CN115137883B - 一种仿生复合矿化支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医用生物材料领域，公开了一种仿生复合矿化支架及其制备方法，所述仿生复合矿化支架为双组份系统的MC‑SF复合共混物，具有可引导骨再生的矿化胶原MC微粒和可控生物降解的丝素蛋白(SF)骨架。所述仿生复合矿化支架具备以下优势：矿化胶原微粒均匀地分布在丝素蛋白骨架的表面及内部，引导骨再生特性的同时保证了良好的生物相容性；具有疏松的多孔结状构，在提供一定支撑强度的同时有利于成骨相关细胞以及新生血管的爬行；可以负载各种生长因子、小RNA、外泌体、微量元素和抗生素等，对成骨性能进行多方面调控；可生物降解，矿化胶原的降解产物可以为骨再生提供原材料，而丝素蛋白的可控降解速率可以与新骨生长速率匹配。

Description

一种仿生复合矿化支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及医用生物材料领域，特别涉及一种具有可引导骨再生的矿化胶原(MC)微粒和可控生物降解的丝素蛋白(SF)骨架的仿生复合矿化支架及其制备方法。
背景技术
骨组织主要由三部分组成：细胞、纤维和基质。骨基质的主要成分是胶原蛋白，它提供拉伸强度。骨的矿物成分主要是磷酸钙，提供抗压强度。其最显著的特点是沉积在细胞间的含有大量钙盐的物质，钙盐成为一种非常坚硬的组织，形成身体的骨骼系统，并为各种器官提供支持和保护。骨缺损/骨丢失的原因有很多，如创伤、骨科手术、骨关节炎、骨质疏松和原发肿瘤切除。
据统计估计，全球每年约有2000万患者因各种疾病而失去骨组织。一般来说，对于轻伤或尺寸较小骨缺损，其可以通过身体的骨组织再生进行修复。对于严重的骨损伤(临界尺寸大小的骨缺损或更严重的损伤)，在实现骨再生之前，必须使用天然骨移植物或生物材料来填补缺损位置。
目前，自体骨移植(通常取自患者的髂骨)仍是修复严重骨缺损的金标准。与其他移植物相比，取自患者自身的新鲜自体骨具有无可比拟的优势，包括良好的组织相容性、无免疫原性、丰富的自体祖细胞和良好的骨传导性。然而，自体骨移植也存在许多缺点，包括可用骨量有限和严重并发症，如供区血肿、深度感染、炎症和住院时间延长等。
由于在临床工作中迫切需要开发与天然骨组织具有类似结构和功能、同时无免疫原性的骨修复材料，骨组织工程在过去十年中应运而生并取得了快速发展。由高分子材料制备的骨修复材料具有来源广泛、参数可调(个性化治疗)和无疾病传播风险等优点，受到研究人员和临床医生的青睐。
需要指出的是，在骨修复材料的优良生物相容性、骨传导性、低免疫原性和非感染性等这些优点的基础上，我们特别强调这些材料的可匹配生物降解性。可匹配生物降解性意味着在骨缺损修复过程中，新骨组织可以替换缺损中的材料，其降解速度与新骨的生长速度相匹配。
从材料科学和角度，天然骨组织是由约28％的I型胶原纤维和67％羟基磷灰石有序排列所组成的复合体。矿化胶原纤维是骨的基本组织单元，具有复杂的分级结构和精密的组装方式，其高度有序的结构使机体不同部位骨组织具有其独特的硬度、强度、韧性以及抗折性能。基于仿生学的视角，天然骨组织的这些优异特点为学者研究模拟骨的生物材料或新型功能材料提供了重要的参考。
蚕丝作为最古老的天然聚合物，它的进化历史跨越了3.8亿年。蚕丝已被证明在不同的生物医学应用中可作为一种有效的聚合物。在不同的天然聚合物中，丝素蛋白(SF)是一种同时具有优异的生物相容性和出色的机械性能的聚合物。此外，如果对其加工形式和过程进行了人为控制，丝绸的降解率就可以维持在数月到数年的时间段里。迄今为止，普通SF已被用作许多动物模型的大骨缺损的骨植入物。然而，单纯的SF在促进骨再生方面的效果非常有限，常常需要添加其他材料来改善其成骨性能。
胶原组织是细胞外基质的主要成分。在天然骨组织中，I型胶原纤维约占28％。需要注意的是，天然骨组织中的胶原纤维均是以矿化胶原纤维的形式存在。矿化胶原骨是一种生物相容性良好的骨修复材料，是研究人员对天然骨细胞外基质进行模仿设计、且具有分级结构的仿生骨修复材料。其在微结构和成分两方面都与天然骨相似，有良好的生物相容性和诱导骨再生的能力，是一种优良的骨修复材料，不足之处在于矿化骨胶原修复材料的强度较低(一般在1～2Mpa)，限制了使用范围。
发明内容
本发明的目的是提供一种仿生复合矿化支架及其制备方法，其为双组份系统的MC-SF复合共混物，具有可引导骨再生的矿化胶原(MC)微粒和可控生物降解的丝素蛋白(SF)骨架，在提供一定支撑强度的同时有利于成骨相关细胞以及新生血管的爬行。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种仿生复合矿化支架，是一种可提供一定支撑强度且具备疏松的多孔结状构的支架，其为双组份系统的MC-SF复合共混物，其特征在于具有可引导骨再生的矿化胶原(MC)微粒和可控生物降解的丝素蛋白(SF)骨架；所述矿化胶原微粒分布在丝素蛋白骨架的表面及内部。
一种仿生复合矿化支架的制备方法，其特征在于，步骤包括：
S1.制备胶原的酸溶液，依次逐滴加入钙盐溶液和磷酸盐溶液，然后逐滴加入氢氧化钠溶液，调节混合溶液的PH为中性，静置一段时间后离心去除上清，得到矿化胶原沉淀物。
S2.对蚕茧进行脱胶处理，蒸馏水洗后自然晾干得到脱胶蚕丝，将其溶解后加入到透析袋中，然后置于去离子水中透析后滤除杂质即可获得丝素蛋白溶液。
S3.将步骤S1中制备的矿化胶原加入到步骤S2中获取的丝素蛋白溶液中进行充分混匀，注入模具并真空冻干后得到初始的仿生复合矿化支架，然后进行交联、水洗、烘干和灭菌后获得最终的仿生复合矿化支架。
进一步地，所述步骤S1中的胶原为Ⅰ型胶原，可来源于哺乳动物的肌腱、韧带、骨组织以及重组人胶原；优选地，选用市售牛肌腱来源的胶原粉末和重组人胶原。
进一步地，所述步骤S1中的酸为盐酸、柠檬酸、硝酸或醋酸，胶原的酸溶液(PH≤3)，其中胶原浓度为0.05～100mg/ml；优选地，选用酸为醋酸，胶原的酸溶液(PH＝3)，其中胶原浓度为5mg/ml。
进一步地，所述步骤S1中的钙盐为氯化钙、高氯酸钙、硝酸钙、碳酸氢钙、磷酸氢钙或磷酸二氢钙，钙离子的浓度为0.01～1mol/L，其中每克胶原所对应的钙离子加入量为0.05～1mol；优选地，选用钙盐为氯化钙，钙离子的浓度为0.1mol/L，每克胶原所对应的钙离子加入量为0.1mol。
进一步地，所述步骤S1中的磷酸盐为磷酸二氢钠/钾、磷酸氢二钠/钾或磷酸镁，磷酸根离子的浓度为0.01～1mol/L，其中磷酸根离子与钙离子的摩尔比为1∶1～1∶2；优选地，选用的磷酸盐为磷酸二氢钠，磷酸根离子的浓度为0.1mol/L，其中磷酸根离子与钙离子的摩尔比为1∶1.67。
进一步地，所述步骤S1中的氢氧化钠的浓度为0.01～10mol/L，逐滴加入调节混合溶液的pH值为6～8；优选地，选用的氢氧化钠浓度为0.1mol/L，调节混合溶液的pH值为7.4。
进一步地，所述步骤S1中的中性混合溶液静置2-72h，以1000～8000r/min的速度离心得到矿化胶原沉淀物；优选地，中性混合溶液静置的时间为48h，以3000r/min的速度离心得到矿化胶原沉淀物。
进一步地，所述步骤S2中的蚕茧为桑蚕茧或柞蚕茧；优选地，蚕茧为桑蚕茧。
进一步地，所述步骤S2中的蚕茧去蛹后，修剪成小片状，放入0.5％w(Na2CO3)：w(H2O)的沸水中进行脱胶处理，蚕茧与水溶液的质量比约为1：100～1：1000，煮沸时间为20～120min，重复2-10次；优选地，蚕茧与水溶液的质量比约为1:500，煮沸时间为20min，重复3次。
进一步地，所述步骤S2中煮沸处理之后的脱胶蚕丝置于去离子水中充分清洗2～10次，挤干水分后自然晾干获得脱去丝胶的丝素纤维；优选地，煮沸处理之后的脱胶蚕丝置于去离子水中充分清洗5次。
进一步地，所述步骤S2中的脱胶蚕丝置于9.3～20mol/L溴化锂溶液、9～20mol/L硫氰酸锂溶液或三元溶液(氯化钙:去离子水:无水乙醇＝74:96:79(w：v：v))中在30-80℃的条件下溶解3～24h，其中脱胶蚕丝与溶液的质量比为1∶8～1∶20；优选地，将脱胶蚕丝置于9.3mol/L溴化锂溶液中在60℃的条件下溶解6h，其中脱胶蚕丝与溶液的质量比为1∶10。
进一步地，所述步骤S2中完全溶解的丝素溶液注入截留分子量为8000～14000Da的透析袋中，在去离子水中透析3～6d，每6-12h换水一次，以去除溶液中的盐离子；优选地，在去离子水中透析3d，每6h换水一次。
进一步地，所述步骤S2中透析所得的溶液经过20～100μm的滤网过滤到得到丝素蛋白溶液，通过在平均分子量为10000～30000、浓度为10～40％的聚乙二醇溶液中反向透析2-48小时来调整丝素蛋白的浓度；优选地，透析所得的溶液经过38μm的滤网过滤，然后在平均分子量为20000、浓度为25％的聚乙二醇溶液中反向透析24小时。
进一步地，所述步骤S3中矿化胶原沉淀物的质量分数为5～100％，丝素蛋白溶液的质量分数为2～30％，混合体系中矿化胶原与丝素蛋白的质量比为1：20～20：1；优选地，矿化胶原沉淀物的质量分数为10％，丝素蛋白溶液的质量分数为15％，混合体系中矿化胶原与丝素蛋白的质量比为1：10。
进一步地，所述步骤S3中将矿化胶原和丝素蛋白溶液的混合液注入定制的硅胶模具中在-20℃预冷1-24h，接着转移至-80℃继续冷1-48h，然后设置真空冷冻干燥的温度为-70～-80℃，冻干时间为1～3d；优选地，将混合液注入定制的硅胶模具中在-20℃预冷3h，接着转移至-80℃继续冷冻6h，真空冷冻干燥的温度为-75℃，冻干时间为2d。
进一步地，所述步骤S3中的交联剂为质量分数为60％以上的乙醇、甲醇或京尼平，交联温度为20～60℃，交联时间为8～48h；优选地，选用的交联剂是质量分数为60％的乙醇，交联温度为37℃，交联时间为24h。
进一步地，所述步骤S3中交联后的支架用去离子水清洗2-10次，每10-120min换一次水，然后置于30-80℃的温度下烘干6-48h；优选地，交联后的支架用去离子水清洗8次，每30min换一次水，然后置于37℃的温度下烘干12h。
进一步地，所述步骤S3中灭菌方式为的钴-60辐照剂量为15-20Kgy的γ射线处理6～24h或者75％乙醇浸泡5min以上；优选地，灭菌方式为的钴-60辐照剂量为20Kgy的γ射线处理12h。
本发明使用到的化学试剂及耗材如胶原、醋酸、氯化钙、磷酸二氢钠、氢氧化钠、蚕茧和溴化锂等均可通过商业途径购得，真空冷冻干燥的条件为常规的冷冻干燥机均可提供。
本发明方法制备的仿生复合矿化支架在清洗烘干后，可以直接进行钴60(20KGy)产生的γ射线辐照灭菌处理后真空无菌包装；也可以将其储存于等渗液体(如生理盐水或PBS)中，封装后采用钴60(20KGy)产生的γ射线辐照灭菌处理，4℃条件下保存备用。
有益效果
本发明采用调整溶液PH值的方法来将胶原自组装和矿化进程联合同步进行，进而制备了仿生矿化胶原(MC)微粒。紧接着，采用物理混合丝素蛋白(SF)，冷冻干燥定型和化学交联固化的方法制备了一种仿生复合矿化支架，所述仿生复合矿化支架为双组份系统的MC-SF复合共混物，具有可引导骨再生的矿化胶原(MC)微粒和可控生物降解的丝素蛋白(SF)骨架。扫描电镜显示支架具有疏松的多孔结状构，矿化胶原微粒在均匀地分布在丝素蛋白骨架的表面及内部，这种结构可以提供较好的支撑强度，引导骨再生特性的同时保证了良好的生物相容性；所述仿生复合矿化支架具有疏松的多孔结状构，在提供一定支撑强度的同时有利于成骨相关细胞以及新生血管的爬行。
大鼠颅骨缺损支架植入修复实验显示本仿生复合矿化支架有利于成骨相关细胞的迁移、成骨及矿化；支架的大鼠皮下包埋实验显示其具有良好的生物相容性；支架植入大鼠颅骨缺损后不同时间的OCTA动态连续成像显示其有利于新生血管的爬行；此外，本发明所涉及的仿生复合矿化支架可以负载各种生长因子、小RNA、外泌体、微量元素和抗生素等，对成骨性能进行多方面调控；最后，矿化胶原的降解产物可以为骨再生提供原材料，通过对丝素蛋白溶液的制备过程参数进行调整，可人为控制丝素蛋白的降解速率，进而保证其与新骨生长速率相匹配。结合丝素蛋白和矿化胶原优势的新型可降解骨仿生复合矿化支架修复材料具有非常好的可行性。
附图说明
图1为实施例1中仿生复合矿化支架的大体观。
图2为实施例1中仿生矿化胶原微粒的透射电镜图。
图3为实施例1中仿生复合矿化支架的扫描电镜图。
图4为实施例1中仿生复合矿化支架的大鼠皮下包埋术后4周的HE染色及Masson图。
图5为实施例1中仿生复合矿化支架的大鼠颅骨缺损原位植入术后6周的OCTA图。
图6为实施例1中仿生复合矿化支架的大鼠颅骨缺损原位植入后12周的micro-CT图。
图7为实施例1中仿生复合矿化支架的大鼠颅骨缺损原位植入后12周的HE染色图。
具体实施方式
为使本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，并配合所附图作详细说明，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。。
实施例1
本实施例提供一种具体的仿生复合矿化支架的制备方法及应用，具体如下：
一种具体的仿生复合矿化支架的制备方法
S1.选用市售牛肌腱来源的Ⅰ型胶原粉末，制备胶原的醋酸溶液(PH＝3)，其中胶原浓度为5mg/ml；依次逐滴加入氯化钙盐溶液，其中钙离子的浓度为0.1mol/L，每克胶原所对应的钙离子加入量为0.1mol；依次逐滴加入磷酸二氢钠盐溶液，磷酸根离子的浓度为0.1mol/L，其中磷酸根离子与钙离子的摩尔比为1∶1.67；然后逐滴加入浓度为0.1mol/L的氢氧化钠溶液，调节混合溶液的pH值为7.4；中性混合溶液静置的时间为48h，以3000r/min的速度离心得到矿化胶原沉淀物。
S2.将桑蚕茧去蛹后，修剪成小片状，放入0.5％w(Na2CO3)：w(H2O)的沸水中煮沸20min并重复3次进行脱胶处理，其中蚕茧与水溶液的质量比约为1:500；煮沸处理之后的脱胶蚕丝置于去离子水中充分清洗5次，挤干水分后自然晾干获得脱去丝胶的丝素纤维；将脱胶蚕丝置于9.3mol/L溴化锂溶液中在60℃的条件下溶解6h，其中脱胶蚕丝与溶液的质量比为1∶10；将完全溶解的丝素溶液注入截留分子量为8000～14000Da的透析袋中，在去离子水中透析3d，每6h换水一次，以去除溶液中的盐离子；将透析所得的溶液经过38μm的滤网过滤到得到丝素蛋白溶液；然后在平均分子量为20000、浓度为25％的聚乙二醇溶液中反向透析24小时。
S3.调整步骤S1中制备矿化胶原的质量分数为10％，调整步骤S2中获取的丝素蛋白溶液的的质量分数为15％，然后将两者进程进行超声分散充分混匀；将混合液注入定制的硅胶模具中在-20℃预冷3h，接着转移至-80℃继续冷冻6h，然后在-75℃的真空冷冻干燥机中冻干2d；将冻干支架置于质量分数为60％的乙醇交联剂中交联24h，交联温度为37℃；将交联后的支架用去离子水清洗8次，每30min换一次水，然后置于37℃的温度下烘干12h；将烘干支架置于无菌袋中密封，再经钴-60辐照剂量为20Kgy的γ射线处理12h进行灭菌处理后备用。
实施例2
将实施例1的S3中制备的仿生复合矿化支架置于蓝色无菌单上拍照记录其大体观，如图1所示，支架呈乳白色，可见支架表面较为密集的疏松多孔状结构。
将实施例1的S1中制备的矿化胶原微粒粉末样品用去离子水溶解稀释后滴到覆盖有碳支撑膜的400目铜网格上，然后在室温下将网格风干，进而调整透射电子显微镜的电压为110kV对样品进行观察拍照。如图2所示，可见胶原微粒呈疏松的絮状结构，颜色较深的矿物钙盐呈针叶松状分布在胶原内部。
将实施例1的S3中制备的仿生复合矿化支架置于液氮中用镊子掰断、喷金后用扫描电子显微镜进行观察拍照。如图3所示，可见仿生复合矿化支架表面及内部均匀分布的矿化胶原微粒，其与丝素蛋白融合较为紧密，且显示出复杂多向的孔状结构，这保证了其引导骨再生特性的同时具有良好的生物相容性，在提供一定支撑强度的同时有利于成骨相关细胞以及新生血管的爬行；以未矿化的胶原和丝素蛋白复合支架作为对比，可见其呈表面较为光滑的多孔状结构。
实施例2
将实施例1的S3中制备的仿生复合矿化支架浸泡于无菌生理盐水中，选取体重为200-220g的雄性SD大鼠禁食24小时后麻醉、备皮后用手术刀在其背部皮肤表面造成一个10mm的切口，然后植入仿生复合矿化支架，关闭创面后对伤口进行消毒，以未矿化的胶原和丝素蛋白复合支架作为对比。术后4周取出植入支架固定、脱水、包埋后行5μm石蜡切片，然后经烤片、脱蜡、复水后用试剂盒进行HE和Masson染色，置于显微镜下拍照记录。如图4所示仿生复合矿化支架组未见明显的免疫反应，机体的大量的蓝染胶原纤维长入到了支架内部，与支架融合良好，且支架的小梁骨架部分显示出一定的降解趋势，部分蓝染胶原纤维已经长入小梁骨架内部；以未矿化的胶原和丝素蛋白复合支架作为对比，可见其内部长入的蓝染胶原纤维较少，且未观察到明显的降解趋势。
实施例3
将实施例1的S3中制备的仿生复合矿化支架浸泡于无菌生理盐水中，选取体重为200-220g的雄性SD大鼠禁食24小时后麻醉、备皮后用牙科环钻在其颅骨部位造成一个直径为5mm的骨缺损，然后将原位植入仿生复合矿化支架，关闭创面后对伤口进行消毒，以未矿化的胶原和丝素蛋白复合支架作为对比。术后6周对大鼠进行麻醉后小心打开手术位置的颅骨皮肤，暴露出颅骨缺损处，采用小动物脑定位仪对大鼠头部进行固定后置于光学相干断层扫描仪下采集缺损修复位置的血流信号并进行三维重建成像。如图5所示直径为5mm的颅骨缺损的仿生复合矿化支架植入位置可见较多的橘黄色血管信号(表层粘膜血管：绿色，中间板层颅骨血管：橘黄色，深层脑部血管：红色)，以未矿化的胶原和丝素蛋白复合支架作为对比，可见其植入位置的橘黄色血管信号较少。
实施例4
将实施例1的S3中制备的仿生复合矿化支架浸泡于无菌生理盐水中，选取体重为200-220g的雄性SD大鼠禁食24小时后麻醉、备皮后用牙科环钻在其颅骨部位造成一个直径为5mm的骨缺损，然后将原位植入仿生复合矿化支架，关闭创面后对伤口进行消毒，以未矿化的胶原和丝素蛋白复合支架作为对比。术后12周对大鼠进行麻醉后小心打开手术位置的颅骨皮肤，取出植入支架固定后进行Micro-CT扫描后进行三维重建成像。如图6所示直径为5mm的颅骨缺损的仿生复合矿化支架植入位置可见较多的新生骨组织信号，以未矿化的胶原和丝素蛋白复合支架作为对比，可见其植入位置的橘新生骨组织信号较少。
实施例5
将实施例1的S3中制备的仿生复合矿化支架浸泡于无菌生理盐水中，选取体重为200-220g的雄性SD大鼠禁食24小时后麻醉、备皮后用牙科环钻在其颅骨部位造成一个直径为5mm的骨缺损，然后将原位植入仿生复合矿化支架，关闭创面后对伤口进行消毒，以未矿化的胶原和丝素蛋白复合支架作为对比。术后12周对大鼠进行麻醉后小心打开手术位置的颅骨皮肤，取出植入支架固定、脱水、包埋后行5μm石蜡切片，然后经烤片、脱蜡、复水后用试剂盒进行HE染色，置于显微镜下拍照记录。如图7所示仿生复合矿化支架组可见较多的新生类骨组织，以未矿化的胶原和丝素蛋白复合支架作为对比，可见其植入位置的新生类骨组织较少。

Claims (5)

1.一种仿生复合矿化支架的制备方法，其特征在于，仿生复合矿化支架为双组份系统的MC-SF复合共混物，包括可引导骨再生的矿化胶原MC微粒和可控生物降解的丝素蛋白SF骨架；所述矿化胶原微粒分布在丝素蛋白骨架的表面及内部；
所述制备方法包括以下步骤：
制备胶原的酸溶液，依次逐滴加入钙盐溶液和磷酸盐溶液，然后逐滴加入氢氧化钠溶液，调节混合溶液的PH为中性，静置一段时间后离心去除上清，得到矿化胶原；
对蚕茧进行脱胶处理，蒸馏水洗后自然晾干得到脱胶蚕丝，将其溶解后加入到透析袋中，然后置于去离子水中透析后滤除杂质即可获得丝素蛋白溶液；
将矿化胶原和丝素蛋白溶液的混合液注入定制的硅胶模具中在-20℃预冷1-24h，接着转移至-80℃继续冷冻1-48h，然后设置真空冷冻干燥的温度为-70~-80℃，冻干时间为1~3d，得到初始的仿生复合矿化支架，然后进行交联、水洗、烘干和灭菌后获得最终的仿生复合矿化支架；所述矿化胶原的质量分数为5~100%，丝素蛋白溶液的质量分数为2~30%，混合体系中矿化胶原与丝素蛋白的质量比为1：20~20：1；
所述蚕茧去蛹后，修剪成小片状，放入Na2CO3：H2O为w：w=0.5%：1的沸水中进行脱胶处理，蚕茧与水溶液的质量比为1∶100~1∶1000，煮沸时间为20~120 min，重复2-10次；所述蚕茧为桑蚕茧或柞蚕茧；将煮沸处理之后的脱胶蚕丝置于去离子水中充分清洗2~10次，挤干水分后自然晾干获得脱去丝胶的丝素纤维；所述脱胶蚕丝置于9.3~20mol/L溴化锂溶液、9~20mol/L硫氰酸锂溶液或三元溶液中在30-80℃的条件下溶解3~24 h，其中脱胶蚕丝与溶液的质量比为1∶8~1∶20；所述三元溶液为氯化钙加入去离子水和无水乙醇的混合溶液，所述氯化钙、去离子水和无水乙醇的比例为w：v：v=74:96:79；
所述胶原的酸溶液中，胶原为 Ⅰ 型胶原，来源于哺乳动物的肌腱、韧带、骨组织或重组人胶原；胶原浓度为0.05~100mg/mL，所述酸溶液为盐酸、柠檬酸、硝酸或醋酸，所述酸溶液的PH≤3；
所述钙盐为氯化钙、高氯酸钙、硝酸钙、碳酸氢钙、磷酸氢钙或磷酸二氢钙，钙离子的浓度为0.01~1mol/L，其中每克胶原所对应的钙离子加入量为0.05~1mol；所述磷酸盐为磷酸二氢钠/钾、磷酸氢二钠/钾或磷酸镁，磷酸根离子的浓度为0.01~1mol/L，其中磷酸根离子与钙离子的摩尔比为1∶1~1∶2；所述氢氧化钠的浓度为0.01~10mol/L，逐滴加入氢氧化钠溶液调节混合溶液的pH值为6~8。
2. 如权利要求1所述的仿生复合矿化支架的制备方法，其特征在于，调节混合溶液的PH为中性后静置2-72 h，以1000~8000r/min的速度离心得到矿化胶原。
3. 如权利要求1所述的仿生复合矿化支架的制备方法，其特征在于，将完全溶解的丝素溶液注入截留分子量为8000~14000Da的透析袋中，在去离子水中透析3~6d，每6 -12h换水一次，以去除溶液中的盐离子；透析所得的溶液经过20~100 μm的滤网过滤到得到丝素蛋白溶液，通过在平均分子量为10000~30000、浓度为10-40%的聚乙二醇溶液中反向透析2-48小时来调整丝素蛋白的浓度。
4.如权利要求1所述的仿生复合矿化支架的制备方法，其特征在于，所述交联剂为质量分数为60%以上的乙醇、甲醇或京尼平，交联温度为20~60℃，交联时间为8~48h；交联后的支架用去离子水清洗2-10次，每10-120min换一次水，然后置于30-80℃的温度下烘干6-48h；灭菌方式为的钴-60辐照剂量为15-20Kgy的γ射线处理6~24h或者75%乙醇浸泡5min以上。
5.一种仿生复合矿化支架，其特征在于，由权利要求1~4任一项所述制备方法制备而成。
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