CN1618954A

CN1618954A - 生物衍生羊膜、复合生物衍生羊膜及其制备方法

Info

Publication number: CN1618954A
Application number: CN 200410036792
Authority: CN
Inventors: 杨志明; 罗静聪
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2003-05-01
Filing date: 2004-04-30
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2024-04-30
Also published as: CN100368534C

Abstract

本发明涉及一种生物衍生羊膜、复合生物衍生羊膜及其制备方法，是一种皮肤、角膜、神经组织修复工程及临床使用的材料，特别是经过脱细胞方法处理过的生物衍生羊膜，与胶原海绵复合形成的复合生物衍生羊膜。采用本发明方法制备的生物衍生羊膜和复合生物衍生羊膜，保持了羊膜完整的空间结构，完全去除细胞，抗原性极低。本发明生物衍生羊膜与复合生物衍生羊膜用于外科手术预防组织粘连、生物敷料、眼表移植和组织工程皮肤、角膜、神经等方面的疾病治疗，能预防组织粘连和促进细胞黏附，缩短皮肤愈合时间，减轻患者疼痛，重建眼表正常结构并且不引起免疫反应，安全性高。

Description

生物衍生羊膜、复合生物衍生羊膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物衍生羊膜、复合生物衍生羊膜及其制备方法，具体地说，是由人体胎盘羊膜为原料经处理得到的生物衍生材料，它是一种皮肤、角膜、神经组织修复工程及外科手术临床使用的材料，属生物领域。

背景技术

羊膜具有5层结构，分别是上皮细胞层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层。研究表明羊膜具有以下特点：1、羊膜含有纤维粘连素(fibernectin，FN)、层粘连素(lamnine，LN)、 IV型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)以及其它一些蛋白多糖大分子和一些细胞生长因子如EGF、BFGF，能促进细胞黏附、迁移、增殖、分化等重要功能，羊膜基底膜易使上皮细胞移行长入，增强上皮细胞的黏附性，促进上皮的分化、增殖，阻止上皮细胞凋亡；2、羊膜具有抑制炎症的作用，羊膜中含有多种蛋白酶抑制剂，通过抑制相应的蛋白酶而发挥抗炎作用；3、羊膜具有抗粘连作用；4、羊膜富含IV、V型胶原，具有活跃的物质转运功能，具半透膜性质，可满足膜内细胞所需营养物质需要；5、因羊膜不表达HLA-A、B、C及DR抗原或β2微球蛋白，同时有无血管的基质，抗原性较低。同时，羊膜来源广泛，易于取材，因而其已应用于组织工程研究和临床使用。

目前，人羊膜主要用于外科手术中，其中包括：1、眼睛表面疾病如角膜修复、先天性青光眼、角膜溃疡等；2、修补鼓膜损伤；3、用于疝修补；4、外科手术后预防粘连；5、烧伤后表面覆盖，用作生物敷料。

目前，普遍使用的新鲜羊膜，不利于保存，使用时也不太方便。虽然也有处理过的羊膜，但这种羊膜材料极少能完全取出细胞等抗原成分，因此仍具有一定的抗原性，有可能在使用时引发炎症。单层的羊膜或羊膜材料较薄，机械强度较差，易撕裂，手术中操作困难，不利于临床使用和研究。

专利申请号为95100812.9，名称为“防止内脏粘连或出血的羊膜移植物或覆盖物”公开了一种特殊处理的羊膜薄片，防止损伤(如外科损伤)后粘连及防止损伤引起的内脏出血。羊膜薄片已除去细胞单层，暴露的基底膜和I、II、III型胶原、昆布氨酸、纤维结合素类和羊膜材料的其它糖蛋白成分，它们促进伤口的愈合。该羊膜材料是灭菌的，并可交联。该羊膜移植物的制备方法，是“从人胎盘羊膜除去细胞物质”，即用胰蛋白酶处理除去细胞物质，或交连，使用胰蛋白酶处理成本高，且不能有效地除去材料中其它抗原成分(如可溶性大分子和脂溶性蛋白等抗原成分)，仍具有一定的抗原性。

发明内容

本发明为了克服上述难题，所要解决的技术方案是提供了一种生物衍生羊膜及其制备方法。

本发明的另一技术方案是提供一种复合生物衍生羊膜，它是由生物衍生羊膜与胶原溶液为原料制备而成。

具体地说，生物衍生羊膜、复合生物衍生羊膜都是由人体胎盘羊膜为原料经处理得到的生物衍生物，它是一种皮肤、角膜、神经组织修复工程及临床使用的材料。

本发明提供了一种生物衍生羊膜，它是由人体胎盘羊膜为原料，通过脱脂、去垢、消化步骤制备而成。该生物衍生羊膜无抗原部位，具暴露的基底膜和I、II、III型胶原、纤维结合素类和羊膜材料的其它糖蛋白成分。

本发明还提供了该生物衍生羊膜的制备方法，它包括以下步骤制备：

a、取人体胎盘羊膜，采用脱脂剂进行脱脂；

b、将a步骤脱脂后的羊膜加入去垢剂进行去垢；

c、将b步骤去垢后的羊膜加入消化剂进行消化。

其中，它还包括步骤：d、消毒。

其中步骤a所述的脱脂剂是氯仿、甲醇的混合溶液。

步骤b所述的去垢剂是：SDS(十二烷基硫酸钠：Sodium dodecylsulfate)或Triton X-100(购于Sigma，Taufkirchen/Germany)。其中SDS液浓度为0.5％v/v，用PBS(0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.0)溶解，室温处理，处理时间为5小时以上；Triton X-100浓度为1％v/v，室温处理，处理时间为5小时以上。

步骤c所述的消化剂是：蛋白酶。蛋白酶为胰蛋白酶，处理时间为6小时，浓度为0.25％(w/v)，PBS溶解，室温处理。

通过本发明方法制备的生物衍生羊膜通过HE染色、Mallor染色及扫描电镜观察，证实羊膜的上皮细胞层、成纤维细胞层、海绵层消失，保留了基膜层和致密层，有效去除羊膜中的抗原细胞成分，保留纤维网状结构，进一步去除材料的抗原性。

本发明还提供了一种复合生物衍生羊膜，它是用胶原溶液覆盖于上述的生物衍生羊膜，通过低温冷冻干燥、交联制备而成。

该复合生物衍生羊膜的制备方法，它包括以下步骤制备：

a、先将所述的生物衍生羊膜平覆于容器底部，再加入胶原溶液，然后低温冷冻干燥；

b、将经a步骤的干燥物进行交联；

c、将经过交联后的物质灭菌，即得。

其中，步骤a所述的低温干燥的温度为低于-80℃；步骤b所述的交联方法是：采用紫外光照射、重度脱水进行交联，或用戊二醛、己异二氰酸酯、碳化二亚胺、叠氮二苯基磷、京尼平中的任意一种进行交联。

进一步地，戊二醛交联的浓度为0.25％w/v，处理温度为20℃，时间为10分钟。

其中所述的胶原溶液可以直接采用市售产品，但由于市售产品价格昂贵，也可由下列步骤制备而成：

a、取人胎盘、肌腱或牛跟腱为原料，经脱脂剂脱脂；

b、将a步骤经脱脂后，采用酸抽提法，提取胶原蛋白；

c、将b步骤的胶原蛋白加入乙酸溶液配制成胶原溶液。

其中步骤b所述的酸抽提法，具体为：采用人胎盘、肌腱或牛跟腱经脱脂、匀浆后用4M盐酸胍去除蛋白多糖，加入10倍体积的0.5M醋酸，同时加入胃蛋白酶，搅拌72小时，静置24小时，过滤得上清液，加入NaCl至终浓度为0.7M，静置24小时，15000g离心20分钟，上清液中继续加入NaCl至终浓度为1.2M，静置24小时，15000g离心20分钟，取沉淀，该沉淀即为胶原蛋白；

步骤c所述的胶原溶液的制备方法是：取两次凝胶状沉淀溶于稀醋酸溶液，用磷酸盐缓冲液(pH7.4)反复透析，可通过聚乙二醇或冷冻干燥将得到的胶原蛋白溶液浓缩，测定蛋白浓度，调整蛋白浓度为0.5％w/v。

胶原作为生物材料具有以下特点：(1)胶原的机械性能、结构强度、可塑性、变形能力和抗疲劳能力位于生物材料的中间水平；(2)胶原具有很高的水渗透率和吸水性；(3)胶原具有良好的润滑性和稳定性；(4)胶原具有良好的生物相容性，植入生物体内无刺激性，无毒性反应。

本发明中，制备复合生物衍生羊膜所使用的胶原可来源于多种组织如骨、皮肤、肌腱及其它结缔组织(的天然细胞外基质)。通过上述制备方法，可以调节胶原层交联纤维的孔径、密度和空间，该胶原层可以为细胞生长提供适合的支架(外基质)，因此，非常有利于组织培养中的细胞的粘附、增殖和分化，完全能够保持单层生物衍生羊膜的各种特点。同时，由于在生物衍生羊膜上覆盖了一层胶原，能够增加羊膜的机械强度，在使用时，还可以根据不同组织、部位的需要，通过调节胶原层的厚度来调节复合羊膜的厚度，避免了单纯生物衍生羊膜在外科手术中易卷曲，容易撕裂等缺陷，为外科手术的使用提供了方便。

采用本发明方法制备的生物衍生羊膜和复合生物衍生羊膜，保持了羊膜完整的空间结构，完全去除细胞，抗原性极低。本发明生物衍生羊膜与复合生物衍生羊膜用于外科手术预防组织粘连、生物敷料、眼表移植和组织工程皮肤、角膜、神经等方面的疾病治疗，能预防组织粘连和促进细胞黏附，缩短皮肤愈合时间，减轻患者疼痛，重建眼表正常结构并且不引起免疫反应，安全性高。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1生物衍生羊膜；

图2复合生物衍生羊膜(背面为胶原海绵)；

图3HAM HE染色x100(HAM，为人胎盘羊膜的英文缩写)；

图4HAM Mallor染色x100；

图5HAM扫描电镜结果示网状结构x1000；

图6HAM扫描电镜结果示致密面x2500；

图7成纤维细胞接种于HAM培养1天后HE染色，细胞呈梭形(x100)；

图8成纤维细胞在HAM膜上粘附，伸出伪足体贴附于HAM，细胞形态正常(x1000)；

图9HAM植入1周，HAM形态完整，致密。有大量炎性细胞；

图10HAM植入2周，炎性细胞减少，HAM膜完整；

图11HAM植入6周，炎性细胞少，HAM膜降解明显，结构疏松；

图12HAM植入14周，HAM降解更明显，胶原蛋白染色浅，结构疏松。

具体实施方式

在以下实施例中将进一步举例说明本发明，这些实施例仅用于说明本发明而对本发明没有限制。

实施例1 生物衍生羊膜的制备

取新鲜健康人羊膜，生理盐水漂洗3次，氯仿/甲醇(1∶1，v/v)脱脂至上清液清澈0.25％戊二醛交联10分钟，生理盐水漂洗3次，每次10分钟；0.5％v/vSDS(十二烷基磺酸钠)处理4小时，生理盐水漂洗3次，每次10分钟；0.25％v/v胰蛋白酶消化8小时，生理盐水漂洗3次，每次10分钟，冷冻干燥，分装，密封，环氧乙烷消毒。

实施例2 复合生物衍生羊膜的制备

采用酸抽提法从人肌腱提取胶原蛋白，用0.3％乙酸溶液配制为0.5％的胶原溶液，将处理后未冻干的实施例1制备的生物衍生羊膜覆盖于不同规格的不锈钢容器(如40x40x8mm)底部，根据所需材料厚度加入胶原溶液，-80℃冷冻半小时，冷冻干燥机冻干24小时，于0.25％的戊二醛溶液中4℃交联12小时，用纯水充分漂洗，洗去残留的戊二醛，再经冷冻干燥制得复合生物衍生羊膜。分装密封，环氧乙烷或γ射线辐照消毒。

实施例3 生物衍生羊膜、复合生物衍生羊膜的物理性质

实施例1制备的生物衍生羊膜和实施例2制备的复合生物衍生羊膜的物理性状如下：

生物衍生羊膜为无色薄膜，极易复水，复水后透明(图1)。复合生物衍生羊膜为黄色海绵状薄膜，其厚度可根据需要确定(图2)。

实施例4 生物衍生羊膜的组织学观察

1、实施例1制备的生物衍生羊膜的HE、Mallor染色(马劳瑞—埃赞法)：将生物衍生羊膜用10％福尔马林固定，用无水酒精梯度脱水，HE、Mallor染色，观察是否有细胞残留。生物衍生羊膜相差显微镜下观察为网状结构，HE染色呈大量浅红色胶原，无蓝染核物质，证实无残留细胞。Mallory染色呈大量蓝色胶原。(图3、图4)(HE染色：为苏木精—伊红染色法的简称，是最常用的组织学染色方法。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。因此，HE染色法可将组织中各种细胞和细胞外基质成分显示出来。)

2、生物衍生羊膜扫描电子显微镜观察将实施例1制备的生物衍生羊膜用2.5％v/v戊二醛固定，乙醇梯度脱水，临界点干燥，喷金，于Philips扫描电镜观察，扫描电镜显示一面为网状纤维结构，存在不规则孔隙，孔径约10-80nm，另一面为致密纤维结构，均无细胞残留(图5、图6)。

以下通过体外实验、药效学试验、毒理实验证明本发明的有益效果。

实验例1 本发明生物衍生羊膜的细胞相容性实验

将实施例1制备的生物衍生羊膜用培养液预湿，植入成纤维细胞，种植密度为10万，在DMEM/HamsF₁₂(Du1becco改良细胞培养液)培养液，pH7.2，5％CO₂的条件下饱和湿度培养，每2天换液1次，倒置相差显微镜下观察细胞的黏附、生长情况。

本发明生物衍生羊膜复合人成纤维细胞培养结果：人成纤维细胞复合于本发明生物衍生羊膜4小时后，倒置相差显微镜下观察可见细胞紧密贴附于本发明生物衍生羊膜表面，仅少数细胞流落到培养瓶底贴壁生长。加入DMEM/HamsF₁₂培养液继续培养10小时后观察，成纤维细胞已经伸展，有多个突起。24小时后细胞大多呈梭形。培养3天后，贴附于材料的细胞数量增加。培养7天后细胞两侧突起伸长，贴附于纤维。继续培养，细胞数量和形态无明显变化。成纤维细胞能在材料上正常生长、增殖(图7)。扫描电镜可见细胞黏附于材料表面，保持良好的形态，正常生长(图8)。

实验例2本发明生物衍生羊膜皮下埋置实验

实验方法：取健康SD大鼠20只，性别不限，分为实验组和对照组，消毒，采用乙醚吸入麻醉，常规无菌操作，切开背部皮肤，实验组背部植入4张1×1cm²材料，对照组切开后即缝合。观察动物术后一般情况和伤口愈合情况。术后1、2、4周处死各组动物，取出植入材料戊二醛固定，常规包埋切片，HE染色，光镜观察植入物周围淋巴细胞、巨噬细胞浸润情况。

实验表明：手术当天动物清醒后即可正常进食，伤口无红肿、渗液等炎性反应，所有创面均可良好愈合，手术切口无1例发生感染，动物无死亡、惊厥、中风等毒性反应，植入物周围软组织未见发黑、坏死、化脓、积液等表现，组织学观察术后1周，植入物周围有大量淋巴细胞，2周时，仅少量淋巴细胞，4周时，基本无淋巴细胞存在。证实本发明生物衍生羊膜无生物学毒性，有良好的组织相容性。

因用于制备本发明复合生物衍生羊膜的胶原溶液为可广泛使用的医用材料，因此，复合生物衍生羊膜同样具有良好的组织相容性。

实验例3 本发明生物衍生羊膜(和复合生物衍生羊膜)用于修复角膜的实验

1、采用生物眼生羊膜治疗眼睛角膜铁水烧伤，通过实验说明，采用本发明生物衍生膜和复合生物衍生羊膜治疗后1周，眼球角膜好转。

2、治疗眼睑-球粘连：用本发明材料生物衍生膜和复合生物衍生羊膜治疗眼睑-球粘连，效果良好。

实验例4本发明生物衍生羊膜(和复合生物衍生羊膜)用于治疗难治性糖尿病溃疡

本发明生物衍生羊膜(和复合生物衍生羊膜)可用于治疗难治性糖尿病溃疡，以下通过一典型临床案例充分说明本发明的有益效果：

患者XXX，女，69岁，糖尿病，足部溃疡，临床采用多种治疗方法(包括各种生长因子)创面均无好转，继发创面感染，经本发明生物衍生羊膜(和复合生物衍生羊膜)治疗后，创面无感染，愈合良好，无瘢痕挛缩。

实验例5 本发明生物衍生羊膜预防肌腱修复术后粘连实验

本实验通过SD大鼠后肢跟腱端端吻合术中植入人胎羊膜，观察周围组织的形态学改变以及愈合状况。

实验方法：切断SD大鼠双侧跟腱后行常规吻合术，左侧用生物衍生羊膜包裹，右侧作为对照，分别于手术后1、2、4、6、8周时取材，大体观察并对跟腱粘连和腱周组织粘连进行评分，对标本进行光镜和扫描电镜观察。结果：1周及2周时羊膜周围组织充血、水肿并有少量炎细胞及异物巨细胞，以后逐渐减少、消失，6-8周时跟腱愈合并与周围组织无粘连。

粘连评分标准如下：0级：缝合处无粘连；1级：少量膜样、束带状粘连，局限于缝合处，肌腱滑动略受限；2级：小块状或宽带状粘连，局限于缝合处，肌腱滑动部分受限；3级：较大面积紧密粘连，向缝合点远近端蔓延，肌腱滑动明显受限或几乎不能滑动；4级：肌腱与鞘管壁、皮下形成紧密粘连，范围广，肌腱无任何滑动。(表1)

腱周粘连分级：0级：无粘连，可有肉芽组织存在；1级：薄膜状粘连，对腱滑动无影响；2级：疏松粘连，和肌腱表面易分离；3级：中等致密粘连，有一定移动性；4级：致密粘连，移动性极差，深入到肌腱实质内，和肌腱无明显分界，不易分离。(表2)

表1跟腱粘连评分

1周 2周 4周 6周 8周 12周

n n n n n n

实验侧 3 2 5 2.4^※ 5 0.254^※ 4 1.2 4 0.25^※ 5 0.4^※

对照侧 3 3 5 4.6 5 1.754 4 1.4 4 1.75 6 1.8

※与对照组相比有显著差异，p＜0.05.

表2腱周组织粘连评分

1周 2周 4周 6周 8周 12周

N n n n n n

实验侧 3 2^※ 5 2.0^※ 5 0.2^※ 4 1.0^※ 4 0.25^※ 5 0.4^※

对照侧 3 4 5 4.3 5 1.8 4 1.6 4 1.5 6 1.8

※与对照组相比有显著差异，p＜0.05.

结论：损伤的跟腱周围植入生物衍生羊膜能有效地预防粘连，不影响跟腱愈合。

实验例6将实施例2制备的复合生物衍生羊膜作为组织引导再生膜用于骨缺损的修复：

采用组织工程骨修复猴腓骨缺损时，采用实施例2制备的复合生物衍生羊膜包裹植入的组织工程骨并与未包裹的组织工程骨比较，结果证实：采用复合生物衍生羊膜包裹的植入物能保持较多的植入成骨细胞，修复情况较未包裹侧好。

实验例7本发明生物衍生羊膜的体内降解

将实施例1制备的生物衍生羊膜1cm²植入SD大鼠背部皮下，分别于植入后1、2、4、6、8、10、14周取出，观察材料的降解情况。生物衍生羊膜在6周后开始降解，14周时降解明显。(图9，图10，图11，图12分别是植入后1、2、6、14周的降解情况)。

实验例8本发明生物衍生羊膜浸提液细胞毒性实验

将DMEM培养液与消毒包装的生物衍生羊膜按10ml/2cm²于37℃静置24小时制备浸提液，成纤维细胞培养至对数生长期消化制成4×10³个/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔100μl，复种4孔，培养24小时使细胞贴壁，然后弃培养液，进行浸提液交换，设浸提原液组，1/2、1/4、1/8、1/16浸提液组，阴性对照组，阳性对照组(含4％苯酚)和空白对照组。置37℃，5％CO₂培养箱培养1、3、5天，加0.5％MTT(四唑盐)，4小时后终止培养，弃培养液，每孔加150μl二甲基亚砜，震荡混匀5分钟，测定490nmOD值，计算细胞相对增殖率，按ISO和医学生物材料标准评定材料毒性。

细胞相对增殖率(RGR)＝(实验组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)×100％

表3生物衍生羊膜浸提液细胞毒性实验

浸提液浓度	RGR(％)	毒性分级	RGR(％)	毒性分级	RGR(％)	毒性分级
浸提液浓度	RGR(％)	毒性分级	RGR(％)	毒性分级	RGR(％)	毒性分级		1天		3天		5天
原液	96.4	1	96.1	1	90.6	1		1天		3天		5天
原液	96.4	1	96.1	1	90.6	1	1/2	100.6	0	94.2	1	99.4	1
1/4	105.0	0	102.1	0	98.4	1	1/2	100.6	0	94.2	1	99.4	1
1/4	105.0	0	102.1	0	98.4	1	1/8	95.8	1	105.0	0	105.6	0
1/16	102.6	0	100.5	0	99.4	1	1/8	95.8	1	105.0	0	105.6	0
1/16	102.6	0	100.5	0	99.4	1	(-)	100.0	0	100	0	100	0
(+)	36.1	3	30.1	3	23.1	4	(-)	100.0	0	100	0	100	0

实验结果：上述实验数据表明：本发明生物衍生羊膜浸提液培养成纤维细胞1、3和5天后，细胞相对增殖率均大于90％，材料毒性分级为0或1级，根据ISO和医学材料生物学标准，材料无细胞毒性，均为合格。

通过上述体外实验和动物实验，说明本发明生物衍生羊膜和复合生物衍生羊膜保持了人羊膜的胶原蛋白空间结构，用于外科手术预防组织粘连、生物敷料、眼表移植和组织工程皮肤、角膜、神经等方面的疾病治疗，能预防组织粘连和促进细胞黏附，缩短皮肤愈合时间，减轻患者疼痛，重建眼表正常结构并且不引起免疫反应，安全性高。

Claims

1、一种生物衍生羊膜，其特征在于：它是由人体胎盘羊膜为原料，通过脱脂、去垢、消化步骤制备而成。

2、权利要求1所述的生物衍生羊膜的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤制备：

a、取人体胎盘羊膜，采用脱脂剂进行脱脂；

b、将a步骤脱脂后的羊膜加入去垢剂进行去垢；

c、将b步骤去垢后的羊膜加入消化剂进行消化。

3、根据权利要求2所述的生物衍生羊膜的制备方法，其特征在于：它还包括步骤：d、消毒。

4、根据权利要求2所述的生物衍生羊膜制备方法，其特征在于：步骤a所述的脱脂剂是氯仿、甲醇的混合溶液。

5、根据权利要求2所述的生物衍生羊膜制备方法，其特征在于：步骤b所述的去垢剂是：SDS或Triton X-100。

6、根据权利要求2所述的生物衍生羊膜制备方法，其特征在于：步骤c所述的消化剂是：蛋白酶。

7、一种复合生物衍生羊膜，它是用胶原溶液覆盖于权利要求1所述的生物衍生羊膜，通过低温冷冻干燥、交联制备而成。

8、权利要求7所述的复合生物衍生羊膜的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤制备：

a、先将权利要求1所述的生物衍生羊膜平覆于容器底部，再加入胶原溶液，然后低温冷冻干燥；

b、将经a步骤的干燥物进行交联；

c、将经过交联后的物质灭菌，即得。

9、根据权利要求8所述的复合生物衍生羊膜的制备方法，其特征在于：步骤b所述的交联方法是：采用紫外光照射、重度脱水进行交联，或用戊二醛、己异二氰酸酯、碳化二亚胺、叠氮二苯基磷、京尼平中的任意一种进行交联。