JP2016521592A - 動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法であって、以下の操作ステップを含む。
新鮮な動物組織を取り、注射用水を用いて3回洗い流す。ここで言う動物とは、理論上はすべての動物を含むが、好ましくはブタ、ウシ、ウマであり、より好ましくはブタである。前記組織には小腸粘膜下層、真皮、心膜が含まれる。
低濃度過酢酸−エタノール溶液法によりウイルスを不活化させる。当該ステップは、洗浄槽が振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、過酢酸の体積百分率を0.05〜0.2%(好ましくは0.1%)、不活化時間を1〜2時間(好ましくは1時間)、洗浄槽の振盪回転数を30〜600rpm(好ましくは100〜300rpm、より好ましくは200rpm)、超音波周波数を20〜80KHz(好ましくは20〜50KHz、より好ましくは35〜50KHz、最も好ましくは45KHz)、温度範囲を4〜40℃とし、次に、リン酸塩緩衝液中で毎回15分ずつ2〜5回洗浄して、洗浄後のリン酸塩緩衝液のpH値を測定し、pHが6.5〜7.5になったら、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が1.5μm/s以下となったことが測定されたら終了する。当該ステップにおいて、リン酸塩緩衝液の配合方法は、7.9gのNaCl、0.2gのKCl、0.24gのKH2PO4、1.8gのK2HPO4を秤量し、800mlの蒸留水中に溶解し、溶液のpH値が7.4になるまでHClを用いて調節した後に、蒸留水を加えて1Lまで定容するという方法である。
当該ステップは、洗浄槽が振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、まず、材料を洗浄槽内に入れ、濃度が5〜100mmol/L(好ましくは5〜20mmol/L、より好ましくは10mmol/L)の水酸化ナトリウム溶液を洗浄槽内に注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を5〜30分(好ましくは20分)とし、次に、洗浄器をオフにして、水酸化ナトリウム溶液を注ぎ出してリン酸塩緩衝液を注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を5〜20分(好ましくは15分)とし、リン酸塩緩衝液で2〜5回繰り返し洗浄して、洗浄後のリン酸塩緩衝液のpH値を測定し、pHが6.5〜7.5になったら、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が1.5μm/s以下となったことが測定されたら終了する。当該ステップにおいて、洗浄槽の振盪回転数は100〜300rpm(好ましくは200rpm)であり、超音波周波数は20〜80KHz(好ましくは20〜50KHz、より好ましくは35〜50KHz、最も好ましくは45KHz)である。当該ステップにおけるリン酸塩緩衝液の配合方法はステップ2と同様とする。
当該ステップは、洗浄槽が振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、濃度が0.015mol/Lまたは2mol/L(好ましくは0.015mol/L)で、pH値が7.8を超えない塩化ナトリウム溶液を洗浄槽内に注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を5〜30分(好ましくは20分)とし、次に、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が1.5μm/s以下となったことが測定されたら終了する。当該ステップにおいて、洗浄槽の振盪回転数は100〜300rpm(より好ましくは200rpm)であり、超音波周波数は20〜80KHz(好ましくは20〜50KHz、より好ましくは35〜50KHz、最も好ましくは45KHz)である。
当該ステップは、治具による固定、凍結乾燥、およびレーザマイクロドリルの3段階を含む。様々な製品の要求に基づいて、適応するサイズと形状の治具(好ましくはステンレススチール治具)を設計し、材料を治具に固定して、様々な製品の要求に応じて複数の層を重ね合わせることができ、注射用水できれいに洗浄済の、治具に固定された材料を凍結乾燥機に入れて、予め設計された凍結乾燥プロセス、つまり、25〜50℃(好ましくは25℃)に予備凍結し、0.5〜4時間(好ましくは2時間)保持し、15℃に昇温して、4〜12時間(好ましくは8時間)保持し、15℃昇温して、0.5〜4時間(好ましくは2時間)保持し、25℃になるまで昇温して、4時間保持するという凍結乾燥プロセスによって、凍結乾燥を行う。凍結乾燥の完了後に、レーザマイクロドリルを用いて、孔径範囲が0.05〜1mm(好ましくは0.2〜0.5mm)、孔間隔が0.1〜2cm(好ましくは0.5〜1cm)である孔を開ける。ここでいうレーザマイクロドリルとは、レーザ技術によって材料にマイクロメートルレベルの小孔を開けることができるものを指し、レーザマイクロドリルを用いて孔を開ける目的は、組織修復に有利になるように、材料の表面に孔隙を形成することである。
無菌の状態で包装し、一層にはタイベックを、他層にはポリエチレンプラスチックを使用し、包装の完了後にエチレンオキシドを用いて滅菌する。
本発明において、注射用水の使用基準は中国薬局方の規定に準じる。
本発明に記載の、洗浄槽が振盪可能な超音波洗浄器は、従来の超音波洗浄器の洗浄槽と機械的振盪器とを組み合わせて、洗浄槽が超音波洗浄と同時に機械的振盪を行えるようにし、機械的振盪と超音波洗浄が同時に連携して作用できるようにしている。
1.動物組織材料の前処理である分離および予備洗浄
屠殺されたばかりのブタの新鮮な小腸組織を取ってきれいに洗浄し、小腸粘膜下層を分離し、注射用水を用いて3回洗い流した。
低濃度過酢酸−エタノール溶液法によりウイルスを不活化させた。当該ステップは、洗浄槽が振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、過酢酸の体積百分率を0.05〜0.2%(好ましくは0.1%)、不活化時間を1〜2時間(好ましくは1時間)、洗浄槽の振盪回転数を30〜600rpm(好ましくは100〜300rpm、より好ましくは200rpm)、超音波周波数を20〜80KHz(好ましくは20〜50KHz、より好ましくは35〜50KHz、最も好ましくは45KHz)、温度範囲を4〜40℃として、次に、リン酸塩緩衝液中で毎回15分ずつ2〜5回洗浄して、洗浄後のリン酸塩緩衝液のpH値を測定し、pHが6.5〜7.5になったら、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が1.5μm/s以下となったことが測定されたら終了した。当該ステップにおいて、リン酸塩緩衝液の配合方法は、7.9gのNaCl、0.2gのKCl、0.24gのKH2PO4、1.8gのK2HPO4を秤量し、800mlの蒸留水中に溶解し、溶液のpH値が7.4になるまでHClを用いて調節した後に、蒸留水を加えて1Lまで定容するという方法である。
当該ステップは、洗浄槽が振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、まず、材料を洗浄槽内に入れ、濃度が5〜100mmol/L(好ましくは5〜20mmol/L、より好ましくは10mmol/L)の水酸化ナトリウム溶液を洗浄槽内に注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を5〜30分(好ましくは20分)とし、次に、洗浄器をオフにして、水酸化ナトリウム溶液を注ぎ出してリン酸塩緩衝液を注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を5〜20分(好ましくは15分)とし、リン酸塩緩衝液で2〜5回繰り返し洗浄して、洗浄後のリン酸塩緩衝液のpH値を測定し、pHが6.5〜7.5になったら、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が1.5μm/s以下となったことが測定されたら終了した。当該ステップにおいて、洗浄槽の振盪回転数は100〜300rpm(好ましくは200rpm)であり、超音波周波数は20〜80KHz(好ましくは20〜50KHz、より好ましくは35〜50KHz、最も好ましくは45KHz)であった。当該ステップにおけるリン酸塩緩衝液の配合方法はステップ2と同様とした。
当該ステップは、洗浄槽が振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、濃度が0.015mol/Lまたは2mol/L(好ましくは0.015mol/L)で、pH値が7.8を超えない塩化ナトリウム溶液を洗浄槽内に注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を5〜30分(好ましくは20分)とし、次に、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が1.5μm/s以下となったことが測定されたら終了した。当該ステップにおいて、洗浄槽の振盪回転数は100〜300rpm(好ましくは200rpm)であり、超音波周波数は20〜80KHz(好ましくは20〜50KHz、より好ましくは35〜50KHz、最も好ましくは45KHz)であった。
様々な製品の要求に基づいて、適応するサイズと形状のスチレンススチール治具を設計し、材料をスチレンススチール治具に固定して、様々な製品の要求に応じて複数の層を重ね合わせることができ、注射用水できれいに洗浄済の、治具に固定された材料を凍結乾燥機に入れて、予め設計された凍結乾燥プロセス、つまり、25〜50℃(好ましくは25℃)に予備凍結して、0.5〜4時間(好ましくは2時間)保持し、15℃に昇温して、4〜12時間(好ましくは8時間)保持し、15℃昇温して、0.5〜4時間(好ましくは2時間)保持し、25℃に昇温して、4時間保持するという凍結乾燥プロセスによって、凍結乾燥を行った。凍結乾燥の完了後に、レーザマイクロドリルを用いて、孔径範囲が0.05〜1mm(好ましくは0.2〜0.5mm)、孔間隔が0.1〜2cm(好ましくは0.5〜1cm)である孔を開けた。
無菌の状態で包装し、一層にはタイベックを、他層にはポリエチレンプラスチックを使用し、包装の完了後にエチレンオキシドを用いて滅菌した。
1.調製された8層の材料に対する物理性能の検出を行った。検出項目には、縫合保持力、引張強度、破断強度、および空隙率が含まれていた。
以下の方法で行った。2−0の外科用縫合糸または同径のステンレススチール線材で8層の材料の一端縁部の内側2ミリメートルの箇所を縫合し、縫合糸またはステンレススチール線材と8層の材料の他端を引張強度試験機に固定し、縫合箇所が引き裂かれるまで20mm/分の速度で引っ張って、縫合箇所が引き裂かれた時点の引張力を記録した。上記の方法により3回分のサンプルに対する検出を行った。その結果、縫合引張強度は5±0.5N以上であった。
以下の方法で行った。引張(圧縮)試験機を用いて、図1に示すように、8層の材料を試片に切断し、切断後に、相対湿度40%〜60%、温度22℃±2℃の条件下で2時間放置した後、直ちに試験を行った。試片の両端を引張試験機のクランプヘッドに固定し、100mm/分の速度で試片が破断するまで順次外向きに引っ張り、試片の縦方向および横方向に対してそれぞれ試験を行った。試片の破断時の力を単位Nで記録した。上記の方法により3回分のサンプルに対して検出を行った。その結果、縦方向:15N、横方向:8Nであった。
以下の方法により行った。引張(圧縮)試験機を用いて、8層の材料を23×23mmの正方形の試片に切断して準備し、相対湿度40%〜60%、温度24℃±2℃の条件下で2時間放置した後、直ちに試験を行った。環状治具で試片を引張強度試験機の作業台に固定し、球状プローブが750mm/分の速度で試片を貫通するようにして、試片を貫通するプローブの力を記録した。上記の方法により3回分のサンプルについて検出を行った。その結果、破断強度は120Nを超えた。
水銀圧入法を用いて材料の空隙率を測定した。その結果、空隙率は85%以上であった。
サンプルの厚さが均一な部分を取って、1cm2の細片に切断し、水で洗浄し、乾燥した後にガラス容器に入れ、サンプルの内外総表面積(cm2)と水(mL)との比が5:1の割合となるように水を加え、蓋をした後に高圧蒸気滅菌器内に置き、121℃±1℃で30分加熱し、加熱終了後にサンプルと液体とを分離し、室温に冷却して試液とした。同じ容積の水を秤取してガラス容器内に置いて、同様の方法によりブランク溶液を調製した。
以下の方法により行った。指示ウイルスとして仮性狂犬病ウイルスを選び、リアルタイム定量的PCR法によりウイルスDNAコピー数を検出し、3回分のサンプルに対して検出を行った。その結果、ウイルスDNAコピー数は0であった。
GB/T14233.1(『医療用輸液、輸血、注射器具の検査方法 第1部:化学分析方法』)の5.4.1に定められた方法で試験を行った。その結果、試液とブランク溶液とのpH値の差は1.5を超えなかった。
6cm2のサンプルに1mlの抽出媒体を加えるという割合で、37±1℃、72±2時間で試液を調製した。抽出媒体は生理食塩水とした。GB/T14233.2−2005(『医療用輸液、輸血、注射器具の検査方法 第2部:生物学試験方法』)に定められた方法で行い、3回分のサンプルに対して検出を行った。その結果、内毒素の含有量は5EU/g未満であった。
生物剤のDNA残留検出方法(『中国薬局方』2010、附録IX−B 外因性DNA残留量の測定法)により、実施例1により提供されたサンプルのDNA残留量を蛍光染色法を用いて検出した。その結果、材料のDNA残留量は150pg/gを超えなかった。
1)光学顕微鏡による観察
以下の方法により行った。パラフィンコーティングされた材料に対してヘマトキシリン−エオシン染色を行い、倒立型位相差顕微鏡で観察した。その結果、図2に示すように、細胞や細胞破片の残留はなく、コラーゲン繊維は破断せず連続していた。
6cm2のサンプルに1mlの抽出媒体を加えるという割合で、37±1℃、72±2時間で試液を調製した。抽出媒体は生理食塩水とした。ELISA法により抽出溶液における塩基性成長因子(bFGF)および血管内皮細胞成長因子(VEGF)の含有量を検出した。結果として、bFGFの含有量は121.8±2.683ng/Lであり、VEGFの含有量は93.8±3.033ng/Lであった。
以下の方法により行った。6cm2のサンプルに1mlの抽出媒体を加えるという割合で、37±1℃、24±2時間で試液を調製した。抽出媒体は血清を含有するMEM培地とした。試液を取り、GB/T16886.5−2003(『医療機器の生物学的評価 第5部:体外細胞の毒性試験』)に定められた試験方法で試験を行った。その結果、細胞毒性反応は1級以下であった。
以下の方法により行った。6cm2のサンプルに1mlの抽出媒体を加えるという割合で、37±1℃、72±2時間で試液を調製した。抽出媒体は生理食塩水と綿実油とした。GB/T16886.10−2005(『医療機器の生物学的評価 第10部:刺激および遅延型過敏反応の試験』)の試験方法の規定に従って試験を行った。その結果、遅延型過敏反応はなかった。
6cm2のサンプルに1mlの抽出媒体を加えるという割合で、37±1℃、72±2時間で試液を調製した。抽出媒体は生理食塩水と綿実油とした。GB/T16886.10−2005(『医療機器の生物学的評価 第10部:刺激および遅延型過敏反応の試験』)の試験方法の規定に従って試験を行った。その結果、試験サンプルと溶剤のコントロールとの平均得点差は1.0未満であった。
屠殺されたばかりのブタの新鮮な真皮組織を原材料として取り、調製方法は実施例1と同様とした。
実施例2に記載の方法により検出を行った。
屠殺されたばかりのブタの新鮮な心膜組織を原材料として取り、調製方法は実施例1と同様とした。
実施例2に記載の方法により検出を行った。
当該ステップは、治具による固定、凍結乾燥、およびレーザマイクロドリルの3段階を含む。様々な製品の要求に基づいて、適応するサイズと形状の治具(好ましくはステンレススチール治具)を設計し、材料を治具に固定して、様々な製品の要求に応じて複数の層を重ね合わせることができ、注射用水できれいに洗浄済の、治具に固定された材料を凍結乾燥機に入れて、予め設計された凍結乾燥プロセス、つまり、−25〜−50℃(好ましくは−25℃)に予備凍結し、0.5〜4時間(好ましくは2時間)保持し、そこから15℃昇温して、4〜12時間(好ましくは8時間)保持し、更に15℃昇温して、0.5〜4時間(好ましくは2時間)保持し、25℃になるまで昇温して、4時間保持するという凍結乾燥プロセスによって、凍結乾燥を行う。凍結乾燥の完了後に、レーザマイクロドリルを用いて、孔径範囲が0.05〜1mm(好ましくは0.2〜0.5mm)、孔間隔が0.1〜2cm(好ましくは0.5〜1cm)である孔を開ける。ここでいうレーザマイクロドリルとは、レーザ技術によって材料にマイクロメートルレベルの小孔を開けることができるものを指し、レーザマイクロドリルを用いて孔を開ける目的は、組織修復に有利になるように、材料の表面に孔隙を形成することである。
様々な製品の要求に基づいて、適応するサイズと形状のスチレンススチール治具を設計し、材料をスチレンススチール治具に固定して、様々な製品の要求に応じて複数の層を重ね合わせることができ、注射用水できれいに洗浄済の、治具に固定された材料を凍結乾燥機に入れて、予め設計された凍結乾燥プロセス、つまり、−25〜−50℃(好ましくは−25℃)に予備凍結して、0.5〜4時間(好ましくは2時間)保持し、そこから15℃昇温して、4〜12時間(好ましくは8時間)保持し、更に15℃昇温して、0.5〜4時間(好ましくは2時間)保持し、25℃になるまで昇温して、4時間保持するという凍結乾燥プロセスによって、凍結乾燥を行った。凍結乾燥の完了後に、レーザマイクロドリルを用いて、孔径範囲が0.05〜1mm(好ましくは0.2〜0.5mm)、孔間隔が0.1〜2cm(好ましくは0.5〜1cm)である孔を開けた。
Claims (20)
- 動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法において、
(1)動物組織材料の前処理である分離および予備洗浄のために、新鮮な動物組織を取り、注射用水を用いて3回洗い流すステップ、
(2)低濃度過酢酸−エタノール溶液法によりウイルスを不活化させるステップであって、洗浄槽式の振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、過酢酸の体積百分率を0.05〜0.2%、不活化時間を1〜2時間、温度範囲を4〜40℃とし、次に、リン酸塩緩衝液中で毎回15分ずつ2〜5回洗浄して、洗浄後のリン酸塩緩衝液のpH値を測定し、pHが6.5〜7.5になったら、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が1.5μm/s以下となったことが測定されたら終了するステップ、
(3)脱細胞のために、洗浄槽式の振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、まず、材料を洗浄槽内に入れ、濃度が5〜100mmol/Lの水酸化ナトリウム溶液を洗浄槽内に注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を5〜30分とし、次に、洗浄器をオフにして、水酸化ナトリウム溶液を注ぎ出してリン酸塩緩衝液を注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を5〜20分とし、リン酸塩緩衝液で2〜5回繰り返し洗浄して、洗浄後のリン酸塩緩衝液のpH値を測定し、pHが6.5〜7.5になったら、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が1.5μm/s以下となったことが測定されたら終了するステップ、
(4)塩化ナトリウム処理のためのステップであって、洗浄槽式の振盪可能な恒温超音波洗浄器内で行われ、濃度が0.015mol/Lまたは2mol/Lで、pH値が7.8を超えない塩化ナトリウム溶液を洗浄槽内に注入し、洗浄器をオンにして、洗浄時間を5〜30分とし、次に、注射用水を流して材料を洗浄し、導電率が1.5μm/s以下となったことが測定されたら終了するステップ、
(5)成形のためのステップであって、治具による固定、凍結乾燥、およびレーザマイクロドリルの3段階を含み、様々な製品の要求に基づいて、適応するサイズと形状の治具を設計し、材料を治具に固定して、注射用水できれいに洗浄済の、治具に固定された材料を凍結乾燥機に入れて、予め設計された凍結乾燥プロセス、つまり、25〜50℃に予備凍結して、0.5〜4時間保持し、15℃に昇温して、4〜12時間保持し、15℃に昇温して、0.5〜4時間保持し、25℃に昇温して、4時間保持するという凍結乾燥プロセスによって凍結乾燥を行い、凍結乾燥の完了後に、レーザマイクロドリルを用いて、孔径範囲が0.05〜1mmで、孔間隔が0.1〜2cmである孔を開けるステップ、並びに
(6)包装および滅菌のためのステップであって、無菌の状態で包装し、一層にはタイベックを、他層にはポリエチレンプラスチックを使用し、包装の完了後にエチレンオキシドを用いて滅菌するステップを含むことを特徴とする、動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。 - 前記ステップ(1)において、動物にはブタ、ウシ、ウマが含まれることを特徴とする、請求項1に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 前記ステップ(1)において、組織には小腸粘膜下層、真皮、心膜が含まれることを特徴とする、請求項1に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 前記ステップ(2)において、過酢酸の体積百分率は0.1%であることを特徴とする、請求項1に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 前記ステップ(2)において、不活化時間は1時間であることを特徴とする、請求項1に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 前記ステップ(2)、(3)、(4)において、洗浄槽の振盪数は100〜300rpmであることを特徴とする、請求項1に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 前記ステップ(2)、(3)、(4)において、洗浄槽の振盪数は200rpmであることを特徴とする、請求項6に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 前記ステップ(2)、(3)、(4)において、超音波周波数は20〜80KHzであることを特徴とする、請求項1に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 前記ステップ(2)、(3)、(4)において、超音波周波数は45KHzであることを特徴とする、請求項8に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 前記ステップ(3)において、水酸化ナトリウム溶液を用いて材料を洗浄する洗浄時間は20分であることを特徴とする、請求項1に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 前記ステップ(3)において、水酸化ナトリウム溶液の濃度は5〜20mmol/Lであることを特徴とする、請求項1に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 前記ステップ(3)において、水酸化ナトリウム溶液の濃度は10mmol/Lであることを特徴とする、請求項11に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 前記ステップ(3)において、リン酸塩緩衝液を用いて材料を洗浄する洗浄時間は15分であることを特徴とする、請求項1に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 前記ステップ(4)において、塩化ナトリウム溶液の洗浄時間は20分であることを特徴とする、請求項1に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 前記ステップ(4)において、塩化ナトリウム溶液の濃度は0.015mol/Lであることを特徴とする、請求項1に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 前記ステップ(5)において、治具はステンレススチール治具であることを特徴とする、請求項1に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 前記ステップ(5)において、予め設計された凍結乾燥プロセスは、25℃に予備凍結して、2時間保持し、15℃に昇温して、8時間保持し、15℃に昇温して、2時間保持し、25℃に昇温して、4時間保持する凍結乾燥プロセスであることを特徴とする、請求項1に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 前記ステップ(5)において、レーザマイクロドリルで開けた孔の孔径範囲は0.2〜0.5mmであることを特徴とする、請求項1に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 前記ステップ(5)において、レーザマイクロドリルで開けた孔の孔間隔は0.5〜1cmであることを特徴とする、請求項1に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法。
- 脱細胞小腸粘膜下層マトリックス材料、脱細胞真皮マトリックス材料、脱細胞心膜マトリックス材料の調製に用いることを含むことを特徴とする、請求項1に記載の動物由来の植込み型医療用生体材料の調製方法の応用。
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