JP2001510358A - 組織修復および再構築に用いられる生重合体発泡体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 単一又は二倍密度重合体発泡体と、単一および二倍密度重合体発泡体を含んだ複合重合体発泡体と、これらの発泡体と複合発泡体とを作製する方法が記載されている。更には、単一又は二倍密度重合体発泡体と細胞外基質微粒子とを含む生物適合性構成体と、これら構成体を作製する方法が記載されている。本発明によるこれらの発泡体と、複合発泡体と、生物適合性構成体とは、組織修復および再構成に用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】 組織修復および再構築に用いられる生重合体発泡体発明の背景 従来から、コラーゲン海綿体または発泡体が、止血剤として使われてきた。そ して、近年では、生体内の組織修復のための骨組として、そして、３次元の細胞 機能を研究するために多様な細胞型に播種するための試験管内のの調査ツールと して使われている。コラーゲン海綿体は免疫抗原性が低く、この海綿体は又、細 胞が付着することができ、相互に作用することができ、分解させることができる 自然発生構造タンパク質からなる。生体内において、これらの海綿体は生体吸収 可能である。しかし、海綿体は通常は架橋されて、上述の多くの使用のために必 要とされるある程度の湿潤強度と溶解に対する抵抗がある。一般に、コラーゲン 海綿体または発泡体のアルデヒド架橋は、細胞および細胞によって分泌される特 定の分子が付着する通常の結合部位を減少させ、分解する。更に、コラーゲン海 綿体、ゼラチン海綿体またはポリビニールアルコール海綿体は、細胞の細胞外基 質環境に典型的に存在する生物的活性を欠いている。しかし、それらの欠如のた め、架橋されたコラーゲン海綿体は生体内では再生を殆ど誘発しないし、試験管 内では組織球および器官型モデルとしての役目を殆ど果たせない。 したがって、上述の問題を克服するかまたは最小限に抑える改良型の生重合体 発泡体に対する必要性が存在する。発明の要約 本発明は、生重合体発泡体と、複合生重合体発泡体と、生重合体発泡体および 細胞外基質微粒子からなる生体適合性のある構成体とを特徴とし、又これらの発 泡体および発泡体組成物を製造し、使用する方法を特徴とする。この発泡体およ び発泡体組成物は、例えば、試験管内で研究目的でモデルシステムのために使用 したり、生体内で損害を与えられたか病気にかかった組織を交換するために、生 体代行機器または移植片としてか、細胞（例えば宿主細胞）が占有すると、再成 形されて機能しうる組織になる骨組を提供する目的で用いることができる。何れ の場合も、この発泡体および発泡体組成物は、この発泡体または発泡体組成物を 用いて修理するかまたは再建する組織と同一タイプの細胞（例えば、人間の細胞 などの哺乳類の細胞）で播種できる。ここに記載されている発泡体および発泡体 組成物を使用して修理および／または再建可能な組織の例としては、神経組織、 皮膚、維管束組織、筋肉組織、例えば骨、軟骨、腱および靭帯のような結合組織 、腎臓組織、例えば肝臓組織および膵臓組織のような腺組織が含まれる。一実施 例においては、組織特定的細胞が播種される発泡体および発泡体組成物は、例え ば人間などの哺乳類の宿主に導入される。あるいは、試験管内の組織内で組織化 し、細胞外基質タンパク質および／または成長因子のような、発泡体および発泡 体組成物に接着する組織具体的な生合成生成物を分泌する機会を有した播種した 細胞は、発泡体および発泡体組成物を宿主に導入する前に除去される。 したがって、本発明は、選択された特性を有する単密度生重合体発泡体に関す る。好適な一実施例では、この単密度生重合体発泡体は、連通したミクロコンパ ートメントの網状組織をなし、このミクロコンパートメントにはその壁体内に散 在させた生重合体分子および／またはその生重合体フィラメントを備える。これ らの発泡体のミクロコンパートメントは、典型的には、ｘ、ｙおよびｚの体積寸 法があり、ここで、ｘは長さ、ｙは幅、そしてｚは高さである。これらの寸法は 概ね等しく、その範囲は約１μｍから約３００μｍであり、好適には約５０μｍ から約１００μｍの範囲である。単密度生重合体発泡体のミクロコンパートメン ト壁体の平均的な厚みは、約１０μｍ未満である。この単密度生重合体発泡体に 用いる事ができる生重合体には、コラーゲン、アルギン酸、ポリビニルアルコー ル、エラスチン、コンドロイチン硫酸、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリ ノーゲン及びこれらの組合わせがある。一つの好適な生重合体はコラーゲンであ り、例えば、ブタの胎児のコラーゲンである。他の実施例では、単密度生重合体 発泡体に、細胞外基質微粒子および／または細胞が含まれている。 本発明の単密度生重合体発泡体を作製するには、生重合体の溶液を作り、その 生重合体溶液中で生重合体を架橋し、その後に生重合体溶液を凍結乾燥して単密 度生重合体発泡体を形成する。別の実施例では、架橋の段階が凍結乾燥の後に来 る。好適実施例の方法はまた、架橋の段階の前に、生重合体の溶液中の生重合体 を重合させて、生重合体の格子を作る段階も含んでいる。好適な生重合体である コラーゲンをこの方法に用いる場合は、コラーゲンをリシルオキシダーゼで準備 刺激する事で架橋できる。発泡体の裂けを抑えるには、不凍ポリペプチド、例え ばＩ、IIあるいはIII型不凍ポリペプチドもしくは不凍糖タンパク質の存在下で 、生重合体を凍結乾燥させる事も可能である。本発明はまた、この方法で作製さ れた単密度生重合体発泡体にも関する。 また、本発明は選択された特質を有する二倍密度生重合体発泡体にも関する。 好適な一実施例では、この二倍密度生重合体発泡体は、連通したミクロコンパー トメントの網状組織をなし、ミクロコンパートメントにはそのコンパートメント の壁体内に散在させた生重合体分子および／または生重合体フィラメントが含ま れている。これらの発泡体のミクロコンパートメントには、典型的にはｘ、ｙお よびｚの体積寸法があり、ここで、ｘは長さ、ｙは幅、そしてｚは高さである。 その内の二つの寸法は概ね等しく、その範囲は約１μｍから約３００μｍであり 、その内の三つ目は、殆ど寸法の等しい二つより小さい。二倍密度生重合体発泡 体のミクロコンパートメント壁体の平均的な厚みは、約１０μｍ未満である。二 倍密度発泡体に使用する好適生重合体が、本明細書で説明されている。他の実施 例では、二倍密度生重合体発泡体に、細胞外基質微粒子および／または細胞が含 まれている。 本発明の二倍密度生重合体発泡体を作製するには、生重合体の溶液を作り、そ の後その生重合体溶液中で生重合体を架橋する。その生重合体溶液はそれから凍 結乾燥する事で発泡体が作られ、水化され、そして選択された形状ができる。そ の後、選択された形状の発泡体を、乾燥させて二倍密度生重合体発泡体を得る事 ができる。別の実施例では、架橋の段階が、凍結乾燥の段階の後に来る。好適な 一実施例では、二倍密度生重合体発泡体を作製する方法はまた、架橋の段階の前 に、生重合体の溶液中の生重合体を重合させて、生重合体の格子を作る段階も含 んでいる。本発明はまた、この方法で作製された二倍密度生重合体発泡体にも関 する。 本発明ではまた、単一および二倍密度の両者を含む複合生重合体発泡体も、特 に意図されている。その発泡体すなわち複合発泡体は更に、試験管内あるいは生 体内で使用する前に、細胞で条件づけできる。複合生重合体発泡体を形成するに は、まず二倍密度生重合体発泡体を用意し、その後その二倍密度生重合体発泡体 を、例えば水あるいは生重合体溶液で水化する。その後、生重合体溶液を、水化 された二倍密度生重合体発泡体に加えて、その溶液と水化された二倍密度発泡体 を凍結乾燥して複合生重合体発泡体を形成する。凍結乾燥の段階の前に、生重合 体発泡体の中の生重合体を架橋してもよい。本発明はまた、この方法で形成され る複合生重合体発泡体も含む。その複合生重合体発泡体中の単一および二倍密度 発泡体を、細胞条件づけの後、凍結乾燥する事もできる。 別の面では、本発明は、単一あるいは二倍密度生重合体発泡体および細胞外基 質微粒子を含む生物学的適合構成体に関する。この細胞外基質微粒子は、発泡体 のあらゆるところに散在させる事ができる。例えば、細胞外基質微粒子は、発泡 体全体への拡散されたり、また（或いは）生重合体発泡体表面へ塗布される生重 合体溶液あるいは懸濁液の中に含まれている。その後、細胞外基質微粒子を含ん だ生重合体発泡体を凍結乾燥できる。 更に別の面では、生重合体発泡体が塗布された、例えばコラーゲンで塗布され た単一あるいは二倍密度発泡体を作製する方法に本発明は関する。これらの方法 は、本明細書に説明されている方法によって単一あるいは二倍密度発泡体を作製 する段階と、その後に生重合体溶液（それは更に細胞外基質微粒子を含くむこと ができる）をその発泡体に加えてることよって、生重合体で塗布された発泡体を 形成する段階とを含む。発泡体が塗布された後で、凍結乾燥してもよい。 本発明はまた、細胞外基質微粒子が塗布された単一あるいは二倍密度発泡体を 作製するための方法に関する。これらの方法は、本明細書に説明されている方法 によって単一あるいは二倍密度発泡体を準備する段階と、その後に細胞外基質微 粒子、例えば、コラーゲン溶液に懸濁している細胞外基質微粒子をその発泡体に 塗布することによって細胞外基質微粒子で塗布された発泡体を形成する段階と、 を含む。一つの実施例では、発泡体が塗布された後で、凍結乾燥してもよい。 本発明の生重合体発泡体および発泡体組成物（細胞外基質微粒子を含んでいて も或いは含んでいなくても）は、例えば、皮膚の代用あるいは皮膚の包帯、人工 血管、整形移植片、人工歯根、また人工軟骨、人工泌尿器、人工腺などの人工結 合組識として使用できる。典型的には、生重合体発泡体および発泡体組成物は細 胞で条件づけされる。好適な一実施例では、生重合体発泡体および発泡体組成物 は皮膚の包帯に使用できる。この皮膚包帯は、単密度コラーゲン発泡体と二倍密 度コラーゲン発泡体を含む複合生重合体発泡体でよい。単密度生重合体発泡体は 、ヒトの皮膚の繊維芽細胞で条件づけられ、二倍密度生重合体発泡体は、角質層 が形成されるように、ヒトのケラチン合成細胞で条件づけしてよい。細胞による 条件づけの後に、これらの単一および二倍密度生重合体発泡体の複合体は凍結乾 燥してよい。別の実施例では、皮膚の包帯は、発泡体全体に拡散された皮膚の繊 維芽細胞と、発泡体の片面に拡散された表皮細胞と、を含む二倍密度生重合体発 泡体である。 本発明の発泡体および発泡体組成物はまた、人工血管としても使用できる。一 つの実施例では、管状の二倍密度生重合体発泡体あるいは複合生重合体発泡体で ある。好適な一実施例では、管状人工血管には、その管腔の内部表面には内皮細 胞が、全体および管腔の外部表面には平滑筋細胞が含まれている。人工血管では また、その平滑筋細胞上に外膜細胞層が被っていてもよい。細胞による条件づけ の後で、人工血管の二倍密度生重合体発泡体あるいは複合生重合体発泡体は凍結 乾燥してもよい。 整形移植片および人工歯根は、細胞外基質微粒子を含んでいても或いはいなく ても、本発明による発泡体あるいは発泡体組成物から作製できる。典型的には、 整形移植片および人工歯根として用いられる発泡体あるいは発泡体組成物は、リ ン酸カルシウムのセメント質を含む。このような人工歯根の例は、生体に吸収可 能なリン酸カルシウムのセメント質を含む管状の二倍密度生重合体発泡体からな る顎堤ビルダーである。代替例では、生重合体発泡体および発泡体組成物は、水 酸化リン灰石を含めて作られ、人工歯根などに使われる。生体に吸収されない水 酸化リン灰石を含む管状の二倍密度生重合体発泡体を有する代用顎堤は、このよ うな人工歯根の例である。歯周靭帯の修復と硬骨の再生を促す力がある人工歯根 およびこれらの移植片を用いて歯周靭帯の修復と硬骨の再生を促す方法もまた、 本明細書で意図される。典型的には、これらの移植片には、エプロン形状の二倍 もしくは四倍密度生重合体発泡体が含まれる。一つの実施例では、エプロン形状 の二倍もしくは四倍密度生重合体発泡体は、リン酸カルシウムのセメント質を含 んだ膨出を有する。歯周靭帯の修復と硬骨の再生を促すために、歯周靭帯の修復 と硬骨の再生を要する歯の部分を、エプロン形状の発泡体で形成したエプロンと 接触させる。例えば、二倍もしくは四倍密度生重合体発泡体の紐を歯に巻いて、 歯周靭帯の修復と骨の再生を要する歯の部分にエプロンを固定する事で接触させ る。 更に別の面では、本発明の生重合体発泡体および発泡体組成物は、人工軟骨、 人工腱、人工靭帯などの人工結合組識として使われる。一つの実施例では、発泡 体および発泡体組成物は、人工軟骨として作られれている。好適な一実施例では 、人工軟骨は、生重合体溶液とセメント質に含ませたリン酸カルシウムを有する 基質およびそのセメント質の基質の片面に凍結乾燥などで埋め込んだ単一もしく は二倍密度生重合体発泡体を含む。人工軟骨の単一あるいは二倍密度生重合体発 泡体にも、軟骨細胞を播種できる。別の実施例では、発泡体および発泡体組成物 が、人工靭帯として作られる。典型的には、人工靭帯は、多数の生重合体フィラ メントおよび単一あるいは二倍密度生重合体発泡体からなる。 本発明の更にまた別の面では、発泡体および発泡体組成物が、人工腺として作 られる。人工腺は、本明細書に説明されている発泡体および発泡体組成物から作 られ、また線組織から得られた細胞外基質微粒子を含むこともできる。好適な一 実施例では、線組織に膵島細胞、肝細胞などの適切な線細胞を播種することもで きる。発明の詳細な説明 本発明の特徴は、生重合体発泡体、複合生重合体発泡体、生重合体発泡体と細 胞外基質微粒子からなる生物学的適合構成体およびこれらの発泡体と発泡体組成 物の形成および使用方法である。生重合体とは、生体、例えば哺乳動物、例えば ヒトなどに移入するのに適切な重合体である。生重合体は、生体に移入された場 合、無毒性で生体に吸収可能であり、且つその分解生成物もまた有機体にとって 無毒性であることが好ましい。単一あるいは二倍密度発泡体などの生物学的適合 発泡体と、複合発泡体と、コラーゲン繊維などの生重合体繊維や、コラーゲン生 地などの生重合体生地および／または細胞外基質微粒子などを含む生物学的適合 組成物とを、本発明の生重合体から形成できる。本発明に於いて使用できる生重 合体には、例えば、コラーゲン、アルギン酸、ポリビニルアルコールと、更にコ ンドロイチン硫酸、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリノゲン などのタンパク質がある。一つの実施例では、単一あるいは複数の生重合体を組 み合わせたり、あるいは混合させて用いる事で、本発明による繊維、発泡体およ び発泡体組成物などの生重合体の形状ができる。例えば、コンドロイチン硫酸と フィブロネクチンの組み合わせを用いる事で、本明細書に説明されている生重合 体繊維ができる。好適な生重合体はコラーゲンである。 好適な生重合体源には、ブタ、例えば出産まじかのブタの胎児、ヒツジ、ウシ などの哺乳動物がある。その他には、陸上および海中の脊椎動物および無脊椎動 物が生重合体源となる。一つの実施例では、無傷のまま取り出され、羊膜の薄膜 に包まれた出産まじかの家畜ブタの胎児の皮膚から得られる。コラーゲンあるい はコラーゲン類型の組み合わせを、本明細書で説明された発泡体および発泡体の 組成物に用ることができる。好適なコラーゲン類型の組み合わせには、Ｉ型コラ ーゲン、III型コラーゲンおよびIV型コラーゲンがある。生重合体を抽出する好 適な哺乳動物の組織には、ブタの胎児などの哺乳動物の胎児全体、真皮、腱、筋 および結合組識がある。コラーゲンの供給源として胎児の組織が優れているのは 、胎児の組織中のコラーゲンは、成体の組織ほど高度に架橋されていないからで ある。したがって、酸抽出法を用いてコラーゲンを抽出する場合、成体組織に比 べて胎児の組織からの方が、多くの割合の無傷のコラーゲン分子が得られる。胎 児の組織にはまた、動物のそれぞれの発達段階に於ける正常な組織にみられる様 々な分子要素が含まれてもいる。 生重合体を用いる事で、小板、板、管などいかなる形態や形状にも成れる発泡 体、例えば単一あるいは二倍密度発泡体などを作り出せる。更に、後にテフロン メッシュなどの重合体メッシュと結合される発泡体を、成いは本発明による発泡 体および発泡体組成物を細胞培養のために成形する鋳型として用いられる多層竪 穴プレートための組織培養挿入物と一緒に用いられる発泡体を、生重合体を用い て形成できる。本発明の発泡体および発泡体組成物と共に用いられる重合体メッ シュは、その発泡体および発泡体組成物の表面および内部に含まれている細胞を 大気に晒す事ができる。例えば、発泡体および発泡体組成物を皮膚同等物として 用いて、角質層の形成を刺激するような場合である。それらのメッシュおよび培 養挿入物には、発泡体および発泡体組成物に実際に触れることなく、それらを扱 える手段を提供できる利点がある。発泡体および発泡体組成物がとる形態および 形状は、代替対象の組織あるいは人体部分の形態および形状に似せる事ができ、 組織細胞が形を変えて、受容者の代替すべき組織の再生を促す人工器管あるいは 移植片として使える。細胞外基質および／または生命力のある細胞もまた、生重 合体に加えられて、その発泡体内部で細胞の内方成長および組織の発達と組織化 を更に促進できる。 生重合体発泡体は、単密度あるいは二倍密度発泡体であってもよい。連通した ミクロコンパートメントの網状組織であって、そのミクロコンパートメントに生 重合体分子および／またはミクロコンパートメント壁体に散在させた生重合体フ ィラメントが含まれている網状組織を「発泡体」という名称で、本明細書では呼 ぶ。「単密度発泡体」という用語は、次に掲げる特質のうち少なくとも２つを有 する生重合体発泡体を指す。その生重合体発泡体は、１）体積寸法ｘ、ｙおよび ｚを持つミクロコンパートメントを有し、ここでｘは長さ、ｙは幅、ｚは高さで あり、それらは殆ど等しい。典型的には、ｘ、ｙおよびｚの範囲は約１μｍから 約３００μｍであり、好適には約２０μｍから約２００μｍの範囲である。更に 好適には、約４０μｍから約１５０μｍの範囲であり、最も好適には、約５０μ ｍから約１００μｍの範囲である、２）約１０μｍ未満の平均的な壁体の厚さを もミクロコンパートメントを有する、３）生重合体繊維および／またはフィラメ ントを含む壁体もつミクロコンパートメントを有する、４）水性溶液で物理的に 安定的である、５）生体に無毒性である、そして６）細胞が定着および成長する 基質として働く。単密度発泡体は、水性緩衝液あるいは組織培養基体内で水化さ れた場合などに、その構造を保持できる。更に、単密度発泡体の三次元的構造は 、内部に播種された細胞組織をサポートできる。単密度発泡体は、コラーゲンか ら作られ、細胞が含まれていない場合は、例えば０．１％のコラゲナーゼで即座 に消化できる。水化された場合、研究用生成物の標準的な単密度発泡体の高さは 、典型的には約１ｍｍである。表１では、単密度発泡体生成物の仕様、例えば大 き さ、コラーゲン含有量などの例を示す。 表１ 単密度発泡体生成物の仕様 本明細書では、「二倍密度発泡体」という用語は、次に掲げる特質のうち少な くとも２つを有する生重合体発泡体を指す。その生重合体発泡体は、１）体積寸 法ｘ、ｙおよびｚを持つミクロコンパートメントを有し、ここでｘは長さ、ｙは 幅、ｚは高さであり、このうちの二つは殆ど等しく、三つ目のものは少なくても 約１０分の１に減少したり、成いは縮小され、またより好適には、単密度発泡体 の同寸法に比べて約２０分の１以上に縮小される。その範囲は約１μｍから約３ ００μｍであり、好適には約２０μｍから約２００μｍの範囲である。更に好適 には、約４０μｍから約１５０μｍの範囲であり、最も好適には、約５０μｍか ら約１００μｍの範囲である、２）約１０μｍ未満の平均的な壁体の厚さをもつ ミクロコンパートメントを有する、３）生重合体繊維および／またはフィラメン トを含む壁体もつミクロコンパートメントを有する、４）水性溶液で物理的に安 定的である、５）生体組織に無毒性である、そして６）細胞が定着および成長す る基質 として働く。コラーゲンから作られた二倍密度発泡体が有するコラゲナーゼの消 化に対する耐性は、コラーゲンから作られた単密度発泡体よりも、例えば約３乃 至５倍以上大きく、０．１％のコラゲナーゼに対する耐性は、単密度発泡体より 大きくなる。コラーゲンから作られた二倍密度発泡体の単位体積当たりのコラー ゲン密度もまた、単密度発泡体の単位体積当たりのコラーゲン含有率より大きい 。水化された場合、二倍密度発泡体の高さは、典型的には約０．２ｍｍ乃至約０ ．４ｍｍである。二倍密度発泡体のどちらの表面も、シートを形成する上皮細胞 、内皮細胞および中皮細胞を培養するのに適当な基質となる。間充織細胞もまた 二倍密度発泡体上に播種できる。二倍密度発泡体は、単密度発泡体と同じ大きさ にもまた同じ形にも、例えばどんな形にでもまたどんな組み合わせでも作れ、ま た単密度発泡体と同様に、生重合体メッシュあるいは多層竪穴プレートの挿入物 に結合できる。本発明による単密度および二倍密度発泡体の両方の表面で成長し た細胞は、三次元的組織の細胞に特徴的な形態と構造を有し、正常な細胞間的な 関係性、即ち、細胞が由来したり、或いは入手したりする対象の組織細胞に特徴 的な形態と構造ににた細胞間的な関係性を形成できる。 本発明の単密度発泡体は、生重合体溶液を作成し、その溶液を凍結乾燥させて 生重合体発泡体を形成し、次に生重合体発泡体を架橋することで形成できる。別 の実施例では、単密度生重合体発泡体は、凍結乾燥の段階に先立って架橋を施す 事で形成できる。凍結乾燥の段階は、生重合体溶液を発泡体に変換する、即ち、 生重合体分子および／またはミクロコンパートメント壁体中に散在させたフィラ メントを含んだ、連通したミクロコンパートメントの網状組織にする。その発泡 体は架橋されると、水性溶液中で、物理的に安定し、また溶解しなくなる。一好 適実施例では、生重合体溶液は、凍結乾燥される前に重合されて、生重合体格子 を形成する。本明細書で、生重合体格子とは、内部に液体を閉じ込める生重合体 フィラメントの網状組織のことである。生重合体フィラメントは、ナノメートル 単位の大きさの重合された生重合体分子である。例えば、生重合体がコラーゲン であれば、そのコラーゲンは自己集合の過程によって重合して、ナノメートル単 位の大きさのフィラメントになる。 単密度発泡体より大きな引張力を有する二倍密度発泡体は、単密度発泡体を更 に重合する事で作り出せる。単密度発泡体は凍結乾燥してから、無菌の水性緩衝 液などで水化できる。水化された単密度発泡体は、更に成形して選択された形状 をもつようにする場合は、例えば、それを所望の形状の内部で、表面であるいは 周囲で、成形あるいは形成したり、例えば、マンドレルの周囲に沿って成形して 管状にしたり、或いは選択された寸法、例えば０．５ｍｍのスペーサーで分離さ せたブロックとスクリーンの間に挟み込む事もできる。成形され水化された単密 度発泡体および平板な水化された単密度発泡体は、その後、無菌状態で約３７℃ から４０℃未満の温度で気乾などで乾燥される。約３７℃をこえる温度で、発泡 体の生重合体は変性し始める。得られた二倍密度発泡体は、上述のように０．５ ｍｍのスペーサーを用いて挟み込むと、例えば約０．２ｍｍというように、ある 選択された厚みをもつようになり、又、それは繊維、壁体および二次元的形状を 保持するが、単密度発泡体のミクロコンパートメントの大きさは保持できない。 二倍密度発泡体は、乾燥状態では硬直しており、湿った状態では柔軟である。二 倍密度発泡体は、単密度発泡体よりもはるかに引き裂きおよび酵素による消化に 対して耐性がある。単密度発泡体とは異なり、二倍密度発泡体は、上皮細胞およ び内皮細胞などの、表面上で正常に成長する細胞のための基質として好適な緊密 な基質である。例えば、二倍密度発泡体は、管状に形成されて血管あるいは管の 再生に使われ、或いはシートにされて縫合糸で広い部分に固定される。または、 二倍密度発泡体には、線維芽細胞、筋細胞、軟骨細胞などの間充織細胞を播種で きる。 二倍密度発泡体は、生重合体としてコラーゲンを用いて作られた場合、その増 大したコラゲナーゼ耐性によって、人工歯周器官として用いられて、例えば歯周 の再生を害する上皮細胞などのなんらかの細胞が内方成長するのを妨げるバリア を形成し、一方では、単密度生重合体の形で、最終的には発泡体生成物を再形成 し又それと置き換わる適切な歯周細胞が成長するための基質となる。更に、単密 度生重合体発泡体および二倍密度生重合体発泡体は、それぞれの発泡体の特質が 、選択された細胞類型の成長を助ける、例えば誘引する、環境を作り出す場合に は、それらの発泡体を結合させて種々の複合生重合体生成物を形成できる。例え ば、複合発泡体を作って皮膚同等物あるいは皮膚包帯として用いる場合に、ケラ チン 合成細胞を使って二倍密度発泡体に播種でき、一方では皮膚の線維芽細胞を、単 密度発泡体に播種できる。 生重合体溶液（これは生重合体を、例えばそのｐＨを操作して溶解させること などで、可溶性にするような方法で形成できる）は、当業で周知の重合法を用い て重合できる。例えば、コラーゲンなどの生重合体は、アンモニウム蒸気に晒し たり、或いはベースを加える事などでその生重合体のｐＨを操作して重合し、生 重合体格子を形成できる。重合率は、温度に比例し、したがってコラーゲン溶液 の温度を調節する事で制御できる。 生重合体が重合されて生重合体格子が形成された後に、その格子が凍結乾燥お よび／または架橋される。典型的には、これらの段階の順番は、用いられる架橋 法によって異なる。例えば、リシルオキシダーゼを用いてコラーゲンの架橋をし たり、或いはアルデヒド架橋法を用いるなど、架橋法が液相法であれば、架橋の 段階は凍結乾燥に先立って行われる。別の方法としては、架橋法が、紫外線を用 いたりする固相法であれば、架橋の段階は凍結乾燥の後に行われる。生重合体の 架橋は、当業で周知の架橋法を用いて達成できる。例えば、紫外線に晒したり、 或いはカルボジイミド、グルタルアルデヒド、アセトアルデヒド、ホルムアルデ ヒド、リボースなどの化学的架橋作用物質で処理する事で生重合体を架橋できる 。生重合体はまた、脱水素熱架橋法で架橋できる。 一実施例では、凍結乾燥の前に、選択された補強材を生重合体溶液に加える事 ができる。このような補強材には、例えば織物の方法で作られた、生重合体の繊 維、織られたり編まれたりした糸、および／または不織の生地などの生地がある 。コラーゲン糸などの生重合体の糸は、生重合体を凝固浴槽中の溶液に押出し、 次に生重合体をエタノール、アセトン、あるいは別の脱水溶液を含む浴槽に移し 替える事で形成できる。代替的には、真空乾燥を行う事で生重合体の糸を脱水で きる。生重合体の糸はその後で、例えば本明細書で述べられた方法で架橋できる 。コラーゲン繊維などの生重合体繊維を紡いだり処理したりする装置の例は、１ ９９４年１１月２日付けで出願された米国出願番号第０８／３３３，４１４で説 明されており、その内容は本明細書にその全体が言及して組み入れられている。 生重合体の糸は、例えば、多数のローラの上を移動する糸を引っ張り、それを伸 ば して乾燥させた後、糸巻きに巻き取るなどして、乾燥され、巻き取られる。それ らの糸は、織ったり編んだりして、本明細書に説明された用途のために、生地あ るいは他の複雑な形状あるいは構造体にできる。不織の生重合体の生地などの生 重合体の生地は、典型的には、選択された大きさ及び密度を有する絡み合った生 重合体繊維のマットである。典型的には、不織の生重合体の生地は、乾いた生重 合体繊維を、一本一本の繊維要素の長さに等しい円周を有するドラムに巻き付け る事で作られる。生地を作るのに必要な繊維の本数がドラムに巻き取られた繊維 の巻き数に等しくなるまで巻き取りが続けられる。それから、巻かれた繊維をド ラムの軸と平行な方向に端から端へ切断し、それらをドラムから取り除く。その 繊維は、前段で架橋されていなければ、その後架橋される。更にまた、その繊維 は一定量のリン酸エステルの緩衝溶液中に、そのｐＨが減少して柔らかくなるま で一定時間拡散される。その繊維は一定量の水の中に移されて機械的に攪拌され て繊維の撚子の絡み合いを作る。その絡み合った繊維は、均一な密度のマット状 に収集スクリーンを被うまで、水からそのスクリーン上へ振るい落とされる。マ ットは次に、そのスクリーン上で乾燥されるか、或いは別の表面、スクリーンあ るいは細胞培養装置に移された後で乾燥される。所望であれば、不織のマットは 、乾燥後、切ったり打ち抜いたりしてもっと小さい形にできる。 一実施例では、生重合体がコラーゲンの楊合、そのコラーゲンは、架橋するた めにそれを下準備するリシルオキシダーゼなどの酵素で処理できる。リシルオキ シダーゼは、リシンのε−アミノ基をアルデヒドに変換する。そのリシルオキシ ダーゼは、例えば、子ウシの大動脈、ヒトの胎盤、ニワトリの胚の骨端軟骨、ブ タの皮膚(Shackleton，D.R．and Hulmes，D.J.S．(1990)Biochem．J．266:917-9 19を参照すること。)、およびブタの胚の幾つかの部位を含む様々な供給源から 精製される。このアルデヒドは、他のε−アミノ基あるいは他のコラーゲン分子 の別のアルデヒドに自発的に結合する反応性と官能基で、不可逆性の共有結合形 の架橋を形成する。その結果コラーゲンは不可溶性になる。リシルオキシダーゼ は、リシンのアルデヒド変換を許容するような条件下でコラーゲン溶液に加えら れる。その後、リシルオキシダーゼはコラーゲン溶液から取り除かれて、本明細 書に説明されているように処理され、その間に自発的な架橋が形成される。例え ば、重 合および凍結乾燥の段階の間などコラーゲン発泡体を処理している間に、単位体 積当たりのコラーゲンの濃度が増大するにつれて架橋が自発的に形成される。リ シルオキシダーゼを媒介した架橋は強固でかつ不可逆的であり、またコラーゲン に自然に見られる結合である。この方法で架橋されたコラーゲンは不可溶性であ り、また組織の再生中に、特定の酵素の作用だけに影響を受ける。リシルオキシ ダーゼはまた、紡いだ繊維、ゲルなどばかりでなく発泡体および発泡体組成物と して用いるためのコラーゲンを架橋するためにも使用できる。 生重合体はまた凍結乾燥して発泡体を形成できる。一実施例では、その凍結段階 は、米国特許番号第４，５３１，３７３（その内容は言及してここにに編入され る）で説明されている方法に従って実施される制御凍結段階である。凍結乾燥の サイクルには、典型的には凍結、瀉出および乾燥段階を含む。本発明による生重 合体発泡体の形成に適した凍結温度は、溶液あるいは生重合体格子中の生重合体 濃度によって決まる。したがって、コラーゲン濃度が約５ｍｇ／ｍｌのコラーゲ ン格子では、その凍結温度は典型的にはマイナス２６℃以下である。コラーゲン 格子は、約１時間の間この温度に晒される。その後温度が徐々に上がるにつれて コラーゲン格子は減圧される。 発泡体の中の組織形成を阻止するために、したがってより大きな発泡体を可能 にするために、不凍ポリペプチド（ＡＦＰ）或いは不凍糖タンパク質（ＡＦＧＰ ）を、凍結段階の前あるいは最中に生重合体溶液に加える事ができる。ＡＦＰの 例には、ＡＦＰＩ、II及びIII型に属するＡＦＰがある。様々な類型のＡＦＰに 関する詳細な説明には、米国特許番号第５，３５８，９３１、ＷＯ９２／１２７ ２２およびＰＴＣ公報ＷＯ９１／１０３６１などを参照。尚、これらの内容は言 及して本明細書に組み入れられている。これらのポリペプチドおよび糖タンパク 質は、生重合体溶液の凍結時に大きな氷の結晶ができるのを妨げ、また乾燥時の 再結晶化による結晶の形成も防ぐ。大きな氷の結晶は、形成される発泡体にひび 割れを生じさせ、それによって発泡体の架橋がうまく行かなかったりまた裂けた りする原因になる。ＡＦＰおよびＡＦＧＰを使えば、結合したチャネルを有する 細孔構造が形成でき、したがって発泡体の様々な部分を凝集できるようになる。 この特質は発泡体の品質を高め、また大きな発泡体の形成を可能にする。例えば 、ＡＦ Ｐ或いはＡＦＰの組み合わせが、約０．２から０．５ｍｇ／ｍｌ（約１２４μＭ ）のような高濃度で生重合体と一緒に凍結乾燥された場合、それは通常の発泡体 細孔を劇的に減らし、その発泡体はまるで緊密に束ねた長い繊維のようになる。 凍結段階でＡＦＰを用いた発泡体は、例えば組織に沿って成長することで、特定 の細胞の過程を統制する移植片として使用できる。 一好適実施例では、生重合体溶液はコラーゲン溶液である。この溶液に用いられ るコラーゲンは、出発原料から加塩抽出法、酸抽出法および／またはペプシン抽 出法で作成する事ができる。一好適実施例では、この溶液に用いられるコラーゲ ンは、コラーゲンを含む同じ出発原料から二つの形態のコラーゲンを一連の手順 で精製する事で作成できる。まず、完全なコラーゲンが出発原料から酸抽出され る。次いで、平頭のコラーゲン、即ちテロペプチドが螺旋部分だけを残して切り 取られたコラーゲンが、ある酸性ｐＨで機能性を有する酵素、例えばペプシンな どの酵素による酵素抽出法を用いて出発原料から抽出される。抽出されたコラー ゲンはその後、例えば、塩化ナトリウムで沈殿させたり、また酸性ｐＨを有する 媒体のなかでコラーゲンを可溶性にする事で、コラーゲン溶液を作成できる。 本発明の単一および二倍密度生重合体発泡体は、それらを結合して複合生重合 体発泡体を形成する事ができる。したがって、本発明の複合生重合体発泡体は、 少なくとも一層の単密度生重合体発泡体と少なくとも一層の二倍密度生重合体発 泡体を含む。複合発泡体中のこれらの発泡体の層のどちらか一方或いは両者は、 試験管内あるいは生体内でその複合発泡体を用いる前に、細胞で条件づけをして もよい。複合生重合体発泡体の典型的な形成あるいは作成は、二倍密度生重合体 発泡体を準備し、上述の説明どうりに作成されるその二倍密度生重合体発泡体を 水化し、次に生重合体溶液をその二倍密度発泡体に加えて行う。二倍密度生重合 体発泡体は、生重合体溶液と一緒に凍結乾燥されて複合生重合体発泡体を形成す る。 本発明の生重合体発泡体および細胞外基質微粒子を含む生物学的適合構成体も また、本明細書で特別に検討される。生重合体溶液中で散在あるいは懸濁させた 細胞外基質微粒子もまた、本発明の生重合体発泡体および発泡体構成物の表面上 および／または内部に塗布でき、それによって細胞外基質微粒子を含む発泡体が 形成できる。本明細書で使われているように、「細胞外基質微粒子」という用語 は、以前は生きた細胞を含む組織源であり、しかし処理が施こされて、それらの 細胞は除去されているが、例えば細胞の成長、形態発生および分化に必要な成長 因子などの非細胞性の細胞外基質因子は保持している組織に由来する、細胞外基 質の断片を指す。移植片の組織を作成するための細胞外基質微粒子を形成する方 法は、１９９２年８月７日に出願された米国特許出願番号第０７／９２６，８８ ５、１９９４年９月６日に出願された米国特許出願番号第０８／３０２，０８７ および１９９５年６月６日に出願された米国特許出願番号第０８／４７１，５３ ５において開示されている。米国特許出願番号第０７／９２６，８８５、第０８ ／３０２，０８７および第０８／４７１，５３５の開示内容は、言及して本明細 書に組み入れられている。 細胞外基質微粒子の作成方法は、例えば結合組織源などの生きている細胞を含 んでいる組織源を凍結し、それによってそれらの生きている細胞を破裂させて、 例えば細胞形質および細胞核の構成要素からなる細胞残存物を作成する。その組 織は次に、細砕、洗浄およびふるい分けなどの処理が施されて、細胞の成長、体 内移行、分化および形態発生に必要な因子を含む細胞外基質を除去することなく 、細胞形質および細胞核の構成要素が取り除かれる。その細胞外基質は、凍結乾 燥されまた断片化されて、例えば低温圧搾されて決められた大きさの微粒子がで きるようにし、細胞外基質微粒子ができる。 その細胞外基質微粒子に細胞外基質タンパク質を含めてもよい。例えば、皮膚 から得られた細胞外基質微粒子には、形質転換因子β１、血小板から得られた成 長因子、原線維芽細胞成長因子、表皮成長因子、シンデカン−１、デコリン、フ ィブロネクチン、ラミニン、テナシンおよび皮膚スルフェートなどがある。肺か ら得られる細胞外基質微粒子には、シンデカン−１、フィブロネクチン、ラミニ ンおよびテナシンなどがある。細胞外基質微粒子にはまた、例えば組織の発達に 必要な成長因子のシトキンを含めてもよい。「シトキン」という呼ばれるものに は、成長因子、インターロイキン、インターフェロンおよびコロニー刺激因子が 含まれるが、これらだけに限定されない。これらの因子は、細胞分裂、形態発生 および分化で特徴づけられる組織発達の様々な段階にある、正常な組織に見られ るも のである。これらの因子の中には、生体内での組織修復に必要な信号の役目を果 たす刺激分子がある。これらのシトキンは、移植片を、取替えられるべき組織の 代わりに機能する代用物に変換させる事ができる。この変換は、組織細胞を類似 の近接している組織から、例えば、血液および血球芽細胞の貯蔵器官から動員す る事で起こる。細胞は、生体に吸収可能な人工器官に付着し、またその人工器官 を代替組織に作り変えることができる。 細胞成長に必要な成長因子は、細胞外基質微粒子の構成要素に付着する。上記 構成要素はたんぱく質（例えば、コラーゲン及びエラスチン）糖たんぱく質、プ ロテオグリカン、並びにグリコサミノグリカンを包含する。上記成長因子は、も ともと細胞により成生され分泌されるが、上記細胞外基質微粒子と結合し、多く の方法で細胞活動を制御する。これらの因子は、表皮成長因子、線維芽細胞成長 因子(アルカリ性と酸性の)、インシュリン様成長因子、神経成長因子、マスト細 胞刺激因子、形質転換成長因子─β系統群、血小板に由来する成長因子、散乱因 子、肝実質細胞成長因子と、シェヴァン細胞成長因子を包含するが、上記に限定 されない。Adam等とKreis等は(Regulation of Development and Differentiatio n by the Extracellular Matrlx"Development Vol．117,p．1183-1198（1993） およびKreis et al.editors of the book entitled"Guidebook to the Extracel lular Matrix and Adhesion Protelns,"Oxford Unlversity Press(1993)を参照) は分化と発達を制御する微小構造を記述している。さらに、Adam等は、成長因子 と細胞外基質微粒子たんぱく質との関連する例を説明している。すなわち、細胞 外基質微粒子は微環境において重要な部分であり、成長因子と協調して、分化と 発達を制御する中心的役割をはたす。Adams等とKreis等の教示は、言及してここ に編入したものとする。 細胞外基質微粒子の粒子は、特定の組織から得られる。この粒子は、２種類の 情報特性を備えている。第１は分子的多様性であり、第２は微小構造であり、両 者は微粒子の組織標本の中に保存できる。細胞外基質微粒子の異なった分子間で の好ましい結合を、微粒子を作製しても保存することもできる。 細胞外基質微粒子は指示的役割をはたし、つまりそれに取り囲まれているか、成 いはその上で組織されている細胞の活動を導く。細胞分割、形態生成、分化、 組織構築および再生のための細胞プログラムの実行は、細胞外基質微粒子からの 信号によって決まるため、コラーゲン発泡体のような３次元の骨組みは、実際の 基質成分により強化され、特定の組織からの遺伝細胞外基質と細胞外基質の分子 多様性と微小構造を示す。 発泡体と発泡体構成との表面上にさらに細胞及び分子結合部位を提供するため に、(例えば架橋手段の結果として損傷した結合部位を備えるために)、塗布段階 を先に行うか、コラーゲン発泡体への細胞外基質微粒子の付加と同時に行うこと ができる。加えて人工微小構造は、一般的に約５から５００μmの幅があり、コ ラーゲンのような基質重合体から構成され、他のたんぱく質、プロテオグリカン 、グリコサミノグリカン、細胞外基質酵素、サイトカイン(成長因子を含む)、及 び配糖体と結合して湿潤又は乾燥粒子の形状で生成され、塗布溶液でコラーゲン 発泡体の表面に付加できる。選択された成分は化学的に又は静電気的に生体高分 子に結合できるし、微粒子格子の中、又は脱水格子に包含できる。したがって、 この発明はコラーゲンで塗布された発泡体と細胞外基質微粒子の粒子で塗布され た発泡体を作製する方法にも関する。これらの方法は、ここで述べた様な選択さ れた型の生重合体発泡体を形成する段階と、コラーゲン溶液または細胞外基質微 粒子溶液を、凍結乾燥発泡体へ付加して、コラーゲンを塗付した生重合体発泡体 又は細胞外基質基質粒子を塗付した生重合体発泡体を形成する段階を一般的には 含む。塗付された発泡体は、更に凍結乾燥できる。一実施例においては、、コラ ーゲン溶液は細胞外基質微粒子の粒子を包含する。 例えば研究用モデルシステムの確立などのため、この発明における発泡体と発 泡体構成は、試験管内と生体内での細胞成長のための基質として使用できる、。 例えばある実施例では、発泡体と発泡体構成には、癌を含む疾患状態の研究のた めに異常細胞と共に移植できる。その他の実施例では、発泡体と発泡体構成を、 発泡体内又は発泡体上で培養した癌細胞を殺す能力のある作用物質を選択して、 化学療法の方針を決定するための診断上の試験モデルとして使用できる。更にそ の他の実施例では、発泡体と発泡体構成は、発泡体内又は発泡体上の細胞が晒さ れた様々な物質の毒性の試験に使用できる。 本発明の発泡体および発泡体組成物を移植片として用いて、受容者（例えば、 ヒトなどの哺乳類受容者）に導入されたり、移植もできる。例えば、この発泡体 および発泡体組成物を移植片として使ったり、例えば以下の種類の組織を再構築 するためにも用いられる。これら組織種類とは、神経組織、皮膚、維管束組織、 筋肉組織、骨、軟骨、腱、および靭帯などの結合組織、肝臓組織、腎臓組織、膵 臓組織である。これらの発泡体および発泡体組成物に播種される組織細胞は、ヒ トなどの哺乳類から得られる。組織細胞は、まず細胞を少量の組織培養基中に懸 濁させて、発泡体および発泡体組成物に送りこまれる。細胞を含んだ組織培養基 を、次に、発泡体又は発泡体組成物に滴下して付加させる。または、発泡体また は発泡体組成物は、組織培養基と懸濁した細胞を含んだ容器であって、細胞を含 んだ組織培養基が発泡体または発泡体組成物全体に分散するように振り動かす容 器内に置くことが出来る。別の実施例では、組織細胞を、低い濃度で、約４℃か ら約１０℃の温度で、約ｐＨ７．０で、生重合体溶液（例えばコラーゲン溶液） 中に懸濁できる。その後、細胞を含んだ溶液は、発泡体または発泡体組成物全体 に送りこまれる。発泡体が３７℃まで温まると、生重合体溶液（例えばコラーゲ ン溶液）は、発泡体中でゲルを形成する。本明細書では、「ゲル」という用語は 、生重合体フィラメントの網状組織またはメッシュと、この網状組織またはメッ シュ内部に閉じ込められた水溶液との組合せを指す。細胞を本発明の発泡体また は発泡体組成物全体に送りこむ手段として使用されるアルギン酸ゲルは、室温お よび中性のｐＨで重合を引き起こすカルシウムを加えて、生成できる。次に、選 択した上皮細胞、内皮細胞または中皮細胞を、ゲルを充填した発泡体または発泡 体組成物の表面で培養できる。 本発明の発泡体および発泡体組成物は、やけど、あざ、皮膚潰瘍や外傷ようの 皮膚包帯として用いることができる。例えば、単密度生重合体（コラーゲンのよ うな）発泡体を包含する複合生重合体発泡体は、二倍密度生重合体発泡体の表面 に接着させて、皮膚および表皮細胞条件付けなどの細胞条件付けを更に含むこと ができる全層皮膚包帯となる。複合生重合体発泡体は、まず二倍密度生重合体発 泡体を円盤かその他の形状を打ちぬけるシートとして作製するか、所望の形状と 寸法の型で作製して、準備する。この二倍密度生重合体発泡体は、その後、二倍 密度生重合体発泡体と同一の形状および寸法の型の底部に置き、例えば水性緩衝 材（ミリＱ水（商標）など）又はコラーゲン溶液などの生重合体で水化する。こ の型に、単密度生重合体の必要な高さまでコラーゲンなどの液体生重合体を満た す。そして、これをここで述べた方法に従って凍結乾燥して、皮膚包帯を作製す る。一実施例では、単密度生重合体層は、例えばヒトの皮膚線維芽細胞(例えば ヒトの自原性皮膚細胞、つまり、皮膚包帯の宿主の皮膚細胞)、例えばヒトの同 種皮膚細胞(つまり移植片宿主の遺伝子型とは異なる遺伝子型のドナーの皮膚細 胞)のような皮膚線維芽細胞を播種して、少なくとも１日以上（例えば約４日か ら約７日）培養する。二倍密度生重合体発泡体層には、例えばヒトの表皮細胞の ような表皮細胞を播種する。表皮細胞は、バリア性のある角質層が形成されるま で、例えば約１４日の間、分化させる。皮膚細胞が存在することで、真皮の完全 分化が可能になる。この発達期間により、細胞外基質生成物（例えば皮膚線維芽 細胞が分泌した細胞外基質生成物）を備えた発泡体製品の皮膚および表皮組織が 強化される。次に、複合生重合体発泡体は、例えば凍結乾燥などで処理して、細 胞を除去する。得られた細胞条件付けした複合生重合体発泡体は、全層皮膚の特 性を備え、皮膚包帯として、例えば火傷、あざ、皮膚潰瘍および外傷を治療する のに使用できる。この製品は、第３度の火傷のような火傷の場合は、皮膚包帯と して皮膚に当てると、体内水分を失うのを防ぎ、皮膚に傷を負った受容者の近く に医療従事者が居ないような緊急事態における使用には都合が良い。皮膚移植片 を必要とする受容者に当てられると、この発泡体製品は細胞条件付けしたものも してないものも、宿主（移植片受容者）の線維芽細胞とケラチノサイトが進出す る。包帯の宿主（受容者）からの線維芽細胞および毛細血管内皮は、複合生重合 体発泡体に移行できる。この複合生重合体発泡体は、発泡体上に播種されたり、 移植されたケラチノサイトに基質を提供し、よってケラチノサイトは近接する皮 膚やその下から（例えば、皮膚損傷後も残る毛包）発泡体表面や内部に広がるこ とができる。また、この発泡体製品は、培養した自原性または同種ケラチノサイ ト用の基質としても役立つ。これらの凍結乾燥複合生重合体発泡体は、選択した 細胞型を播種することが出来、半減期が長く、よって長期にわたり保存が利く。 別の実施例においては、二倍密度発泡体は皮膚包帯として使用できる。この二 倍密度発泡体は、まず始めに細胞培養基中で皮膚細胞を播種される(例えば１ｍ ｇ／ｍｌのコラーゲンを用いても良く、用いなくても良い)。数日以後、表皮細 胞（例えばケラチノサイト）は、皮膚細胞がすでに播種された発泡体の表面上へ 播種される。この二倍密度発泡体内部及び表面の細胞に、試験管内で分離し、分 化し、皮膚様の器官を形成させる。この発泡体それから数週後に試験管内で凍結 乾燥される。得られる発泡体骨組は、微生物のコラゲナーゼによる破壊に抵抗性 があり、よく発達した角皮層を有する。 ここで記載されているこれら発泡体や、発泡体組成物や、生重合体の他の発泡 体は、細胞で条件付けできる(例えば、細胞に接触させたり曝露したりする)。例 えば、これら発泡体や、発泡体組成物や、生重合体の他の発泡体は、単一又は複 数の選択した細胞型を播種できる。こうした細胞は、その後成長させ、増殖させ 、例えば細胞外基質因子などの細胞成長、分化、形態形成を支える因子を分泌さ せられる。ここで記載されている発泡体、発泡体組成物および他の生重合体発泡 体の細胞調整には、少なくとも２つの機能がある。第一に、細胞は発泡体の化学 調整を提供する。すなわち、細胞は、細胞の発泡体の中や、発泡体組成物の中や 、生重合体発泡体中への内殖をひきつけ、発泡体内部での細胞の成長と分化を支 える細胞外基質組成物を分泌する。第２に、細胞は発泡体、発泡体組成物および 生重合体発泡体の機械調整を提供する。この調整とは、細胞は発泡体、発泡体組 成物および生重合体発泡体を再成形して、発泡体が取って代わったり、再構成す る組織内の細胞型に適した物理的構造を提供する骨組みを形成することである( 例えば、本明細書で述べた様に、細胞は、皮膚の様々な細胞層に自己を配列する )。生細胞を含む発泡体、発泡体組成物および生重合体発泡体を宿主に導入でき る。あるいは、生細胞を含む発泡体、発泡体組成物および生重合体発泡体は、細 胞を殺すために更に処理（例えば、凍結乾燥してから宿主に導入する）してもよ い。 本発明の発泡体および発泡体組成物は、管形状の人工血管に形成し、また、送 達後にゲル化する中和コラーゲン溶液として送達される平滑筋細胞を内部的に播 種できる。これは外部的には、外膜線維芽細胞を用いて、更に内皮細胞を用いて 管腔表面にも送達できる。例えば、人工血管または血管ステントは、マンドリル の周囲に二倍密度生重合体発泡体層を注型することによって形成できる。この人 工血管または血管ステントは、マンドリルを管に、マンドリルの外面と管の内壁 の間に空間を設けつつ封止することによって形成される。生重合体がコラーゲン である場合は、管はその後、コラーゲンで下準備したリシルオキシダーゼで満た して、コラーゲンの処理の間に架橋を実行する。コラーゲンを塗布したマンドリ ルは、管理乾燥方式に従って凍結乾燥機のシェルフで凍結乾燥する。あるいは、 コラーゲンまたは異なる生重合体は、紫外線放射を使用して架橋可能である。発 泡体は、真空下で水和させられ、二倍密度発泡体を形成するために乾燥させても よい。乾燥の後、二倍密度発泡体は、人工血管として用いるため管形状となり、 マンドリルから取り外す。二倍密度発泡体は、架橋した生重合体糸（例えば巻き 付けたコラーゲン糸(補強材料)）を二倍密度発泡体の層に巻き付けて、単密度生 重合体発泡体または第二の二倍密度生重合体発泡体を巻き付けた糸の上に注型し て、補強できる。二層の二倍密度発泡体は、その後、巻き付けた生重合体糸が形 成される管状発泡体に統合されるように融着させる。所望なら、内側平滑筋細胞 および内皮細胞は、管状発泡体のabluminalおよび管腔表面にそれぞれ送達され る。外膜線維芽細胞の層を、ここで、内側平滑筋細胞に加えても良い。管状発泡 体は試験管内で処理して、成熟した血管構成を有する導管を得ることができる。 例えば、人工血管やステントとして用いるための成熟した血管を形成するように 、これらの細胞層を備えた管状の発泡体は、徐々に量を増加させる選択した液体 (例えば、グリセロールおよび培養基)の拍動流に晒すことも例えば出来る。 骨、軟骨、腱および靭帯を再建するためには、本発明の発泡体および発泡体組 成物は適当な細胞（例えば骨細胞、軟骨細胞、腱および靭帯線維細胞のような結 合組織細胞）を播種でき、また、損害した結合組織を修復するため成形できる。 一実施例においては、本発明の発泡体は、細胞外基質微粒子の有無にかかわらず 、リン酸カルシウムセメント(例えば、６４％のβ３カルシウムリン酸塩、１６ ％の第１カルシウムリン酸塩、１５％の硫酸カルシウム半水化物および５％のカ ルシウム・ピロリン酸塩を含むβ３リン酸カルシウムセメント(Mirtichi et al ．(1989)Biomaterials 10:634-638を参照すること。)と混合して、整形移植片或 いは義歯として使用する補強セメントを形成できる。骨の有機性分の殆どの部分 を構成するコラーゲンの派生物であるゼラチンを、リン酸カルシウムセメントに 添加物として加えることも出来る。他の実施例においては、本発明の生重合体発 泡 体はセメント表面に注型され、上述の様に処理される。あるいは、ここで記載さ れている細胞外基質微粒子に、リン酸カルシウムセメントを混合することができ 、整形移植片または義歯として使用できる。生重合体発泡体および／または細胞 外基質微粒子は、リン酸カルシウムセメントによる骨細胞侵入を増大する。それ に加えて、細胞外基質微粒子に存在する成長因子は、骨細胞が増殖し、セメント に取って代る速度を増やす分裂促進刺激を提供する。例えば、いろいろな組織か らの細胞外基質微粒子は、培養挿入物に加えられると、細胞外基質微粒子のない 培養挿入物と比較すると、様々な異なる細胞型において有糸分裂を刺激したこと が発見されている。指示組織原点から、１ｍｇの細胞外基質微粒子を、無漿液培 養基中の指示細胞型をふくむ培養挿入物に加えた実験の結果を示す表２を参照の こと。５日後に、細胞外基質微粒子を含んだ培養株の細胞番号および細胞外基質 微粒子のない制御培養株の細胞番号を測定した。 表２ 選択された細胞型に対する細胞外基質微粒子の分裂促進作用 例えば、編み上げファイバなどの生重合体ファイバや生重合体生地と同様に生 重合体溶液、発泡体および／または細胞外基質微粒子は、適切な割合のセメント を混ぜ合わせられる場合は少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくと も約４０％および好ましくは少なくとも、少なくとも約５０％は、カルシウムリ ン酸塩を基材としたセメントの強度を増やすことができる。例えば、液体コラー ゲンが、８ｇのセメントに対して５ｍｇのコラーゲンの割合で付加される場合は 、または細胞外基質微粒子が、８ｇのセメントに対して０．１ｇの細胞外基質微 粒子の割合で付加される場合は、セメントが壊れるまでのポンドで測定されたセ メント強度は、コラーゲンまたは細胞外基質微粒子が無い楊合のセメント強度に 比べて５０％増加する。 軟骨移植片は、本発明の発泡体または発泡体組成物を使用して製造できる移植 片の追加例である。一実施例において、軟骨移植片が、生重合体（例えばコラー ゲン溶液）をリン酸カルシウムセメントを用いて結合し、更にその混合物をセメ ントに凝固（乾燥はさせずに）させて生成される。セメントがまだ可塑性があり 展性がある内に、生重合体溶液を乾いているが凝固していないセメントでないヤ ットに注型され、凍結乾燥されて、セメント質の基板の一面に埋め込まれた一層 の単一又は二倍密度生重合体発泡体の層を形成する。セメントが凝固して、乾い たあと、生重合体発泡体に軟骨細胞が播種される。別の実施例においては、軟骨 移植片の製造は、生重合体（例えばコラーゲン、溶液）をリン酸カルシウムセメ ントと結合して、この混合物をセメントになるように凝固させて乾燥させて行う 。凝固して乾燥したセメントは、再水和して、生重合体溶液で飽和させられる。 生重合体溶液を、セメント質の基質と生重合体溶液の集成層に注型され、その後 、セメント質の基板が凍結乾燥されて、セメント質の基板の一面に埋め込まれた 一層の単一又は二倍密度生重合体発泡体を形成する。生重合体発泡体には、それ から例えば人間の軟骨細胞などのような軟骨細胞（例えば、発泡体１ミリリット ルに付き５ｘ１０⁴乃至５ｘ１０⁶の細胞数で）を播種できる。いずれの実施例に おいても、軟骨細胞は分化と、軟骨組織に一般的な基質の生成とが可能となり、 関節関係上に置く。一般的には、軟骨移植片の関節関係は、関節軟骨を生じて発 達させる機械的装置を用いて、成立させる。この種の機械装置は、軟骨細胞を含 む生重合体発泡体を、関節液と特性が類似し且つ、ヒアルロン酸（例えば血漿の 透析液体）を含んだ液体の存在下で、第二表面（例えば、軟骨細胞を含んだ第二 の生重合体発泡体）と静かに接触させる。こうすればそれは、攪拌すると液化す る が放置するとゲルに戻るのような例えばチキソトロピー液になる。その後、軟骨 細胞と第二表面とを含んだ生重合体発泡体は、回転されるか、互いに摺動されて 、軟骨組織が生体内で受けるような力を模倣した剪断力と圧縮力を生成する。得 られる軟骨組織は、通常の関節軟骨組織の特性（例えば通常の軟骨組織がさらさ れる力に耐える能力および構成）を有する。 本発明の生重合体のマルチフィラメント発泡体としての靭帯移植片は、本発明 の発泡体および発泡体組成物によって性能を高めて、細胞播種を促進できる。例 えば、連続靭帯マルチフィラメント構成を細胞外基質微粒子を加えるか加えない で製造して、選択した特性を備えることができる。その後、靭帯細胞は発泡体ケ ースに埋め込み可能な靭帯に送達できる。靭帯の端部は、切断してリン酸カルシ ウムセメントに埋め込み可能である。その後、靭帯は管状の組織成熟チャンバに 取り付けできる。靭帯細胞が靭帯に接着した後で、靭帯は、応力が加わるように 循環軸方向伸長を受けるが、これは靭帯が成熟するに従って強さを増大させる。 成熟した生重合体靭帯は、例えば人工靭帯として使用できる。 義歯も、本発明の発泡体および発泡体組成物から形成できる。例えば、発泡体 および発泡体組成物は、歯周靭帯修理および歯周骨の再建用の特殊な義歯として 作製できる。一実施例においては、本発明の発泡体および発泡体組成物は、エプ ロン形状の移植片として作製でき、この移植片は歯の周囲にエプロンの紐を結ん で固定可能とする。別の実施例では、本発明の発泡体および発泡体組成物は、リ ン酸カルシウムセメントまたはリン酸カルシウムセメントで補強したコラーゲン 組成物で満たしたポスト抽出ソケットのカバーとして設計されている。更に別の 実施例では、本発明の発泡体および発泡体組成物は、顎堤ビルダーとして用いら れるリン酸カルシウムまたはヒドロキシアパタイトで満たした管として設計され ている。 エプロン形状の発泡体は、歯周靭帯修復及び歯周骨再建用の二倍密度または四 倍密度発泡体（二倍密度発泡体を折り返したもの）として作製できるが、歯周靭 帯修復及び歯周骨再建を要する部分のはぐき組織弁と歯槽骨との間に取り付け可 能である。この発泡体は、清掃し、平削りした歯部分への付着上皮の侵入を防ぐ ように設計されている。歯周靭帯細胞はその後、発泡体に移転し、発泡体に結合 し、発泡体内に細胞外基質物質を分泌可能である。微生物の襲撃に対して防御を 提供する毛管内皮細胞および免疫細胞が、発泡体に侵入することも出来る。上皮 を排除することによって、また歯周靭帯細胞を刺激することによって、発泡体は 歯周靭帯および歯槽骨の再生を促進可能である。上述の様に、エプロン形状の義 歯は、また、リン酸カルシウムセメントを含むように改良することもできる。一 実施例においては、リン酸カルシウムセメントを、侵食した歯槽骨上に設置でき るエプロンの膨出に含めてもよい。リン酸カルシウムセメントは、侵入する歯槽 骨に通路を提供し、水和する際に硬化する。エプロン形状の義歯には、歯の組織 から生成される細胞外基質微粒子を含むことができる。これらの細胞外基質微粒 子は、歯周靭帯細胞および歯周骨細胞成長を移植片に発展させるための適切な成 長因子（例えば骨および靭帯特定的な成長因子）を提供する。 さらには、本発明の発泡体および発泡体組成物は、ポスト抽出ソケット充填材 として作製できる。発泡体をリン酸カルシウムセメントと混合して、抜いた歯の 歯槽に挿入される。これらの歯槽充填材は、少なくともチタンなどの金属の固定 具の基礎とその後の歯冠の取り付けの基礎を少なくとも提供する、骨の再生を歯 槽内部において促進する。チタンなどやその他の材質の固定具は、ここで記載さ れている発泡体組成物で補強されるリン酸カルシウムセメントを用いて、抜歯直 後に歯槽内に固定できる。その後、この移植片を、エプロンと本明細書で呼ぶ２ 倍または四倍密度発泡体膜で覆う、つまり言わばテントを張ったように覆うこと ができる。ソケット充填材は、骨組織または歯乳頭から生成される細胞外基質微 粒子を含むことができる。これらの細胞外基質微粒子は、骨細胞成長を移植片に 発展させるめの適切な成長因子（例えば骨および靭帯特定的な成長因子）を提供 する。それに加えて、金属製の義歯用の骨性基盤が金属製の義歯を十分支持しな い場合は、本発明の発泡体および発泡体組成物で補強あるいは強化したリン酸カ ルシウムセメントを用いてこの骨性基盤を支持できる。 更に他の実施例において、これらの発泡体および発泡体組成物は、顎堤代替物 または顎堤ビルダーとして設計できる。顎堤代替物は義歯の支えとなる。一般的 には、顎堤代替物は、非再吸収性のハイドロキシアパタイト（または、ここで述 べたリン酸カルシウムセメント）を充填した適切な長さの二倍密度発泡体の管と して設計される。この場合、適切な長さとは、顎堤にそって鉱物化プラット発泡 体を建造し、ハイドロキシアパタイト微粒子の周りに骨と結合組織の骨組みの発 達を促進するのに、適切ということである。本発明の顎堤ビルダーは、この発泡 体管が、骨組みの発達を促進するが再吸収性があるリン酸カルシウムセメントを 充填したことを除いては顎堤代替物と同一に設計されている。顎堤ビルダーの成 分は、例えば義歯または金属移植片の取り付けの前に、顎堤の再成長と修復を導 く骨細胞と毛細血管の貫通を促進する。顎堤ビルダーの発泡体管には、顎堤骨の 再生を促進する細胞外基質微粒子を含むことができる。 同様に、腺組織（例えば膵臓組織、肝臓組織、皮膚組織および他の腺組織）に 由来する細胞外基質微粒子で強化された本発明の発泡体および発泡体組成物は、 細胞増殖を促進する手段として、移植の前か後に、膵臓島細胞（例えば膵臓内分 泌腺）のような腺細胞を播種でき、また肝臓（例えば肝[実質]細胞）の腺細胞を 播種できる。このため、細胞を含む発泡体移植片の移植及び血管新生の後には、 機能する代替腺が成長する。 本発明の発泡体および発泡体組成物内部および表面に成功裏に成長した細胞型 の例としては、間葉細胞、歯周靭帯細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、軟骨細 胞、歯肉線維芽細胞、腱細胞、靭帯細胞ある。 限定的には理解すべきではない以下の例に基づいて、本発明を更に説明する。 この出願の全体にわたって引用される全ての引例（文献参照、発行特許、公開さ れた特許出願および出願中の特許出願を含む）の内容は、言及してここに明白に 編入したものとする。 例１： ブタの胎児の皮膚からのコラーゲンの酸抽出 コラーゲンを組織から抽出する一つの好適な方法では、コラーゲン源はブタの 胎児を含む。胎児は子宮内において子宮が端部を紐で結ばれて破壊されていない 状態で凍結される。解剖の１２時間から２４時間前に子宮を冷凍室から取出して 、摂氏４度に保った冷蔵室に入れる。この子宮は、まだ９０％は冷凍状態にある はずだが、無菌の大型の洗い桶に移しかえる。折り曲げられた状態の子宮をでき る だけ早く、丁寧に直線状に伸ばす。子宮の外表面は、１％の漂白剤を含んだミリ −Ｑ（商標）水で１０分間の洗浄を２回行なう。その後、無菌のミリ−Ｑ（商標 ）水で洗浄を２回行ない子宮外部を滅菌する。 クリーンルームにて、主血管の反対の表面から子宮の全長を開く。この際に胎 児の羊膜に触れたり、傷つけたりしないように注意する。子宮の外面に触れる器 具は、７０％のエチルアルコールで洗浄する。各胎児は子宮から静かに持ち上げ 、へそは子宮から少なくとも２ｃｍの箇所で切断する。まだかなり凍った状態に ある胎児を、頭部を除去した後にさ滅菌プラスチック袋の中に入れる。 無菌手袋を用いて、胎児を無菌ガラス皿に移しかえる。無菌のメス（例えば１ １番）で各足部の周りの皮膚を円形切開する。皮膚にメスを入れ、各肢の内表面 に沿って体幹の腹側の表面の正中線まで切開する。正中線切開を体幹の腹側に沿 って尻尾から頚部まで行なう。この際、その下層の筋肉組織を切らないように注 意する。ここで皮膚を体から剥がす。剥がした皮膚は氷で冷やした無菌容器（蓋 付きの１リットル容量の遠心分離ボトル）に移す。 皮膚は無菌の氷と共に粉砕し、粉砕した組織をリン酸緩衝液を含む食塩水（Ｐ ＢＳ）を約３３％を５リットル用意し、その中で５ｋｇの各バッチを９回洗浄す る。組織は、複数の２０リットル容量の箱入り大型ガラス瓶に均等に分け入れ、 各大型ガラス瓶に０．５モルの酢酸及び４ミリモルのエチレンジアミン四酢酸( ＥＤＴＡ)を加える。これらの大型ガラス瓶は約摂氏４度に保って７日間ローラ ーボトル装置上に載置する。 この皮膚処理開始後の８日目に、皮膚と抽出物を４層の無菌チーズクロスで濾 過して分離する。無菌の塩化ナトリウムをこの溶液に加え、約０．９モルにする 。コラーゲンを沈降させつつ、２時間ほど撹拌する。この全食塩沈降溶液及び沈 降物は、３００ミリリットルを一分間の間１２，０００ｒｐｍで連続流動により 遠心分離させる。得られた上清を除去し、ペレットは続けて処理される。これら ペレットは、ｐＨ２．５で０．５モルの酢酸および２ミリモルのエチレンジアミ ン四酢酸（ＥＤＴＡ）中で均質化させ、分散させた後、ローラーボトル装置上に 載置した箱入り大型ガラス瓶に移して、摂氏４度の気温で約１６時間置く。ペレ ットを完全な溶解させるために、０．５モルの酢酸及びエチレンジアミン四酢酸 (Ｅ ＤＴＡ)溶液を追加してもよい。 無菌の塩化ナトリウムをフラスコに追加して０．９モルにする。２時間以上に 亘り時々撹拌して、コラーゲンを上述の様にもう一度沈降させる。塩類を沈殿さ せた溶液全体と沈降物を、３００ミリリットルを一分間の間１２，０００ｒｐｍ で連続流動により遠心分離させる。上清を２．０μｍで濾過した後、コラーゲン 濃度をヒドロキシプロリン・アッセイで測定する。溶液を、中空繊維中で０．０ ５Ｍの酢酸および７ｍｇ／ｍｌまで透析する。 コラーゲンの最終濃度をヒドロキシプロリン・アッセイで測定する。 例２： ブタの胎児の皮膚からの準じ酸および酵素抽出 例１にて説明したように、胎児のブタの皮膚を粉砕し、洗浄した後に、０．５ モルの酢酸及びエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ｐＨ２．５の割合で８日間 混ぜ合わせる。粉砕した材料は、それから液体から切り離し、無傷のコラーゲン は、例１で述べたように塩沈降および溶解を２サイクル行い、この液体から精製 される。そして、粉砕した材料は、０．５モルの酢酸、０．００２モルのエチレ ンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ｐＨ２．５の中の皮膚は、再び同じ緩衝液中の０ ０１７％ペプシンと７日間にわたり混合する。粉砕した材料は、再び液体から分 離される。わずかに一部切り取ったされたコラーゲンを、酸抽出コラーゲンと類 似した方法で２つの液体の抽出物から精製する。両方の型のコラーゲンは、コラ ーゲンを逃がさない孔隙率を備えた中空繊維を用いて０．０５Ｍの酢酸および所 望の濃度まで透析する。ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって測定される 様に、酸抽出Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩコラーゲンおよびＩＶ型コラーゲンを含む 胎児のコラーゲン混合物である。ペプシン抽出コラーゲン（すなわちわずかに一 部切り取ったされたコラーゲン）はより低い量のＩＶ型（この酵素処理により劣 化する）を除いて上記混合コラーゲンのテロペプチドのない三重らせん状コアを 含む。コラーゲン濃度も、ヒドロキシプロリン・アッセイ標準によって較正され たシリウス染料・アッセイによって測定される。タンパク質一致および保全性は ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって確認され、粘性は５ｍｇ／ｍｌで少 なくとも５０センチポアズで標準化される。このコラーゲンは、中性ｐＨでゲル を形成することが可能である。変性汚染物質が含まれないことは、有極性（−３ ５０°以下での値が、許容範囲内である）によって測定される。品質は、また、 コラーゲンが繊維を形成する能力によってテストされる。 例３：ブタの胎児の皮膚から抽出されるコラーゲンからの単密度発泡体の作製 例１または例２おいて述べた様に作製された生重合体溶液（細胞外基質微粒子 の有無にかかわらず）は、ウェル（竪穴型）やその他の型に導入される。竪穴に 導入される前に、コラーゲン溶液は、バブル形成が観察されなくなるまで真空の 下にガス抜きされる。一実施例においては、溶液はおよそ１時間にわたり５乃至 １０ｍｍの水銀の気圧にさらされる。この竪穴は、必要な発泡体製品の厚みによ って決定される量のポリマーで満たす。直系約１.２ｃｍの竪穴に、厚さの約２ ｍｍの発泡体を提供するために０.３５ミリリットルの溶液で満たす。竪穴は、 凍結乾燥製品の必要とされる形状大きさを得るためであれば、かなるサイズもお よび形状であってもよい。各竪穴内の生重合体の濃度は、製品の必要な密度によ るが、１ミリリットル当たり１．０ｍｇのコラーゲンから約１０ｍｇ間の範囲で よい。好適な実施例においては、約５．０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する溶液が使わ れる。コラーゲン溶液は液体の状態から直接に凍結乾燥できるが、好適な実施例 においては、コラーゲン溶液はアンモニウムを２９％含む溶液からのアンモニウ ム水酸化物蒸気に晒すか、溶液に塩基を加えて重合させて、ゲルを形成しつつ７ ．０のｐＨとする。重合速度は温度と比例していて、竪穴の中のコラーゲン溶液 の温度を調節することによって制御できる。 コラーゲン溶液の重合のおよび格子形成の後に、格子は凍結乾燥の前か後の何 れかに、約２５４ナノメートルの波長の紫外線放射によって架橋される。凍結乾 燥する前に架橋される場合は、放射強度は一平方ｃｍ当たり約０．３８ｘ１０７ マイクロジュールでよい。凍結乾燥した後に架橋される場合は、放射強度はこの 値のおよそ４倍で良い。紫外線放射への曝露は、所望の架橋の程度に従い増加す ることができる。０.５のｘＰＢＳにおける１５ミリモルのカルボジイミドとの 化学 架橋を用いても良い。 発泡体を形成するために用いる凍結乾燥手順は、凍結、排出、加熱サイクルか らなるが、共融温度（すなわち材料全体が凍結するための最低凝固点）は、溶液 中のまたは重合格子中の生重合体の濃度に従って変化するので、このサイクルは ポリマー濃度の関数として変化する。仕上げ又は未仕上げ直径１．０乃至１.２ ｃｍおよび１．０乃至５．０ｍｍ或いはそれ以上の厚さの発泡体ディスクを、複 数竪穴プレートトランスウェルまたは、組織培養竪穴または、細胞培養を実行す るために使われる複数竪穴プレート中に挿入する。トランスウェル容器に挿入す る発泡体挿入物は、上記４つ何れの型でも良い。つまり、コラーゲン溶液を塗布 していないものか、コラーゲン溶液を塗布したものか、または上記の何れの形状 の細胞外基質組成物を含んだコラーゲン溶液を塗布したものの何れかで良い。各 発泡体ディスクは、組織培養基中で組織細胞が播種される。発泡体の隙間を占め るのに選択される細胞種類は開放細胞発泡体であるが、通常は細胞外基質に囲ま れている。一実施例においては、組織細胞が発泡体のコラーゲンゲルに囲まれる ように、細胞は中和コラーゲン溶液に混入される。本実施例においては、他の表 現型の細胞（特に、内皮、上皮、または中皮細胞）をゲルの下表面にまたはゲル の上表面に平板培養して、２つ、３つ、あるいはそれ以上の細胞型の組織等価物 を構成できる。他の実施例においては、細胞は組織培養基に置かれる。 細胞外基質成分を含んだ様々な型のコラーゲン溶液で上記した様に処理した発 泡体シート、チューブ、ロッド、その他の形状体を、ヒトの代替部位として使用 できる。例えば、架橋されたコラーゲン・エプロン・ストリングを備えた、厚み 約０.４のミリメータの１.０平方ｃｍの長方形体は、歯根人工器管として使用で きる。この例では、発泡体の全ての表面には、歯の組織から得られた細胞外基質 微粒子で外装を施す。これら微粒子は、選択した細胞外基質組成物に関して検査 され、その結果、基本線維芽細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子β２ 、血小板由来成長因子、インターロイキン１、デコリン、およびＩ及びIII型コ ラーゲンを含むことが示される。この歯根人工器管は、当業者には周知の治療法 で歯を処置した後で、歯根（歯周病）で苦しむ患者の治療用生体吸収可能機器と して取り付けられる。この基質は、歯槽の骨、歯槽の骨を囲む結合組織および歯 槽の 骨自体に歯を固定する歯根靭帯の再生を誘発することができる。この発泡体は、 その組成物のおかげで、組織細胞によって認識される。細胞は発泡体からシグナ ルを受け取って、それらに付着し、再構築することができる。細胞外基質微粒子 を含ませた際に、発泡体が線維芽細胞成長因子を含むため、発泡体は脈管形成性 があり、毛細血管循環を引き起こすことができる。作製した人工器管夫々に関し 、組織特定又は一般的な細胞外基質構成要素を用いて、組織構築および再生のた めに必要な情報を提供できる。同等物 ここに説明された発明の具体的な実施例の同等物が可能であることは、当業者 には直ちに、又は単純な実験のみを行えば明らかであろう。これらの同等物は、 以下の特許請求の範囲に包含されるものである。

【手続補正書】 【提出日】平成１１年１１月１９日（１９９９．１１．１９） 【補正内容】 請求の範囲 １． 複合生重合体発泡体であって、 生重合体分子および／または生重合体フィラメントを壁体内に散 在させた連通したミクロコンパートメントの網状組織を備える生重合体発泡体と 、 第二の重合体構成体と、を包含する複合生重合体発泡体。 ２． 前記の生重合体発泡体が、概ね等しい長さ、幅、及び高さの寸 法を持つミクロコンパートメントを備えた単密度生重合体発泡体を包含する、請 求項１に記載の複合生重合体発泡体。 ３． 前記の生重合体発泡体が、長さ、幅、及び高さの寸法を持つミ クロコンパートメントを備えた二倍密度発泡体を包含し、前記寸法のうち二つが 概ね等しく、三番目の寸法が少なくとも１０分の１以下である、請求項１に記載 の複合生重合体発泡体。 ４． 前記第二の重合体構成体が生重合体である、請求項１に記載の 複合生重合体発泡体。 ５． 生重合体が、コラーゲン、アルギン酸、ポリビニルアルコール 、コンドロイチン硫酸、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、およびフィ ブリノーゲンからなるグループから選択される、請求項４に記載の複合生重合体 発泡体。 ６． 前記生重合体がコラーゲンである、請求項５に記載の複合生重 合体発泡体。 ７． 前記コラーゲンがブタの胎児のコラーゲンである、請求項６に 記 載の複合生重合体発泡体。 ８． 前記コラーゲンが重合される、請求項７に記載の複合生重合体 発泡体。 ９． 前記コラーゲンが架橋されている、請求項７に記載の複合生重 合体発泡体。 １０． 前記コラーゲンがリシルオキシダーゼで架橋される、請求項９ に記載の複合生重合体発泡体。 １１． 細胞外基質微粒子を更に包含する、請求項１に記載の複合生重 合体発泡体。 １２． 前記生重合体発泡体及び／又は前記第二の重合体構成体が、細 胞を更に包含する、請求項１に記載の複合生重合体発泡体。 １３． 前記第二の重合体構成体が繊維を包含する、請求項２又は３に 記載の複合生重合体発泡体。 １４． 前記繊維が編んだものである、請求項１３に記載の複合生重合 体発泡体。 １５． 前記繊維が生地である、請求項１３に記載の複合生重合体発泡 体。 １６． 前記繊維が不織の生地である、請求項１３に記載の複合生重合 体発泡体。 １７． 請求項１３の複合生重合体発泡体を包含した皮膚包帯。 １８． 請求項１３の複合生重合体発泡体を包含した人工靭帯。 １９． 前記第二の重合体構成体が二倍密度発泡体を包含する、請求項 ２に記載の複合生重合体発泡体。 ２０． 請求項１９に記載の複合生重合体発泡体を包含した人工皮膚で あって、前記生重合体発泡体が、単密度発泡体であり且つヒトの皮膚の繊維芽細 胞で条件づけられ、更に、前記二倍密度発泡体が、角質層が形成されるように、 ヒトのケラチン合成細胞で条件づけられている、人工皮膚。 ２１． 、前記単密度発泡体および前記二倍密度発泡体が、細胞による 条件付けの後で凍結乾燥される細胞を包含した、請求項２０に記載の人工皮膚。 ２２． 請求項３に記載の複合生重合体発泡体を包含した人工血管であ って、前記二倍密度発泡体が管状である、人工血管。 ２３． 前記第二の重合体構成体が、管に巻き付けられた生重合体繊維 である、 請求項２２に記載の人工血管。 ２４． 前記人工血管が、前記生重合体繊維の周囲に注型されている、 請求項２２に記載の人工血管。 ２５． その管腔の内部表面には内皮細胞を、その全体および管腔の外 部表面には平滑筋細胞を更に包含した、請求項２２又は２４に記載の人工血管。 ２６． 前記細胞を含んだ前記管状二倍密度生重合体発泡体は、細胞に よる条件付けの後で凍結乾燥される、請求項２５に記載の人工血管。 ２７． 前記管状二倍密度生重合体発泡体は、前記平滑筋細胞上に外膜 細胞の層を更に包含する、請求項２６に記載の人工血管。 ２８． 前記細胞を含んだ前記管状二倍密度生重合体発泡体は、細胞に よる条件付けの後で凍結乾燥される、請求項２７に記載の人工血管。 ２９． 請求項１に記載の複合生重合体発泡体を包含した人工血管であ って、この複合発泡体が管状である、人工血管。 ３０． 歯周靭帯の修復と硬骨の再建を促進可能な、請求項３に記載の 複合生重合体発泡体を包含する人工歯根であって、前記第二の重合体構成体が二 倍密度重合体発泡体である、人工歯根。 ３１． エプロン形状の請求項３０に記載の人工歯根。 ３２． 硬骨再建物質を保持可能な膨出を含んだ、請求項３１に記載の 人工歯根。 ３３． 歯周靭帯細胞を更に包含する、請求項３１に記載の人工歯根。 ３４． 歯の組織に由来する細胞外基質微粒子を更に包含する、請求項 ３１に記載の人工歯根。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シオスサット トレイシー エム. アメリカ合衆国 01867 マサチューセッ ツ州 リーディング、ボスウェルロード 26 (72)発明者 フォフォノフ ティモシー ダブル. アメリカ合衆国 02026 マサチューセッ ツ州 デッドハム、ハイストリート 1150

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 散在させた生重合体分子および／または生重合体フィラメント を壁体内に備える連通したミクロコンパートメントの網状組織を包含する単密度 生重合体発泡体であって、前記ミクロコンパートメントが、 ｘ、ｙおよびｚの体積寸法があり、ここで、ｘは長さ、ｙは幅、そして ｚは高さであって、これらの寸法は概ね等しく、その範囲は約１μｍから約３０ ０μｍであり、 壁体の平均的な厚みは、約１０μｍ未満である、単密度生重合体発泡体 。 ２． ｘ、ｙ、およびｚが約５０μｍから約１００μｍの範囲である 請求項１に記載の発泡体。 ３． 前記生重合体発泡体が、コラーゲン、アルギン酸、ポリビニル アルコール、コンドロイチン硫酸、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、 およびフィブリノーゲンからなるグループから選択される、請求項１に記載の発 泡体。 ４． 前記生重合体発泡体が、少なくとも二つの異なる生重合体発泡 体の混合物を包含する、請求項１に記載の発泡体。 ５． 前記生重合体発泡体がコラーゲンである、請求項３に記載の発 泡体。 ６． 前記コラーゲンがブタの胎児のコラーゲンである、請求項６に 記載の発泡体。 ７． 前記コラーゲンが架橋されている、請求項６に記載の発泡体。 ８． 細胞外基質微粒子を更に包含する、請求項１に記載の発泡体。 ９． 細胞を更に包含する、請求項１に記載の発泡体。 １０． 単密度生重合体発泡体を作製する方法であって、 生重合体溶液を形成する段階と、 前記生重合体溶液中の生重合体を架橋する段階と、 単密度生重合体発泡体を形成するために、前記生重合体溶液を凍結乾燥 する段階と、を包含する、単密度生重合体発泡体を作製する方法。 １１． 前記架橋する段階の前か後の何れかに、前記生重合体溶液中の 前記生重合体を重合して、生重合体格子を形成する段階をさらに包含する、請求 項１０に記載の方法。 １２． 前記架橋する段階が前記凍結乾燥する段階の後である、請求項 １０に記載の方法。 １３． 前記生重合体発泡体がコラーゲンである、請求項１０に記載の 方法。 １４． 前記コラーゲンがブタの胎児のコラーゲンである、請求項１３ に記載の方法。 １５． 前記コラーゲンを架橋する段階が、前記コラーゲンをリシルオ キシダーゼで準備刺激することを包含する、請求項１３に記載の方法。 １６． 前記溶液を凍結乾燥する段階が、前記溶液を不凍ポリペプチド 又は不凍糖タンパク質の存在下で凍結乾燥することを包含する、請求項１０に記 載の方法。 １７． 前記不凍ポリペプチドが、Ｉ型不凍ポリペプチド、II型不凍ポ リペプチドあるいはIII型不凍ポリペプチドからなるグループから選択される、 請求項１６に記載の方法。 １８． 請求項１０に記載の方法で作製された単密度生重合体発泡体。 １９． 散在させた生重合体分子および／または生重合体フィラメント を壁体内に備える連通したミクロコンパートメントの網状組織を包含する二倍密 度生重合体発泡体であって、前記ミクロコンパートメントが、 ｘ、ｙおよびｚの体積寸法があり、ここで、ｘは長さ、ｙは幅、そして ｚは高さであって、これらの内の二つの寸法は概ね等しく、その範囲は約１μｍ から約３００μｍであり、三番目のものは概ね等しい二つより小さく、 壁体の平均的な厚みは、約１０μｍ未満である、単密度生重合体発泡体 。 ２０． 細胞を更に包含する、請求項１９に記載の発泡体。 ２１． 二倍密度生重合体発泡体を作製する方法であって、 生重合体溶液を形成する段階と、 前記生重合体溶液中の生重合体を架橋する段階と、 発泡体を形成するために、前記生重合体溶液を凍結乾燥する段階と、 前記発泡体を水和する段階と、 前記発泡体を成形して、選択した形状を持たせる段階と、 前記成形した発泡体を乾燥する段階とを包含する、二倍密度生重合体発 泡体を作製する方法。 ２２． 前記架橋する段階の前か後の何れかに、前記生重合体溶液中の 前記生重合体を重合して、生重合体格子を形成する段階をさらに包含する、請求 項２１に記載の方法。 ２３． 前記架橋する段階が前記凍結乾燥する段階の後である、請求項 ２１に記載の方法。 ２４． 請求項２１に記載の方法で作製された二倍密度生重合体発泡体 。 ２５． 単密度生重合体発泡体と、 二倍密度生重合体発泡体と、を包含する複合生重合体発泡体。 ２６． 前記単密度生重合体発泡体が、細胞で条件付けされる、請求項 ２５に記載の複合発泡体。 ２７． 前記二倍密度生重合体発泡体が、細胞で条件付けされる、請求 項２５に記載の複合発泡体。 ２８． 前記単密度生重合体発泡体および前記二倍密度生重合体発泡体 が、細胞で条件付けされる、請求項２５に記載の複合発泡体。 ２９． 前記生重合体がコラーゲンを包含する、請求項２５に記載の複 合発泡体。 ３０． 単密度生重合体発泡体および二倍密度生重合体発泡体を包含す る複合生重合体発泡体を作製する方法であって、 二倍密度生重合体発泡体を提供する段階と、 前記二倍密度生重合体発泡体を水和する段階と、 前記二倍密度生重合体発泡体に生重合体溶液を加える段階と、 前記生重合体溶液中の生重合体を架橋する段階と、 複合生重合体発泡体を形成するために、前記生重合体溶液と前記二倍密 度生重合体発泡体とを凍結乾燥する段階とを包含する、複合生重合体発泡体を作 製する方法。 ３１． 前記架橋する段階が前記凍結乾燥する段階の後である、請求項 ３０に記載の方法。 ３２． 請求項３０に記載の方法によって作製された複合生重合体発泡 体。 ３３． 単密度生重合体発泡体と、 細胞外基質微粒子とを包含する生体適合性構成体。 ３４． 前記生重合体発泡体がコラーゲンを含む、請求項３３に記載の 構成体。 ３５． 前記細胞外基質微粒子が前記発泡体全体に分散されている、請 求項３３に記載の構成体。 ３６． コラーゲン溶液中の細胞外基質微粒子の懸濁が、前記生重合体 発泡体の表面に塗布されている、請求項３３に記載の構成体。 ３７． 前記生重合体発泡体および懸濁が凍結乾燥される、請求項３６ に記載の構成体。 ３８． コラーゲンを塗布した単密度生重合体発泡体を作製する方法で あって、 生重合体溶液を形成する段階と、 前記生重合体溶液中の生重合体を重合して、生重合体格子を形成する段 階と、 前記生重合体格子を架橋する段階と、 発泡体を形成するために、前記生重合体格子を凍結乾燥する段階と、 コラーゲン溶液を前記凍結乾燥した発泡体に添加して、コラーゲンを塗 布した発泡体を形成する段階とを包含する、コラーゲンを塗布した単密度生重合 体発泡体を作製する方法。 ３９． 前記コラーゲン溶液が細胞外基質微粒子を含む、請求項３８に 記載の方法。 ４０． 前記生重合体がコラーゲンを包含する、請求項３８に記載の方 法。 ４１． 細胞外基質微粒子を備えた前記発泡体を凍結乾燥する段階をさ らに包含する、請求項３９に記載の方法。 ４２． 前記添加する段階の後に、前記コラーゲン溶液と発泡体を凍結 乾燥して、コラーゲンを塗布した発泡体を作製する段階を更に包含する、請求項 ３９に記載の方法。 ４３． 細胞外基質微粒子の被膜を供えた単密度生重合体発泡体を作製 する方法であって、 生重合体溶液を形成する段階と、 前記溶液を凍結乾燥して、発泡体が前記生重合体溶液から形成される段 階と、 前記発泡体に、コラーゲン溶液中に懸濁した細胞外基質微粒子を塗布す る段階と、 細胞外基質微粒子を塗布した前記発泡体を凍結乾燥して、 コラーゲン溶液を前記凍結乾燥した発泡体に添加して、細胞外基質微粒子で被膜 した単密度生重合体発泡体を形成する段階とを包含する、コラーゲンを塗布した 単密度生重合体発泡体を作製する方法。 ４４． 単密度コラーゲン発泡体と二倍密度コラーゲン発泡体とを含ん だ複合生重合体発泡体を包含した皮膚包帯であって、 この単密度生重合体発泡体は、ヒトの皮膚線維芽細胞で条件付けられて おり、 この二倍密度生重合体発泡体は、ヒトのケラチノサイトで条件付けられ ている、皮膚包帯。 ４５． 前記の細胞を含んだ前記単密度および二倍密度発泡体は、細胞 による条件付けの後で凍結乾燥される、請求項４２に記載の皮膚包帯。 ４６． 二倍密度生重合体発泡体を包含した皮膚包帯であって、角質層 が形成されるように、この二倍密度生重合体発泡体が全体に皮膚線維芽細胞と、 一表面に表皮細胞とを含んだ、皮膚包帯。 ４７． 前記の細胞を含んだ前記二倍密度生重合体発泡体が、細胞によ る条件付けの後で凍結乾燥される、請求項４６に記載の皮膚包帯。 ４８． 二倍密度生重合体発泡体を包含した人工血管であって、 前記二倍密度生重合体発泡体が管状である、人工血管。 ４９． 生重合体糸が前記管に巻き付けられている、請求項４８に記載 の人工血管。 ５０． 第二の二倍密度生重合体発泡体が、前記生重合体糸の周囲に注 型されている、請求項４９に記載の人工血管。 ５１． その管腔の内部表面には内皮細胞を、全体および管腔の外部表 面には平滑筋細胞を更に包含した、請求項５０に記載の人工血管。 ５２． 前記細胞を含んだ前記管状二倍密度生重合体発泡体は、細胞に よる条件付けの後で、凍結乾燥される、請求項５１に記載の人工血管。 ５３． 前記管状二倍密度生重合体発泡体は、平滑筋細胞上に外膜細胞 の層を更に包含する、請求項５２に記載の人工血管。 ５４． 前記細胞を含んだ前記管状二倍密度生重合体発泡体は、細胞に よる条件付けの後で、凍結乾燥される、請求項５３に記載の人工血管。 ５５． 複合生重合体発泡体を包含した人工血管であって、この複合生 重合体発泡体がが管状である、人工血管。 ５６． リン酸カルシウムのセメント質と、 細胞外基質微粒子とを包含した、整形移植片または人工歯根。 ５７． リン酸カルシウムのセメント質と、 生重合体発泡体とを包含した、整形移植片または人工歯根。 ５８． 再吸収可能なリン酸カルシウムのセメント質を含んだ管形状の 二倍密度生重合体発泡体を包含した顎堤ビルダーである、請求項５７に記載の人 工歯根。 ５９． 歯周靭帯細胞を更に包含する、請求項５７に記載の人工歯根。 ６０． 前記生重合体発泡体が細胞外基質微粒子を更に包含する、請求 項５７に記載の人工歯根。 ６１． 前記生重合体発泡体と、 ヒドロキシアパタイトとを包含する、人工歯根。 ６２． 非吸収性のヒドロキシアパタイトを含んだ管形状の二倍密度生 重合体発泡体を包含した歯周靭帯代用品である、請求項５７に記載の人工歯根。 ６３． 歯周靭帯細胞を更に包含する、請求項６１に記載の人工歯根。 ６４． 前記生重合体発泡体が、細胞外基質微粒子を更に包含する、請 求項６１に記載の人工歯根。 ６５． 歯周靭帯の修復と硬骨の再生を促進可能で、エプロン形状の２ 倍又は四倍密度重合体発泡体を包含する人工歯根。 ６６． 前記エプロン形状の２倍又は四倍密度重合体発泡体が、リン酸 カルシウムのセメント質を含んだ膨出をふくむ、請求項６５に記載の人工歯根。 ６７． 歯周靭帯細胞を更に包含する、請求項６５に記載の人工歯根。 ６８． 歯の組織に由来する細胞外基質微粒子を更に包含する、請求項 ６５に記載の人工歯根。 ６９． 歯周靭帯の修復と歯の周囲の硬骨の再生を促進する方法であっ て、エプロン形状の２倍又は四倍密度重合体発泡体の紐を歯の周囲に結んで、前 記エプロンを歯周靭帯の修復と硬骨の再生を必要とする部分に固定する段階を包 含する、促進する方法。 ７０． 前記発泡体が歯周靭帯細胞を更に包含する、請求項６９に記載 の方法。 ７１． 重合体溶液とリン酸カルシウムのセメント質とを含んだ、セメ ン トに凝固させた基質（基質？）と、 前記セメント質基質の一面に埋め込まれた単一又は二倍密度重合体発泡 体とを包含する、人工軟骨。 ７２． 前記単一又は二倍密度重合体発泡体を、この発泡体が前記セメ ント質基質の一面に埋め込まれるように、凍結乾燥させる、請求項７１に記載の 人工軟骨。 ７３． 前記単一又は二倍密度重合体発泡体が、軟骨細胞を播種した、 請求項７１に記載の人工軟骨。 ７４． 複数の重合体フィラメントと、単一又は二倍密度重合体発泡体 とを包含する人工靭帯。 ７５． 腺細胞を播種した単一又は二倍密度重合体発泡体からなる人工 腺。 ７６． 腺細胞を更に包含する、請求項７５に記載の人工腺。 ７７． 腺組織に由来する細胞外基質微粒子を更に包含する、請求項７ ５に記載の人工腺。 ７８． 腺組織が膵臓組織である、請求項７７に記載の人工腺。 ７９． 腺組織が肝組織である、請求項７７に記載の人工腺。