CN115414529B - 一种三层结构3d打印骨软骨支架制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学组织工程技术领域，具体涉及一种三层结构3D打印骨软骨支架制备方法，针对天然骨软骨的多层结构进行了简化设计，构造了三层结构模拟原位骨软骨结构，同时使用不同的组成成分组成结构层，实现机械强度递增的特点，通过仿生结构有利于植入后与天然骨软骨组织的生长融合，进一步地，在整个支架中采用3D打印多孔结构，有利于环境中营养成分的进入，同时有利于体细胞向支架上迁移，提高仿生支架的植入效果，解决了现有的骨软骨修复技术植入效果和临床应用不佳的技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学组织工程技术领域，具体涉及一种三层结构3D打印骨软骨支架制备方法。
背景技术
骨软骨(osteochondral tissue)是软骨(chondro)及其下方的接壤的一层骨头(osteo)结构，属于和软骨交界的组织。损伤后极易引发慢性疼痛、炎症、关节僵硬、畸形、骨刺甚至残障。不同于其他类型的组织(骨骼，皮肤，肌肉等)，软骨损伤一般很难自我修复。因为软骨部分没有血管穿插，故不能通过血管网来输送营养物质。其主要通过关节液内的营养渗透到软骨当中，从而能够促进关节软骨的生长发育。软骨损伤之后，大部分情况下都会有不同程度的创伤性软骨炎的发生。
现有的用于骨软骨修复的技术或产品，有如下几类：
1.硬支架：基于含钙盐(如磷酸三钙、羟基磷灰石等)或者高分子聚合物(如聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)等)所制造的修复支架。
2.膜类的补片：基于生物膜类(如天然去细胞基质膜、胶原蛋白、透明质酸、海藻酸钠等)所制造的补片。
3.膜+硬支架：结合以上两种技术所制备的含有膜和硬材料支架。
4.可注射填充材料：基于天然生物基(如天然去细胞基质膜、胶原蛋白、透明质酸、海藻酸钠等)材料所制备的可注射水凝胶材料。
但现有的骨软骨修复技术的组织工程方法都存在以下的不足：
1.单层结构简单。未能模拟出骨软骨组织的多层复杂结构。
2.组成成分单一。而原位骨软骨组织每层的组成有一定的差别。
3.无微孔结构，导致外部营养物质无法进入到仿生组织内部。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三层结构3D打印骨软骨支架制备方法，通过构造三层结构模拟原位骨软骨结构，并在每层结构的成分上进行仿生模拟以利于植入后与天然骨软骨组织的生长融合，解决现有的骨软骨修复技术植入效果和临床应用不佳的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种三层结构3D打印骨软骨支架制备方法，包括下列步骤：
制备甲基丙烯酸酯明胶；
制备甲基丙烯酸酯丝蛋白；
制备纳米羟基磷灰石；
分别制备生物墨水A、生物墨水B和生物墨水C；
使用所述生物墨水A、所述生物墨水B和所述生物墨水C依次分三层进行支架打印。
优选的，制备甲基丙烯酸酯明胶的过程，包括下列步骤：
10克明胶粉末中加入100克蒸馏水，磁力搅拌加热溶解至澄清透明；
加入4毫升甲基丙烯酸酐继续磁力搅拌并在40度反应3小时；
再装入8～14千道尔顿截留分子量的透析袋中，并在50度的蒸馏水中透析，至反应物无异味无色透明为止；
收集透析袋中溶液冷冻干燥，获得甲基丙烯酸酯明胶。
优选的，制备甲基丙烯酸酯丝蛋白的过程，包括下列步骤：
20克蚕茧加入100毫升0.05mol/L的碳酸钠溶液中煮沸30分钟；
捞出后用蒸馏水充分洗涤在70度烘干备用；
加入100毫升9.3mol/L的溴化锂溶液中磁力搅拌加热溶解至澄清透明；
加入6毫升甲基丙烯酸酐继续磁力搅拌并在60度反应4小时；
再装入8～14千道尔顿截留分子量的透析袋中，并在50度的蒸馏水中透析，至反应物无异味无色透明为止；
收集透析袋中溶液冷冻干燥，获得甲基丙烯酸酯丝蛋白。
优选的，制备纳米羟基磷灰石的过程，包括下列步骤：
将0.6mol/L磷酸铵溶于825毫升蒸馏水中；
加入约50毫升氢氧化铵将pH调节至9；
再加入90毫升0.883mol/L硝酸钙并以3.6mL/min的速度边搅拌边滴加入溶液；
将混合物转移到反应釜中200℃反应20小时；
收集固形物烘干碾磨备用，获得纳米羟基磷灰石。
优选的，所述生物墨水A的成分配比为：5～20克甲基丙烯酸酯明胶和5～20克甲基丙烯酸酯丝蛋白充分溶于100mL含0.1％～1％光引发剂溶液混匀；
所述生物墨水B的成分配比为：5～20克甲基丙烯酸酯明胶、5～20克甲基丙烯酸酯丝蛋白和2～8克纳米羟基磷灰石充分溶于100mL含0.1％～1％光引发剂溶液混匀；
所述生物墨水C的成分配比为：5～20克甲基丙烯酸酯明胶和5～20克甲基丙烯酸酯丝蛋白和4～16克纳米羟基磷灰石充分溶于100mL含0.1％～1％光引发剂溶液混匀。
优选的，所述生物墨水A、所述生物墨水B和所述生物墨水C在制备过程中均需避光保存备用。
优选的，在所述生物墨水A、所述生物墨水B和所述生物墨水C依次分三层进行支架打印的过程中，支架从顶层到底层的机械强度梯度递增来模拟从表层到骨下骨层结构，包括表中层、钙化层、及软骨下骨层，其中所述生物墨水A用于打印表中层，所述生物墨水B用于打印钙化层，所述生物墨水C用于打印软骨下骨层。
优选的，支架打印采用光固化光源为350～370nm波长的紫外光或者390～410nm波长的蓝光，光引发剂为I2959或LAP。
优选的，支架打印时为支架预留有孔径为100μm多孔流道。
本发明提供了一种三层结构3D打印骨软骨支架制备方法，针对天然骨软骨的多层结构进行了简化设计，构造了三层结构模拟原位骨软骨结构，同时使用不同的组成成分组成结构层，实现机械强度递增的特点，通过仿生结构有利于植入后与天然骨软骨组织的生长融合，进一步地，在整个支架中采用3D打印多孔结构，有利于环境中营养成分的进入，同时有利于体细胞向支架上迁移，提高仿生支架的植入效果，解决了现有的骨软骨修复技术植入效果和临床应用不佳的技术问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的一种三层结构3D打印骨软骨支架制备方法的具体流程示意图。
图2是关节软骨结构和组成示意图。
图3是本发明的骨软骨支架的表中层支架TEM电镜图。
图4是本发明的骨软骨支架的钙化层支架TEM电镜图。
图5是本发明的骨软骨支架的软骨下骨层支架TEM电镜图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
请参阅图1，本发明提供了一种三层结构3D打印骨软骨支架制备方法，包括下列步骤：
S1：制备甲基丙烯酸酯明胶；
S2：制备甲基丙烯酸酯丝蛋白；
S3：制备纳米羟基磷灰石；
S4：分别制备生物墨水A、生物墨水B和生物墨水C；
S5：使用所述生物墨水A、所述生物墨水B和所述生物墨水C依次分三层进行支架打印。
以下结合制备步骤和各成分对本发明作进一步说明：
请参阅图2至图5，本发明所用的水凝胶材料有多种，如常见的甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)、甲基丙烯酸酯丝蛋白(SFMA)、甲基丙烯酸酯透明质酸(HAMA)、甲基丙烯酸酯壳聚糖(CSMA)、甲基丙烯酸酯海藻酸钠(ALMA)、聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)等，这类常用材料均可用于光固化3D打印。
以下仅以GelMA、SFMA为例。
1.1.甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)合成
10克明胶(A型，300克果冻强度(BLOOM值))粉末中加入100克蒸馏水(质量浓度10％)，磁力搅拌加热溶解至澄清透明。随后加入4毫升甲基丙烯酸酐继续磁力搅拌在40度反应3小时。然后装入透析袋(8-14千道尔顿截留分子量)在50度的蒸馏水中透析，至反应物无异味无色透明为止，期间多次更换蒸馏水以提高透析效率。最后收集透析袋中溶液冷冻干燥，即得GelMA。
1.2.甲基丙烯酸酯丝蛋白(SFMA)合成
20克蚕茧加入100毫升0.05摩尔每升(mol/L)的碳酸钠(Na2CO3)溶液中煮沸30分钟，捞出后用蒸馏水充分洗涤在70度烘干备用。随后加入100毫升9.3摩尔每升(mol/L)的溴化锂(LiBr)溶液中磁力搅拌加热溶解至澄清透明。随后加入6毫升甲基丙烯酸酐继续磁力搅拌在60度反应4小时。装入透析袋(8-14千道尔顿截留分子量)在50度的蒸馏水中透析，至反应物无异味无色透明为止，期间多次更换蒸馏水以提高透析效率。最后收集透析袋中溶液冷冻干燥，即得SFMA。
2.纳米羟基磷灰石(nHA)合成
将0.6摩尔每升(mol/L)磷酸铵((NH4)3PO4)溶于825毫升蒸馏水中，加入约50毫升氢氧化铵((NH4)OH)将pH调节至9，再加入90毫升0.883摩尔每升(mol/L)硝酸钙(Ca(NO3)2)以3.6毫升每分钟(mL/min)的速度边搅拌边滴加入溶液。随后将混合物转移到反应釜中200℃反应20小时，收集固形物烘干碾磨备用，即获得了纳米级nHA。
3.各层生物墨水的成分配置
根据三层成分差异，分别准备如下3种配比。
生物墨水A:(5-20)％GelMA+(5-20)％SFMA。5-20克GelMA和5-20克SFMA充分溶于100mL含(0.1-1)％光引发剂溶液混匀,避光保存备用。
生物墨水B:(5-20)％GelMA+(5-20)％SFMA+(1-4)％nHA。5-20克GelMA、5-20克SFMA、2-8克nHA充分溶于100mL含(0.1-1)％光引发剂溶液混匀,避光保存备用。
生物墨水C:(5-20)％GelMA+(5-20)％SFMA+(4-16)％nHA。5-20克GelMA、5-20克SFMA、4-16克nHA充分溶于100mL含(0.1-1)％光引发剂溶液混匀,避光保存备用。
光引发剂为I2959或LAP：
I2959：2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)。
LAP：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate)。
4.3D打印具三层结构的骨软骨支架
考虑到仿生支架植入机体后能够与原位组织进行组织液交换，本发明设计了孔径为100μm多孔流道，有利于与外界环境进行营养物质的交换。根据真实的骨软骨结构(详见图2)，本发明简化设计构造了三层结构，该支架从顶层到底层的机械强度梯度递增来模拟从表层到骨下骨层结构，包括表中层、钙化层、及软骨下骨层。采用光固化光源为紫外(350-370nm波长)或者蓝光(390-410nm波长)以激发光引发剂为I2959或LAP。打印方式为数字光处理(Digital Light Procession,DLP)或者立体光固化成型(StereolithographyAppearance,SLA)技术来实现支架打印。
打印过程为：将生物墨水C加入供料糟，开始按程序曝光打印软骨下骨层。当达到预定层高后，将生物墨水B加入供料糟，开始按程序曝光打印钙化层。当达到预定层高后，再加入生物墨水A，继续打印表中层。最终形成仿生支架，各层成分不同，具有微孔流道的三层结构。
综上所述，本发明方法中制备的骨软骨支架具有以下优点：
1.三层结构模拟原位骨软骨结构。针对天然骨软骨的多层结构，我们对此进行了简化设计，构造了三层结构，该支架从顶层到底层的机械强度梯度递增来模拟从表层到骨下骨层结构。
2.每层组成成分不同。从顶层到底层各层依次由水凝胶(表中层)，水凝胶+低含量钙盐(钙化层)，水凝胶+高含量钙盐(软骨下骨)组成。以实现各层的机械强度递增特点。其中nHA成分可以模拟钙化成分，水凝胶可以模拟软骨成分。这种仿生结构有利于植入后与天然骨软骨组织的生长融合。
3.3D打印多孔结构。采用3D打印技术分层打印出具有高精度的多孔复合材料支架，整个仿生支架为立体三层多孔超微结构，有利于环境中营养成分的进入，同时有利于体细胞向支架上迁移，提高仿生支架的植入效果。
4.此三层结构的3D打印骨软骨支架可以荷载细胞。细胞可以在多孔支架上生长并向支架内部迁移，分泌ECM成分，增加软骨组织的再生和自我更新能力。从而制备出本项目所需的多功能的3D仿生骨软骨组织。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。
Claims (5)
1.一种三层结构3D打印骨软骨支架制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
制备甲基丙烯酸酯明胶；
制备甲基丙烯酸酯明胶的过程，包括下列步骤：
10克明胶粉末中加入100克蒸馏水，磁力搅拌加热溶解至澄清透明；
加入4毫升甲基丙烯酸酐继续磁力搅拌并在40度反应3小时；
再装入8～14千道尔顿截留分子量的透析袋中，并在50度的蒸馏水中透析，至反应物无异味无色透明为止；
收集透析袋中溶液冷冻干燥，获得甲基丙烯酸酯明胶；
制备甲基丙烯酸酯丝蛋白；
制备甲基丙烯酸酯丝蛋白的过程，包括下列步骤：
20克蚕茧加入100毫升0.05mol/L的碳酸钠溶液中煮沸30分钟；
捞出后用蒸馏水充分洗涤在70度烘干备用；
加入100毫升9.3mol/L的溴化锂溶液中磁力搅拌加热溶解至澄清透明；
加入6毫升甲基丙烯酸酐继续磁力搅拌并在60度反应4小时；
再装入8～14千道尔顿截留分子量的透析袋中，并在50度的蒸馏水中透析，至反应物无异味无色透明为止；
收集透析袋中溶液冷冻干燥，获得甲基丙烯酸酯丝蛋白；
制备纳米羟基磷灰石；
制备纳米羟基磷灰石的过程，包括下列步骤：
将0.6mol/L磷酸铵溶于825毫升蒸馏水中；
加入约50毫升氢氧化铵将pH调节至9；
再加入90毫升0.883mol/L硝酸钙并以3.6mL/min的速度边搅拌边滴加入溶液；
将混合物转移到反应釜中200℃反应20小时；
收集固形物烘干碾磨备用，获得纳米羟基磷灰石；
分别制备生物墨水A、生物墨水B和生物墨水C；
所述生物墨水A的成分配比为：5～20克甲基丙烯酸酯明胶和5～20克甲基丙烯酸酯丝蛋白充分溶于100mL含0.1％～1％光引发剂溶液混匀；
所述生物墨水B的成分配比为：5～20克甲基丙烯酸酯明胶、5～20克甲基丙烯酸酯丝蛋白和2～8克纳米羟基磷灰石充分溶于100mL含0.1％～1％光引发剂溶液混匀；
所述生物墨水C的成分配比为：5～20克甲基丙烯酸酯明胶和5～20克甲基丙烯酸酯丝蛋白和4～16克纳米羟基磷灰石充分溶于100mL含0.1％～1％光引发剂溶液混匀；
使用所述生物墨水A、所述生物墨水B和所述生物墨水C依次分三层进行支架打印。
2.如权利要求1所述的三层结构3D打印骨软骨支架制备方法，其特征在于，
所述生物墨水A、所述生物墨水B和所述生物墨水C在制备过程中均需避光保存备用。
3.如权利要求1所述的三层结构3D打印骨软骨支架制备方法，其特征在于，
在所述生物墨水A、所述生物墨水B和所述生物墨水C依次分三层进行支架打印的过程中，支架从顶层到底层的机械强度梯度递增来模拟从表层到骨下骨层结构，包括表中层、钙化层、及软骨下骨层，其中所述生物墨水A用于打印表中层，所述生物墨水B用于打印钙化层，所述生物墨水C用于打印软骨下骨层。
4.如权利要求3所述的三层结构3D打印骨软骨支架制备方法，其特征在于，
支架打印采用光固化光源为350～370nm波长的紫外光或者390～410nm波长的蓝光，光引发剂为I2959或LAP。
5.如权利要求4所述的三层结构3D打印骨软骨支架制备方法，其特征在于，
支架打印时为支架预留有孔径为100μm多孔流道。
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