CN103861151A

CN103861151A - 一种脱细胞胎盘基质材料的制备方法

Info

Publication number: CN103861151A
Application number: CN201410120995.5A
Authority: CN
Inventors: 徐世兰; 侯鹏; 刘凯
Original assignee: QINGSHAN LIKANG PHARMACEUTICAL INDUSTRY Co Ltd CHENGDU
Current assignee: Chengdu Qingshan Likang Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-03-27
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2034-03-27
Also published as: CN103861151B

Abstract

本发明公开了一种脱细胞胎盘基质材料的制备方法，包括如下步骤：（1）取新鲜胎盘组织，清洗，加水，匀浆，离心，弃上清，得下层组织；（2）取步骤（1）得到的下层组织，在甲醇和三氯甲烷的混合溶液浸泡2～6h，离心，弃上清，清洗，得下层组织；（3）将步骤（2）得到的下层组织，在过氧乙酸和乙醇的混合溶液中浸泡2～6h，离心，弃上清，清洗，得下层组织；（4）将步骤（3）得到的下层组织，震荡浸泡于浓度为0.3～0.7%（w/v）的十二烷基硫酸钠溶液中，离心，弃上清，清洗，得下层组织；（5）真空冷冻干燥，灭菌，即可。本发明方法制备的脱细胞胎盘基质材料的免疫原性低，生长因子含量高，具有较好的应用前景。

Description

一种脱细胞胎盘基质材料的制备方法

技术领域

本发明涉及一种胎盘基质材料的制备方法，属于生物材料领域。

背景技术

胎盘是一种母体和胎儿物质交换的重要的器官，它富含细胞外基质和基底膜。胎盘基质中含有丰富的生长因子，如，表皮细胞生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子（TGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF），可用于促进伤口愈合，辅助治疗皮肤癣、类风湿关节炎等疾病。

现代医学研究表明，胎盘具有抗感染、增强机体抵抗力、对血凝的影响等作用：胎盘γ-球蛋白含有麻疹、流感等抗体以及白喉抗毒素等，可用于预防或减轻麻疹等传染病。胎盘γ-球蛋白中还含干扰素，临床上可用于预防或控制病毒感染。胎盘中还含有溶菌酶，可防止小鼠（腹腔注射）由肠炎引起的死亡；对内毒素对大鼠的伤害也有一定的保护作用；给小鼠口服胎盘粉，能减轻结核病变，而在试管中反能促进结核杆菌的生长，故认为其作用主要在于增加机体抵抗力。脱脂后胎盘的盐酸水解产物，给大鼠腹腔注射，对四氯化碳及乙硫基丁氨酸引起的肝脂肪沉着，有明显的抑制作用。给小鼠皮下注射人胎盘提取物，可使其游泳时间延长；对大鼠肌肉注射，对某些实验类型（利血平性、紧张性、结扎幽门下部等）的实验性溃疡，也有一定的预防及治疗效果；胎盘中含有尿激酶抑制物，能抑制尿激酶对纤维蛋白溶酶元的活化作用；此可解释妊娠纤溶活性之降低。据测定，妊娠时子宫肌层中纤维蛋白溶酶元活化物与尿激酶抑制物的比例为1:3.4，而胎盘中二者之比例则高达1:1197。人胎盘中含有低分子量的凝血因子ⅩⅢ，因此可用来治疗因ⅩⅢ因子缺乏的出血患者。此种凝血因子不仅能稳定纤维蛋白凝块、促进创伤愈合，在动物实验中还有抗组织胺的作用；在离体试验中，胎盘提取物能促进受抑制心脏的恢复。胎盘蛋白中，含有肾素样的升压物质。人胎盘含有的糖蛋白成分，在体外试验中，能抑制淋巴细胞中DNA的合成，但不影响细胞的活力。胎盘提取物大量时能抑制去氧麻黄碱引起的发热。冷藏胎盘的胃蛋白酶消化液、水提取液及70%丙酮提取物用瓦氏呼吸器测知，能促进肝、心、脑等数种组织的呼吸及酵母菌的呼吸。胎盘血清对离体豚鼠子宫有兴奋作用，类似垂体后叶激素。

以上均为胎盘的药物学研究及应用，利用胎盘作为组织工程材料的研究及应用鲜有报道。胎盘组织中含有丰富的细胞外基质和保存完好的内源性生长因子。这种细胞外基质具有类似于正常皮肤组织细胞再生真皮的功能。提供了有利于细胞生长和分化，并有效调节全层皮肤伤口愈合的微环境。但是胎盘组织中具有多种免疫原性物质，直接用于机体会产生强烈的免疫反应，副作用强，因此需要采用脱细胞方法脱去其免疫原性物质。

Ji Suk Choi等，“Human extracellular matrix(ECM)powders for injectablecell delivery and adipose tissue engineering”，Journal of Controlled Release139(2009)2–7公开了一种制备脱细胞胎盘基质的方法，步骤如下：（1）将胎盘组织用纯化水反复清洗，除去血液成分。将胎盘组织与水按照2:1的比例混匀，室温匀浆5min，再离心分离（3000g，5min），弃去上清液，得到下层组织，之后反复离心清洗；（2）将（1）中得到的组织用0.5%的SDS（加液量与组织的体积比为1:1）于室温下振荡浸泡30min，浸泡完毕，用纯化水离心清洗4天直至除去残留的SDS；（3）将（2）中得到的组织与核酸酶（0.2%的DNA酶（酶活单位2000U）&200mg/ml的RNA酶）于37℃下混合浸泡10min，浸泡完毕，用纯化水用离心清洗2天；（4）将（3）中得到的组织与水按照一定比例混合均匀，导入模具中，于-70℃下冷冻干燥48h以上，最终得到脱细胞胎盘基质材料（片状，直径=15mm，厚度=10mm）。该方法可以制备得到核酸残留量低的脱细胞胎盘基质，核酸残留量仅为34.3±3.2ng/mg，但是，该方法需要同时采用SDS和核酸酶进行脱细胞，成本高，难以大规模工业应用。

需要寻找一种制备方法简单，成本低廉的制备方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种制备脱细胞胎盘基质材料的制备方法及该方法制得的基质。

本发明脱细胞胎盘基质材料的制备方法，包括如下步骤：

（1）取新鲜胎盘组织，清洗，加水，匀浆，离心，弃上清，得下层组织；

（2）取步骤（1）得到的下层组织，在甲醇和三氯甲烷的混合溶液浸泡2～6h，离心，弃上清，清洗，得下层组织；所述混合溶液中，甲醇和三氯甲烷的体积比为（0.5～1.5）:（0.5～1.5）；

（3）将步骤（2）得到的下层组织，在过氧乙酸和乙醇的混合溶液中浸泡2～6h，离心，弃上清，清洗，得下层组织；所述混合溶液中，过氧乙酸的浓度为0.1～0.3%（v/v），乙醇的浓度为3～7%（v/v）；

（4）将步骤（3）得到的下层组织，震荡浸泡于浓度为0.3～0.7%（w/v）的十二烷基硫酸钠溶液中，浸泡4～10次，每次30～120min，震荡的频率为50～200r/min，离心，弃上清，清洗，得下层组织；

（5）真空冷冻干燥，灭菌，即可。

步骤（1）中，水的加入量为胎盘组织体积的1～3倍；所述匀浆的时间是10～30min。优选地，水的加入量为胎盘组织体积的2倍；所述匀浆的时间是20min。

步骤（2）中，所述浸泡的时间为4h；所述混合溶液中，甲醇和三氯甲烷的体积比为1:1。

步骤（3）中，所述浸泡的时间为4h；所述混合溶液中，过氧乙酸的浓度为0.18%（v/v），乙醇的浓度为5%（v/v）。

步骤（4）中，所述十二烷基硫酸钠溶液的浓度为0.5%（w/v）；所述浸泡的次数为10次，每次60min；所述震荡的频率为100r/min。

步骤（1）、（2）、（3）和/或（4）中，所述离心的离心力为2000～4000g，离心时间为4～8min。优选地，所述离心力为3000g，离心时间为6min。

本发明还提供了前述方法制备的脱细胞胎盘基质材料及其在制备组织修复材料中的用途。

本发明方法制备的脱细胞基质材料脱细胞彻底，免疫原性低，有效保留生长因子，制备方法简单，无需采用核酸酶等溶剂，成本低廉，克服了现有技术的缺陷。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1处理前后胎盘组织中核酸含量结果。处理前后胎盘组织中核酸含量对比柱状图。

图2胎盘组织处理前后外观图。其中，A：胎盘组织处理前的外观图；B：胎盘组织处理后的外观图。

图3常规组织学切片HE染色结果。其中，A：处理前的胎盘组织中含有大量细胞（×200）；B：处理后的胎盘组织未见细胞残留（×200）。C：处理后材料的电镜扫描图。

图4胎盘组织处理前后HGF生长因子含量对比柱状图。

图5胎盘组织处理前后EGF生长因子含量对比柱状图。

图6细胞相容性实验的观察结果。其中：A：接种第1天细胞的生长情况；B：接种第七天细胞的生长情况。

具体实施方式

实施例1本发明脱细胞胎盘基质材料的制备方法

（1）制备方法

a、取健康产妇胎盘，去除羊膜和脐带，用0.9%生理盐水多次浸泡清洗至胎盘组织呈淡黄色或白色，得到去除血液后的胎盘组织。

b、将a中处理得到的胎盘组织与纯化水以质量比1:1混合，匀浆10min；将匀浆处理后的组织在4000g离心力下离心8min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，得到下层组织。

c、将b中处理得到的组织用甲醇-三氯甲烷（体积比为1.5:0.5）浸泡2h。之后在4000g离心力下离心8min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的有机残留量符合规定，得到下层组织。

d、将c中处理得到的组织用0.1%的过氧乙酸和3%的乙醇混合溶液浸泡4h。之后在4000g离心力下离心8min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的过氧乙酸和乙醇残留量符合规定，得到下层组织。

e、将d中处理得到的组织用0.3%十二烷基硫酸钠（SDS）震荡浸泡4次，震荡的频率为50r/min，30min/次后，在4000g离心力下离心8min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的表面活性剂残留量符合规定，得到下层组织。

f、将e中处理后所得的组织与水以体积比2:1混合均匀，再置入模具中冷冻真空干燥，得到干燥塑形的胎盘细胞外基质材料。

g、将f中处理得到的材料用γ射线辐照灭菌，辐照剂量为25KGY，即得本发明脱细胞胎盘基质材料。

实施例2本发明脱细胞胎盘基质材料的制备方法

（1）制备方法

b、将a中处理得到的胎盘组织与纯化水以质量比1:2混合，匀浆30min；将匀浆处理后的组织在2000g离心力下离心4min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，得到下层组织。

c、将b中处理得到的组织用甲醇-三氯甲烷（体积比为0.5:1.5）浸泡6h。之后在2000g离心力下离心4min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的有机残留量符合规定，得到下层组织。

d、将c中处理得到的组织用0.3%的过氧乙酸和7%的乙醇混合溶液浸泡4h。之后在2000g离心力下离心4min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的过氧乙酸和乙醇残留量符合规定，得到下层组织。

e、将d中处理得到的组织用0.7%十二烷基硫酸钠（SDS）震荡浸泡6次，震荡的频率为200r/min，120min/次后，在2000g离心力下离心4min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的表面活性剂残留量符合规定，得到下层组织。

实施例3本发明脱细胞胎盘基质材料的制备方法

1、制备

b、将a中处理得到的胎盘组织与纯化水以质量比1:2混合，匀浆20min；将匀浆处理后的组织在3000g离心力下离心6min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，得到下层组织。

c、将b中处理得到的组织用甲醇-三氯甲烷（体积比为1:1）浸泡4h。之后在3000g离心力下离心6min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的有机残留量符合规定，得到下层组织。

d、将c中处理得到的组织用0.18%的过氧乙酸和5%的乙醇混合溶液浸泡4h之后在3000g离心力下离心6min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的过氧乙酸和乙醇残留量符合规定，得到下层组织。

e、将d中处理得到的组织用0.5%十二烷基硫酸钠（SDS）震荡浸泡10次，震荡的频率为100r/min，60min/次后，在3000g离心力下离心6min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的表面活性剂残留量符合规定，得到下层组织。

2、检测

每组检测样品设三个平行组，一个空白组。

（1）DNA含量检测

采用市售DNA含量相关检测试剂盒，按照厂家提供的检测步骤检测胎盘组织处理前后的核酸含量。

（2）胎盘组织处理前后的外观以及空间结构检测

观察处理前后的外观；通过HE染色光学显微镜和扫描电镜观察，胎盘组织处理前后的细胞残留情况。

（3）生长因子含量检测

采用市售ELISA检测试剂盒检测正交试验样品的HGF和EGF含量，在450nm波长下读出检测样品的OD值。

（4）细胞相容性实验

将胎盘脱细胞基质先用完全培养基浸泡24h，其过程如下：在超净台中，取出灭菌好的材料，将其放入6孔板中（每孔各1块材料），加2ml完全培养基，使材料完全浸泡在培养基中，37℃密封静置24h；弃6孔板中用于浸泡材料的完全培养基，按7万细胞/孔接种细胞，每孔加入3mL完全培养基，饱和湿度，37℃条件下培养，每3天更换培养基1次；于接种后1，3，5，7天倒置显微镜观察六孔板内细胞的生长情况。

3、检测结果

（1）DNA含量

结果如图1和表1所示：

表1胎盘组织处理前后核酸的含量

结果如图1和表1所示，处理前的胎盘组织DNA含量平均为851.27±97.52ng/mg，采用本发明方法处理后，胎盘组织的DNA含量平均仅42.28±13.14ng/mg。

实验结果说明，本发明方法能够有效去除胎盘组织中DNA含量，降低免疫原性。

（2）胎盘组织处理前后的空间结构检测

如图2所示，采用本发明方法处理后的胎盘组织呈白色；

如图3所示，胎盘组织处理前有大量细胞，处理后未发现有细胞残留。由扫描电镜图结果可观察出，材料成三维空间网状结构，孔隙率高，能够为细胞生长提供一个良好的物理空间环境，有利于细胞在材料上面的附着生长。

实验结果说明，本发明方法可以有效去除胎盘组织中的细胞，降低免疫原性，同时，有效地保留了胎盘基质的空间网状结构，有利于细胞生长。

（3）生长因子含量

实验结果如图4～5和表2～3所示：

表2胎盘组织处理前后，检测样品生长因子的O.D.值

表3处理前后的胎盘组织中几种生长因子的含量

结果如表2～3所示，经过本发明方法处理后，胎盘组织中生长因子的含量有所下降，但是大部分仍然存在于组织中。

实验结果说明，本发明方法可以有效保留生长因子。

（4）体外细胞相容性

实验结果如图6所示，接种人脂肪间充质干细胞共培养7天，细胞保持成纤维细胞样形态，细胞的生长和增殖良好，说明本发明材料的浸提液对细胞无毒性，细胞相容性好。

综上，本发明方法可以去除胎盘组织中的细胞，降低DNA含量，同时可以有效维持胎盘组织的空间结构，保留生长因子，制备得到的胎盘基质DNA含量仅42.28±13.14ng/mg，HGF含量为4981.419±448.883pg/ml，EGF含量为197.133±22.932pg/ml，细胞相容性好，可用于体内组织修复。

实施例4本发明脱细胞胎盘基质材料的制备方法

1、实验方法

调节本发明方法中，SDS溶液处理的参数，具体参数如下表所示，其余条件同实施例2，制备脱细胞胎盘基质材料：

按照实施例3的方法检测DNA残留和生长因子含量，参照YY/T0606.6和GB5009.6规定的方法检测样品中的脂肪含量。

2、实验结果

如表4～7所示：

表4DNA残留结果

表5样品EGF含量（pg/ml）

表6样品HGF含量（pg/ml）

表7样品脂肪含量（%，m/m）

其中：A为浸泡时间（min），A₁=30min，A₂=60min；

B为浸泡次数（次），B₁=6，B₂=8；

C为搅拌转速（r/min），C₁=50，C₂=100。

如表4～7所示，采用本实施例方法处理得到的胎盘基质，DNA残留量低，脂肪残留量少，免疫原性小，生长因子含量高。

实验结果说明，在实施例2的工艺的基础上，对SDS浸泡的参数，如，浸泡时间、浸泡次数和转速进行调整后，仍然可以制备得到免疫原性小，生长因子含量高的胎盘基质。

以下用实验例的方式说明本发明的有益效果：

实验例1本发明胎盘基质的体内实验

1、实验方法

取健康SD大鼠30只，雌雄各半，分为实验组和对照组，消毒，采用水合氯醛腹腔注射麻醉，常规无菌操作，切开背部皮肤，实验组背部植入4张直径10mm，厚度1mm的实施例3制备的本发明脱细胞胎盘基质材料，对照组切开后即缝合。观察动物术后一般情况和伤口愈合情况。术后1、2、4周处死各组动物，取出植入材料戊二醛固定，常规包埋切片，HE染色，光镜观察植入物周围淋巴细胞、巨噬细胞浸润情况。

2、实验结果

手术当天动物清醒后即可正常进食，伤口无红肿、渗液等炎症反应，所有创面均可良好愈合，手术切口无1例发生感染，动物无死亡、惊厥、中风等毒性反应。

本发明实验组中，植入物周围软组织未见发黑、坏死、化脓、积液等表现，组织学观察术后1周，植入物周围含有大量淋巴细胞，2周时，仅少量淋巴细胞，4周时，基本无淋巴细胞存在。

实验结果说明，本发明生物组织修复材料无生物学毒性，有良好的组织相容性，可以有效促进组织愈合和再生。

综上，本发明方法制备的脱细胞基质材料脱细胞彻底，免疫原性低，生长因子含量高，可有效促进组织愈合和再生，制备方法简单，无需采用核酸酶等溶剂，成本低廉，应用前景良好。

Claims

1.一种脱细胞胎盘基质材料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（5）真空冷冻干燥，灭菌，即可。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，水的加入量为胎盘组织体积的1～3倍；所述匀浆的时间是10～30min。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，水的加入量为胎盘组织体积的2倍；所述匀浆的时间是20min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述浸泡的时间为4h；所述混合溶液中，甲醇和三氯甲烷的体积比为1:1。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述浸泡的时间为4h；所述混合溶液中，过氧乙酸的浓度为0.18%（v/v），乙醇的浓度为5%（v/v）。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，所述十二烷基硫酸钠溶液的浓度为0.5%（w/v）；所述浸泡的次数为10次，每次60min；所述震荡的频率为100r/min。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）、（2）、（3）和/或（4）中，所述离心的离心力为2000～4000g，离心时间为4～8min。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述离心力为3000g，离心时间为6min。

9.权利要求1～8任意一项所述方法制备的脱细胞胎盘基质材料。

10.权利要求9所述的胎盘基质材料在制备组织修复材料中的用途。