充质干细胞的软骨材料在所述钙化层上依次进行第三挤出3D打印和空间挤出打印，在所述钙化层上形成具有梯度孔隙结构和弧形曲面结构的软骨层，得到大块骨软骨支架。在本发明中，所述含骨髓间充质干细胞的软骨材料(软骨干细胞生物墨水)的制备原料优选包括骨髓间充质干细胞、软骨材料和第四溶剂；本发明对所述骨髓间充质干细胞的来源没有特殊的限定，按照本领域熟知的方式获取即可。
在本发明中，所述软骨材料优选包括胶原、明胶、海藻酸盐、壳聚糖、透明质酸和甲基丙烯酰化明胶中的一种或几种；当所述软骨材料优选为上述中的几种时，本发明对不同种类软骨材料的配比没有特殊的限定，任意配比均可。
在本发明中，所述第四溶剂优选为三重蒸馏水、PBS缓冲液或HBSS溶液(Hank's平衡盐溶液)。本发明对所述PBS缓冲液和HBSS溶液(Hank's平衡盐溶液)没有特殊的限定，本领域熟知的市售商品即可。
在本发明中，所述骨髓间充质干细胞在软骨干细胞生物墨水中的浓度优选为(1～5)×106cells/g；所述软骨材料在软骨干细胞生物墨水中的质量浓度优选为10～40％，更优选为12～30％，进一步优选为16～20％。
在本发明中，所述含骨髓间充质干细胞的软骨材料优选还添加有BMP-7蛋白，有助于促进软骨层骨髓间充质干细胞向软骨组织分化。在本发明中，所述BMP-7蛋白的质量优选为所述软骨干细胞生物墨水质量的5～30％，更优选为10～20％。
本发明优选采用含骨髓间充质干细胞软骨材料进行第三挤出3D打印，形成具有梯度孔隙结构的软骨结构，然后继续进行空间挤出打印，在软骨结构的表层形成与人体软骨外表面结构完全相同的弧形曲面结构，保证修复不同人体结构对应的骨软骨缺损部位。
在本发明中，所述软骨层的梯度孔隙结构中自软骨层的底层至高层，梯度孔隙结构的孔隙依次增大。本发明对所述梯度孔隙结构的具体孔隙排布情况没有特殊的限定，根据不同人体软骨层结构调整打印参数以适应不同人体软骨层结构即可。
本发明对所述第三挤出3D打印和空间挤出打印的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程根据不同损伤的人体软骨结构调整打印参数得到对应不同人体软骨结构的软骨层即可。
得到大块骨软骨支架后，为保证支架结构的稳定性及力学特性，本发明优选将所得大块骨软骨支架进行交联；所述交联的方式优选包括物理交联或化学交联，所述物理交联的方式优选为光照交联，更优选为在405nm蓝光下交联；当在蓝光条件进行交联时，优选在骨干细胞生物墨水和软骨干细胞生物墨水中添加LAP光引发剂；所述LAP光引发剂的质量为所述骨干细胞生物墨水质量的0.2％～0.4％。在本发明中，所述化学交联所用交联剂优选为氯化钙、京尼平或三聚磷酸盐；所述交联剂优选以PBS缓冲液的形式使用，本发明对所述交联剂在缓冲液中的浓度没有特殊的限定，能够实现交联即可。在本发明中，所述交联剂的质量优选为所述骨干细胞生物墨水质量的4～10％。
完成所述交联后，本发明将所述大块骨软骨支架置于细胞培养液中，进行体外培养，得到仿生含细胞大块骨软骨生物支架。
本发明对所述细胞培养液的具体组成没有特殊的限定，根据不同细胞的实际需求选用本领域熟知的市售细胞培养液，能够维持细胞正常生长增殖即可。
在本发明中，所述体外培养的培养环境优选为温度：37℃，培养气氛为含有体积分数5％的CO2。
在所述体外培养过程中，大块骨软骨支架的软骨下骨层中牺牲材料降解，同时人脐静脉内皮细胞逐渐生长和迁移到预制血管化网络通道内壁上形成内皮层，最终长成预血管化通道；同时大块骨软骨支架中软骨下骨层和软骨层中的骨髓间充质干细胞分别向骨细胞和软骨细胞分化，并合成对应的基质及分泌，最终成形具有仿生结构的含细胞大块骨软骨生物支架。
本发明提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的仿生含细胞大块骨软骨生物支架，包括软骨下骨层、钙化层和软骨层，以及位于所述软骨下骨层和钙化层之间的含细胞纳米纤维隔离膜。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中，所有材料使用前均进行灭菌处理，整个制备过程在无菌和温度(25～37℃)条件下进行；所有生物材料的原料含量，质量体积比(w/v)代表对应材料与溶剂的比例；质量质量比(w/w)代表对应材料占所有材料和溶剂总质量的比例。
实施例1
按照图1所示流程进行实施例1的方案：
a.骨干细胞生物墨水的制备：以PBS缓冲液为溶剂，采用明胶(10％)、海藻酸钠(5％)、骨髓间充质干细胞(5×106cells/g)混合制备，并添加BMP-2蛋白5％(w/w，相对于骨干细胞生物墨水的总质量)；将制备好的骨干细胞生物墨水取10mL加入到医用注射器中，并将注射器安装在打印喷头一上；
含细胞牺牲材料的制备：以PBS缓冲液为溶剂，由胶原(5％，w/v)、PVA(10％，w/v)和人脐静脉内皮细胞(5×106cells/g)混合制备；再将制备好的含细胞牺牲材料取10mL加入到医用注射器中，并安装在打印喷头二上；
b.含干细胞电纺材料的配制：以PBS缓冲液为溶剂，采用PEO(15％)、海藻酸钠(5％)和人脐静脉内皮细胞(5×106cells/g)混合制备，将制备好的含干细胞电纺材料取10mL加入到医用注射器中，并将注射器安装在打印喷头三上；
c.软骨干细胞生物墨水的制备：以PBS缓冲液为溶剂，采用海藻酸钠(6％w/v)、透明质酸(6％w/v)和骨髓间充质干细胞(5×106cells/g)混合制备，并添加BMP-7蛋白5％(w/w，相对于软骨干细胞生物墨水总质量)；将制备好的软骨干细胞生物墨水取10mL加入到医用注射器中，并安装在打印喷头四上；
d.进行软骨下骨层结构的打印，按照所需网状结构设计打印程序，打印喷头一(骨干细胞生物墨水的挤出喷头)连续挤出骨干细胞生物墨水，接收平台按照软骨下骨层支架模型生成的路径沿X/Y方向运动，进行平面打印，实现软骨下骨层支架的基底制备(如图1中①)；然后，接收平台运动到喷头二(含细胞牺牲材料的挤出喷头)的工位，喷头二实现血管网络通道结构的制备(如图1中②)，所形成的预血管化通道直径为250μm；接收平台在喷头一和喷头二之间不断切换直至完成含干细胞和内皮细胞的三维血管网络通道的软骨下骨层支架的制备(如图1中③)；
e.在高压(20kV)静电场环境下，接收平台移动到喷头三(含干细胞电纺材料的喷头)的工位，喷头三在打印的软骨下骨层支架上表面进行含细胞电纺(静电纺丝)，进行仿骨软骨潮线结构的打印，形成含细胞纳米纤维隔离膜(如图1中④)，纳米纤维直径为200nm，所述含细胞纳米纤维隔离膜的孔隙为40μm；
f.在高压(20kV)静电场环境下，接收平台保持在喷头三的工位不变，喷头三停止供料，并且向下运动到与接收平台间有一定的距离，然后继续喷头三供料，按照钙化层设计的打印程序，喷头三进行钙化层结构的直写打印，形成含细胞微米级纤维丝结构钙化层(如图1中⑤)，微米级纤维丝的直径为300μm；
g.接收平台移动到喷头四(软骨干细胞生物墨水的挤出喷头)的工位，喷头四连续挤出软骨干细胞生物墨水，接收平台按照软骨层支架模型生成的路径进行梯度孔隙结构的软骨层内层打印，如图1中⑥至⑦所示，成形具有梯度孔隙结构的软骨结构，为了仿人骨软骨表层结构，喷头四再沿软骨层内层进行软骨层表层的空间挤出打印(如图1中⑧)，按照弧形轨迹的打印方式形成表面的弧形结构，完成具有定向纤维丝结构的软骨表层结构的打印，得到大块骨软骨支架；
h.将所制备的大块骨软骨支架置入含有氯化钙的PBS缓冲液(氯化钙的质量为所述骨干细胞生物墨水质量的4％)中进行交联固化30min，然后再将交联后的大块骨软骨支架置入37℃、5％(体积分数)CO2的细胞培养液环境下进行培养，成形具有仿生结构的含细胞大块骨软骨生物支架，结构示意图如图2所示。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅在于：
骨干细胞生物墨水，溶剂为HBSS溶液(Hank's平衡盐溶液)，采用甲基丙烯酰化明胶(12％w/v)、羟基磷灰石(5％w/w)和骨髓间充质干细胞(5×106cells/g)混合制备，并添加LAP光引发剂0.2％(w/w，相对于骨干细胞生物墨水的总质量)；
软骨干细胞生物墨水溶剂为HBSS溶液(Hank's平衡盐溶液)，采用甲基丙烯酰化明胶(10％w/v)、透明质酸(10％w/v)和骨髓间充质干细胞(5×106cells/g)混合制备，并添加LAP光引发剂0.2％(w/w，相对于软骨干细胞生物墨水的总质量)；
将制备的大块骨软骨支架置于波长为405nm的蓝光下进行交联；
其他步骤同实施例1。
实施例3
本实施例与实施例1的区别仅在于：
含细胞牺牲材料由溶剂PBS缓冲溶液，胶原(8％w/v)、PNIPAAm(8％w/v)和人脐静脉内皮细胞(5×106cells/g)混合制备，其中PNIPAAm为温敏性材料，可以通过控制温度调节牺牲材料的降解速率，调节预血管化通道的成形速率；其他同实施例1。
实施例4
本实施例与实施例1的区别仅在于：
软骨下骨层材料、含细胞电纺材料(钙化层材料)和软骨层支架材料不同，具体制备步骤如下：
骨干细胞生物墨水：溶剂为HBSS溶液(Hank's平衡盐溶液)，采用明胶(10％w/v)、壳聚糖(10％w/v)和骨髓间充质干细胞(5×106cells/g)混合制备；
含细胞牺牲材料：溶剂为HBSS溶液(Hank's平衡盐溶液)，由胶原(5％w/v)、PVA(10％w/v)和人脐静脉内皮细胞(5×106cells/g)混合制备；
干细胞电纺材料：溶剂为HBSS溶液(Hank's平衡盐溶液)，采用PEO(10％w/v)、明胶(10％w/v)和人脐静脉内皮细胞(5×106cells/g)混合制备；
软骨干细胞生物墨水：溶剂为HBSS溶液(Hank's平衡盐溶液)，采用壳聚糖(8％w/v)、胶原(8％w/v)和骨髓间充质干细胞(5×106cells/g)混合制备；
将所制备的大块骨软骨支架置于含有三聚磷酸盐的PBS缓冲液(三聚磷酸盐的质量为所述骨干细胞生物墨水质量的8％)中进行交联30min；其他同实施例1。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种仿生含细胞大块骨软骨生物支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含骨髓间充质干细胞的软骨下骨材料进行第一挤出3D打印，在所形成的软骨下骨支架结构中采用含人脐静脉内皮细胞的牺牲材料进行第二挤出3D打印，依次交替进行所述第一挤出3D打印和第二挤出3D打印，得到含预制血管化网络结构的软骨下骨层；
采用含骨髓间充质干细胞的电纺材料，在所述软骨下骨层进行静电纺丝，在所述软骨下骨层上表面形成含细胞纳米纤维隔离膜；
继续采用所述含骨髓间充质干细胞的电纺材料在所述含细胞纳米纤维隔离膜上进行电流体动力学直写3D打印，在所述含细胞纳米纤维隔离膜上形成钙化层；
采用含骨髓间充质干细胞的软骨材料在所述钙化层上依次进行第三挤出3D打印和空间挤出打印，在所述钙化层上形成具有梯度孔隙结构和弧形曲面结构的软骨层，得到大块骨软骨支架；
将所述大块骨软骨支架置于细胞培养液中，进行体外培养，得到仿生含细胞大块骨软骨生物支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含骨髓间充质干细胞的软骨下骨材料的制备原料包括骨髓间充质干细胞、骨材料和第一溶剂；所述骨材料包括明胶、胶原、海藻酸钠、壳聚糖、甲基丙烯酰化明胶、羟基磷灰石和磷酸三钙中的一种或几种；所述第一溶剂包括PBS缓冲液、HBSS溶液或培养基。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含人脐静脉内皮细胞的牺牲材料的制备原料包括人脐静脉内皮细胞、牺牲材料和第二溶剂；所述牺牲材料包括胶原、海藻酸钠、PVA和聚(N-异丙基丙烯酰胺)中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述预制血管化网络结构中预血管化通道直径为100～500μm。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含骨髓间充质干细胞的电纺材料的制备原料包括骨髓间充质干细胞、电纺材料和第三溶剂；所述电纺材料包括胶原、明胶、海藻酸盐、PVA、PEO和PEG中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含细胞纳米纤维隔离膜中纳米纤维直径≤200nm，所述含细胞纳米纤维隔离膜的孔隙≤50μm。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述钙化层为微米级纤维丝结构，所述微米级纤维丝的直径为100～300μm。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述含骨髓间充质干细胞的软骨材料的制备原料包括骨髓间充质干细胞、软骨材料和第四溶剂；所述软骨材料包括胶原、明胶、海藻酸盐、壳聚糖、透明质酸和甲基丙烯酰化明胶中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述软骨层的梯度孔隙结构中自软骨层的底层至高层，梯度孔隙结构的孔隙依次增大。
10.权利要求1～9任一项所述制备方法制备得到的仿生含细胞大块骨软骨生物支架，其特征在于，包括软骨下骨层、钙化层和软骨层，以及位于所述软骨下骨层和钙化层之间的含细胞纳米纤维隔离膜。
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