JP2019529015A - 生着率を増加させた移植用真皮層及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
生着率を増加させた移植用真皮層及びその製造方法に関するものであって、細胞が除去された無細胞性真皮移植片にＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液を充填させて製造することができる。このように製造された移植用真皮層が内部に充填されているＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液によって、移植された周辺組織から細胞の流入と固着を速くすることで、初期炎症反応を緩和し、周辺組織との融合が促進されることを確認した。【選択図】図４
Description
本発明は生着率を増加させた移植用真皮層及びその製造方法に関するものである。より詳しくは、生物学的に不活性化された真皮層にＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液を充填させて、移植時、生着率を増加させた移植用真皮層に関するものである。
皮膚は人体表面の全体を覆っている最も大きい臓器であって、体液の流失を止めて、外部から有害物質と微生物の流入を止めて、物理的刺激、放射線と紫外線などから私達の体を保護する機能を遂行している。皮膚は、毛嚢、毛、汗腺、皮脂腺など、いろいろな付属器官を保有しているので、保護膜機能の他にも多様な機能を遂行している重要な複合器官である（非特許文献１）。皮膚は 表皮層（epidermis）、真皮層（dermis）、及び皮下組織（subcutaneous tissue、hypodermis）に大別される。
表皮層は皮膚の外部の薄い層であって、新しく分化する細胞で構成されており、これらは外部環境から皮膚を保護する細胞を続けて新しい細胞に交替してくれる。一番下段部から基底層（stratum basalis、basal cell layer）、有棘層（stratum spinosum、spinous cell layer）、顆粒層（stratum granulosum、granular cell layer）、角質層（stratum corneum）に階層化されているので、皮膚の表面には最終分化された死んだ細胞が多重に積まれて保護膜機能を遂行するようになる。
真皮層は表皮の下にいる層で、血管、神経などの多様な構造物を指示する基質を供給する層であって、コラーゲン、弾性繊維、及び細胞外基質（extracellular matrix）からなっている。真皮層は大別して上層部の線維芽細胞（fibroblast）が豊富で、微細血管が分布する乳頭層（papillary layer）と、厚いコラーゲン繊維が豊富な細網結合組織（reticular connective tissue）とから構成されている。
皮下組織は真皮と筋肉、骨格の間にある部分であって、脂肪組織（adipose tissue）と結合組織とから構成されており、血管とリンパ管及び神経末端部を含む。皮下組織内の脂肪組織は外部の圧力から保護してくれて、摩擦力に対するパッディング効果を提供して骨と筋肉のような深部構造の上で皮膚の移動を容易にするようにする。また、脂肪組織が多くて熱を生産し、生産した熱を保有するだけでなく、衝撃を吸収することによって身体を保護し、余分の営養素を蓄積する。
皮膚組織は、火傷、外傷、及び皮膚疾患などにより組織の一部が損傷できるが、この場合、損傷された組織の治癒を目的とするか、または再建成形を目的に本人の皮膚組織を移植する自家移植（autograft）、他の人の皮膚を移植する同種移植（homograft、allograft）、動物の皮膚を移植する異種移植（heterograft、xenograft）方法を使用する。これら方法のうち、自家移植が最も理想的であるが、治療部位が広範囲な場合、組織を確保することができる部位に制限がつき、採取部位が新しい傷部位として残ることになる困難性がある。同族移植は永久的な生着よりは傷周辺部の細胞の移動と治癒を助ける役割をする。
皮膚の損失が深刻な状態の患者のためには傷を覆うことができる支持体（scaffold）が必要であり、このために人工皮膚（artificial skin）が開発されている。人工皮膚は損失部位の感染及び体液の損失を止める保護膜の役割と、患者の傷部位に傷跡が残らず、治癒過程で発生できる深刻な収縮を原則的に止めることができなければならない（非特許文献２）。
人工皮膚は、創傷被覆材（wound dressing）という一時的被覆型（temporary skin equivalent）と培養皮膚または体内移植用である永久生着型（permanent skin equivalent）という２種類に大別できる。一時的被覆型である創傷被覆材は、火傷や外傷などにより損傷を受けた皮膚が回復するまで一時的に患部を保護するものであって、体内からの水分露出を防止し、滲出液を吸収し、外部から微生物の侵入及び感染を防止する役割をする。一方、永久生着型人工皮膚は合成高分子と天然高分子とからなり、創傷被覆材の役割は勿論、人体の細胞が容易に侵入することができる通路を提供し、本来の皮膚組織に再生されることを積極的に助けて、その自体は人体内で分解、吸収される。永久生着型人工皮膚のうちの１つである生人工皮膚（bioartifical skin）は保護膜機能は勿論、損傷組織の再生に必要な成長因子と細胞外基質を提供して迅速な傷治癒と傷痕の減少など、その卓越した効果が立証されている。現在、生人工皮膚は火傷、褥瘡、外傷、成形、難治性潰瘍、糖尿性皮膚壊死、圧力靡爛（erosion）などに臨床適用されている。
皮膚移植は移植する外植片（explant）の厚さと移植部位管理によって成功可否が多様に表れる（非特許文献３〜４）。成功的な皮膚移植のために皮膚移植の機転に対する研究、技術的発達と手術後の供与部管理、手術部位管理などに対する研究も活発になされてきた（非特許文献５〜６）。一般的に知られた皮膚移植の機転は移植皮膚が着床培地から血流の供給を受けて生きるようになり、移植成功可否は２４−４８時間に発生する栄養及び酸素の拡散効果である血漿吸収（plasmatic imbibition）と新生血管形成（revascularization）により決定される（非特許文献５）。皮膚移植の失敗原因に最もありふれたものは移植皮膚下血腫や体液の貯留と報告されている。２番目にありふれた原因は感染と知られている（非特許文献７〜８）。その他の皮膚移植の成功に影響を及ぼす多様な因子や関連因子があることと考えられるが、これに対する研究結果は不足し、調節可能な適切な皮膚移植の前提条件や基準は提示されたところがない（非特許文献９）。
キトサン（chitosan）（poly β−(1→4)-2-amino-2-deoxy-D-glucan）はＤ−グルコサミンがβ−（1→4）結合した線形高分子で、キチン（chitin）（poly β−（1→4）-2-acetamined-2-deoxy-D-glucan）のC２位置にあるアセトアミド基のうち、アセチル基を除去させることによって得られる天然多糖類である。キトサンはキチンに比べて結晶性が低いので、塩酸（hydrochloric acid）、硫酸（sulfuric acid）などの無機酸、フォルム酸（formic acid）、アセト酸（acetic acid）、プロピオン酸（propionic acid）、蓚酸（oxalic acid）、コハク酸（succinic acid）などの有機酸、グルコン酸（gluconic acid）、乳酸（lactic acid）、リンゴ酸（malic acid）などのオキシ酸（oxy acid）、グルタミン酸（glutamic acid）などの酸性アミノ酸の薄い水溶液で酸塩を形成して溶ける（非特許文献１０〜１１）。
キトサン溶液は粘度が高い特徴を有しており、脱アセチル化度、イオン強度、ｐＨ、温度などによって差がある。例えば、溶媒のｐＨが低ければキトサン溶液の粘度は減少し、ｐＨが高まれば粘度は増加し、温度の場合には温度が高まればキトサン溶液の粘度が減少し、また元来の温度になれば初めてと同じ粘度となる。
キトサンは人を含んだ動物、植物に対する生理活性を有するので、広い分野で応用及び用いられている。キトサンの生理作用を活用して最も広く応用されていることは坑菌作用である。キトサンの坑菌作用は陽イオン化されたアミノ基により発現されることと知られている。陽イオン化されたキトサンのアミノ基と細菌の細胞壁を構成するシアル酸（sialic acid）、燐脂質（phospholipid）などの酸性基（acidic group）の間にイオン結合が起こって、高分子電解質複合体を形成した結果、細胞膜のうち、燐脂質の極性化により接触面の反対側の細胞膜組織が破壊され、それによって細胞内の原形質が漏出して細菌が死ぬようになる。また、生体医療工学分野で優れる人体適合性と拒否反応が最小である高分子素材としてキトサンを利用しようとする研究が持続されており、創傷保護材、創傷軟膏、歯科用材、整形外科材料、手術用縫合糸などの人体適合性生体高分子素材として脚光を浴びている（非特許文献１２）。
ここに、本発明者らは皮膚移植用組成物を研究する過程で、生物学的に不活性化された真皮層にＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液で充填させて製造した移植用真皮層が移植した部位で生着率が増加したことを確認することによって本発明を完成できた。
従来の先行技術として特許文献１〜２には移植用無細胞真皮層が記載されて本発明の構成と類似しているが、ＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液を充填させる方法は記載されていなくて、本発明の構成と差がある。また、特許文献３には皮膚移植時、新生血管形成誘導因子を暗号化している核酸を投与する方法を記載しているが、本発明のキトサンは全く言及されておらず、薬物が充填された真皮組成物が記載されていないので、本発明の構成と相異する。韓国登録特許第１５３４２７６号には脂肪移植手術後、脂肪細胞の生着率増進のためのポリデオキシリボヌクレオチドを成分とする組成物が記載されているので、本発明の構成と類似しているが、キトサンは全く言及されておらず、薬物が充填された真皮組成物が記載されていないので、本発明の構成と差がある。
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コ ビョン ヨル、et al., ２００２
本発明の目的は、生着率を増加させた移植用真皮層及びその製造方法を提供することにある。
本発明は移植用真皮層製造方法に関するものであって、ＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液（stock solution）を製造する第１ステップ；キトサン貯蔵溶液を製造する第２ステップ；前記ＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液及び前記キトサン貯蔵溶液を混合して撹拌した後、滅菌してＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液を製造する第３ステップ；及び前記充填液を無細胞性真皮移植片に充填する第４ステップ；を含む移植用真皮層の製造方法に関するものである。
前記製造方法は、ＤＮＡ断片混合物を緩衝溶液に入れて５０℃乃至７０℃で撹拌しながら１時間乃至３時間の間溶解させてＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液を製造する第１ステップ；キトサンを酸性緩衝溶液に溶解させてキトサン貯蔵溶液を製造する第２ステップ；前記ＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液及び前記キトサン貯蔵溶液をＤＮＡ断片混合物及びキトサンの重量割合が２０：１−１０，０００：１になるように混合して６５℃乃至７５℃で１時間乃至２時間の間撹拌した後、滅菌してＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液を製造する第３ステップ；及び前記充填液を真空薬物充填装置を用いて無細胞性真皮移植片に充填する第４ステップ；を含むことができる。
前記ＤＮＡ断片混合物は、魚類の精巣または精液から分離することができる。
前記魚類は、サケ類でありうる。
前記ＤＮＡ断片混合物は、分子量が５０ｋＤａ乃至１０，０００ｋＤａでありうる。
前記ＤＮＡ断片混合物は充填液の総重量を基準に０．０１重量％乃至３重量％でありうる。
前記キトサンは、分子量が３ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａでありうる。
前記キトサンは、充填液の総重量を基準に１x１０−６重量％乃至０．１５重量％でありうる。
前記第４ステップの無細胞性真皮移植片は真皮から細胞及び不純物が除去され、ウイルス不活化処理後、凍結乾燥処理して生物学的に不活性化されたコラーゲン使用組織補充材でありうる。
前記真皮は、自家、同種、または異種から分離したものでありうる。
前記第４ステップの充填は圧力を用いて無細胞性真皮移植片の内部に粘性がある充填液を流入させてコラーゲンの間の空いた空間を詰めるものでありうる。
前記第４ステップの真空薬物充填装置は、充填液を一方向に連結し、陽圧または陰圧を発生させて連結された充填液が無細胞真皮移植片の内部のコラーゲンの間の空間を詰めて充填されるようにすることができる。
また、本発明は前記製造方法により製造された移植用真皮層に関するものである。
また、本発明は前記移植用真皮層を含む皮膚損傷治療剤に関するものである。
前記皮膚損傷は、擦過傷（abrasion）、切開（incision）、裂傷（laceration）、皮膚裂離（skin avulsion）、皮膚打撲（skin bruise）、穿刺負傷（puncture wound）、及び手術による皮膚切除群より選択される１種以上が原因となることがある。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明はＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液（stock solution）を製造する第１ステップ；キトサン貯蔵溶液を製造する第２ステップ；前記ＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液及び前記キトサン貯蔵溶液を混合して撹拌した後、滅菌してＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液を製造する第３ステップ；及び前記充填液を無細胞性真皮移植片に充填する第４ステップ；を含む移植用真皮層の製造方法に関するものである。
前記移植用真皮層の製造方法は、ＤＮＡ断片混合物を緩衝溶液に入れて５０℃乃至７０℃で撹拌しながら１時間乃至３時間の間溶解させてＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液を製造する第１ステップ；キトサンを酸性緩衝溶液に溶解させてキトサン貯蔵溶液を製造する第２ステップ；前記ＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液及び前記キトサン貯蔵溶液をＤＮＡ断片混合物及びキトサンの重量割合が２０：１−１０，０００：１になるように混合して６５℃乃至７５℃で１時間乃至２時間の間撹拌した後、滅菌してＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液を製造する第３ステップ；及び前記充填液を真空薬物充填装置を用いて無細胞性真皮移植片に充填する第４ステップ；を含むことができる。
前記第１ステップでＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液製造時に用いることができる緩衝溶液には、ソジウムホスフェートジベーシックドデカハイドレート（sodium phosphate dibasic dodecahydrate）、塩化ナトリウム（sodium chloride）、塩化マグネシウム（magnesium chloride）、塩化カリウム（potassium chloride）、燐酸緩衝食塩水（phosphate buffer saline）、HEPES（N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N'-2-ethanesulfomc acid）、またはグリセロール−３−燐酸（glycerol-3-phosphate）緩衝溶液があり、好ましくはソジウムホスフェートジベーシックドデカハイドレート（sodium phosphate dibasic dodecahydrate）を用いることができるが、これに限定するものではない。
前記ＤＮＡ断片混合物は、魚類の精巣または精液から分離したものでありうる。
前記魚類はサケ類で、好ましくはサケまたは鱒で、最も好ましくはサケでありうる。
前記ＤＮＡ断片混合物とは、燐酸、４種類の塩基、デオキシリボース（deoxyribose）からなる生体高分子に該当するＤＮＡであって、分子量が低減した断片形態に混合されて存在することを称する。
前記ＤＮＡ断片混合物は、特定のサイズのＤＮＡ断片が混合されて薬理効果または高分子支持体の役割をする物質をいう。
前記ＤＮＡ断片混合物は、ポリデオキシリボヌクレオチド（Polydeoxyribonucleotide）及びポリヌクレオチド（Polynucleotide）でありうる。
前記ポリデオキシリボヌクレオチドは、細胞再生、傷治癒の役割をする物質として知られており、前記ポリヌクレオチドは支持体構造を通じての細胞再生環境を構成する役割をすることができる。
前記ＤＮＡ断片混合物は分子量が５０ｋＤａ乃至１０，０００ｋＤａでありうる。好ましくは、５０ｋＤａ乃至５，０００ｋＤａで、最も好ましくは５０ｋＤａ乃至３，５００ｋＤａである。
前記第２ステップで、キトサン貯蔵溶液製造時に用いることができる酸性緩衝溶液には、アセト酸（acetic acid）、塩酸（hydrochloric acid）、アスコルブ酸（ascorbic acid）、乳酸（lactic acid）、窒酸（nitric acid）があり、好ましくはアセト酸（acetic acid）を用いることができるが、これに限定するものではない。
前記キトサンは分子量が３ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａでありうる。
前記第３ステップでＤＮＡ断片混合物及びキトサンの重量割合が２０：１−１０，０００：１で、好ましくは２０：１−１，０００：１で、より好ましくは５０：１−２００：１である。
前記ＤＮＡ断片混合物は、充填液の総重量を基準に０．０１重量％乃至３重量％で、好ましくは０．１重量％乃至２重量％で、最も好ましくは０．５重量％乃至１．５重量％である。ＤＮＡ断片混合物が０．０１重量％未満の場合には、生着率増進効果を期待し難く、３重量％超過の場合には充填液製造工程上の問題点が発生することがあるので、好ましくない。
前記キトサンは充填液の総重量を基準に１x１０−６重量％乃至０．１５重量％で、好ましくは１x１０−５重量％乃至０．１５重量％で、最も好ましくは１x１０−４重量％乃至０．０７５重量％である。キトサンが１x１０−６重量％未満または０．１５重量％超過である場合には充填液の粘性により無細胞真皮移植片充填時、充填率が低くなって好ましくない。
前記キトサンは、ＤＮＡ断片混合物と混合されることによって充填液の粘性を増加させることができる。このような粘性の増加は充填液の充填時、無細胞性真皮移植片の内部のコラーゲンの間の空いた空間を詰める充填効率を増加させることができ、無細胞性真皮移植片の内部に流入したＤＮＡ断片混合物が移植片の内部に存在するようにすることができる。
前記キトサンは、無細胞真皮移植片の主成分である陰電荷を帯びるコラーゲンとイオン結合を通じて充填時、充填液の充填効率を増加させることができる。
前記第３ステップで、滅菌は、高温高圧蒸気滅菌、乾熱滅菌、ＥＯ（ethylene oxide）ガス滅菌などを用いることができ、好ましくは高温高圧蒸気滅菌を用いるが、これに限定するものではない。
前記第４ステップで、無細胞真皮移植片（Acellular dermal matrix）は真皮から細胞及び不純物が除去され、ウイルス不活化処理後、凍結乾燥処理して生物学的に不活性化されたコラーゲン使用組織補充材及び支持体（scaffold）でありうる。
前記補充材は傷を覆うことができるものであって、人工皮膚（artificial skin）でありうる。
前記無細胞真皮移植片は、真皮から一連の過程を通じて製造することができ、また、商用化されて販売されるものを用いることができる。
前記真皮は、自家、同種、または異種から分離した真皮でありうる。
前記第４ステップの充填は圧力を用いて無細胞性真皮移植片の内部に粘性がある充填液を流入させてコラーゲンの間の空いた空間を詰めるものであって、有効成分が移植片の内部に多量に存在できるように詰めるものでありうる。特に、充填液が粘性を帯びて無細胞性真皮移植片の内部への流入が難しい場合、陰圧または陽圧を加えることによって、無細胞性真皮移植片の内部に充填液の流入を増加させてコラーゲンの間の空いた空間を詰める充填効率を増加させることができる。また、充填液の移植片の内部への流入を増加させて充填液に含まれている物質と無細胞性真皮移植片の主要成分であるコラーゲンとの接触面積を増加させることによって、充填液に含まれている物質とコラーゲンとのイオン結合機会を高めて２つ物質の間の結合を促進させることによって、充填効率が増加できる。
前記充填は、真空薬物充填装置を用いてなされることができる。
前記真空薬物充填装置は、無細胞性真皮移植片に陽圧（positive pressure）または陰圧（negative pressure）を加えることによって、充填液が無細胞性真皮移植片の内部に流入するようにする装置でありうる。好ましくは、陰圧を用いる。
前記真空薬物充填装置は、無細胞性真皮移植片を固定する部位と充填液が流入する部位、陽圧または陰圧のための真空ポンプが連結された部位からなることができる。
前記固定する部位は、薬物充填時、圧力により薬物が漏れないようにパッキング（packing）されなければならない。
また、本発明は前記製造方法により製造された移植用真皮層に関するものである。
前記移植用真皮層は充填されているＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液によって、移植された周辺組織から細胞が速く移動するようにすることによって、周辺組織との融合を促進させて生着率を増加させることができ、初期炎症を緩和させて移植後の回復を速くすることができる。
また、本発明は移植用真皮層を含む皮膚損傷治療剤に関するものである。
前記皮膚損傷は、擦過傷（abrasion）、切開（incision）、裂傷（laceration）、皮膚裂離（skin avulsion）、皮膚打撲（skin bruise）、穿刺負傷（Puncture wound）、及び手術による皮膚切除群より選択される１種以上が原因となって表れるものでありうる。
前記皮膚損傷治療は、皮膚の損傷が深刻な部位に補充材または支持体（scaffold）を移植して傷部位を覆って損傷部位の体液損失を止めて、傷部位に傷跡が残らないようにするものである。
本発明は生着率を増加させた移植用真皮層及びその製造方法に関するものであって、生物学的に不活性化された真皮移植片にＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液を充填させて製造することができる。このように製造された移植用真皮層が内部に充填されているＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液によって、移植された周辺組織から細胞の流入と固着を速くすることによって、初期炎症反応を減らし、周辺組織との融合を促進することを確認した。
したがって、本発明の移植用真皮層を皮膚が損傷された部位に移植することによって、生着率が高く、速い皮膚損傷治療効果を得ることができることと期待される。
以下、本発明の好ましい実施例を詳細に説明する。しかしながら、本発明はここで説明される実施例に限定されず、他の形態に具体化されることもできる。むしろ、ここで紹介される内容が徹底し、完全になり、当業者に本発明の思想を十分に伝達するために提供するものである。
＜実施例１．生着率を増加させた移植用真皮層製造＞
実施例１−１．ＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液製造
本発明の生着率を増加させた移植用真皮層を製造するためにＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液を製造した。
ＤＮＡ断片混合物を１９０ｍＭソジウムホスフェートジベーシックドデカハイドレート（sodium phosphate dibasic dodecahydrate）緩衝溶液に入れて６０℃の熱撹拌機を用いて２時間以上溶解させてＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液（stock solution）を製造した。キトサンは９０ｍＭアセト酸（acetic acid）に入れて常温で３時間の間撹拌させて溶解してキトサン貯蔵溶液を製造した。
前記で製造したＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液及びキトサン貯蔵溶液を混合して７０℃の熱撹拌機で２時間の間撹拌した。この際、ＤＮＡ断片混合物及びキトサンの濃度及び混合割合が以下の表１の条件になるように混合した。製造されたＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液を高温高圧蒸気滅菌器で滅菌処理した。
実施例１−２．生着率を増加させた移植用真皮層製造
本発明の生着率を増加させた移植用真皮層を製造するためにハンスバイオメド社（ソウル、Korea）から無細胞性真皮移植片（Acellular dermal matrix）（商品名：Nature-Derma）を購入して使用した。この製品は化学処理工程による豚真皮から細胞及び不純物を除去し、ウイルス不活化処理後、凍結乾燥処理されたコラーゲン使用組織補充材で内外科的処理及び手術時の欠損または損傷された骨、軟骨などを補充するために使用するコラーゲン含有製品である。
前記ハンスバイオメド社から購入した無細胞性真皮移植片を真空薬物充填装置に固定させた後、前記実施例１−１で製造したＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液のうち、発明者の肉眼検査と充填テストを通じて使用感が優れる充填液１−１を無細胞性真皮移植片に充填させて本発明の移植用真皮層を製造した。
＜実施例２．ＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液の充填確認＞
無細胞性真皮移植片にＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液が充填されたかを確認するために、Ｈ＆Ｅ（haematoxylin and eosin）染色を進行した。Ｈ＆Ｅ染色過程でヘマトキシリン（haematoxylin）が陰電荷を有する核酸と結合して紫色を示し、エオシン（eosin）が陽電荷を有する細胞質内の蛋白質と結合して赤色を示すが、無細胞性真皮移植片の主成分であるコラーゲンがエオシンと結合して赤色に染色される。
前記実施例１−２で製造した移植用真皮層のうち、表１の充填液１−１を充填させた移植用真皮層を用いてＨ＆Ｅ染色を進行した。この際、対照群に充填液を充填しない無細胞性真皮移植片（対照群１）、無細胞性真皮移植片を充填液に浸して、１時間位担持させた移植片（対照群２）を有してＨ＆Ｅ染色を進行し、その結果を図１に示した。
図１で示すように、ＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液を充填しない無細胞性真皮移植片（対照群１）（Ａ）及び充填液に担持させた無細胞性真皮移植片（対照群２）（Ｂ）の場合には、エオシンによりコラーゲン部分が赤色に染色されたが、ヘマトキシリンにより紫色に染色された部分がないことが分かる。一方、前記実施例１−２で製造した移植用真皮層（Ｃ）の場合には、赤色に染色されたコラーゲンの間間に紫色に染色された部分（黒色の矢印）が表れることが分かる。
これを通じて、充填液に担持する方法は無細胞性真皮移植片の内部への充填液が流入しないことが分かり、無細胞性真皮移植片にＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液を充填する方法により真空薬物充填装置を用いた方法が最も効率的であることが分かった。
＜実験例１．実験動物の準備＞
動物実験は７週齢の重さが２３０〜２８０ｇのSprague-Dawley系雄ネズミ（Rat）をヤングバイオ（城南市、大韓民国）から購入して使用した。飼料は実験動物用固形飼料（Harlan laboratories、Inc., USA）を使用し、給餌機に固形飼料を入れて自由摂取させた。飮水は水道水をフィルター流水殺菌器で濾過した後、紫外線を照射し、自動給水装置で自由摂取させた。実験動物飼育室の環境は温度２３±３℃、相対湿度５５+１５％、照明時間１２時間、及び照度１５０〜３００Ｌｕｘに維持した。
＜実験例２．生着率を増加させた移植用真皮層の生着率確認＞
実験例２−１．移植用真皮層の移植
前記実施例１−２で製造した移植用真皮層を同一な濃度の充填液が入っている溶液に３０分位追加担持して使用した。この際、対照群に充填液を充填させない無細胞性真皮移植片をＰＢＳ（Phosphate buffer saline）溶液に担持させたもの（対照群１）と充填液１−１に３０分位担持させたもの（対照群２）、０．００５重量％のキトサンを充填させたもの（対照群３）を用いた。
前記実験例１のネズミをイソフルラン（isofluran）で呼吸麻酔させた後、移植しようとする部位をポビドンとエタノールで消毒した。消毒後、ネズミの脊椎に沿って背部位を切開してピンセットを用いて外皮を持ち上げて移植空間を確保した。確保された移植空間に前記で準備した本発明の移植用真皮層または対照群を入れた後、切開部位を縫合した。この際、脊椎を中心にネズミの左側背の皮下には対照群を、右側背の皮下には本発明の移植用真皮層を移植した。手術したネズミをケージに１頭ずつ入れて安定な環境で飼育した。
実験例２−２．肉眼観察を通じての生着率確認
前記実験例２−１の移植手術後、１週毎にネズミを１頭ずつ犠牲させた後、移植部位の組織を分離して移植用真皮層の変化有無を肉眼で観察し、その結果を表２及び図２に示した。表２の場合には、移植後４週が過ぎたネズミの移植用真皮層のサイズ変化を確認した結果で、移植時に利用した移植用真皮層サイズ対比移植後のサイズを百分率（％）で示した。
前記表２及び図２に示すように、対照群１（ＰＢＳ溶液に担持した無細胞性真皮移植片）（Ａ）、対照群２（充填液１−１に担持した無細胞性真皮移植片）（Ｂ）、及び対照群３（０．００５重量％キトサンを充填させた無細胞性真皮移植片）（Ｃ）を移植した場合には、時間が過ぎても移植した真皮移植片のサイズの変化がほとんどない一方、本発明の移植用真皮層を移植した場合（Ｄ）には３週まではサイズ変化がほとんどなかったが、４週が過ぎた後には移植した真皮層の枠が分解されて真皮層のサイズが小さくなることが分かる。
これを通じて、対照群２のように無細胞性真皮移植片を充填液に担持して外部表面のみに吸着させた場合、及び対照群３のようにキトサンのみ含まれた充填液を充填させた場合には生着率が増加せず、ＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液を充填させて製造した本発明の移植用真皮層で生着率が増加したことが分かった。
実験例２−３．組織染色を通じての細胞生着率及び生体適合性確認
前記実験例２−１で充填液１−１を充填させた本発明の移植用真皮層及びＰＢＳ溶液に担持した無細胞性真皮移植片（対照群１）を移植した後、１週目と４週目の組織を回収してＨ＆Ｅ染色した後、生体適合性及び生着率を確認した。
１週目と４週目の移植部位の組織を回収してホルマリンで固定し、一連の脱水作業を経てパラフィンに植えてパラフィンブロックを製作した。製作したパラフィンブロックを５μｍ厚さで組織切片し、組織切片をMayer's hematoxyline（Sigma、USA）溶液に１秒間反応させた後、流れる水で１０分間洗浄した。以後、eosin（Sigma、USA）溶液に３秒間反応させた。染色が完了した組織は脱水過程を経てPermount（Fischer scientific、USA）で封入した。Ｈ＆Ｅ染色した組織切片を顕微鏡を用いて組織病理学的変化を観察し、その結果を図３及び図４に示した。図３は炎症により表れる繊維組織カプセル（fibrous tissue capsule）を観察することによって生体適合性を確認した結果を示しており、図４は移植した真皮層内の細胞数の変化を観察することによって細胞生着率を確認した結果を示している。
図３に示すように、移植後、１週目には炎症により表れる繊維組織カプセルの厚さが対照群１（Ａ）に比べて本発明の移植用真皮層（Ｂ）を移植した場合に薄いことが分かり、４週目には対照群１（Ａ）及び本発明の移植用真皮層（Ｂ）を移植した場合に全て繊維組織カプセルの厚さが薄くなった。
また、細胞生着率の場合には、図４に示すように、移植後、１週目には対照群１（Ａ）及び本発明の移植用真皮層（Ｂ）のコラーゲンの間の空いた空間が多数観察された一方、４週目にはコラーゲンの間の空いた空間が細胞で詰められたことを観察した。特に、本発明の移植用真皮層（Ｂ）を移植した場合が対照群１（Ａ）を移植した場合より細胞数がより多い増加したことが分かる。
これを通じて、本発明の移植用真皮層に充填されたＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液により初期炎症が緩和されたことが分かり、周辺組織から細胞が速く移動するようにして周辺組織との融合が促進されて細胞生着率が増加したことが分かった。
Claims (15)
- ＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液（stock solution）を製造する第１ステップ；
キトサン貯蔵溶液を製造する第２ステップ；
前記ＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液及び前記キトサン貯蔵溶液を混合して撹拌した後、滅菌してＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液を製造する第３ステップ；
前記充填液を無細胞性真皮移植片に充填する第４ステップ；を含む
ことを特徴とする生着率を増加させた移植用真皮層の製造方法。 - 前記製造方法は、
ＤＮＡ断片混合物を緩衝溶液に入れて５０℃乃至７０℃で撹拌しながら１時間乃至３時間の間溶解させてＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液を製造する第１ステップ；
キトサンを酸性緩衝溶液に溶解させてキトサン貯蔵溶液を製造する第２ステップ；
前記ＤＮＡ断片混合物貯蔵溶液及び前記キトサン貯蔵溶液をＤＮＡ断片混合物及びキトサンの重量割合が２０：１−１０，０００：１になるように混合して６５℃乃至７５℃で１時間乃至２時間の間撹拌した後、滅菌してＤＮＡ断片混合物及びキトサンを含む充填液を製造する第３ステップ；
前記充填液を真空薬物充填装置を用いて無細胞性真皮移植片に充填する第４ステップ；を含む
請求項１に記載の生着率を増加させた移植用真皮層の製造方法。 - 前記ＤＮＡ断片混合物は、魚類の精巣または精液から分離したものである
請求項１または２に記載の生着率を増加させた移植用真皮層の製造方法。 - 前記魚類は、サケ類である
請求項３に記載の生着率を増加させた移植用真皮層の製造方法。 - 前記ＤＮＡ断片混合物は、分子量が５０ｋＤａ乃至１０，０００ｋＤａである
請求項１または２に記載の生着率を増加させた移植用真皮層の製造方法。 - 前記ＤＮＡ断片混合物は充填液の総重量を基準に０．０１重量％乃至３重量％である
請求項１または２に記載の生着率を増加させた移植用真皮層の製造方法。 - 前記キトサンは、分子量が３ｋＤａ乃至１，０００ｋＤａである
請求項１または２に記載の生着率を増加させた移植用真皮層の製造方法。 - 前記キトサンは、充填液の総重量を基準に１x１０−６重量％乃至０．１５重量％である
請求項１または２に記載の生着率を増加させた移植用真皮層の製造方法。 - 前記第４ステップの無細胞性真皮移植片は真皮から細胞及び不純物が除去され、ウイルス不活化処理後、凍結乾燥処理して生物学的に不活性化されたコラーゲン使用組織補充材である
請求項１または２に記載の生着率を増加させた移植用真皮層の製造方法。 - 前記真皮は、自家、同種、または異種から分離した真皮である
請求項９に記載の生着率を増加させた移植用真皮層の製造方法。 - 前記第４ステップの充填は圧力を用いて無細胞性真皮移植片の内部に粘性がある充填液を流入させてコラーゲンの間の空いた空間を詰めるようにする
請求項１または２に記載の生着率を増加させた移植用真皮層の製造方法。 - 前記第４ステップの真空薬物充填装置は、充填液を一方向に連結し、陽圧または陰圧を発生させて連結された充填液が無細胞真皮移植片の内部のコラーゲンの間の空間を詰めて充填されるようにする
請求項２に記載の生着率を増加させた移植用真皮層の製造方法。 - 請求項１または２の方法により製造された生着率を増加させた移植用真皮層。
- 請求項１３の移植用真皮層を含む皮膚損傷治療剤。
- 前記皮膚損傷は、擦過傷（abrasion）、切開（incision）、裂傷（laceration）、皮膚裂離（skin avulsion）、皮膚打撲（skin bruise）、穿刺負傷（puncture wound）、及び手術による皮膚切除群より選択される１種以上が原因となる
請求項１４に記載の皮膚損傷治療剤。
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