CN101564553B

CN101564553B - 人源化活性煅烧骨的制备方法

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Publication number: CN101564553B
Application number: CN200910022842A
Authority: CN
Inventors: 王爱军
Original assignee: SHAANXI RUISHENG BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHAANXI RUISHENG BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2009-06-05
Filing date: 2009-06-05
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2029-06-05
Also published as: CN101564553A

Abstract

本发明公开了一种人源化活性煅烧骨及其制备方法，其主要成分为羟基磷灰石晶体的天然动物松质骨，具有三维网状多孔结构，粒径为0.1～5mm的颗粒，孔径分布在50～600μm之间，表面复合有人体细胞合成分泌的细胞外基质所形成的涂层。本发明的煅烧骨不仅与人骨结构相似，有利于细胞长入、新骨的形成，有利于移植部位骨结构的重建，而且表面覆有人体细胞所分泌合成的细胞外基质涂层和细胞生长因子，能够与煅烧骨牢固结合、促进体内成骨细胞的贴附生长、加快新骨的形成；同时还具有任意塑型、不会引起免疫排斥反应的优点，可满足临床骨缺损、骨不连的治疗需要。

Description

人源化活性煅烧骨的制备方法

技术领域

本发明属于组织工程学生物材料技术领域，具体涉及一种人源化活性煅烧骨及其制备方法。

背景技术

骨移植是治疗骨缺损的主要方法之一，通常自体骨移植的效果最好，但由于自体骨的来源受限，同时会增加病人的痛苦及手术并发症。而人工合成的骨替代材料(如生物陶瓷、磷酸钙骨水泥、高分子多聚体、及金属材料等)制造工艺较复杂、生产过程要求条件较高，还有可能含有有害因素危害病人健康，有的植入体内后难以吸收替代，妨碍骨组织的改建和修复。理想的骨移植材料应具有类似自然骨的内联孔结构，以支持和引导新生骨不断向纵深生长延伸，最后完全填充整块材料。煅烧骨是将动物骨脱脂脱蛋白后经高温煅烧制成，具有天然骨的骨小梁、小梁间隙及骨内管腔系统，保留了天然骨的内联孔结构，具有一定的强度，能够起到支撑作用。煅烧骨内的天然多孔结构具有很大的内表面积，有利于细胞因子的复合和新生骨组织细胞的长入。煅烧骨经高温煅烧后，可以消除其抗原性，不会产生免疫排斥反应，生物相容性好。煅烧骨具有天然骨良好的生物相容性、骨传导性、机械承载能力和可控制降解速度等特性；此外，在韧性、功能适应性、理化性能、体内降解方面也优于人工材料。煅烧骨材料来源丰富，易于大量获取和加工贮存，加工简单，其成本远低于人工合成材料，是较为理想的组织载体之一。

但是煅烧骨经过脱脂脱蛋白和高温处理后，其中的有机成分全部破坏，缺乏天然骨的骨诱导性，其单纯的羟基磷灰石表面结构不能提高成骨细胞的贴附率。为提高细胞的贴附率，增强煅烧骨的骨诱导性，可以对煅烧骨的表面进行处理促进细胞贴附，例如在煅烧骨表面添加含有RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，细胞贴附位点)或其衍生物的多肽涂层、含有胶原蛋白的涂层或含有动物血清成分的涂层等。有文献报道，添加活性涂层的煅烧骨上细胞的贴附率明显高于表面未处理组。但目前这些涂层在其促进细胞贴附的结构中都存在一些不足，例如含有RGD的多肽涂层，RGD多肽只是细胞贴附蛋白中的一段多肽序列，其对细胞的贴附效果远不如含有多种蛋白的动物血清；而由于动物血清的免疫原性，限制了它在临床中的应用；另外一个技术难题还在于如何将涂层与煅烧骨牢固结合。

细胞外基质在体内能引导并支持宿主细胞生长，逐渐完全降解，适用于组织工程的支架材料。而且细胞外基质中含有多种细胞生长因子，即使经过脱细胞处理后仍然含有这些生长因子，在创伤愈合的早期阶段可以为组织的再生创造合适的微环境。这是其它天然材料和人工聚合物(如胶原、壳聚糖和聚乳酸、聚羟基乙酸等)所不能比拟的。

与本发明比较接近的现有技术，中国专利(200510119076.7)申请公开了一种煅烧骨的制备技术，是将牛脊骨切割成小块后水煮，再经过酸碱处理去除有机质，然后在煅烧炉中经600～1000℃煅烧后制成。该煅烧骨具备了典型煅烧骨的优缺点，有松质结构但没有促进细胞贴附的表面涂层。

中国专利(02145493.0)申请公开了一种作为骨缺损修复材料的可吸收煅烧骨的制备方法，成分为羟基磷灰石和β-磷酸三钙双相煅烧骨，以松质骨为原料，通过浸渍(NH₄)₂HPO₄溶液，将煅烧骨中的羟基磷灰石成分部分或完全转化为β-磷酸三钙，煅烧温度为900～1300℃。该专利中使用了胶原蛋白涂层，难以与材料形成牢固结合；且煅烧骨复合细胞后，因细胞具有免疫原性难以在临床应用；同时对不规则的骨缺损难以预制成所需的形状，这些不足限制了这种材料在实际中的应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种人源化活性煅烧骨及其制备方法，所制备的煅烧骨不仅具有天然的骨小梁多孔状结构和良好的生物相容性，而且表面覆有人体细胞所分泌合成的细胞外基质涂层和细胞生长因子，能够牢固与煅烧骨结合、促进体内成骨细胞的贴附生长、加快新骨的形成；同时还具有任意塑型、不会引起免疫排斥反应的优点，可满足临床骨缺损、骨不连的治疗需要。

本发明所提出人源化活性煅烧骨，为去除有机质并经高温煅烧后的天然动物松质骨颗粒，其特征在于：主要成分为羟基磷灰石晶体，具有三维网状多孔结构，粒径为0.1～5mm的颗粒，孔径大小分布在50～600μm之间；在煅烧骨表面复合有人体细胞合成分泌的细胞外基质所形成的涂层。其与人骨结构高度相似，有利于细胞长入，新骨的形成，有利于移植部位骨结构的重建。所述的人体细胞为自体或异体来源的成体细胞或是成体干细胞，可以根据需要选择成骨细胞、软骨细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细胞、皮肤干细胞、间充质干细胞、肌肉干细胞、脂肪干细胞的任一种或是几种。

本发明所述的人源化活性煅烧骨的制备方法，采用有煅烧骨颗粒，包括人体细胞培养液的配制、细胞接种、真空干燥的步骤，具体如下：

步骤一、煅烧骨颗粒处理：将去除有机质并经煅烧后的碎骨块，机械粉碎为粒径0.1～5mm的颗粒，用筛网分选不同大小等级的煅烧骨颗粒；为使种植细胞更容易贴附，将煅烧骨颗粒置于牛血清、或胶原蛋白、或多聚赖氨酸、或RGD多肽的任一种溶液浸泡不少于1小时；再经干燥后灭菌消毒；

步骤二、配制人体细胞培养液：其组分按体积百分比包括：商用最低必需培养液DMEM 67.5％、商用培养液F12 22.5％、胎牛血清5～15％，胰岛素1～50 ng/ml、氢化可的松10～500ng/ml、腺嘌呤0.02～0.25mM、碱性成纤维细胞生长因子1～10ng/ml、转铁蛋白1～10μg/ml、维生素C 10～50μg/ml；

步骤三、细胞接种：将干燥的煅烧骨颗粒按不超过4％的重量比加至人体细胞培养液中静置0.5～2小时后，采用旋转式细胞培养方法进行动态三维培养，定时观测细胞生长情况，每三天换液，培养6～10天后取出煅烧骨颗粒；所述的人体细胞培养液中至少含有10⁵个人体细胞/ml；

步骤四、真空干燥：将培养后的煅烧骨颗粒用磷酸盐缓冲液清洗，真空干燥煅烧骨颗粒至重量不变化，经灭菌消毒后，即得到复合有人体细胞合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子的人源化煅烧骨颗粒。

本发明步骤一中所述去除有机质的步骤为：取动物股骨、椎骨的松质骨，去除表面的软组织，机械加工成粒径1～20mm大小的碎骨块，用纯水清洗；用浓度为0.5～2g/L胰酶溶液消化24～72h，再用纯水清洗后置于1M的NaOH溶液中超声波处理2小时以上，每0.5～1小时更换NaOH溶液，根据碎骨块大小调整处理时间，纯水清洗至中性；再用10％～30％ H₂O₂溶液处理30分钟以上，纯水清洗后干燥。

本发明步骤一中所述煅烧的步骤为：将去除有机质干燥后的碎骨块放入刚玉坩埚中煅烧，升温至400～800℃后恒温煅烧2～5小时，自然降温，完成一次煅烧；还可根据产品的需要进行二次煅烧，其工艺为，升温至800～1200℃后恒温煅烧2～4小时，自然降温。一次煅烧的骨块强度比二次煅烧的强度小，一次煅烧适于制备粒径500μm以下的骨颗粒，二次煅烧更适于制备较大尺寸的骨颗粒，且二次煅烧会形成更多的CaO晶体，提高煅烧骨的溶解性。

本发明所制备的煅烧骨颗粒可以作为填充材料单独使用，也可以与凝胶溶液混合使用；所述的凝胶为纤维蛋白原、纤维蛋白、海藻酸盐、胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、水凝胶、骨胶、明胶、果胶、骨水泥的任一种或是几种的混合；与凝胶溶液混合后为凝胶状，可以塑形成缺损部位的形状，填充到人体骨缺损部位，便于操作；单独使用本发明煅烧骨颗粒填充骨缺损部位时，可用膜样结构包被骨缺损部位(例如胶原膜、羊膜等材料)，可以隔离颗粒与周围软组织，起到固定骨颗粒，隔离骨颗粒与周围软组织的作用，降低骨颗粒被组织吸收的速度，有利于骨缺损部位的重建。

本发明利用组织工程技术制备的人源化煅烧骨颗粒，在植入体内后可填充修复各种缺损的骨组织。在制备过程中，通过一系列化学处理，和二次煅烧的方式，完全去除了动物源性的有机成分；同时，在煅烧骨颗粒表面添加有人体细胞外基质涂层，这些措施能够显著提高产品的生物相容性和骨诱导性。所制备的煅烧骨颗粒具有以下优点：保留了天然骨的三维立体多孔结构，具有骨小梁及小梁间隙和骨内管腔系统，结构上与天然骨相似，有利于成骨细胞黏附生长、血管长入，是理想的骨替代材料；对人体无毒、无热原，对周围组织无刺激作用，可充填不规则骨缺损，降解速度适中，植入后不会引起溶血反应和免疫排斥反应，无致癌性和致畸作用，能逐步被降解吸收和被机体组织替代；适用于填充骨缺损、辅助加固骨折内固定，作为牙科的填充材料、用于椎体成形术等应用，具有骨诱导性。本发明煅烧骨颗粒可根据需要，使用可固化的材料塑型成任意形状，便于临床操作。

附图及其说明

附图1为本发明制备的煅烧骨大体照片，可见煅烧骨为白色、多孔状；附图2为本发明煅烧骨的扫描电镜照片，可见煅烧骨微观结构为多孔状；附图3为本发明煅烧骨表面复合骨髓间充质干细胞的扫描电镜照片，可见骨髓间充质干细胞长满煅烧骨表面。

具体实施方式

以下结合实例对本发明技术方案作进一步的详细说明。

实施例1、

1.去除有机质：取牛股骨骨骺端松质骨，去除表面的软组织后，机械加工成粒径5mm大小碎骨块，纯水搅拌清洗30分钟；将碎骨块置入浓度为0.5g/L胰酶溶液常温下消化24h，纯水搅拌清洗后置于1M的NaOH溶液中超声波清洗2小时，每半小时更换溶液一次，纯水搅拌清洗至中性；再用10％浓度的H₂O₂溶液常温处理40分钟，纯水搅拌清洗，37℃干燥箱内至干燥。

2.煅烧：将干燥后的碎骨块放入刚玉坩埚中，在马弗炉中煅烧；升温到800℃，继续恒温煅烧4小时，将炉内温度降至室温，取出煅烧骨；

3.表面处理：将煅烧骨机械粉碎后用筛网分选出粒径100～200μm的煅烧骨颗粒，置于2mmol/ml的RGD多肽溶液中负压抽吸后，浸泡1小时；再经常温干燥后灭菌消毒。

4.骨髓间充质干细胞培养液的配制：其组分按体积百分比包括有：商用最低必需培养液DMEM 67.5％、商用培养液F12 22.5％、胎牛血清10％，胰岛素50ng/ml、氢化可的松500ng/ml、腺嘌呤0.05mM、碱性成纤维细胞生长因子4ng/ml、转铁蛋白8μg/ml、维生素C 40μg/ml。

5.细胞种植：将煅烧骨颗粒20g加至含有10⁵个/ml骨髓间充质干细胞的1L培养液中静置1小时，再置于旋转式细胞培养系统(美国NASA)，进行动态三维培养，每三天更换培养液，培养8天后，取出煅烧骨颗粒。

6.真空干燥：将完成培养的煅烧骨颗粒用磷酸盐缓冲液清洗，再用真空干燥机干燥20h，γ射线灭菌消毒后，得到复合有人体细胞合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子的人源化煅烧骨颗粒。

7.使用前将人源化煅烧骨颗粒与胶原蛋白溶液按重量体积比1∶3混合均匀，形成可自固化的人源化煅烧骨凝胶。煅烧骨与胶原蛋白溶液混合后的凝胶状混合物通过注射器注射到骨缺损的部位，填充缺损，在体内塑形成缺损部位的形状。

实施例2、

1、去除有机质：取牛椎骨的松质骨去除表面的软组织，机械加工成粒径10mm大小碎骨块，纯水搅拌清洗90分钟；将碎骨块置入1.5g/L胰酶溶液常温下消化48h，纯水充分搅拌清洗后置于1M NaOH溶液中超声波清洗3小时，每1小时更换溶液一次，纯水充分搅拌清洗至中性；再用20％的H₂O₂溶液处理50分钟，纯水充分搅拌清洗，37℃干燥箱内直至干燥。

2、煅烧：将干燥后的碎骨块放入刚玉坩埚中，在马弗炉中煅烧；升温到600℃，继续恒温煅烧3小时，将炉内温度降至室温，再次升温到1000℃，恒温煅烧3小时后降至室温，取出煅烧骨，将其机械粉碎后用筛网分选出粒径1～2mm的骨颗粒。

3、表面处理：为使种植细胞更容易贴附，将煅烧骨颗粒置于2mg/ml的胶原蛋白溶液中负压抽吸，浸泡1小时；再真空干燥后灭菌消毒。

4、成骨细胞培养液的配制：其组分按体积百分比包括有：商用最低必需培养液DMEM 67.5％、商用培养液F12 22.5％、胎牛血清5％，胰岛素10ng/ml、氢化可的松100ng/ml、腺嘌呤0.2mM、碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml、转铁蛋白2μg/ml、维生素C 20μg/ml。

5、细胞种植：将煅烧骨颗粒50g加至含有10⁶个/ml成骨细胞的2L培养液中静置1小时，再置于旋转式细胞培养系统(rotate cell culture system，美国NASA)进行动态三维培养，10天后培养完毕，取出煅烧骨颗粒。

6、干燥：将培养后的煅烧骨颗粒用磷酸盐缓冲液清洗后，使用真空干燥机干燥24h，灭菌消毒后，得到复合有人体成骨细胞合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子的人源化煅烧骨颗粒。

7、使用前将人源化煅烧骨颗粒与明胶溶液按重量体积比1∶2混合均匀，然后填充到缺损部位，该凝胶状混合物，能够根据缺损部位的形状自动塑形来填充缺损部位。

实施例3、

1.去除有机质：取猪股骨骨骺端松质骨去除表面的软组织，加工成粒径20mm大小碎骨块，纯水搅拌清洗60分钟；将碎骨块加入2g/L胰酶溶液常温下消化72h，纯水搅拌清洗后置于1M的NaOH溶液中超声波清洗4小时，每1小时更换溶液一次，纯水超声波清洗至中性；再用30％的H₂O₂溶液处理60分钟，纯水搅拌清洗，37℃干燥箱内至干燥。

2.煅烧：将干燥后的碎骨块放入刚玉坩埚中，在马弗炉中煅烧；升温到700℃，恒温煅烧4小时，将炉内温度降至室温，再次升温到1100℃，恒温煅烧3小时后降至室温，取出煅烧骨，将其机械粉碎后用筛网分选出粒径4～5mm的骨颗粒.

3.表面处理：为使种植细胞更容易贴附，将煅烧骨颗粒置于2mmol/ml的RGD多肽溶液负压抽吸后，浸泡1小时；再经常温干燥后灭菌消毒。

5.细胞贴附生长：将煅烧骨颗粒100g加至含有10⁵个/ml骨髓间充质干细胞的3L培养液中静置1小时，再置于旋转式细胞培养系统(美国NASA)进行动态三维培养， 7天后培养完毕，取出煅烧骨颗粒。

6.干燥：将培养后的煅烧骨颗粒使用磷酸盐缓冲液清洗后，使用真空干燥机干燥32h，灭菌消毒后，得到复合有人体细胞合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子的人源化煅烧骨颗粒。

7.将粒径4～5mm的人源化煅烧骨颗粒填充到有内固定的大体积骨缺损部位，可以促进缺损部位的骨重建。

Claims

1.一种人源化活性煅烧骨的制备方法，采用去除有机质并经高温煅烧后的天然动物松质骨颗粒，其特征在于，其主要成分为羟基磷灰石晶体，具有三维网状多孔结构，粒径为0.1～5mm的颗粒，孔径大小分布在50～600μm之间；在煅烧骨表面复合有人体细胞合成分泌的细胞外基质所形成的涂层；具体步骤为：

步骤一、煅烧骨颗粒处理：将去除有机质并经煅烧后的碎骨块，机械粉碎为粒径0.1～5mm的颗粒，用筛网分选不同大小等级的煅烧骨颗粒；将煅烧骨颗粒置于牛血清、或胶原蛋白、或多聚赖氨酸、或RGD多肽的任一种溶液浸泡不少于1小时；再经干燥后灭菌消毒；

步骤二、配制人体细胞培养液：其组分按体积百分比包括：商用最低必需培养液DMEM 67.5％、商用培养液F1222.5％、胎牛血清5～15％，胰岛素1～50ng/ml、氢化可的松10～500ng/ml、腺嘌呤0.02～0.25mM、碱性成纤维细胞生长因子1～10ng/ml、转铁蛋白1～10μg/ml、维生素C 10～50μg/ml；

步骤三、细胞接种：将干燥的煅烧骨颗粒按不超过4％的重量比加至人体细胞培养液中静置0.5～2小时后，采用旋转式细胞培养方法进行动态三维培养，每三天换液，培养6～10天后取出煅烧骨颗粒；所述的人体细胞培养液中至少含有10⁵个人体细胞/ml；

步骤四、真空干燥：将培养后的煅烧骨颗粒用磷酸盐缓冲液清洗，真空干燥至重量不变化，经灭菌消毒后，即得到复合有人体细胞合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子的人源化煅烧骨颗粒。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中所述去除有机质的步骤为：取动物股骨、椎骨的松质骨，去除表面的软组织，机械加工成粒径1～20mm大小的碎骨块，用纯水清洗；用浓度为0.5～2g/L胰酶溶液消化24～72h，再用纯水清洗后置于1M的NaOH溶液中超声波处理2小时以上，每0.5～1小时更换NaOH溶液，纯水清洗至中性；再用10％～30％H₂O₂溶液处理30分钟以上，纯水清洗后干燥。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中所述煅烧的步骤为：将去除有机质干燥后的碎骨块放入刚玉坩埚中煅烧，升温至400～800℃后恒温煅烧2～5小时，自然降温。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，二次煅烧的工艺为，升温至800～1200℃后恒温煅烧2～4小时，自然降温。