CN1579562A - 一组同类不同结构的陶瓷化骨的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一组同类不同结构的医用陶瓷化骨的制备方法,用本方法制备的陶瓷化骨,无机晶格与正常骨完全一致,按结构可分为皮质骨型、松质骨型、复合型、颗粒型,主要成分为羟基磷灰石的天然衍生生物材料。其制备方法是取大动物的不同部位骨,经脱脂、脱蛋白、脱水、煅烧工序制备。根据不同结构,可作为移植材料、药物或生长因子的载体以及组织工程的支架材料,可形成不同效果的新骨。
Description
技术领域
本发明属于组织工程中人工生物材料技术领域,涉及一组同类不同结构的陶瓷化骨的制备方法。
背景技术
20世纪90年代初诞生的组织工程学(Tissue Engineering)是一门利用工程学和生命科学的原理,以人工合成材料为载体整合被分离细胞或募集受体局部环境中的细胞,形成新的有功能组织的新兴边缘科学。它的确立和发展依赖于组织培养,生物材料科学和器官移植学的进步。由于骨组织的力学特殊要求,故其支架材料多采用无机盐、人工合成高分子和天然聚合物等具有一定力学性能的材料。陶瓷化骨是质脆、色灰白的一组天然衍生无机材料,它具有优良的生物相容性,一定的硬度,无免疫原性,出色的骨传导性。陶瓷化骨可以作为单独的移植、充填材料治疗骨缺损,如长骨缺损可采用皮质骨型陶瓷化骨进行移植,扁骨缺损可用复合型陶瓷化骨,牙槽窝的填塞可用松质骨型或颗粒型陶瓷化骨。陶瓷化骨可作为天然衍生材料,具有其他生物材料无法比拟的优势,但也有不足之处,其降解率较低,完全降解需一年以上。
在本发明以前的现有技术中,CN1224623A专利申请公布了一种煅烧骨与BMP的复合方法,其中提到煅烧骨的制备方法,其骨来源是动物的股骨骺端,煅烧所得为松质骨型的煅烧骨。由于其自身结构所决定只能作为填塞材料治疗小型骨缺损和构建不承力的组织工程骨的支架,无法完全满足临床及组织工程骨研究、应用的需要。目前,国内市场上,尚未见到具备上述优良性能的陶瓷化骨产品。
发明内容
本发明的目的在于:制备一组具有同类不同结构的天然衍生物材料-陶瓷化骨,包括皮质骨型、松质骨型、颗粒型、复合型,满足临床各种骨缺损、骨不连的需要,为组织工程骨提供各种类型支架材料。
本发明所述的一组同类不同结构的陶瓷化骨的制备方法包括以下步骤:(1)骨骼切割、清洗;(2)脱脂肪;(3)脱蛋白;(4)脱水;(5)煅烧。其所述的步骤(1)为:选取动物的股骨骨干、干骺端、肋骨等,切割成所需形状,清洗干净;所述的步骤(2)、(3)为:置入0.5mol/L氢氧化钠溶液中脱脂10-20小时,冲洗干净后,再置入30%过氧化氢中脱蛋白10-20小时,反复处理两次,然后进行冲洗;所述的步骤4为:将冲洗后的骨块置入烘箱,40-45℃烘烤5-50小时;或是置入氯仿与酒精3∶1的混合液浸泡1小时,再于丙酮中浸泡1小时;或/和置入乙醇中浸泡4-6小时;再干燥。所述的步骤(5)为:将脱水干燥后的骨块置于高温炉中以600-1000℃煅烧1-4小时,冷却后将陶瓷化骨置入无菌器皿中保存。煅烧时间与温度有关,煅烧温度高时,煅烧时间短,煅烧温度低时,煅烧时间长。如复合型陶瓷化骨是在900-1000℃下煅烧1-2小时,皮质骨型陶瓷化骨是在800-900℃下煅烧2-3小时,而松质骨型陶瓷化骨是在600-800℃下煅烧3-4小时。
本发明所制备的一组同类不同结构的陶瓷化骨,其主要成分是羟基磷灰石,具有与正常骨完全一致的无机晶格;I型胶原mRNA与骨钙素水平与天然羟基磷灰石HA相近;体外培养的成骨样细胞与本陶瓷化骨复合后,细胞扩增量、胶原含量均高于与天然羟基磷灰石HA复合的成骨样细胞;碱性磷酸酶(ALP)活性较高;根据陶瓷化骨的不同结构,可分为皮质骨型、松质骨型、复合型、颗粒型。松质骨型具有多孔状结构,网孔间相互交通,质脆,有天然的高密度小梁骨结构,骨小梁、小梁间隙及骨内管腔系统同时存在,孔隙率为85%,孔径大小为450μm。皮质骨型陶瓷化骨非常致密,表面有大小不等的微孔,具有动物皮质骨的结构,坚硬、质脆。复合型陶瓷化骨具备上述两型的优点,但其硬度低于皮质骨型,而且网孔状结构较松质骨型少;颗粒型陶瓷化骨是由直径在40μm-300μm之间的颗粒构成,可通过调节筛网孔径大小而获得不同直径的颗粒。
附图说明
图1:本发明制备方法步骤框图
图2:本发明陶瓷化骨用RT-PDR方法检测的I型胶原mRNA与钙素水平
图3:应用复合型陶瓷化骨接种矿化诱导后的骨髓基质细胞修复照片
图4:颗粒型陶瓷化骨与矿化诱导后的骨髓基质细胞复合照片
附图3所示的是本发明制备的复合型陶瓷化骨接种矿化诱导后的骨髓基质细胞修复SD大鼠颅骨极量缺损,8周时HE染色可见移植物与骨创缘成骨性连接,移植物中有大量小梁状骨形成,小梁之间有少量骨髓形成,而小梁骨的表层可见薄层的板层骨。移植物牢固镶嵌在骨缺损处,表面有纤维组织覆盖,内有少量毛细血管,无炎性浸润。单纯植入复合型陶瓷化骨组,只在骨缺损创缘附近有骨组织形成,移植物被纤维结缔组织包绕,但牢固镶嵌在骨缺损处。而骨缺损未经任何修复的空白对照组只是由纤维结缔组织覆盖缺损处。说明复合型陶瓷化骨与骨髓基质细胞构建而成的组织工程骨能够修复扁骨缺损,而且较单纯植入材料更有利于骨组织的形成,明显缩短骨缺损的修复时间。
附图4所示为本发明制备的颗粒型陶瓷化骨与矿化诱导后的骨髓基质细胞复合,修复SD大鼠颅骨极量缺损,8周时HE染色可见创缘与植入物成骨性连接,在陶瓷化骨颗粒周围形成条索状骨基质,经脱钙后成网状。植入物表面为内有少量毛细血管的纤维组织覆盖,未见炎性浸润。说明颗粒型陶瓷化骨与骨髓基质细胞具有良好的成骨特性,能够修复颅骨缺损。
具体实施方式
下面以几个实例来详细描述本发明技术案。
实例一:复合型陶瓷化骨的制备。取新鲜的牛肋骨,去除肌肉和筋膜,将肋骨纵向剖开后,横断成不同大小的骨块;清洗干净,放入0.5mol/L氢氧化钠溶液中14小时,冲洗干净,再置入30%过氧化氢中12小时,反复处理两次;然后用蒸馏水漂洗,再放入3∶1氯仿与酒精的混合液及丙酮中各浸泡1小时,进行脱水;再置入乙醇中浸泡4小时后,干燥,再置于马佛炉中以900℃煅烧1小时,冷却后取出复合型陶瓷化骨放入无菌器皿中保存。
实例二:松质骨型陶瓷化骨的制备。将股骨的骺端取下,切割成不同大小的松质骨块;清洗干净,置入0.5mol/L氢氧化钠溶液中12小时,冲洗干净,再置入30%过氧化氢中16小时,反复处理两次;然后用蒸馏水漂洗,置入42℃烘箱内烘烤48小时;置于马佛炉中以700℃煅烧4小时,冷却后取出松质骨型陶瓷化骨放入无菌器皿中保存。
实例三:皮质骨型陶瓷化骨的制备。将股骨骨干纵向剖开,切割成块,清洗干净;置入0.5mol/L氢氧化钠溶液中16小时,冲洗干净,再置入30%过氧化氢中12小时,反复处理两次;冲洗干净后置入乙醇中浸泡6小时后,干燥;再置于马佛炉中以800℃煅烧3小时,冷却后取出皮质骨型陶瓷化骨放入无菌器皿中保存。
颗粒型陶瓷化骨是将上述三型中的任意一型经研磨、过筛而得。
本发明的临床应用原理以及构建组织工程骨原理解释如下:由于本发明的陶瓷化骨是一组不同结构的生物材料,从而适应临床不同骨缺损、骨不连等疾病,长骨缺损可用皮质骨型的陶瓷化骨或复合生长因子后移植。皮质骨型陶瓷化骨是由致密的均质状颗粒紧密排列而成,表面可见一些沟、嵴,这些沟、嵴样结构有利于细胞的附着。由于皮质骨型陶瓷化骨的抗压强度为20kg/cm2,可以承受一定的压力,由于其脆性较大,应避免侧向力的打击,如治疗期间给与一定的保护,约一年以后陶瓷化骨被机体降解吸收,由自身新生骨替代。部分扁骨缺损可用松质骨型、复合型陶瓷化骨移植。松质骨型陶瓷化骨是由相互交通的网状结构组成,与正常松质骨的结构一致。松质骨型陶瓷化骨的抗压强度很低,而复合型较松质骨型抗压强度大,但明显低于皮质骨型,因此不适合承力的骨缺损治疗。由于大部分扁骨承力不大或不承力,如颅骨缺损,可以应用松质骨型、复合型的陶瓷化骨进行治疗。小型腔洞型骨缺损可用颗粒型陶瓷化骨移植治疗。颗粒型陶瓷化骨为新生骨提供更多的空间,不仅发挥了新生的天然骨对移植物的补强增韧作用,而骨化后的陶瓷化骨更接近于天然骨。
本发明制备的陶瓷化骨是各种生长因子的良好载体,而生长因子又能拓宽陶瓷化骨的应用范围,增强陶瓷化骨的治疗效果。可通过预涂、浸泡、化学交联等方式将陶瓷化骨与人或动物源性以及重组的骨形成蛋白(BMP)、转化生长因子-β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、金属基质蛋白(MMP)、神经生长因子(NGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)等生长因子复合,进而提高功效。陶瓷化骨还可以单独或与其他材料复合作为组织工程支架材料,与骨膜、松质骨来源的成骨细胞、骨髓来源的骨髓基质细胞、成骨细胞、成软骨细胞、脂肪来源的成骨细胞、外胚间充质干细胞来源的成骨细胞、成软骨细胞、胚胎干细胞来源的成骨细胞、成软骨细胞等种子细胞构建组织工程骨。与其他材料复合还可进行表面修饰改善其表面性能,增加细胞的粘附,促进细胞的生长、分化,更有利于组织工程骨的形成。陶瓷化骨与胶原、藻酸钠水凝胶、温固化水凝胶、聚丙烯酰胺水凝胶(PAHG)、半晶聚乙烯醇水凝胶(Semi-crystal-line polyvinylalcohol hydrogel,PVA-H)、聚丙烯延胡索酸酯(PPF)、壳聚糖等材料复合,形成复合材料拓宽应用范围。也可在陶瓷化骨表面预涂、化学交联多聚赖氨酸、纤维粘结素(Fn)、聚丙烯酸、RGD短肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)、玻璃结合蛋白(Vn)等进行表面修饰,有利于细胞粘附、伸展。
Claims (6)
1、一组同类不同结构的陶瓷化骨的制备方法,以动物骨骼为原料,采用有骨骼切割,清洗,脱水和煅烧步骤,其特征在于,所述的制备方法包括以下步骤:(1)骨骼切割、清洗,(2)脱胇肪,(3)脱蛋白,(4)脱水,(5)煅烧;所述的步骤(1)为:选取动物的股骨骨干、干骺端、肋骨,切割成所需形状,清洗干净;所述的步骤(2)和(3)为:置入0.5mol/L氢氧化钠溶液中脱脂10-20小时,冲洗干净后,再置入30%过氧化氢中脱蛋白10-20小时,反复处理两次,然后进行脱水;所述的步骤(5)为:将脱水干燥后的骨块置于高温炉中以600-1000℃煅烧1-4小时,冷却后将陶瓷化骨置入无菌器皿保存。
2、根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述的步骤(4)为:用水清洗脱蛋白后的骨块,置入烘箱40-45℃烘烤45-50小时;或是置入氯仿与酒精3∶1的混合液浸泡1小时,再于丙酮中浸泡1小时;或/和置入乙醇中浸泡4-6小时;再干燥。
3、根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:复合型陶瓷化骨的制备是选取动物肋骨并将肋骨纵向剖开、横断成骨块;其煅烧温度为900-1000℃,煅烧时间为1-2小时。
4、根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:松质骨型陶瓷化骨的制备是选取动物股骨的骺端,按所需大小切割成块;其煅烧温度为600-800℃,煅烧时间为3-4小时。
5、根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:皮质骨型陶瓷化骨的制备是选取动物股骨的骨干并纵向剖开,切割成块;其煅烧温度为800-900℃,煅烧时间为2-3小时。
6、根据权利要求1-5所述的任一种制备方法,其特征在于:颗粒型陶瓷化骨的制备是将上述制备的任一型陶瓷化骨经研磨、过筛而得。
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