DE69724275T2

DE69724275T2 - Biopolymerschäume zur gewebeerneurung und -rekonstruktion

Info

Publication number: DE69724275T2
Application number: DE69724275T
Authority: DE
Inventors: Eugene Bell; M. Tracy SIOUSSAT; W. Timothy FOFONOFF
Original assignee: TEI Biosciences Inc
Current assignee: TEI Biosciences Inc
Priority date: 1996-11-21
Filing date: 1997-11-12
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2017-11-13
Also published as: EP0946127B1; AU727696B2; JP2001510358A; AU727696C; US5891558A; AU5261698A; DE69724275D1; ATE247452T1; US6153292A; WO1998022154A2; WO1998022154A3; EP0946127A2; CA2278497A1

Description

Ausgangspunkt der Erfindung
Kollagen-Schwämme oder -schäume wurden als hämostatische Mittel verwendet und wurden kürzlich als Gerüste für die Gewebsheilung in vivo und als Forschungswerkzeuge in vitro zum Aussäen verschiedener Zelltypen zur Untersuchung von Zellfunktionen in drei Dimensionen verwendet. Kollagen-Schwämme weisen eine geringe Immunogenität auf und bestehen aus einem natürlich vorkommenden Strukturprotein, an das sich Zellen anlagern bzw. binden, mit diesem interagieren und dieses abbauen können. In vivo sind diese Schwämme bioabsorbierbar. Jedoch werden Schwämme üblicherweise vernetzt, um einen Grad an Nassfestigkeit und bemessener Beständigkeit gegenüber Auflösung bereitzustellen, der für viele der oben erwähnten Anwendungen erforderlich ist. Im Allgemeinen reduziert ein aldehydisches Vernetzen von Kollagen-Schwämmen oder -schäumen die normalen Bindungsstellen oder baut diese ab, an die sich Zellen und bestimmte Moleküle, die von Zellen abgesondert werden, binden. Weiterhin fehlt Kollagen-Schwämmen, Gelatine-Schwämmen oder Polyvinylalkohol-Schwämmen eine biologische Aktivität, die typischerweise in der extrazellulären Matrix-Umgebung von Zellen vorhanden ist. Jedoch induzieren vernetzte Kollagen-Schwämme wegen dieser Mängel eine nur geringe Regeneration in vivo oder funktionieren in vitro nur schlecht als histiotypische und organotypische Modelle.
Es existiert deswegen ein Bedarf nach einem verbesserten Biopolymerschaum, der die oben erwähnten Probleme überwindet oder minimiert.
WO96/15818 beschreibt einen Biopolymerschaum mit extrazellulären Matrixteilchen. Das Dokument betrifft Schwämme, die mit einem Biopolymerschaum und extrazellulären Matrix-Teilchen ausgebildet sind. Eine Biopolymer-Lösung wird geformt und das Biopolymer wird darauf in der Biopolymer-Lösung polymerisiert, wodurch ein Biopolymer-Gerüst bzw. -Gitter gebildet wird. Das Gerüst wird zur Bildung eines Schaumes vernetzt und gefriergetrocknet. Extrazelluläre Matrixteilchen, die in einer Lösung aus Kollagen suspendiert sind, werden auf den gefriergetrockneten Schaum aufgebracht, wodurch sich ein Schaum mit extrazellulären Matrixteilchen bildet.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen zusammengesetzten Biopolymerschaum (beispielsweise in Form eines Rohres), der einen Biopolymerschaum mit einem Netzwerk aus miteinander in Verbindung stehenden Mikrokompartimenten, wobei Biopolymermoleküle und/oder Biopolymerfilamente in den Wänden der Mikrokompartimente eingelagert sind, und eine zweite Polymerstruktur umfasst.
Die Erfindung umfasst Biopolymerschäume, zusammengesetzte Biopolymerschäume, biokompatible Konstrukte, die Biopolymerschäume und extrazelluläre Matrixteilchen umfassen und Verfahren zur Herstellung und Verwendung dieser Schäume und Schaumzusammensetzungen. Die Schäume und Schaumzusammensetzungen können beispielsweise in vitro für Modellsysteme zur Forschung oder in vivo als Prothesen oder Implantate zum Ersatz beschädigten oder erkrankten Gewebes oder zur Bereitstellung von Gerüsten verwendet werden, die, wenn sie von Zellen besetzt werden, beispielsweise von Wirtszellen, umgeformt werden, so dass sie zu funktionellem Gewebe werden. In jedem Falle können die Schäume und Schaumzusammensetzungen mit Zellen besät werden, beispielsweise mit Säugetierzellen, beispielsweise mit humanen Zellen desselben Typs wie diejenigen des Gewebes, in dem die Schäume oder Schaumzusammensetzungen zur Reparatur bzw. Heilung oder Rekonstruktion verwendet werden. Beispiele für Gewebe, die unter Verwendung der Schäume und Schaumzusammensetzungen, die hierin beschrieben sind, repariert und/oder rekonstruiert werden, schließen Nervengewebe, Haut, Gefäßgewebe, Muskelgewebe, Bindegewebe wie beispielsweise Knochen, Knorpel, Sehnen und Bänder, Nierengewebe und Drüsengewebe wie beispielsweise Lebergewebe und Pankreas-Gewebe, ein. In einer Ausführungsform werden die Schäume und Schaumzusammensetzungen, die mit gewebsspezifischen Zellen besät sind, in einen Empfänger, beispielsweise in ein Säugetier, beispielsweise in einen Menschen, eingebracht. Alternativ werden die ausgesäten Zellen, die die Gelegenheit hatten, sich zu einem Gewebe in vitro zu organisieren und gewebsspezifische biosynthetische Produkte wie beispielsweise extrazelluläre Matrixproteine und/oder Wachstumsfaktoren zu sezernieren, die an die Schäume und Schaumzusammensetzungen binden, vor Einbringung der Schäume und Schaumzusammensetzungen in einen Empfänger entfernt.
Demgemäß betrifft die Erfindung Biopolymerschäume mit einfacher Dichte, die ausgewählte Eigenschaften aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Biopolymerschäume einfacher Dichte ein Netzwerk von miteinander in Verbindung stehenden Mikrokompartimenten, die Biopolymermoleküle und/oder Biopolymerfilamente in den Wänden der Mikrokompartimente eingelagert aufweisen. Die Mikrokompartimente dieser Schäume weisen typischerweise Volumendimensionen von x, y und z auf, wobei x = Länge, y = Breite und z = Höhe, die im Wesentlichen gleich sind und sich von ungefähr 1 μm bis ungefähr 300 μm, vorzugsweise von ungefähr 50 μm bis ungefähr 100 μm erstrecken. Die durchschnittliche Wanddicke der Mikrokompartimente der Biopolymerschäume mit einfacher Dichte beträgt weniger als ungefähr 10 μm. Beispiel für Biopolymere, die in Biopolymerschäumen mit einfacher Dichte verwendet werden können, schließen Kollagen, Alginsäure, Polyvinylalkohol, Elastin, Chondroitinsulfat, Laminin, Fibronektin, Fibrinogen und Kombinationen dieser Biopolymere ein. Ein bevorzugtes Biopolymer ist Kollagen, beispielsweise fötales Schweinekollagen. In anderen Ausführungsformen können die Biopolymerschäume mit einfacher Dichte extrazelluläre Matrix-Teilchen und/oder Zellen einschließen.
Biopolymerschäume der Erfindung mit einfacher Dichte können durch Ausbilden einer Biopolymer-Lösung, Vernetzen des Biopolymers in der Biopolymer-Lösung und Gefriertrocknen der Biopolymer-Lösung zur Ausbildung eines Biopolymerschaumes mit einfacher Dichte hergestellt werden. In einer weiteren Ausführungsform tritt der Vernetzungsschritt nach dem Gefriertrocknungsschritt ein. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt das Verfahren ebenfalls einen Schritt des Polymerisierens des Biopolymers in der Biopolymer-Lösung vor dem Vernetzungsschritt zur Bildung eines Biopolymer-Gerüstes ein. Wenn Kollagen, das bevorzugte Biopolymer, in diesem Verfahren verwendet wird, kann es durch Primen mit Lysyloxidase vernetzt werden. Um das Aufspalten des Schaumes zu reduzieren, kann das Biopolymer ebenfalls in Gegenwart eines Gefrierschutzpolypeptids gefriergetrocknet werden, beispielsweise eines Typ-I-, -II-, -III-Gefrierschutzpolypeptids oder eines Gefrierschutzglykoproteins.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Biopolymerschäume mit einfacher Dichte, die durch dieses Verfahren hergestellt wurden.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Biopolymerschäume mit doppelter Dichte, die ausgewählte Eigenschaften aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Biopolymerschäume doppelter Dichte ein Netzwerk von miteinander in Verbindung stehenden Mikrokompartimenten, die in den Wänden der Mikrokompartimente Biopolymermoleküle und/oder Biopolymerfilamente eingelagert aufweisen. Die Mikrokompartimente dieser Schäume weisen typischerweise Volumendimensionen von x, y und z auf, wobei x = Länge, y = Breite und z = Höhe, wobei zwei von diesen im Wesentlichen gleich sind und sich von ungefähr 1 μm bis ungefähr 300 μm bewegen und die dritte von diesen weniger als die beiden Dimensionen beträgt, die im Wesentlichen gleich sind. Die durchschnittlichen Wanddicken der Mikrokompartimente der Biopolymerschäume mit doppelter Dichte betragen weniger als ungefähr 10 μm. Bevorzugte Biopolymere zur Verwendung in Schäumen mit doppelter Dichte sind hierin beschrieben. In anderen Ausführungsformen können die Biopolymerschäume doppelter Dichte extrazelluläre Matrixteilchen und/oder Zellen einschließen.
Biopolymerschäume mit doppelter Dichte der Erfindung können durch Ausbilden einer Biopolymer-Lösung und darauf Vernetzen des Biopolymers in der Biopolymer-Lösung hergestellt werden. Die Biopolymer-Lösung kann darauf zur Bildung eines Schaumes gefriergetrocknet, hydratisiert und ausgeformt werden, so dass er die ausgewählte Form aufweist. Der Schaum mit der ausgewählten Form kann dann getrocknet werden, um den Biopolymerschaum mit doppelter Dichte zu erzielen. In einer weiteren Ausführungsform tritt der Vernetzungsschritt nach dem Gefriertrocknungsschritt ein. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt das Verfahren zur Herstellung von Biopolymerschäumen mit doppelter Dichte vor dem Vernetzungsschritt den Schritt ein, das Biopolymer in der Biopolymer-Lösung zur Ausbildung eines Biopolymer-Gerüstes zu polymerisieren. Die Erfindung betrifft ebenfalls Biopolymerschäume mit doppelter Dichte, die durch dieses Verfahren hergestellt sind.
Zusammengesetzte Biopolymerschäume, die sowohl Schäume mit einfacher als auch doppelter Dichte einschließen, werden durch diese Erfindung ebenfalls speziell betrachtet. Die Schäume oder zusammengesetzten Schäume können weiterhin mit Zellen vor der Verwendung in vitro oder in vivo konditioniert werden. Zusammengesetzte Biopolymerschäume werden gebildet, indem zunächst ein Biopolymerschaum mit doppelter Dichte bereitgestellt wird und darauf der Biopolymerschaum mit doppelter Dichte mit beispielsweise Wasser oder einer Biopolymer-Lösung hydratisiert wird. Eine Biopolymer-Lösung wird dann dem hydratisierten Biopolymerschaum mit doppelter Dichte zugesetzt und die Lösung und der hydratisierte Schaum mit doppelter Dichte werden dann gefriergetrocknet, so dass ein zusammengesetzter Biopolymerschaum gebildet wird. Vor dem Gefriertrocknungsschritt kann das Biopolymer im Biopolymerschaum vernetzt werden. Die Erfindung schließt weiterhin zusammengesetzte Biopolymerschäume ein, die durch dieses Verfahren hergestellt sind. Die Schäume mit einfacher Dichte und doppelter Dichte des zusammengesetzten Biopolymerschaums können nach Zellkonditionierung ebenfalls gefriergetrocknet werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung biokompatible Konstrukte, die Biopolymerschäume mit einfacher oder doppelter Dichte einschließen, und die extrazelluläre Matrixteilchen einschließen. Die extrazellulären Matrixteilchen können im gesamten Schaum dispergiert werden, beispielsweise werden extrazelluläre Matrixteilchen in einer Biopolymer-Lösung oder -Suspension eingeschlossen, die im gesamten Schaum verteilt ist und/oder die auf die Oberfläche des Biopolymerschaums aufgeschichtet ist. Die Biopolymerschaum mit den extrazellulären Matrixteilchen kann darauf gefriergetrocknet werden.
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Biopolymer-beschichteten, beispielsweise Kollagen-beschichteten, Schäumen mit einfacher oder doppelter Dichte. Diese Verfahren schließen die Herstellung von Schäumen mit einfacher oder doppelter Dichte durch die hierin beschriebenen Verfahren und darauf ein Aufbringen einer Biopolymer-Lösung, die weiterhin extrazelluläre Matrixteilchen einschließen kann, auf die Schäume ein, wodurch ein Biopolymer-beschichteter Schaum gebildet wird. Nachdem der Schaum beschichtet wurde, kann er gefriergetrocknet werden.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Herstellung von Schäumen mit einfacher oder doppelter Dichte, die mit extrazellulären Matrixteilchen beschichtet sind. Diese Verfahren schließen die Herstellung von Schäumen mit einfacher oder doppelter Dichte durch die hierin beschriebenen Verfahren und das darauf Aufbringen extrazellulärer Matrixteilchen, beispielsweise von extrazellulären Matrixteilchen, die in einer Kollagen-Suspension suspendiert sind, auf die Schäume ein, wodurch ein mit extrazellulären Matrixteilchen beschichteter Schaum gebildet wird. In einer Ausführungsform kann der beschichtete Schaum gefriergetrocknet werden.
Die Biopolymerschäume und Schaumzusammensetzungen der Erfindung, mit oder ohne extrazellulären Matrixteilchen, können beispielsweise als Hautersatz oder Hautverbände, Gefäß-Implantate, orthopädische Implantate, Zahn-Implantate, Bindegewebs-Implantate, beispielsweise Knorpel-Implantate, urologische Implantate und Drüsen-Implantate verwendet werden. Typischerweise werden die Biopolymerschäume und Schaumzusammensetzungen mit Zellen konditioniert. In einer bevorzugten Ausführungsformn können die Biopolymer-Schäume und Schaumzusammensetzungen als Hautverbände verwendet werden. Der Hautverband kann ein zusammengesetzter Biopolymerschaum sein, der einen Kollagenschaum mit einfacher Dichte und einen Kollagenschaum mit doppelter Dichte einschließt. Der Biopolymerschaum mit einfacher Dichte kann mit humanen dermalen Fibroblasten konditioniert werden und der Schaum mit doppelter Dichte kann mit humanen Keratinozyten konditioniert werden, so dass eine Hornhautschicht gebildet wird. Nach der Zellkonditionierung können die Biopolymerschäume der Zusammensetzung mit einfacher und doppelter Dichte gefriergetrocknet werden. In einer weiteren Ausführungsform kann der Hautverband ein Biopolymerschaum mit doppelter Dichte sein, der im gesamten Schaum dispergierte dermale bzw. Hautfibroblasten und Epidermis-Zellen auf der Oberfläche des Schaumes aufweist.
Die Schäume und Schaumzusammensetzungen der Erfindung können ebenfalls als Gefäßprothesen verwendet werden. In einer Ausführungsform ist die Gefäßprothese ein Biopolymerschaum mit doppelter Dichte oder ein zusammengesetzter Biopolymerschaum in Form eines Rohres. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die rohrförmige Gefäßprothese Endothelzellen auf ihrer luminalen Oberfläche und glatte Muskelzellen auf ihrer gesamten und ihrer abluminalen Oberfläche auf. Die Gefäßprothese kann ebenfalls eine Schicht aus Adventitialzellen auf den glatten Muskelzellen einschließen. Nach der Zellkonditionierung kann der Biopolymerschaum mit doppelter Dichte oder der zusammengesetzte Biopolymerschaum der Gefäßprothese gefriergetrocknet werden.
Orthopädische und dentcle Implantate können ebenfalls aus dem Schaum und den Schaumzusammensetzungen der Erfindung, mit oder ohne extrazelluläre Matrixteilchen, gebildet werden. Typischerweise schließen die Schaum und Schaum-Bestandteile, die als orthopädische und dentcle Implantate verwendet werden, Kalziumphosphatzement ein. Ein Beispiel für ein solches Dental-Implantat ist ein Alveolarkamm- bzw. Kieferkamm-Bildner, der aus einem Biopolymerschaum mit doppelter Dichte in Form eines Rohres zusammengesetzt ist, der resorbierbaren Kalziumphosphatzement enthält. Alternativ können die Biopolymerschäume und Schaumzusammensetzungen so hergestellt werden, dass sie Hydroxyapatit einschließen und beispielsweise als Dental-Implantate verwendet werden. Ein Alveolarkamm-Substitut bzw. -Ersatz, das einen Biopolymerschaum mit doppelter Dichte in Form eines Rohres einschließt, das nicht-resorbierbares Hydroxyapatit enthält, ist ein Beispiel für ein solches Dental-Implantat.
Ebenfalls hierin betrachtet werden Dental-Implantate, die zur Förderung der Heilung des Parodontiums und der Knochenneubildung in der Lage sind und Verfahren zur Förderung der Heilung bzw. Reparatur und der Knochenneubildung unter Verwendung dieser Implantate. Typischerweise schließen diese Dental-Implantate einen schürzenförmigen Biopolymerschaum doppelter oder vierfacher Dichte ein. In einer Ausführungsform schließt der schürzenförmige Biopolymerschaum mit doppelter oder vierfacher Dichte eine Ausstülpung ein, die Kalziumphosphatzement enthält. Um die Heilung des Parodontiums und die Knochenneubildung zu fördern, wird ein Zahnbereich, der die Heilung von Parodontium und die Knochenneubildung erfordert, mit dem schürzenförmigen Schaum in Berührung gebracht, beispielsweise durch Binden der Schnürchen des Biopolymerschaums mit doppelter oder vierfacher Dichte um einen Zahn herum, um die Schürze an einem Zahnbereich zu befestigen, der die Heilung des Parodontiums und die Knochenumformung bzw. -neubildung erfordert.
Bei einem noch weiteren Aspekt können die Biopolymerschäume und Schaumzusammensetzungen der Erfindung als Bindegewebs-Implantate verwendet werden, beispielsweise als Knorpel-, Sehnen-, Bänder-Implantate. In einer Ausführungsform werden die Schäume und Schaumzusammensetzungen als Knorpel-Implantate hergestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform schließen die Knorpel-Implantate ein Substrat ein, das eine Biopolymerlösung und einen Kalziumphosphatzement einschließt, in den ein Zement und ein Biopolymerschaum mit einfacher oder doppelter Dichte in einer Oberfläche des zementartigen Substrats, beispielsweise durch Gefriertrocknen, eingebettet wurde. Der Biopolymerschaum mit einfacher oder doppelter Dichte des Knorpel-Implantats kann mit Knorpelzellen beimpft bzw. besät werden. In einer weiteren Ausführungsform werden die Schäume und Schaumzusammensetzungen als Band-Implantate hergestellt. Typischerweise sind die Band-Implantate aus einer Vielzahl von Biopolymer-Filamenten und aus einem Biopolymerschaum mit einfacher oder doppelter Dichte zusammengesetzt.
Bei einem noch weiteren Aspekt der Erfindung werden Schäume und Schaumzusammensetzungen als Drüsen-Implantate hergestellt. Die Drüsen-Implantate können aus einem Schaum oder einer Schaumzusammensetzung, die hierin beschrieben sind, hergestellt werden und können extrazelluläre Matrixteilchen einschließen, die aus Drüsengewebe gewonnen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Drüsengewebe ebenfalls mit geeigneten Drüsenzellen besät werden, beispielsweise mit Pankreasinsel-Zellen, Hepatozyten.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung umfasst Biopolymerschäume, zusammengesetzte Biopolymerschäume, biokompatible Konstrukte, die Biopolymerschäume und extrazelluläre Matrixteilchen umfassen und Verfahren zur Herstellung und Verwendung dieser Schäume und Schaumzusammensetzungen. Ein Biopolymer ist ein Polymer, das zur Einbringung in einen lebenden Organismus, beispielsweise ein Säugetier, beispielsweise einen Menschen, geeignet ist. Vorzugsweise ist das Biopolymer nicht-toxisch und bioabsorbierbar, wenn es in einen lebenden Organismus eingebracht wird, und alle Abbauprodukte des Biopolymers sind ebenfalls für den Organismus nicht toxisch. Die Biopolymere der Erfindung können zu biokompatiblen Schäumen, beispielsweise Schäumen mit einfacher oder doppelter Dichte, zu zusammengesetzten Schäumen und biokompatiblen Konstrukten ausgebildet werden, die Biopolymerfasern, beispielsweise Kollagenfasern, Biopolymergewebe, beispielsweise Kollagengewebe und/oder extrazelluläre Matrixteilchen einschließen. Beispiele für Biopolymere, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Kollagen, Alginsäure, Polyvinylalkohol, Proteine, beispielsweise Chondroitinsulfat, Elastin, Laminin, Heparinsulfat, Fibronektin und Fibrinogen ein. In einer Ausführungsform kann eine Kombination oder ein Gemisch aus einem oder mehreren Biopolymeren zur Bildung der Biopolymer-Formen verwendet werden, beispielsweise von Fasern, Schäumen und Schaumzusammensetzungen der Erfindung. Beispielsweise kann eine Kombination aus Chrondroitinsulfat und Fibronektin zur Ausbildung von Biopolymerfasern, die hierin beschrieben sind, verwendet werden. Ein bevorzugtes Biopolymer ist Kollagen.
Bevorzugte Quellen für Biopolymere schließen Säugetiere wie beispielsweise Schweine, fötale Schweine nahe dem Geburtstermin, Schafe und Kühe ein. Weitere Quellen für die Biopolymere schließen sowohl Land- als auch Meeres-Wirbeltiere und Wirbellose ein. In einer Ausführungsform kann das Kollagen aus der Haut von Hausschweinföten nahe dem Entbindungstermin gewonnen werden, die vollständig in ihrer Amnionmembran eingeschlossen gewonnen werden. Kollagen oder Kombinationen von Kollagentypen können in den Schäumen und Schaumzusammensetzungen, die hierin beschrieben sind, verwendet werden. Eine bevorzugte Kombination von Kollagentypen schließt Kollagentyp I, Kollagentyp III und Kollagentyp IV ein. Bevorzugte Säugetiergewebe, aus denen das Biopolymer extrahiert wird, schließen ganze Säugetierföten, beispielsweise Schweineföten, -haut, -sehnen, -muskeln- und -bindegewebe ein. Als Kollagenquelle sind fötale Gewebe von Vorteil, weil das Kollagen in fötalen Geweben nicht so stark vernetzt ist wie in adulten Geweben. Somit wird, wenn das Kollagen unter Verwendung einer Säure-Extraktion extrahiert wird, ein größerer Prozentsatz an intakten Kollagenmolekülen aus fötalen Geweben im Vergleich zu adulten Geweben gewonnen. Fötale Gewebe schließen ebenfalls verschiedene molekulare Faktoren ein, die in normalem Gewebe in unterschiedlichen Stadien der Tierentwicklung vorliegen.
Die Biopolymere können zur Erzeugung von Schäumen verwendet werden, beispielsweise von Schäumen mit einfacher oder doppelter Dichte, die in jeder Form oder Ausformung vorliegen können, beispielsweise Streifen, Blätter, Röhren etc. Zusätzlich können die Biopolymere dazu verwendet werden, Schäume zu erzeugen, die dann mit einem Polymernetz kombiniert werden, beispielsweise einem Teflon-Netz oder die mit Gewebskultur-Inserten für Multiwell-Platten verwendet werden können, die als Gussformen verwendet werden, in denen Schäume und Schaumzusammensetzungen der Erfindung für eine Zellkultur gebildet werden können. Polymernetze, die mit den Schäumen und Schaumzusammensetzungen der Erfindung verwendet werden, können Zellen, die auf oder innerhalb der Schäume oder Schaumzusammensetzungen enthalten sind, gegenüber der Atmosphäre exponieren, wenn beispielsweise die Schäume und Schaumzusammensetzungen als Hautäquivalente zur Simulierung der Bildung von Hornhaut verwendet werden. Sowohl die Netze als auch die Kultur-Inserte weisen den Vorteil auf, ein Mittel zur Handhabung der Schäume und Schaumzusammensetzungen bereitzustellen, ohne eine tatsächliche Berührung mit den Schäumen oder Schaumzusammensetzungen zu erfordern. Die Formen und Ausformungen, in denen die Schäume und Schaumzusammensetzungen hergestellt werden, können solche der zu ersetzenden Gewebe und Körperteile nachahmen und können somit als Prothesen oder Transplantate verwendet werden, wobei die Gewebszellen umgeformt werden, um eine Regeneration eines Ersatzgewebes im Empfänger zu fördern. Extrazelluläre Matrixteilchen und/oder lebensfähige Zellen können ebenfalls den Biopolymeren zugesetzt werden, um das Zellwachstum und die Gewebsentwicklung und Organisation innerhalb der Schäume weiter zu fördern.
Die Biopolymerschäume können Schäume mit einzelner oder doppelter Dichte sein. Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Schaum" ein Netzwerk von miteinander in Verbindung stehenden Mikrokompartimenten, wobei Biopolymer-Moleküle und/oder Biopolymer-Filamente in den Wänden der Mikrokompartimente eingelagert sind. Der Begriff „Schaum mit einfacher Dichte" betrifft einen Biopolymerschaum, der zumindest zwei der folgenden Eigenschaften aufweist: 1) Er weist Mikrokompartimente mit den Volumendimensionen x, y und z auf, wobei x = Länge, y = Breite und z = Höhe, die im Wesentlichen gleich sind. Typischerweise bewegen sich x, y und z von ungefähr 1 μm bis ungefähr 300 μm, vorzugsweise von ungefähr 20 μm bis ungefähr 200 μm, besonders bevorzugt von ungefähr 40 μm bis ungefähr 150 μm und am meisten bevorzugt von ungefähr 50 μm bis ungefähr 100 μm; 2) er weist Mikrokompartimente mit einer durchschnittlichen Wanddicke von weniger als ungefähr 10 μm auf; 3) er weist Mikrokompartimente mit Wänden auf, die Biopolymer-Fasern und/oder -Filamente einschließen; 4) er ist in wässrigen Lösungen physikalisch bzw. physisch stabil; 5) er ist für lebende Organismen nicht toxisch; und 6) er kann als Substrat für Zellbindung und Wachstum dienen. Die Schäume mit einfacher Dichte erhalten ihre Struktur, wenn sie beispielsweise in wässriger Pufferlösung oder Gewebskulturmedium hydratisiert sind. Zusätzlich kann die dreidimensionale Struktur der Schäume mit einfacher Dichte die Organisation von Zellen, die in diese eingesät werden, unterstützen. Schäume mit einfacher Dichte können, wenn sie aus Kollagen und ohne Zellen hergestellt werden, in einfacher Weise mit Kollagenase, beispielsweise 0,1% Kollagenase, digeriert bzw. verdaut werden. Wenn sie hydratisiert sind, ist die Höhe der Standardschäume mit einfacher Dichte für Forschungsprodukte typischerweise 1 mm. Beispiele für Ausprägungen von Kollagenschaum-Produkten mit einfacher Dichte, beispielsweise Größen, Kollagengehalt, sind in Tabelle 1 zu finden:
Tabelle 1
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Schaum mit doppelter Dichte" einen Biopolymerschaum mit zumindest zwei der folgenden Eigenschaften: 1) Er weist Mikrokompartimente mit den Volumendimensionen x, y und z auf wobei x = Länge, y = Breite und z = Höhe, von denen zwei im Wesentlichen gleich sind und die dritte hiervon um einen Faktor von zumindest ungefähr 10 gesenkt oder vermindert ist und insbesondere zumindest ungefähr 20 oder mehr gesenkt oder vermindert ist im Vergleich zu derselben Dimension im Schaum mit einfacher Dichte und kann sich von ungefähr 1 μm bis ungefähr 300 μm bewegen, vorzugsweise von ungefähr 20 μm bis ungefähr 200 μm, besonders bevorzugt von ungefähr 40 μm bis ungefähr 150 μm und am meisten bevorzugt von ungefähr 50 μm bis ungefähr 100 μm; 2) er weist Mikrokompartimente mit einer durchschnittlichen Wanddicke von weniger als ungefähr 10 μm auf; 3) er weist Mikrokompartimente mit Wänden auf, die Biopolymer-Fasern und/oder -Filamente einschließen; 4) er ist in wässrigen Lösungen physisch bzw. physikalisch stabil; 5) er ist für lebende Organismen nicht toxisch; und 6) er kann als Substrat für die Zellanbindung und -wachstum dienen. Die Schäume mit doppelter Dichte sind, wenn sie aus Kollagen hergestellt sind, gegenüber einer Kollagenase-Verdauung in einem größeren Umfang beständig als Schäume mit einfacher Dichte, die aus Kollagen hergestellt sind, beispielsweise aus ungefähr dreimal bis ungefähr fünfmal oder mehr beständiger gegenüber 0,1% Kollagenase als Schäume mit einzelner Dichte. Schäume mit doppelter Dichte, die aus Kollagen hergestellt wurden, weisen ebenfalls eine höhere Kollagendichte pro Volumeneinheit auf als der Kollagengehalt pro Volumeneinheit Schäume mit einfacher Dichte. Wenn sie hydratisiert sind, ist die Höhe der Schäume mit doppelter Dichte typischerweise von ungefähr 0,2 mm bis ungefähr 0,4 mm. Jede Oberfläche des Schaumes mit doppelter Dichte stellt ein Substrat bereit, das zum Ausplattieren von Epithel-Endothel- und Mesothel-Zellen geeignet ist, die Blätter bilden können. Mesenchymale Zellen können ebenfalls auf die Schäume mit doppelter Dichte aufgesät werden. Die Schäume mit doppelter Dichte können in denselben Größen und denselben Formen produziert werden, beispielsweise in jeder Form und in Kombination und gebunden an ein Polymernetz oder als Multiwell-Platteninsert wie die Schäume mit einfacher Dichte. Zellen, die sowohl auf Schäumen mit einfacher als auch doppelter Dichte der Erfindung wachsen, weisen Morphologien auf, die für Zellen aus dreidimensionalen Geweben charakteristisch sind und die ein normales interzelluläres Verhältnis ausbilden können, d. h. interzelluläre Verhältnisse wie solche in dem Gewebe, aus dem sie stammen oder gewonnen werden.
Schäume der Erfindung mit einfacher Dichte können durch Ausbilden einer Biopolymer-Lösung, Gefriertrocknen der Lösung zur Bildung eines Biopolymerschaums und Vernetzen des Biopolymerschaums hergestellt werden. In einer weiteren Ausführungsform kann der Schaum durch Durchführen des Vernetzungsschrittes vor dem Gefriertrocknungsschritt gebildet werden. Der Schritt des Gefriertrocknens wandelt die Biopolymer-Lösung zu einem Schaum um, d. h. ein Netzwerk von miteinander in Verbindung stehenden Mikrokompartimenten mit Biopolymer-Molekülen und/oder -Filamenten, die in den Wänden der Mikrokompartimente eingelagert sind. Wenn der Schaum vernetzt wird, wird er physisch stabil und in wässrigen Lösungen unlöslich. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Biopolymer-Lösung vor dem Gefriertrocknen zur Bildung eines Biopolymer-Gerüstes polymerisiert. Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Biopolymer-Gitter" ein Netzwerk aus Biopolymer-Filamenten, in das eine Flüssigkeit eingefangen ist. Biopolymer-Filamente sind Nanometer-große Formen aus polymerisierten Biopolymer-Molekülen. Falls beispielsweise das Biopolymer Kollagen ist, polymerisiert das Kollagen durch einen Prozess des Selbstzusammenbaus zu Filamenten von Nanometer-Größe.
Schäume mit doppelter Dichte weisen eine Zugfestigkeit auf, die größer als diejenige von Schäumen mit einfacher Dichte ist, und können durch weiteres Verarbeiten der Schäume mit einfacher Dichte erzeugt werden. Nachdem ein Schaum mit einfacher Dichte gefriergetrocknet wird, kann er beispielsweise mit einem sterilen wässrigen Puffer hydratisiert werden. Wenn der hydratisierte Schaum mit einfacher Dichte weiter ausgeformt werden soll, so dass er eine ausgewählte Form aufweist, kann er beispielsweise in, auf oder um eine erwünschte Form herum gegossen oder geformt werden, er kann beispielsweise um eine Spindel bzw. Welle gegossen werden, um eine rohrförmige Form zu bilden, oder er kann zwischen einem Block und einem Sieb eingepasst werden, die durch Spacer ausgewählter Größen beabstandet sind, beispielsweise von 0,5 mm. Geformte hydratisierte Schäume mit einfacher Dichte und flache, hydratisierte Schäume mit einfacher Dichte werden dann getrocknet, beispielsweise bei einer Temperatur von nicht mehr als ungefähr 37°C bis 40°C unter sterilen Bedingungen getrocknet. Bei Temperaturen von mehr als ungefähr 37°C beginnt das Biopolymer in den Schäumen zu denaturieren. Der sich ergebende Schaum mit doppelter Dichte weist eine ausgewählte Diclce auf, beispielsweise ungefähr 0,2 mm, wenn er mit Spacern von 0,5 mm wie oben beschrieben, eingelegt ist und behält die Fasern, Wände und zweidimensionale Form bei, jedoch nicht die Mikrokompartiment-Größen der Schäume mit einfacher Dichte. Der Schaum mit doppelter Dichte ist steif, wenn er trocken ist, und biegsam, wenn er feucht bzw. nass ist. Er ist gegenüber einem Abreißen und einer enzymatischen Verdauung in einem viel größerem Umfang gegenüber beständig als der Schaum mit einfacher Dichte. Im Gegensatz zum Schaum mit einfacher Dichte ist der Schaum mit doppelter Dichte eine Dichtematrix, die als Substrat für Zellen bevorzugt wird, die normalerweise auf Oberflächen wachsen, wie beispielsweise Epithelzellen und Endothelzellen. Beispielsweise kann ein Schaum mit doppelter Dichte in Form eines Rohres zur Verwendung zur Rekonstruktion von Gefäßen oder Leitungen oder als ein Blatt bzw. eine Folie ausgebildet werden, die an großen Flächen mit Nieten befestigt werden. Alternativ kann der Schaum mit doppelter Dichte mit mesenchymalen Zellen, wie beispielsweise Fibroblasten, Muskelzellen, Knorpelzellen etc. besät werden.
Der Schaum mit doppelter Dichte kann, wenn er unter Verwendung von Kollagen als Biopolymer hergestellt wird, aufgrund seiner erhöhten Kollagenase-Beständigkeit als Periodontal-Prothese zur Bildung einer Barriere zum Einwachsen bestimmter Zellen verwendet werden, beispielsweise von Epithelzellen, die die Regeneration von Periodontal-Gewebe stören, während sie ein Substrat in Form eines Biopolymerschaums mit einfacher Dichte zum Wachstum der geeigneten Perdiodontal-Zellen bereitstellen, die das Schaumprodukt tatsächlich umformen und ersetzen. Zusätzlich kann ein Biopolymerschaum mit einfacher Dichte und ein Biopolymerschaum mit doppelter Dichte zu einem zusammengesetzten Biopolymer-Produkt als unterschiedliche Schichten kombiniert werden, wenn die Eigenschaften jedes der Schäume Umgebungen bereitstellt, die beispielsweise das Anlocken, Wachstum ausgewählter Zelltypen begünstigen. Wenn beispielsweise ein zusammengesetzter Schaum zur Verwendung als Hautäquivalent oder -verband hergestellt wird, können Keratinozyten dazu verwendet werden, den Schaum mit doppelter Dichte zu besäen, während dermale Fibroblasten dazu verwendet werden können, den Schaum mit einfacher Dichte zu besäen.
Die Biopolymer-Lösung, die durch Behandlung des Biopolymers in einer solchen Weise gebildet werden kann, dass es löslich wird, beispielsweise durch Verändern des pHs, um es in eine Lösung zu überführen, kann unter Verwendung von Polymerisationsverfahren polymerisiert werden, die in der Technik bekannt sind. Beispielsweise kann das Biopolymer, beispielsweise Kollagen, zur Bildung eines Biopolymer-Gitters durch Veränderung bzw. Manipulation des pHs der Biopolymer-Lösung polymerisiert werden, beispielsweise durch Exposition gegenüber Ammonium-Dampf oder durch Zusetzen einer Base. Wenn der pH der Lösung die Neutralität erreicht, polymerisiert das Biopolymer. Die Geschwindigkeit der Polymerisation ist der Temperatur proportional und kann durch Regulieren der Temperatur der Kollagen-Lösung gesteuert werden.
Nachdem das Biopolymer zur Bildung eines Biopolymer-Gitters polymerisiert wurde, kann es gefriergetrocknet und/oder vernetzt werden. Typischerweise hängt die Größenordnung bzw. die Reihenfolge dieser Schritte von dem verwendeten Vernetzungsverfahren ab. Wenn das Vernetzungsverfahren beispielsweise ein Flüssigphasen-Verfahren ist, beispielsweise die Verwendung von Lysyloxidase zum Vernetzen von Kollagen oder die Verwendung von aldehydischen Vernetzungsmethoden, wird der Vernetzungsschritt vor dem Gefriertrocknungsschritt durchgeführt.
Wenn alternativ das Vernetzungsverfahren ein Festphasenverfahren ist, beispielsweise die Verwendung von Ultraviolettstrahlung, wird der Vernetzungsschritt nach dem Gefriertrocknungsschritt durchgeführt. Eine Vernetzung des Biopolymers kann durch Verwendung von Vernetzungsverfahren erreicht werden, die in der Technik bekannt sind.
Beispielsweise kann das Biopolymer durch Aussetzen bzw. Unterziehen einer Ultraviolettstrahlung oder durch Behandlung mit chemischen Vernetzungsmitteln wie beispielsweise Carbodiimid, Glutaraldehyd, Acetaldehyd, Formaldehyd und Ribose, vernetzt werden. Das Biopolymer kann ebenfalls durch dehydrothermisches Vernetzen vernetzt werden.
In einer Ausführungsform kann vor dem Gefriertrocknen ausgewähltes Verstärkungsmaterial den Biopolymer-Lösungen zugesetzt werden. Solche Verstärkermaterialien schließen Biopolymerfasern, Fäden, beispielsweise gewobene oder gesponnene Fäden und/oder Gewebe, beispielsweise Vliesstoffe ein, die beispielsweise durch Textil-Verfahren hergestellt wurden. Biopolymerfäden, beispielsweise Kollagen-Fäden, können durch Extrudieren des Biopolymers in Lösung in einem Koagulationsbad und Übertragen des Biopolymers zu einem Bad hergestellt werden, das Ethanol oder Aceton oder eine andere Dehydratisierungs-Lösung enthält. Alternativ kann der Faden durch Unterziehen gegenüber einer Vakuum-Trocknung dehydratisiert werden. Der Biopolymerfaden kann dann beispielsweise durch hierin beschriebene Verfahren vernetzt werden. Ein Beispiel für eine Vorrichtung zum Spinnen und Verarbeiten einer Biopolymerfaser, beispielsweise einer Kollagen-Faser, ist im US-Patent Serien-Nr. 081333,414, eingereicht am 02. November 1994, beschrieben, dessen Inhalt hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit aufgenommen sind. Die Fäden können darauf getrocknet, aufgespult werden, indem beispielsweise der sich bewegende Faden über mehrere Walzen gezogen wird, indem dieser gedehnt und getrocknet wird und dann auf Spulen gewickelt wird. Die Fäden können zu einem Stoff oder anderen komplexen Formen oder Konstrukten zur wie hierin beschriebenen Verwendung gewoben oder gesponnen werden.
Biopolymerfasern, beispielsweise Vlies-Biopolymerstoffe sind typischerweise aus einer Matte aus verwickelten Biopolymerfasern ausgewählter Größe und Dichte zusammengesetzt. Typischerweise werden die Biopolymer-Vliesstoffe durch Aufspulen einer trockenen Biopolymerfaser auf eine Trommel eines Umfanges erzeugt, die demjenigen der Länge jedes individuellen Faserelementes gleich ist. Das Aufspulen wird fortgeführt, bis die Anzahl an Umwicklungen der Faser auf der Trommel der Anzahl der Faserstücke gleicht, die für den Stoff erforderlich sind. Ein Schnitt wird dann entlang der aufgewickelten Faser in einer Richtung vorgenommen, die zur Trommelachse parallel ist und die Fasern werden von der Trommel entfernt. Die Faser kann darauf vernetzt werden, wenn sie nicht bereits früher vernetzt wurde. Die Faser wird dann in einem Volumen einer Phosphatpuffer-Lösung für eine Zeitspanne dispergiert, um ihren pH zu senken und die Faser zu erweichen. Die Faser wird auf ein Volumen Wasser übertragen und mechanisch gerührt, um ein Verwickeln der Faser-Stränge zu erzeugen. Die verwickelten Faser-Stränge werden aus dem Wasser auf einen Kollagen-Schirm bzw. -Sieb gesiebt, bis sie das Sieb mit einer Matte gleichförmiger Dichte beschichten. Die Matte wird darauf auf dem Sieb oder nach Übertragen auf eine andere Oberfläche, Sieb oder Zellkulturvorrichtung getrocknet. Falls es erwünscht ist, kann die Vliesmaterial-Matte nach dem Trocknen in kleinere Formen geschnitten oder ausgestanzt werden.
In einer Ausführungsform kann, wenn das Biopolymer Kollagen ist, das Kollagen mit einem Enzym behandelt werden, beispielsweise mit Lysyloxidase, das das Kollagen für das Benetzen vorbereitet. Lysyloxidase, die aus einer Vielzahl von Quellen aufgereinigt werden kann, einschließlich beispielsweise Kalbsaorta, humaner Plazenta, Hühnerembryoepiphysenknorpel, Schweinehaut (siehe Shackleton, D. R. und Hulmes, D. J. S. (1990), Biochem. J. 266: 917–919) und mehrerer Orte in Schweineembryos, wandelt die ε-Aminogruppe von Lysin zu einem Aldehyd um. Dieses Aldehyd ist eine reaktive funktionelle Gruppe, die spontan an andere Lysin-ε-Aminogruppen oder andere Aldehyde auf anderen Kollagen-Molekülen bindet, um irreversible kovalente Vernetzungen zu bilden. Das Ergebnis besteht darin, dass Kollagen unlöslich wird. Lysyloxidase kann den Kollagen-Lösungen unter Bedingungen zugesetzt werden, die die Aldehyd-Umwandlung der Lysine ermöglichen. Die Lysyloxidase wird darauf aus der Kollagen-Lösung entfernt und das Kollagen wird wie hierin beschrieben, während sich spontane Vernetzungen bilden, verarbeitet. Beispielsweise bilden sich während der Prozessierung bzw. Verarbeitung der Kollagenschäume, beispielsweise während der Polymerisation und Gefriertrocknungsschritten, die Querverbindungen spontan, wenn die Konzentration an Kollagen pro Volumeneinheit zunimmt. Die Lysyloxidasevermittelte Verbindung ist stark, irreversibel und ist eine Bindung, die natürlicherweise in Kollagen zu finden ist. Das auf diese Weise vernetzte Kollagen ist unlöslich und lediglich einem spezifischen enzymatischen Angriff während der Umformung von Geweben gegenüber empfindlich. Lysyloxidase kann ebenfalls dazu verwendet werden, Kollagen zur Verwendung als Schäume und Schaumzusammensetzungen ebenso wie als Fasern, Gels etc. zu vernetzen.
Die Biopolymer-Lösung kann dann zur Bildung eines Schaumes gefriergetrocknet werden. In einer Ausführungsform ist der Einfrierschritt ein kontrollierter Einfrierschritt, der gemäß dem in US-Patent Nr. 4 531 373 beschriebenen Verfahren durchgeführt wird, dessen Inhalt durch diese Bezugnahme hierin mit aufgenommen ist. Der Gefriertrocknungszyklus schließt typischerweise ein Einfrieren, eine Evakuierung und Trocknungsphasen ein. Die Friertemperaturen, die zur Bildung der Biopolymerschäume der Erfindung geeignet sind, hängen von der Konzentration des Biopolymers in Lösung oder im Biopolymer-Gitter ab. Somit ist für ein Kollagen-Gitter, bei dem das Kollagen in einer Konzentration von ungefähr 5 mg/ml vorliegt, die Einfriertemperatur typischerweise weniger als –26°C. Das Kollagen-Gitter wird dieser Temperatur für eine Zeitspanne von ungefähr 1 Stunde gegenüber ausgesetzt. Ein Vakuum wird dann an das Kollagen-Gitter angelegt, wenn die Temperatur langsam gesenkt wird.
Um die Bildung von Rissen im Schaum zu verhindern und somit eine größere Schaumgröße zu ermöglichen, kann ein Gefrierschutzpolypeptid (AFP) oder ein Gefrierschutzglykoprotein (AFGP) der Biopolymer-Lösung vor oder während dein Einfrierschritt zugesetzt werden. Beispiele für AFPs schließen die AFPs ein, die zu den AFP Typen I, II und III gehören. Bezüglich einer ausführlichen Beschreibung der unterschiedlichen Typen von AFPs siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5 358 931, PCT-Veröffentlichung WO92/12722 und PCT-Veröffentlichung WO91/10361.
Diese Polypeptide und Glycoproteine verhindern die Bildung großer Eiskristalle während des Einfrierens der Biopolymer-Lösung und verhindern ebenfalls die Bildung von Kristallen bei einer Umkristallisierung während des Trocknungsverfahrens. Große Eiskristalle können Risse im sich ergebenden Schaum erzeugen, die zu einer schlechten Vernetzung und einer Aufsplitterung des Schaumes beitragen. Die Verwendung von AFPs und AFGPs ermöglicht die Bildung einer Porenstruktur, die miteinander in Verbindung stehende Kanäle aufweist und somit die Kohäsion verschiedener Abschnitte des Schaumes ermöglicht. Dieses Merkmal verbessert die Qualität der Schäume und ermöglicht die Produktion großer Schäume. Wenn beispielsweise eine AFP oder eine Kombination aus AFPs mit dem Biopolymer in hohen Konzentrationen gefriergetrocknet wird, beispielsweise ungefähr 0,2 bis 0,5 mg/ml (ungefähr 124 μm) reduziert diese drastisch die normalen Schaumporen, bis der Schaum eng gepackten langen Fasern ähnelt. Die unter Verwendung der AFPs in einem Gefrierzyklus erzeugten Schäume können beispielsweise als Implantate verwendet werden, die spezielle zelluläre Prozesse, beispielsweise durch Wachstum entlang der Fasern, dirigieren bzw. leiten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Biopolymer-Lösung eine Kollagen-Lösung. Das in dieser Lösung verwendete Kollagen kann durch Salzextraktion, Säureextraktion und/oder Pepsin-Extraktion aus dem Ausgangsmaterial erzeugt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das in dieser Lösung verwendete Kollagen durch aufeinanderfolgendes Reinigen zweier Formen von Kollagen aus demselben Kollagen enthaltenden Ausgangsmaterial erzeugt. Zunächst wird intaktes Kollagen aus dem Ausgangsmaterial Säure-extrahiert. Als Nächstes wurde trunkiertes Kollagen, d. h. Kollagen, aus dem die Telopeptide abgespalten wurden und lediglich den helikalen Anteil zurücklassen, aus dem Ausgangsmaterial unter Verwendung eines Enzyms extrahiert, beispielsweise eines Enzyms, das bei einem sauren pH funktionell ist, beispielsweise eine Pepsin-Extraktion. Das extrahierte Kollagen kann als Kollagen-Lösung hergestellt werden, beispielsweise durch Ausfällen des Kollagens mit Natriumchlorid und Lösen des Kollagens in einem Medium mit einem sauren pH.
Die Biopolymerschäume mit einfacher und doppelter Dichte gemäß der Erfindung können zur Bildung zusammengesetzter Biopolymerschäume kombiniert werden. Somit schließen zusammengesetzten Biopolymerschäume der Erfindung zumindest eine Schicht eines Biopolymerschaums mit einfacher Dichte und zumindest eine Schicht aus einem Schaum mit doppelter Dichte ein. Jede oder beide dieser Schaumschichten im zusammengesetzten Schaum können mit Zellen vor Verwendung des zusammengesetzten Schaums in vitro oder in vivo konditioniert werden. Die zusammengesetzten Biopolymerschäume werden typischerweise erzeugt oder hergestellt, indem ein Biopolymerschaum mit doppelter Dichte bereitgestellt wird, der wie hierin beschrieben erzeugt wird, indem der Biopolymerschaum mit doppelter Dichte hydratisiert wird und darauf eine Biopolymerlösung dem Biopolymerschaum mit doppelter Dichte zugesetzt wird. Der Biopolymerschaum mit doppelter Dichte zusammen mit der Biopolymerlösung wird gefriergetrocknet, um einen zusammengesetzten Biopolymerschaum zu erzeugen.
Biokompatible Konstrukte, die Biopolymerschäume der Erfindung und extrazelluläre Matrixteilchen einschließen, werden hierin insbesondere betrachtet. Extrazelluläre Matrixteilchen oder extrazelluläre Matrixteilchen, die in einer Biopolymerlösung dispergiert oder suspendiert sind, können ebenfalls auf und/oder in die Schäume und Schaumzusammensetzungen der Erfindung auf- bzw. eingebracht werden, wodurch sich ein Schaum mit extrazellulären Matrixteilchen bildet. Wie hierin verwendet betrifft der Begriff „extrazelluläre Matrixteilchen" ein Fragment oder eine extrazelluläre Matrix, die aus einer Gewebsquelle gewonnen werden, die vorher lebende Zellen aufwies, die jedoch so bearbeitet wurde, dass die Zellen entfernt wurden und nicht-zelluläre extrazelluläre Matrixfaktoren zurückbleiben, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren, die für das Zellwachstum, die Morphogenese und Differenzierung notwendig sind. Verfahren zur Ausbildung extrazellulärer Matrixteilchen zur Erzeugung von Transplantat-Gewebe sind in der US-Patentanmeldung Serien-Nr. 07/926 885, eingereicht am 07. August 1992, US-Patentanmeldung Serien-Nr. 08/302 087, eingereicht am 06. September 1994 und US-Patentanmeldung Nr. 08/471 535, eingereicht am 06. Juni 1995, offenbart.
Die Verfahren zur Ausbildung extrazellulärer Matrixteilchen schließt ein Einfrieren einer Gewebsquelle, beispielsweise einer Bindegewebsquelle, mit lebenden Zellen ein, wodurch die lebenden Zellen zur Bildung von Zellüberbleibseln zerstört werden, die beispielsweise aus zytoplasmatischen und Kern-Bestandteilen bestehen. Die Gewebsquelle wird dann beispielsweise durch Vermahlen, Waschen und Sieben zur Entfernung der zytoplasmatischen und Kern-Bestandteile ohne Entfernen der extrazellulären Matrix verarbeitet, einschließlich von Faktoren, die für das Zellwachstum, Migration, Differenzierung und Morphogenese notwendig sind. Die extrazelluläre Matrix wird gefriergetrocknet und beispielsweise cryovermahlen, um Teilchen mit definierter Größe zu erzeugen, so dass extrazelluläre Matrixteilchen gebildet werden.
Die extrazellulären Matrixteilchen können extrazelluläre Matrixproteine einschließen. Beispielsweise schließen extrazelluläre Matrixteilchen, die aus Haut gewonnen wurden, den transformierenden Wachstumsfaktor β1, Blutplättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor, basischen Fibroblastenwachstumsfaktor, epidermalen Wachstumsfaktor, Syndecan-1, Decorin, Fibronectin, Kollagene, Laminin, Tenascin und Dermatansulfat ein. Extrazelluläre Matrixteilchen aus der Lunge schließen Syndecan-1, Fibronectin, Laminin und Tenascin ein. Die extrazellulären Matrixteilchen können ebenfalls Zytokine einschließen, beispielsweise Wachstumsfaktoren, die für die Gewebsentwicklung notwendig sind. Der Begriff „Zytokin" schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf, Wachstumsfaktoren, Interleukine, Interferone und Kolonie-stimulierende Faktoren. Diese Faktoren liegen in normalem Gewebe in unterschiedlichen Stadien der Gewebsentwicklung vor, markiert durch Zellteilung, Morphogenese und Differenzierung. Zu diesen Faktoren zählen stimulierende Moleküle bzw. stimulatorische Moleküle, die die für die in vivo Gewebs-Heilung notwendigen Signale bereitstellen. Diese Zytokine können die Umwandlung eines Implantats in ein funktionelles Substitut bzw. Ersatz für das zu ersetzende Gewebe stimulieren. Diese Umwandlung kann durch Mobilisieren von Gewebszellen aus ähnlichen benachbarten Zellen eintreten, beispielsweise aus dem Kreislauf und aus Stammzellreservoirs. Die Zellen können sich an den Prothesen anlagern, die bioabsorbierbar sind und können diese zu Ersatz-Geweben umformen.
Wachstumsfaktoren, die zum Zellwachstum notwendig sind, werden an strukturelle Elemente der extrazellulären Matrix angebunden. Die strukturellen Elemente schließen Proteine, beispielsweise Kollagen und Elastin, Glycoproteine, Proteoglycane und Glycosaminoglycane ein. Die Wachstumsfaktoren, die ursprünglich von Zellen erzeugt und sezerniert werden, binden an die extrazelluläre Matrix und regulieren das Zellverhalten auf vielen Wegen. Diese Faktoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, epidermalen Wachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktor (basisch und sauer) Insulin-artiger Wachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor, Mastzell-stimulierender Faktor, die Familie des transformierenden Wachstumsfaktors-β, Blutplättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor, Scatter-Faktor bzw. Streu-Faktor, Hepatozyten-Wachstumsfaktor und Schwann-Zell-Wachstumsfaktor. Adams et al., „Regulation of Development and Differentiation by the Extracellular Matrix" Development, Bd. 117, Seiten 1183–1198 (1993) (hierin nachstehend „Adams et al.") und Kreis et al., Hsg. des Buchs mit dem Titel „Guidebook to the Extracellular Matrix and Adhesion Proteins", Oxford University Press (1993) (hierin nachstehend „Kreis et al.") beschreiben extrazelluläre Matrixbestandteile, die die Differenzierung und Entwicklung regulieren. Weiterhin offenbaren Adams et al. Beispiele für die Bildung von Wachstumsfaktoren mit extrazellulären Matrixproteinen und dass die extrazelluläre Matrix ein bedeutender Teil der Mikroumgebung sind und in Zusammenarbeit mit Wachstumsfaktoren eine zentrale Rolle beim Regulieren der Differenzierung und Entwicklung spielen.
Extrazelluläre Matrixteilchen können aus spezifischen Geweben gewonnen werden. Die teilchenförmigen Materialien weisen zwei Arten von Informations-Eigenschaften auf. Die erste ist ihre molekulare Vielfalt und die zweite ist ihre Mikroarchitektur, die beide bei der Herstellung der Mikroteilchen konserviert werden. Die bevorzugten Bindungen zwischen den unterschiedlichen Molekülen der extrazellulären Matrix werden ebenfalls bei der Herstellung der Mikroteilchen konserviert.
Die extrazelluläre Matrix spielt eine instruktive Rolle und leitet die Aktivität der Zellen, die von ihr umgeben ist oder die auf ihr organisiert sind. Weil die Ausführung von Zellprogrammen für die Zellteilung, Morphogenese, Differenzierung, Gewebsbildung und Regeneration von Signalen abhängt, die aus der extrazellulären Matrix entstehen, werden dreidimensionale Gerüste, wie beispielsweise Kollagenschäume, mit tatsächlichen Matrixbestandteilen angereichert, die die molekulare Vielfalt und die Mikroarchitektur einer generischen bzw. gattungsgemäßen extrazellulären Matrix zeigen und von extrazellulären Matrices von speziellen Geweben.
Um weiterhin zelluläre und molekulare Bindungsstellen auf den Oberflächen der Schäume und Schaumzusammensetzungen bereitzustellen, um beispielsweise Bindungsstellen zu ersetzen, die als Folge eines Vernetzungs-Verfahrens beeinträchtigt wurden, kann ein Beschichtungsprozess der Aufbringung extrazellulärer Matrixteilchen auf dem Kollagenschaum vorangehen oder diesen begleiten. Zusätzlich können künstliche Mikrostrukturen, die typischerweise eine Größe im Bereich von ungefähr zwischen 5 und 500 μm aufweisen, zusammengesetzt aus einem Matrixpolymer, wie beispielsweise Kollagen, mit anderen Proteinen, Proteoglycanen, Glycosaminoglycanen, extrazellulären Matrixenzymen, Zytokinen (einschließlich von Wachstumsfaktoren) und Glycosiden, in Form von feuchten oder trockenen teilchenförmigen Materialien erzeugt werden, die mit der Beschichtungslösung auf die Oberflächen des Kollagenschaumes aufgebracht werden können. Die ausgewählten Bestandteile können chemisch oder elektrostatisch an das Biopolymer gebunden werden oder können im Mikroteilchen-Gitter enthalten sein oder in einer dehydrierten bzw. dehydratisierten Form des Gitters. Somit ermöglicht die Erfindung ebenfalls Verfahren zur Herstellung von Kollagen-beschichteten Schäumen und extrazellulären Matrixteilchen-beschichteten Schäumen. Diese Verfahren schließen typischerweise das Ausbilden eines ausgewählten Typs an Biopolymerschaum, wie hierin beschrieben, und das Aufbringen einer Kollagen-Lösung oder einer extrazellulären Matrixteilchen-Lösung auf den gefriergetrockneten Schaum ein, wodurch der Kollagenbeschichtete oder extrazelluläre Matrixteilchen-beschichtete Biopolymerschaum gebildet wird. Die beschichteten Schäume können weiter gefriergetrocknet werden. In einer Ausführungsform schließt die Kollagen-Lösung weiterhin extrazelluläre Matrixteilchen ein.
Die Schäume und Schaumzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können als Substrate für das Zellwachstum in vitro und in vivo verwendet werden, beispielsweise zur Errichtung von Forschungsmodellsystemen. Beispielsweise können in einer Ausführungsform die Schäume und Schaumzusammensetzungen mit abnormalen Zellen besät werden, um Krankheitszustände, einschließlich Krebs, zu untersuchen. In einer weiteren Ausführungsform können die Schäume und Schaumzusammensetzungen als diagnostische Testmodelle zur Bestimmung chemotherapeutischer Strategien durch Auswahl von Mitteln dienen, die zum Abtöten von Krebszellen, die in oder auf den Schäumen kultiviert werden, in der Lage sind. In einer noch weiteren Ausführungsform können die Schäume und Schaumzusammensetzungen zum Testen der Toxizität verschiedener Substanzen verwendet werden, denen Zellen in oder an den Schäumen ausgesetzt werden.
Die Schäume und Schaumzusammensetzungen können ebenfalls als Prothesen verwendet werden, die in Empfänger eingebracht oder transplantiert werden können, beispielsweise in Säugetier-Empfänger, beispielsweise Menschen. Beispielsweise können die Schäume und Schaumzusammensetzungen als Prothesen verwendet werden oder um beispielsweise die folgenden Gewebstypen zu rekonstituieren: Nervengewebe, Haut, Gefäßgewebe, Muskelgewebe, Bindegewebe wie beispielsweise Knochen, Knorpel, Sehnen und Bänder, Nierengewebe, Lebergewebe und Pankreasgewebe. Gewebszellen, die in diesen Schäumen und Schaumzusammensetzungen ausgesät werden, können aus einem Säugetier, beispielsweise einem Menschen, gewonnen werden. Gewebszellen werden an die Schäume und Schaumzusammensetzungen abgegeben, indem die Zellen zunächst in kleinen Volumina an Gewebskulturmedium suspendiert werden. Das Gewebskulturmedium, das die Zellen enthält, kann darauf in Tropfen an die Schäume oder Schaumzusammensetzungen verabreicht werden. Alternativ können die Schäume oder Schaumzusammensetzungen in einem Gefäß angeordnet werden, das das Gewebskulturmedium und Zellen in Suspension enthält und das derart geschüttelt wird, dass das Gewebskulturmedium, das die Zellen enthält, durch den gesamten Schaum und Schaumzusammensetzungen verteilt wird. In einer weiteren Ausführungsform können die Gewebszellen in einer Biopolymer-Lösung, beispielsweise einer Kollagen-Lösung, in niedrigen Konzentrationen bei einer Temperatur von ungefähr 4°C bis 10°C und bei einem pH von ungefähr 7,0 suspendiert werden. Die Lösung, die die Zellen enthält, kann dann an die Schäume und Schaumzusammensetzungen abgegeben werden. Wenn der Schaum auf 37°C aufgewärmt wird, bildet die Biopolymer-Lösung, beispielsweise die Kollagen-Lösung, ein Gel im Schaum. Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Gel" ein Netzwerk oder ein Netz aus Biopolymer-Filamenten zusammen mit einer wässrigen Lösung, die innerhalb des Netzwerks oder Netzes der Biopolymer-Filamente eingefangen ist.
Ein Alginat-Gel zur Verwendung als Abgabeträger bzw. Vehiculum von Zellen an die Schäume oder Schaumzusammensetzungen der Erfindung kann durch Zusatz von Kalzium erzeugt werden, das bei Raumtemperatur und bei neutralem pH eine Polymerisation verursacht. Ausgewählte Epithel-, Endothel- oder Mesothel-Zellen können darauf auf die Oberfläche der Gel-befüllten Schaum oder Schaumzusammensetzung aufgeschichtet werden.
Die Schäume und Schaumzusammensetzungen der Erfindung können als Hautverbände für Verbrennungen, Narben und Hautgeschwüre und Läsionen bzw. Verletzungen verwendet werden. Beispielsweise wird ein zusammengesetzter Biopolymerschaum, der ein Biopolymer mit einfacher Dichte umfasst, beispielsweise ein Kollagen-Schaum, an die Oberfläche eines Biopolymerschaums mit doppelter Dichte gebunden, um einen Hautverband mit voller Dicke zu erzeugen, der weiterhin eine Zellkonditionierung, beispielsweise dermale und epidermale Zellkonditionierung, einschließt. Der zusammengesetzte Biopolymerschaum kann hergestellt werden, indem der Biopolymerschaum mit doppelter Dichte zunächst als Folie bzw. Blatt hergestellt wird, aus der (dem) Scheiben oder andere Formen ausgestanzt werden können oder indem der Biopolymerschaum mit doppelter Dichte in einer Gussform der erwünschten Form und Größe hergestellt wird. Der Biopolymerschaum mit doppelter Dichte kann darauf am Boden einer Gussform derselben Geometrie bzw. Gestaltung und Dimensionen angeordnet werden wie derjenigen des Biopolymerschaums mit doppelter Dichte und kann beispielsweise mit einem wässrigen Puffer, beispielsweise MilliQ^TM-Wasser oder einer Biopolymer – beispielsweise Kollagen-Lösung – hydratisiert werden. Die Gussform wird dann mit flüssigem Biopolymer, beispielsweise Kollagen, bis zu der für den Schaum mit einfacher Dichte erforderlichen Höhe befüllt, und die Kombination wird wie hierin beschrieben gefriergetrocknet, um einen Hautverband zu erzeugen. Bei einer Ausführungsform wird die Biopolymerschaumschicht mit einfacher Dichte mit dermalen Fibroblasten besät, beispielsweise humanen dermalen Fibroblasten, beispielsweise autogenen humanen Hautzellen (d. h. Hautzellen, die vom Hautverband-Empfänger gespendet wurden), beispielsweise allogenen humanen Hautzellen (d. h. Hautzellen, die von einem Spender mit anderem Genotyp als demjenigen des Transplantat-Empfängers bereitgestellt werden), und wird für zumindest einen Tag oder mehr Tage, beispielsweise von ungefähr bis ungefähr 7 Tage inkubiert. Die Biopolymerschaumschicht mit doppelter Dichte wird mit Keratinozyten, beispielsweise humanen Keratinozyten, besät. Die Keratinozyten lässt man sich differenzieren, bis sich eine Barriere-kompetente Hornhaut gebildet hat, beispielsweise für ungefähr 14 Tage. Das Vorhandensein der Hautzellen ermöglicht die volle Differenzierung der Epidermis. Diese Zeitspanne der Entwicklung ermöglicht Zeit für die Anreicherung der dermalen und epidermalen Gewebe des Schaumproduktes mit extrazellulären Matrixprodukten, beispielsweise extrazelluläre Matrixprodukte, die von den Haut-Fibroblasten sezerniert werden. Der zusammengesetzte Biopolymerschaum wird dann verarbeitet, beispielsweise gefriergetrocknet, um die Zellen zu eliminieren. Der sich ergebende Zell-konditionierte zusammengesetzte Biopolymerschaum weist die Eigenschaften einer Haut mit voller Dicke auf und kann als Hautverband dazu verwendet werden, Verbrennungen, Narben und Hautgeschwüre und -läsionen zu behandeln. Dieses Produkt dient insbesondere im Fall von Verbrennungen, beispielsweise Verbrennungen dritten Grades, zum Reduzieren eines Verlustes an Körperfeuchtigkeit, wenn es als Hautverband aufgebracht wird und ist geeignet zur Verwendung in Notfallsituationen, in denen der Empfänger der Hautverletzung nicht in der Nähe professioneller Pflegekräfte ist. Wenn es auf einem Empfänger angeordnet wird, der eines Hauttransplantates bedarf, wird das Schaumprodukt, mit oder ohne Zellkonditionierung, mit Wirts-(Transplantatempfänger-)Fibroblasten und Keratinozyten besiedelt. Fibroblasten und Kapillarendothel vom Empfänger des Verbandes oder Wirtes kann in den zusammengesetzten Biopolymerschaum wandern. Der zusammengesetzte Biopolymerschaum stellt ebenfalls ein Substrat für Keratinozyten bereit, die auf diesem ausgesät oder aufgeschichtet sind und erlaubt es den Keratinozyten, sich auf diesem oder innerhalb diesem von benachbarter Haut oder von unten, beispielsweise von Haarfollikeln, die nach der Hautverletzung zurückbleiben, zu verteilen. Alternativ kann das Schaumprodukt als Substrat für kultivierte autogene oder allogene Keratinozyten dienen. Diese gefriergetrockneten zusammengesetzten Biopolymerschäume, die mit einem ausgewählten Zelltyp besät bzw. beimpft werden, weisen lange Halbwertszeiten auf und können somit über lange Zeitspannen aufbewahrt bzw. gelagert werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann der Schaum mit doppelter Dichte als ein Hautverband dienen. Der Schaum mit doppelter Dichte wird zunächst mit Hautzellen in einem Gewebskulturmedium besät (mit oder ohne Kollagen, beispielsweise Kollagen zu 1 mg/ml). Nach mehreren Tagen werden Epidermiszellen, beispielsweise Keratinozyten, auf der Oberfläche des Schaumes ausgesät, die bereits mit den Hautzellen bevölkert sind. Die Zellen in und an dem Schaum mit doppelter Dichte lässt man sich dann teilen, differenzieren und in vitro ein Haut-ähnliches Organ bilden. Der Schaum wird dann nach einer Zeitspanne von mehreren Wochen in vitro gefriergetrocknet. Das sich ergebende Schaumgerüst ist gegenüber einem Zusammenbruch bzw. einer Störung durch mikrobielle Kollagenase resistent und weist einen wohl entwickelte Hornhaut auf.
Die Schäume, Schaumzusammensetzungen und weitere Formen von Biopolymeren, die hierin beschrieben sind, können beispielsweise mit Zellen in Berührung gebracht oder gegenüber Zellen exponiert werden. Beispielsweise können die Schäume, Schaumzusammensetzungen und andere Formen von Biopolymeren mit einem ausgewählten Zelltyp oder ausgewählten Zelltypen besät werden. Die Zellen können dann wachsen, proliferieren und Faktoren sezernieren gelassen werden, beispielsweise extrazelluläre Matrixfaktoren, die beispielsweise Zellwachstum, Differenzierung, Morphogenese unterstützen. Die Zellkonditionierung der Schäume, Schaumzusammensetzungen und anderer Biopolymer-Formen, die hierin beschrieben sind, dient zumindest zwei Funktionen. Zunächst stellen die Zellen eine chemische Konditionierung der Schäume bereit, d. h. die Zellen sezernieren extrazelluläre Matrixbestandteile, die das Einwachsen von Zellen in die Schäume, Schaumzusammensetzungen und Biopolymer-Formen anziehen und stützen das Wachstum und die Differenzierung der Zellen in den Schäumen. Zweitens stellen die Zellen eine mechanische Konditionierung der Schäume, Schaumzusammensetzungen und Biopolymer-Formen bereit, d. h. die Zellen formen die Schäume, Schaumzusammensetzungen und Biopolymerschäume zur Bildung eines Gitters um, das die geeignete physische Struktur des Typs von Zellen im Gewebe bereitstellt, die der Schaum ersetzen oder rekonstruieren soll, beispielsweise ordnen sich die Zellen in den unterschiedlichen Zellschichten der Haut selbst um, wie es hierin beschrieben ist. Die Schäume, Schaumzusammensetzungen und Biopolymer-Formen, die lebensfähige Zellen enthalten, können in einen Empfänger eingebracht werden. Alternativ können die Schäume, Schaumzusammensetzungen und Biopolymer-Formen, die die Zellen enthalten, weiter zum Abtöten der Zellen verarbeitet werden, beispielsweise gefriergetrocknet werden, und dann in ein Empfängersubjekt eingebracht werden.
Die Schäume und Schaumzusammensetzungen der Erfindung können ebenfalls zu Gefäßprothesen in Form eines Rohres ausgebildet werden und können innen mit glatten Muskelzellen, die in einer neutralisierten Kollagen-Lösung abgegeben werden, die nach der Abgabe gelieren, und extern mit Adventitial-Fibroblasten und auf ihrer luminalen Oberfläche mit Endothelzellen besät werden. Beispielsweise kann eine Gefäßprothese oder ein vaskulärer Stent durch Gießen einer Biopolymerschaumschicht mit doppelter Dichte um eine Welle herum gebildet werden. Die Prothese oder der Stent wird dann durch Versiegeln der Welle zu einem Rohr ausgebildet, wobei ein Raum zwischen der Außenseite der Welle und der Innenwand des Rohres bestehen bleibt. Wenn das Biopolymer Kollagen ist, wird das Rohr mit Lysyloxidase-geprimtem Kollagen befüllt, um die Vernetzung des Kollagens während der Verarbeitung zu bedingen. Die Kollagen-beschichtete Welle wird auf einer Ablage in einem Gefriertrockner gefriergetrocknet, wonach ein Programm eines kontrollierten Trocknens folgt. Alternativ kann das Kollagen oder ein anderes Biopolymer unter Verwendung von ultravioletter Strahlung vernetzt werden. Der Schaum wird unter Vakuum hydratisiert und trocknen gelassen, um einen Schaum mit doppelter Dichte zu bilden. Nach dein Trocknen wird ein Schaum mit doppelter Dichte aus der Welle in Form eines Rohres zur Verwendung als Gefäßprothese entfernt. Der Schaum mit doppelter Dichte kann durch Winden bzw. Wickeln eines vernetzten Biopolymerfadens, beispielsweise eines gewundenen Kollagen-Fadens (das Verstärkungmaterial) um die Schaumschicht mit doppelter Dichte und darauf Gießen einer Biopolymerschaumschicht mit einfacher Dichte oder einer zweiten Biopolymerschaumschicht mit doppelter Dicke über den gewundenen Faden herum verstärkt werden. Die beiden Schichten der Schäume mit doppelter Dichte werden dann derart fusioniert, dass der aufgewickelte Biopolymerfaden in den sich ergebenden rohrförmig geformten Schaum einbaut wird. Falls dies erwünscht ist, werden mediale glatte Muskelzellen und Endothelzellen an die abluminalen und luminalen Oberflächen jeweils des rohrförmigen Schaums abgegeben. Eine Schicht aus Advential-Fibroblasten kann dann den medialen glatten Muskelzellen zugesetzt werden. Der rohrförmige Schaum kann dann in vitro behandelt werden, um ein Gefäß mit der Struktur eines reifen Blutgefäßes zu erzielen. Beispielsweise kann der rohrförmige Schaum zusammen mit diesen Zellschichten einer rhythmischen Strömung einer ausgewählten Flüssigkeit bzw. eines Fluidums mit zunehmender Magnitude, beispielsweise von Glycerol und Kulturmedium, unterworfen werden, so dass sich ein reifes Blutgefäß zur Verwendung beispielsweise als Gefäßprothese oder Stent ergibt.
Zur Umformung bzw. Neubildung von Knochen, Knorpel, Sehnen und Bänder können die Schäume und Schaumzusammensetzungen der Erfindung mit den geeigneten Zellen besät werden, beispielsweise Bindegewebszellen, wie beispielsweise Osteozyten, Chrondrozyten und Venen und Ligamentfibrozyten und können zur Reparatur von geschädigtem Bindegewebe in die geeignete Form gegossen werden. In einer Ausführungsform können die Biopolymerschäume der Erfindung mit oder ohne extrazelluläre Matrixteilchen mit Kalziumphosphatzement vermischt werden, beispielsweise mit β-Tricalziumphosphatzement, der 64% β-Tricalziumphosphat, 16% monobasisches Kalziumphosphat und 15% Kalziumsulfat-Hemihydrat und 5% Kalziumpyrophosphat einschließt (siehe Mirtichi et al. (1989), Biomaterials 10: 634–638), um einen verstärkten Zement als beispielsweise orthopädische oder dentcle Implantate zu erzeugen. Gelatine, ein Kollagenderivat, das einen großen Teil des organischen Gehaltes des Knochens ausmacht, kann dem Kalziumphosphatzement als Klebstoff zugesetzt werden. In einer anderen Ausführungsform werden die Biopolymerschäume der Erfindung auf den Zement gegossen und wie hierin beschrieben verarbeitet. Alternativ können die extrazellulären Matrixteilchen, die hierin beschrieben sind, mit Kalziumphosphatzement vermischt und als orthopädische oder dentcle Implantate verwendet werden. Die Biopolymerschäume und/oder extrazellulären Matrixteilchen erhöhen die Knochenzell-Invasion des Kalziumphosphatzements. Zusätzlich ergeben Wachstumsfaktoren, die in den extrazellulären Matrixteilchen vorliegen, mitogene Stimuli bzw. Reize, um die Geschwindigkeit zu erhöhen, in der sich die Knochenzellen vervielfältigen und den Zement ersetzen. Es hat sich beispielsweise herausgestellt, dass extrazelluläre Matrixteilchen von einer Vielzahl von Geweben, wenn sie Kulturinserten zugesetzt wurden, in einer Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen, die Mitose stimulierten, im Vergleich zu Kulturinserts ohne die extrazellulären Matrixteilchen. Siehe Tabelle 2, die die Ergebnisse von Experimenten zeigt, in denen 1 mg extrazelluläre Matrixteilchen aus dem angezeigten Gewebsursprung Kultur-Inserts zugesetzt wurden, die die indizierten Zelltypen in Serum-freiem Medium enthielten. Nach fünf Tagen wurde die Zellzahl in den Kulturen, die extrazelluläre Matrixteilchen enthielten und die Zellzahl in den Kontroll-Kulturen ohne die extrazellulären Matrixteilchen bestimmt.
Tabelle 2
Die Biopolymer-Lösungen, Schäume und/oder extrazelluläre Matrixteilchen ebenso wie die Biopolymerfasern, beispielsweise geflochtene bzw. gesponnene Fasern, und Biopolymergewebe können ebenfalls die Festigkeit des Kalziumphosphat-basierten Zements um zumindest ungefähr 20%, zumindest ungefähr 30%, zumindest ungefähr 40% und vorzugsweise zumindest ungefähr 50% oder mehr erhöhen, wenn sie mit dem Zement in geeigneten Verhältnissen vermischt werden. Wenn beispielsweise flüssiges Kollagen im Verhältnis von 5 mg Kollagen bis 8 g Zement zugesetzt wird oder wenn extrazelluläre Matrixteilchen im Verhältnis von 0,1 g extrazelluläre Matrixteilchen zu 8 g Zement zugesetzt werden, nimmt die Festigkeit, gemessen in Pfund Widerstand bis der Zement bricht, des Zementes um 50% gegenüber dem Zement ohne Kollagen oder extrazelluläre Matrixteilchen zu.
Knorpelimplantate sind zusätzliche Beispiele für Implantate, die unter Verwendung der Schäume oder Schaumzusammensetzungen der Erfindung erzeugt werden können. In einer Ausführungsform werden Knorpelimplantate durch Kombinieren einer Biopolymer-, beispielsweise Kollagen-Lösung, mit Kalziumphosphatzement und Setzenlassen des Gemisches (jedoch nicht Trocknen) zu einem Zement erzeugt. Während der Zement noch plastisch und kalt verformbar ist, wird eine Biopolymer-Lösung auf den Satz gegossen, jedoch nicht auf den Trockenzement, und wird zur Bildung einer Schicht aus einem Biopolymerschaum mit einfacher oder doppelter Dichte gefriergetrocknet, der in einer Oberfläche des zementartigen Substrates eingebettet ist. Nachdem der Zement sich abgesetzt hat und getrocknet wurde, wird der Biopolymerschaum mit Chondrozyten besät. In einer alternativen Ausführungsform werden Knorpelimplantate durch Kombinieren eines Biopolymers, beispielsweise einer Kollagen-Lösung mit Kalziumphosphatzement und Setzenlassen des Gemisches und Trocknen zu einem Zement hergestellt. Der abgesetzte und trockene Zement kann darauf mit einer Biopolymer-Lösung rehydratisiert und gesättigt werden. Eine Biopolymer-Lösung kann darauf auf das zementartige Substrat gegossen werden und der Zusammenbau bzw. die Verbindung der Schicht aus einer Biopolymer-Lösung und dem zementartigen Substrat wird gefriergetrocknet, um eine Schicht aus einem Biopolymerschaum mit einzelner oder doppelter Dichte zu bilden, eingebettet in einer Oberfläche des zementartigen Substrats. Der Biopolymerschaum kann dann mit Chondrozyten besät werden, beispielsweise humanen Chondrozyten (beispielsweise zu 5 × 10⁴ bis 5 × 10⁶ Zellen/ml Schaum). In jeder Ausführungform lässt man die Knorpelzellen bzw. Chondrozyten sich differenzieren und eine Matrix erzeugen, die für Knorpelgewebe typisch ist und diese werden dann in einem artikulären bzw. Gelenk-Verhältnis angeordnet. Typischerweise wird ein artikuläres Verhältnis für das Knorpelimplantat unter Verwendung einer mechanischen Vorrichtung zum Wachsen und Entwickeln von Gelenkknorpel etabliert. Ein solche mechanische Vorrichtung bringt den Biopolymerschaum, der die Knorpelzellen enthält, mit einer zweiten Oberfläche in sanfte Berührung, beispielsweise einen zweiten Biopolymerschaum, der die Knorpelzellen enthält, in Gegenwart eines Fluids, das ähnliche Eigenschaften aufweist wie solche der Synovial-Flüssigkeit und die Hyaluronsäure enthalten, beispielsweise ein Dialysat aus Blutplasma, so dass es eine thixotrope Flüssigkeit wird, d. h. ein Gel, das sich verflüssigt, wenn es gerührt wird, das jedoch nach Stehenlassen in einen Gel-Zustand zurückkehrt. Der Biopolymerschaum, der die Knorpelzellen und die zweite Oberfläche enthält, werden dann rotiert oder aneinander entlang gleiten gelassen, um Scher- und Druckkräfte zu erzeugen, die solche nachahmen, denen das Knorpelgewebe in vivo ausgesetzt ist. Das sich ergebende Knorpelgewebe weist die Eigenschaften normalen Gelenkknorpel-Gewebes auf, beispielsweise die Fähigkeit und Architektur, Kräften zu widerstehen, denen normales Knorpelgewebe ausgesetzt ist.
Band-Implantate können als Multifilament-Formen der Biopolymere der Erfindung mit den Schäumen und Schaumzusammensetzungen der Erfindung zur Unterstützung der Zell-Besäung angereichert werden.
Beispielsweise können kontinuierliche Band-Multifilament-Strukturen mit oder ohne Zusatz extrazellulärer Matrixteilchen erzeugt werden, so dass sie ausgewählte Eigenschaften aufweisen. Ligament-Zellen können dann an das Ligament bzw. Band abgegeben werden, das in einer Schaumhülle eingebettet sein kann. Die Enden des Bandes können abgeschnitten werden oder in Kalziumphosphatzement eingebettet werden. Das Ligament kann darauf in einer rohrförmigen Gewebsreifungskammer befestigt werden. Nachdem die Ligament-Zellen an das Ligament angelagert wurden, wird das Ligament dem System einer zyklischen axialen Verlängerung unterworfen, was eine Belastung nach sich zieht, die in ihrer Größenordnung zunimmt, wenn das Band reift. Die reifen Biopolymer-Bänder können beispielsweise als Bandprothesen verwendet werden.
Dental-Implantate können sich aus den Schäumen und Schaumzusammensetzungen der Erfindung bilden. Beispielsweise können die Schäume und Schaumzusammensetzungen als spezialisierte Dental-Implantate für die Periodontium-Heilung und Knochen-Umbildung bzw. -Neubildung hergestellt werden. In einer Ausführungsform werden die Schäume und Schaumzusammensetzungen der Erfindung als schürzenförmige Implantate hergestellt, die an einem Zahn befestigt werden können, indem die Schnürchen der Schürze um den Zahn gebunden werden. In einer weiteren Ausführungsform werden die Schäume und Schaumzusammensetzungen als Abdeckungen von Nach-Extraktions-Höhlen entwickelt, die mit Kalziumphosphatzement oder einer Kollagen-Zusammensetzung befüllt sind, die mit Kalziumphosphatzement verstärkt ist. In einer noch weiteren Ausführungsform werden die Schäume und Schaumzusammensetzungen als Kalziumphosphat- oder Hydroxyapatit-befüllte Röhren entwickelt, um als Alveolarkamm-Bildner zu dienen.
Der Schürzen-förmige Schaum, der als Schaum mit doppelter Dichter oder vierfacher Dichte produziert werden kann, d. h. ein Schaum mit doppelter Dichte, der über sich selbst gefaltet ist, kann zur Förderung der Parodontium-Heilung und Knochenumbildung zwischen einer Gummiklappe bzw. -platte und dem Alveolarknochen in einem Bereich positioniert werden, der einer Parodontium-Heilung und Knochenumbildung bedarf. Der Schaum kann so aufgebaut sein, dass er die Invasion durch Junktionsepithel der gereinigten und geebneten Zahnzone blockiert. Parodontium-Zellen können darauf in den Schaum migrieren, an den Schaum binden und extrazelluläre Matrixprodukte in den Schaum sezernieren. Ebenfalls können Kapillarendothelzellen und Immunzellen in den Schaum eindringen, die eine Verteidigung gegen eine mikrobiellen Angriff bereitstellen. Durch Ausschließen von Epithel und durch Stimulieren von Parodontium-Zellen kann der Schaum eine Regeneration von Parodontium und Alveolar-Knochen fördern. Die Schürzen-förmigen Zahnimplantate können ebenfalls so modifiziert werden, dass ein wie hierin beschriebener Kalziumphosphatzement eingeschlossen wird. In einer Ausführungsform kann der Kalziumphosphatzement in einer Ausstülpung der Schürze eingeschlossen werden, der auf dem erodierten Alveolar-Knochen angeordnet wird. Der Kalziumphosphatzement stellt Wege zum Eindringen von Knochenzellen bereit und härtet aus, wenn er hydratisiert wird. Das Schürzen-förmige Dentalimplantat kann ebenfalls extrazelluläre Matrixteilchen einschließen, die aus Zahngeweben erzeugt werden. Diese extrazellulären Matrixteilchen stellen die geeigneten Wachstumsfaktoren bereit, beispielsweise Knochen- und Band-spezifische Wachstumsfaktoren, um ein Parodnntium-Zell- und -Knochenzell-Wachstum im Implantat zu fördern.
Alternativ können die Schäume und Schaumzusammensetzungen der Erfindung als Postextraktions-Höhlenfüllmaterialien präpariert bzw. hergestellt werden. Die Schäume können mit Kalziumphosphatzement vermischt und in die Höhlungen der extrahierten Zähne eingebracht werden. Diese Höhlenfüllmittel fördern die Knochenregeneration innerhalb der Aushöhlung, die zumindest eine Grundlage für ein Metall, beispielsweise Titan, Vorrichtung und anschließende Aufbringung auf eine Krone bereitstellt. Die Titan- oder andere Material-Vorrichtung kann in einem Sockel bzw. in einer Aushöhlung unmittelbar nach einer Extraktion mit Kalziumphosphat-Zement verankert werden, der mit einer der hierin beschriebenen Schaum oder Schaumzusammensetzungen verstärkt ist. Das Implantat kann dann mit einer Schaum-Membran mit doppelter oder vierfach doppelter Dichte bedeckt oder „mit einem Zelt umgeben" werden, wie es hierin als Schürze beschrieben ist. Die Sockelfüllmaterialien können extrazelluläre Matrixteilchen einschließen, die aus Knochengewebe oder Dental-Papillen erzeugt werden. Diese extrazellulären Matrixteilchen stellen die geeigneten Wachstumsfaktoren bereit, beispielsweise Knochen-spezifische Wachstumsfaktoren zur Förderung eines Knochenzell-Wachstums in das Implantat. Zusätzlich kann in den Fällen, in denen das Knochenfundament für Zahnimplantate, die aus Metall zusammengesetzt sind, keine geeignete Stütze für das Metallimplantat bereitstellt, Kalziumphosphatzement, verstärkt oder verfestigt mit den Schäumen und Schaumzusammensetzungen der Erfindung, zur Verstärkung des Knochenfundamentes verwendet werden.
In einer noch weiteren Ausführungsform können die Schäume und Schaumzusammensetzungen als Alveolarkamm-Ersatz oder Alveolarkamm-Bildner entwickelt werden. Alveolarkamm-Substitute werden dazu verwendet, Gebisse zu unterlegen. Typischerweise werden die Alveolarkamm-Substitute als Schaumrohre mit doppelter Dichte der geeigneten Länge entwickelt, die mit nicht-resorbierbarem Hydroxyapatit befüllt werden (oder mit dem hierin beschriebenen Kalziumphosphatzement), um eine mineralisierte Plattform entlang des Alveolarkammes aufzubauen und um die Entwicklung von Knochen- und Bindegewebsnetzwerken um die Hydroxyapatit-Teilchen herum zu fördern. Die Alveolarkamm-Bildner der Erfindung weisen dasselbe Design wie die Alveolarkamm-Substitute auf, außer dass das Schaumrohr mit Kalziumphosphat befüllt ist, der die Knochenentwicklung fördert, der jedoch resorbierbar ist. Die Zusammensetzung der Alveolarkamm-Bildner fördert die Knochenzell- und Blutkapillarpenetration, die zu einem erneuten Wachstum und einer Wiederherstellung des Kammes vor, beispielsweise Installation eines Gebisses oder eines Metallimplantates, führt. Das Schaumrohr des Alveolarkamm-Bildners kann ebenfalls extrazelluläre Matrixteilchen einschließen, die die Alveolarkamm-Knochenregeneration fördern.
In ähnlicher Weise können die Schäume und Schaumzusammensetzungen der Erfindung, die beispielsweise mit extrazellulären Matrixteilchen, gewonnen aus Drüsengewebe, beispielsweise Pankreas-Gewebe, Leber-Gewebe, Haut-Gewebe und anderen Drüsen-Gewebe, angereichert werden, mit Drüsen-Zellen, wie beispielsweise solchen des endokrinen Pankreas, beispielsweise pankreatische Inselzellen oder solchen der Leber, beispielsweise Hepatozyten, als Mittel zur Förderung der Zellproliferation vor und/oder nach Implantation besät werden, so dass nach Implantation und Vaskularisierung des Zell-beladenen Schaum-Implantats sich eine funktionelle Ersatzdrüse entwickelt.
Beispiele für Zelltypen, die in und an dem Schaum und Schaumzusammensetzungen der Erfindung erfolgreich gezüchtet wurden, schließen mesenchymale Zellen, Parodontium-Zellen, Fibroblasten, Keratinozyten, Knorpelzellen, Zahnfleisch-Fibroblasten und Sehnen- und Bänder-Zellen ein.
Diese Erfindung wird weiter durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht, die keinesfalls als weitere Einschränkung aufgefasst werden sollten.
Beispiel 1: Säureextraktion von Kollagen aus der Haut von Schweineföten
In einem bevorzugten Verfahren zum Extrahieren des Kollagens aus Gewebe schließt eine Kollagenquelle Schweineföten ein. Die Föten werden in utero eingefroren, wobei die Uteri in einem unverletzten Zustand gehalten werden, wobei die Enden durch einen Faden zusammengebunden werden. 12–24 Stunden vor dem Sezieren wird ein Uterus aus dem Gefriergerät entfernt und in einem 4°C-kalten Raum angeordnet. Der Uterus, der noch zu ungefähr 90% gefroren sein sollte, wird in eine große sterile Abwaschschüssel übertragen. Sobald wie möglich wird der gefaltete Uterus sanft gestreckt. Die äußere Oberfläche des Uterus wird dreimal für 10 Minuten in 1% Bleiche in Milli-Q^TM-Wasser gewaschen und darauf zweimal mit sterilem Milli-QTM-Wasser gewaschen, um das Äußere des Uterus zu sterilisieren.
Unter Reinraumbedingungen wird die gesamte Länge des Uterus auf der den Hauptblutgefäßen gegenüberliegenden Seite geöffnet. Es wird Sorge getragen, die Amnion-Membranen des Fötus nicht zu berühren oder zu beschädigen. Instrumente, die mit der Außenoberfläche des Uterus in Berührung kommen, werden mit 70% Ethylalkohol gewaschen. Jeder Fötus wird sanft aus dem Uterus angehoben und die Nabelschnur wird zumindest 2 cm vom Fötus entfernt geschnitten. Der nach wie vor hauptsächlich gefrorene Fötus wird in einem sterilen Kunststoff-Beutel angeordnet, nachdem der Kopf entfernt wurde.
Mit sterilen Handschuhen wird der Fötus auf eine sterile Glasschale übertragen. Mit einem sterilen Skalpell, wie beispielsweise einer Nr.-11-Klinge, wird die Haut um jeden Fuß herum aufgeschnitten, um einen kreisförmigen Einschnitt herzustellen. Ein einziger Einschnitt wird durch die Haut vom ersten Schnitt vorgenommen, entlang der Innenoberfläche jeder Gliedmaße zur Mittellinie der ventralen Oberfläche des Rumpfes. Ein Mittellinien-Einschnitt wird entlang der ventralen Oberfläche des Rumpfes vom Schwanz bis zum Nacken vorgenommen und es wird Sorge getragen, das darunterliegende Muskelgewebe nicht zu durchdringen. Die Körperhaut wird abgeschält. Die abgeschälte Haut wird in einem sterilen Behälter angeordnet (1 l Zentrifugen-Flasche mit Deckel) auf Eis.
Die Haut wird mit sterilem Eis gemahlen und das gemahlene Gewebe wird in eiskalter, 0,33 × Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS): 5 Liter gewaschen, 9 Waschungen jedes 5 kg Ansatzes. Das Gewebe wird gleichmäßig in 20-Liter-Ballons wie erforderlich aufgeteilt und jeweils mit 0,5 M Essigsäure und 2 mM EDTA befällt. Die Ballons werden auf einer Rollflaschenvorrichtung für ungefähr 7 Tage bei einer Temperatur von ungefähr 4°C angeordnet.
Am 8. Tage nach Beginn der Hautpräparation werden die Haut und der Extrakt durch Filtration durch 4 Schichten eines sterilen Käsetuches aufgetrennt. Steriles Natriumchlorid wird zugesetzt, um die Lösung auf ungefähr 0,9 M zu bringen. Sie wird über eine Zeitspanne von ungefähr 2 Stunden gerührt, während das Kollagen ein Präzipitat bildet. Die gesamte Salz-präzipitierte Lösung und das Präzipitat werden durch kontinuierliche Strömung bei 12.000 upm 300 ml/Min. zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet wird behalten. Die Pellets werden homogenisiert und in 0,5 M Essigsäure mit einem pH von 2,5 + 2 mM EDTA dispergiert und in einen Ballon auf einer Rollflaschen-Vorrichtung für ungefähr 16 Stunden bei einer Temperatur von ungefähr 4°C übertragen. Der Kolben wird bezüglich des Ausmaßes der Solubilisierung und Resuspension überprüft. Mehr 0,5 M Essigsäure und EDTA-Lösung können zugesetzt werden, um eine vollständige Lösung des Pellets sicherzustellen.
Steriles Natriumchlorid wird dein Kolben zugesetzt, um die Lösung auf ungefähr 0,9 M zu bringen. Sie wird über eine Zeitspanne von 2 Stunden gerührt, um das Kollagen für eine zweite Zeitspanne wie oben beschrieben auszufällen. Die gesamte Salz-präzipitierte Lösung und das Präzipitat werden durch kontinuierliche Strömung bei 12.000 upm 300 ml/Min. zentrifugiert. Der Überstand wird zu 2,0 μm filtriert. Die Kollagenkonzentration wird darauf mit einem Hydroxyprolin-Assay bestimmt. Die Lösung wird darauf gegen 0,05 M Essigsäure und einer Konzentration von 7 mg/ml in einer Hohlfaser dialysiert. Die Endkonzentration an Kollagen wird unter Verwendung eines Hydroxyprolin-Assays bestimmt.
Beispiel 2: Sequentielle Säure- und Enzymextraktion von Kollagen aus der Haut von Schweineföten
Fötale Schweinehaut, die wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert wurde, wird verkleinert bzw. vermahlen und gewaschen, darauf mit einem definierten Anteil an 0,5 M Essigsäure, 0,002 M EDTA, pH 2,5 für 8 Stunden vermischt. Das zerkleinerte Material wird darauf aus der Flüssigkeit abgetrennt und intaktes Kollagen wird aus der Flüssigkeit durch zwei Zyklen einer Salzpräzipitation und -lösung, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt. Das zerkleinerte Material wird darauf mit 0,017% Pepsin in 0,5 M Essigsäure, 0,002 M EDTA, pH 2,5 für 5 Tage vermischt. Die Haut wird erneut mit 0,017% Pepsin im selben Puffer für 7 Tage vermischt. Das zerkleinerte Material wird erneut aus der Flüssigkeit abgetrennt. Leicht abgeschnittenes Kollagen wird dann aus den beiden Flüssigextrakten durch ein ähnliches Verfahren wie bei sauer-extrahiertem Kollagen aufgereinigt. Beide Kollagentypen werden in 0,05 M Essigsäure dialysiert und auf erwünschte Konzentrationen unter Verwendung von Hohlfaserfiltern mit Porositäten konzentriert, die ein Austreten von Kollagen verhindern. Wie durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestimmt, ist das sauer-extrahierte Kollagen ein Gemisch aus fötalen Kollagenen, einschließlich Kollagen vom Typ I, Kollagen-Typ III und Kollagen-Typ IV. Das Pepsin-extrahierte Kollagen, d. h. leicht abgeschnittenes Kollagen, enthält die dreifachen helikalen Kerne ohne Telopeptide der gemischten Kollagene außer geringe Mengen an Typ IV, der einem Abbau mit der Enzym-Behandlung unterworfen wird. Kollagen-Konzentrationen werden ebenfalls durch den Sirius Dye Assay bestimmt, der durch Hydroxyprolin-Assay-Standards geeicht wurde. Proteinidentitäten und die Integrität werden durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese validiert und die Viskosität wird zu 5 mg/ml in einem Minimum von 50 Centipoise standardisiert. Das Kollagen ist dazu in der Lage, ein Gel bei neutralem pH zu bilden. Das Fehlen denaturierter Kontaminanten wird durch die Polarität gemessen (Werte bei –350°C und weniger sind akzeptabel). Die Qualität wird ebenfalls durch die Fähigkeit des Kollagens zur Bildung von Fasern getestet.
Beispiel 3: Produktion eines Schaumes mit einfacher Dichte aus Kollagen, das aus den Häuten von Schweineföten extrahiert wurde
Eine Biopolymer-Lösung (mit oder ohne extrazellulären Matrixteilchen), hergestellt wie in Beispiel 1 oder Beispiel 2 beschrieben, wird in eine Well bzw. Vertiefung oder eine Gussform eingebracht. Vor dem Einbringen in die Well wird die Kollagen-Lösung unter Vakuum entgast, bis keine weitere Blasenbildung beobachtet wird. In einer Ausführungsform wird die Lösung 5–10 min Hg für ungefähr 1 Stunde ausgesetzt. Das Well wird mit einer Menge an Polymer befüllt, die durch die Dicke des Schaumproduktes, die erforderlich ist, bestimmt wird. Eine Well von ungefähr 1,2 cm Durchmesser wird mit 0,35 ml Lösung befüllt, um einen Schaum mit einer Dicke von ungefähr 2 mm bereitzustellen. Der Well kann irgendeine Größe oder Form aufweisen, um die erforderliche Geometrie des gefriergetrockneten Produktes herzustellen. Die Konzentration des Biopolymers in jedem Well kann im Bereich von zwischen 1,0 mg/ml Kollagen bis ungefähr 10 mg/ml abhängig von der Dichte des erwünschten Produktes betragen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Lösung mit einer Konzentration von ungefähr 5,0 mg/ml verwendet. Während die Kollagen-Lösung direkt aus dem flüssigen Zustand gefriergetrocknet werden kann, wird die Kollagen-Lösung in einer bevorzugten Ausführungsform durch Exposition gegenüber einem Ammoniumhydroxid-Dampf aus einer 29%-igen Lösung oder durch Zusatz einer Base zur Lösung zur Bildung eines pHs von 7,0 während der Bildung eines Geles polymerisiert. Die Polymerisationsgeschwindigkeit ist der Temperatur proportional und kann durch Regulieren der Temperatur der Kollagen-Lösung in der Well gesteuert werden.
Nach der Polymerisierung der Lösung und der Bildung eines Kollagen-Gitters wird das Gitter durch Ultraviolettstrahlung bei einer Wellenlänge von ungefähr 254 nm entweder vor oder nach dem Gefriertrocknen vernetzt. Wenn es vor dem Gefriertrocknen vernetzt wird, kann die Bestrahlungsintensität ungefähr 0,38 × 10⁷ Mikrojoule/cm² betragen. Wenn es nach dem Gefriertrocknen vernetzt wird, kann die Intensität ungefähr das Vierfache des vorherigen Wertes betragen. Die Exposition gegenüber Ultraviolettstrahlung kann abhängig vom Ausmaß der erwünschten Vernetzung erhöht werden. Die chemische Veretzung mit 15 millimolarem Carbodiimid in 0,5 × PBS kann ebenfalls verwendet werden.
Die Gefriertrocknungs-Routine, die zur Ausbildung eines Schaumes verwendet wird, besteht aus Einfrieren, Evakuieren, Hitzezyklus, der als Funktion einer Polymerkonzentration variiert wird, weil die eutektische Temperatur, d. h. der minimale Gefrierpunkt für das Gesamtvolumen des einzufrierenden Materials, mit der Konzentration des Biopolymers in Lösung oder im polymerisierten Gitter variieren wird. Schaumscheiben mit unbegrenzten oder begrenzten Dimensionen von 1,0 bis 1,2 cm Durchmesser und 1,0 bis 5,0 mm oder mehr Dicke können in Multiwellplatten-Transwells oder in Wells von Gewebskulturplatten oder Multiwell-Platten, die zur Durchführung von Zellkulturen verwendet werden, eingebracht werden. Die Schauminserte, die in Transwell-Behältern eingebracht sind, können irgendeinen der vier oben beschriebenen Typen einnehmen: das heißt mit Kollagen-Lösung unbeschichtet, mit Kollagen-Lösung beschichtet oder mit Kollagen-Lösung beschichtet, die extrazelluläre Matrixbestandteile in irgendeiner der oben beschriebenen Formen enthält. Jede Schaumscheibe wird mit Gewebszellen in einem Gewebskulturmedium besät. Die Typen von Zellen, die zur Belegung der Zwischenräume des Schaumes ausgewählt sind, der ein offenzelliger Schaum ist, werden normalerweise von extrazellulärer Matrix umgeben. In einer Ausführungsform werden die Gewebszellen in einer Lösung mit neutralisiertem Kollagen vermischt, so dass die Zellen von einem Kollagen-Gel im Schaum umgeben werden. In dieser Ausführungsform können Zellen anderer Phänotypen, insbesondere Endothel-, Epithel- oder Mesothel-Zellen, auf der unteren Oberfläche des Geles oder auf der oberen Oberfläche des Geles aufgeschichtet werden, wodurch Gewebsäquivalente von zwei oder drei oder mehr Zelltypen gebildet werden. In einer anderen Ausführungsform werden die Zellen in Gewebskulturmedium angeordnet.
Schaumblätter bzw. platten-, -Rohre, -Stäbe, -Becher und andere Formen in Form von Prothesen, die wie oben beschrieben mit den verschiedenen Typen an Kollagen-Lösungen, die extrazelluläre Matrixbestandteile enthalten, behandelt wurden, können als humane Ersatzteile verwendet werden. Beispielsweise kann ein 1,0 cm² Rechteck mit einer Dicke von ungefähr 0,4 mm, ausgestattet mit einem vernetzten Kollagenschürzen-Band als Parodontal-Prothese dienen. In diesem Falle sind alle Oberflächen des Schaumes mit extrazellulären Matrixteilchen aus Dentalgeweben ausgestattet. Die Teilchen werden bezüglich ausgewählter extrazellulärer Matrixbestandteile getestet und es wird gezeigt, dass diese basischen Fibroblasten Wachstumsfaktor, transformierenden Wachstumsfaktor-β2, Plättchenabgeleiteten Wachstumsfaktor, Interleukin-1α, Decorin und Kollagen-Typen I und III enthalten. Die Parodontal-Prothese wird als bioabsorbierbare Rehabilitierungsvorrichtung in Individuen installiert, die unter einer Parodontal-Erkrankung leiden, nachdem ein Zahn, der behandelt wird, auf einer für dem Fachmann auf dein Gebiet vertrauten Weise präpariert wurde. Diese Matrix kann eine Regeneration von Parodontium induzieren, das den Zahn am Alveolar-Knochen hält, von Bindegeweben, die den Alveolar-Knochen umgeben und des Alveolar-Knochens selbst. Die Schäume werden von den Gewebszellen aufgrund ihrer Zusammensetzung erkannt. Die Zellen empfangen Signale aus den Schäumen und sind dazu in der Lage, an diese zu binden und diese umzuformen. Wegen ihres Gehalts an Fibroblasten-Wachstumsfaktor werden die extrazellulären Matrixteilchen mit diesen eingeschlossen, die Schäume sind angingen und sind dazu in der Lage, eine kapillare Zirkulation anzuziehen. Für jede der entwickelten Prothesen können gewebsspezifische oder generische extrazelluläre Matrixbestandteile zur Bereitstellung einer Information verwendet werden, die für die Gewebsbildung und Regeneration erforderlich ist.

Claims

Zusammengesetzter Biopolymerschaum (beispielsweise in Form eines Rohres), der einen Biopolymerschaum mit einem Netz von miteinander in Verbindung stehenden Mikrokompartimenten, wobei Biopolymermoleküle und/oder Biopolymerfilamente in den Wänden der Mikrokompartimente eingelagert sind, und eine zweite Polymerstruktur umfasst.
Zusammengesetzter Biopolymerschaum nach Anspruch 1, wobei: (a) der Biopolymerschaum einen Schaum mit einfacher Dichte umfasst, der Mikrokompartimente mit Längen-, Breiten- und Höhendimensionen aufweist, die im Wesentlichen gleich sind; und bei dem beispielsweise die zweite Polymerstruktur einen Schaum mit doppelter Dichte umfasst; oder (b) wobei der Biopolymerschaum einen Schaum mit doppelter Dichte umfasst, der Mikrokompartimente mit Längen-, Breiten- und Höhendimensionen aufweist, wobei zwei der Dimensionen im Wesentlichen gleich und die dritte Dimension um einen Faktor von zumindest zehn verringert ist.
Zusammengesetzter Biopolymerschaum nach Anspruch 1, wobei die zweite Polymerstruktur ein Biopolymer umfasst, wie beispielsweise ein Biopolymer ausgewählt aus der Gruppe, die aus Kollagen, Alginsäure, Polyvinylalkohol, Chondroitinsulfat, Laminin, Elastin, Fibronektin und Fibrinogen besteht.
Zusammengesetzter Biopolymerschaum nach Anspruch 3, wobei das Biopolymer Kollagen, beispielsweise fötales Schweinekollagen ist; und wobei wahlweise (a) das Kollagen polymerisiert ist und/oder (b) das Kollagen vernetzt ist, beispielsweise durch Primen mit Lysyloxidase.
Zusammengesetzter Biopolymerschaum nach Anspruch 1, der: (a) weiterhin extrazelluläre Matrixteilchen umfasst; oder (b) der Biopolymerschaum und/oder die zweite Polymerstruktur weiterhin Zellen umfasst.
Zusammengesetzter Biopolymerschaum nach Anspruch 2, wobei die zweite Polymerstruktur eine Faser umfasst; und wobei beispielsweise (a) die Faser eine Flechte ist; oder (b) die Faser ein Gewebe ist; oder (c) die Faser ein Vliesstoff ist.
Hautverband oder Bandprothese, die den zusammengesetzten Biopolymerschaum nach Anspruch 6 umfasst.
Hautprothese, die den zusammengesetzten Biopolymerschaum nach Anspruch 1 umfasst, wobei der Biopolymerschaum ein Schaum mit einfacher Dichte ist und mit humanen dermalen Fibroblasten konditioniert ist und die zweite Polymerstruktur einen Schaum mit doppelter Dichte umfasst, der mit humanen Keratinocyten konditioniert ist, so dass eine Hornhautschicht gebildet wird; und wahlweise, wobei der Schaum mit einfacher Dichte und der Schaum mit zweifacher Dichte Zellen enthält, die nach der Zellkonditionierung gefriergetrocknet werden.
Gefäßprothese, die den zusammengesetzten Biopolymerschaum nach Anspruch 2 (b) umfasst, wobei der Schaum mit doppelter Dichte in der Form eines Rohres vorliegt; und wobei beispielsweise die zweite Polymerstruktur eine Biopolymerfaser ist, die um ein Rohr herum gewickelt ist; wobei die Prothese wahlweise um die Biopolymerfaser herum gegossen ist.
Gefäßprothese nach Anspruch 9, die weiterhin auf ihrer luminalen Oberfläche Endothelzellen und in ihrer gesamten und auf ihrer abluminalen Oberfläche glatte Muskelzellen umfasst; und wahlweise, wobei der röhrenförmige Biopolymerschaum mit doppelter Dichte, der die Zellen enthält, nach der Zellkonditionierung gefriergetrocknet wird und beispielsweise der röhrenförmige Biopolymerschaum mit doppelter Dichte weiterhin eine Schicht von Adventialzellen auf den glatten Muskelzellen umfasst.
Zahnimplantat, das zur Förderung der Heilung des Parodontiums und der Knochenneubildung in der Lage ist, umfassend einen zusammengesetzten Biopolymerschaum nach Anspruch 2 (b), wobei die zweite Polymerstruktur ein Schaum mit doppelter Dichte ist; wobei das Zahnimplantat wahlweise schürzenförmig ist, und, wenn die Schürze ausgebildet ist, weiterhin wahlweise (a) eine Ausstülpung einschließt, die zum Halten eines Knochenwiederherstellungsmaterials in der Lage ist; oder (b) weiterhin Parodontium-Zellen umfasst; oder (c) weiterhin extrazelluläre Matrixteilchen umfasst, die aus Dentalgewebe gewonnen wurden.