CN106983909B - 一种耳科修复材料、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种耳科修复材料、制备方法及应用。所述修复材料由经免疫原去除处理的小肠粘膜下层基质材料制成，所述修复材料包括基层和设置在所述基层上的一个或多个凸起部；该修复材料可诱导患者自身细胞长入，为细胞重建受损组织提供模板，修复为功能化的组织或器官，并且免疫原去除基质会逐步降解，与重建组织再生过程基本同步，最终免疫原去除基质补片完全被宿主组织代替，从而使耳科恢复。该修补材料不会引发免疫原反应，易于加工成所需的形状。而且无需患者承受额外手术的痛苦。

Description

一种耳科修复材料、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及医用生物材料领域，具体涉及一种耳科修复材料(生物修补片)、制备方法及应用。
背景技术
鼓膜又称耳膜，为一椭圆形半透明状薄膜，位于中耳鼓室与外耳道交界处，构成鼓室的外侧壁，将外耳道和中耳腔进行分隔。在听觉传导的过程中，鼓膜的结构能使传入的声波增益，通过与听小骨作用，将外界声音传递至听觉神经，是生物体获得对外界声音的感知。由于鼓膜本身比较脆弱，日常生活中由于感染、胆脂瘤、外物碰触或鼓室内外压力差较大等情况，将导致耳膜出现穿孔甚至破损，甚至整个鼓室结构发生损伤。
现有技术中采用纸、鸡蛋膜、明胶海绵等异体材料进行修补，或者采用乳突部骨膜、颞肌筋膜、静脉瓣等自体材料进行修补。对于异体材料，由于其生物相容性差，难以吸收，将带来新的问题。而自体材料虽然没有生物相容性问题，但是由于需要从自体采集，因此对于患者而言需要增加额外的手术，导致患者机体额外的损伤，给患者带来额外的痛苦。此外，鼻咽部和中耳通过咽鼓管相连，由于儿童的咽鼓管比较短、宽且直，呈水平位，病原体及分泌物很容易经过咽鼓管进入中耳引起急性炎症，从而导致耳膜穿孔。而且这些无论是自体还是异体材料厚度比鼓膜大得多，影响鼓膜修复后的听力恢复。而且对于儿童实施自体生物材料采集的手术将额外增加手术的难度。
本发明采用动物源性免疫原去除小肠黏膜下层组织材料制备的鼓膜修复材料，则避免了上述问题的出现。该修复材料可诱导患者自身细胞长入，为细胞重建受损组织提供模板，修复为功能化的组织或器官，并且免疫原去除基质会逐步降解，与重建组织再生过程基本同步，最终免疫原去除基质补片完全被宿主组织代替，从而使鼓膜恢复。该修补材料不会引发免疫原反应，易于加工成所需的形状。而且无需患者承受额外手术的痛苦。
发明内容
本发明提供一种可诱导患者自身细胞长入，为细胞重建受损组织提供模板，修复为功能化的组织或器官，并且免疫原去除基质会逐步降解，与重建组织再生过程基本同步，最终免疫原去除基质补片完全被宿主组织代替的耳科修复材料。
为了解决上述技术问题，本发明提供采用的技术方案为：一种耳科修复材料，其特征在于：所述修复材料由经免疫原去除处理的小肠粘膜下层基质材料制成，所述修复材料包括基层和设置在所述基层上的一个或多个凸起部。
本发明所述小肠粘膜下层基质材料取自哺乳动物，优选为猪或牛。
所述的凸起部呈半球形、圆锥形、矩形或圆台形形状。上述结构可以提高修复材料强度，并且在填入鼓室后有利于填充鼓室并有利于破损鼓膜的爬附。
所述的基层至少由层状经干燥处理的小肠粘膜下层基质材料构成，所述的凸起部由经破碎和干燥处理的小肠粘膜下层基质材料构成。
本发明所述去除免疫原性是指细胞残留量小于10个，DNA残留量小于10ng/mg，半乳糖苷酶(α-Gal)清除率为99％以上。
本发明所述小肠粘膜下层基质材料保留完整的细胞外基质成分，保留完整的细胞外基质成分是指保留包含胶原蛋白、多糖物质、活性因子及生长因子成分。
本发明所述胶原蛋白为I型胶原蛋白及III型、IV型和VI型胶原蛋白的组合物。
本发明所述多糖物质为包含硫酸软骨素和透明质酸的组合物。
本发明所述活性因子包含纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、整合素及其配体的组合。
本发明所述生长因子成分为碱性生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)。
本发明所述耳科修复材料为微观多孔结构，孔隙率在60％以上。
本发明所述耳科修复材料拉伸断裂强度大于50N/cm。
本发明还提供一种耳科修复材料的制备方法，其特征在于：包括以下操作步骤：组织前置处理、病毒灭活、免疫原去除、干燥、冷冻干燥、成型、灭菌解析。
所述步骤分别为：
(1)组织前置处理：取小肠粘膜下层组织材料进行初处理；
(2)病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活；完成后在超声波清洗机中清洗；
(3)免疫原去除：采用含有胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液，使用包含至少两个频率的超声进行超声振荡处理；完成后在超声波清洗机中清洗，得到免疫原去除后的小肠粘膜下层基质材料；
(4)小肠粘膜下层基质材料浆料制备：使用低温破碎装置破碎由步骤(3)处理后的小肠粘膜下层基质材料，向破碎后的所述基质材料加入醋酸溶液，形成小肠粘膜下层基质材料浆料；
(5)干燥：将由步骤(3)处理后的免疫原去除的小肠粘膜下层基质材料固定于第一成型模具上，然后将模具在热循环烘箱中进行干燥；
(6)冷冻干燥：采用带有一个或多个凹坑的第二成型模具，将由步骤(4)处理后的小肠粘膜下层基质材料浆料填入凹坑中，刮平浆料；然后将由步骤(5)得到的干燥后的免疫原去除的小肠粘膜下层基质材料平铺于所述第二成型模具中的被刮平的所述浆料上，将所述第二成型模具置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥。
本发明步骤(2)的过氧乙酸-乙醇溶液，其中过氧乙酸的体积百分比浓度为0.1％-5％、乙醇的体积百分比浓度为5％-40％，过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(20-40)︰1，灭活时间2-4小时，过氧乙酸-乙醇溶液的温度范围为10-40℃。
步骤(2)所述的清洗过程包括：采用pH6-8中的PBS溶液超声清洗处理，PBS溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为20-40：1之间，每次10-30分钟；清洗2-4次，检测清洗后溶液的pH为6-8之间停止清洗；然后采用注射用水(降温后的)清洗，注射用水与小肠粘膜下层组织材料的体积比为20-40：1，检测清洗后的注射用水的电导率为10μS/cm以下终止；清洗过程在超声波清洗机中进行，超声波清洗机的频率优选40kHz、功率优选3000W以上。
本发明步骤(3)中的免疫源去除液中胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.01-0.2％，EDTA的浓度为0.1-1mmol/L，免疫源去除液pH值为7.0-8.0；优选地：免疫源去除液中胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.02-0.05％，EDTA的浓度为0.4-0.8mmol/L，免疫源去除液pH值优选为7.2-7.5；所述免疫源去除液与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1；超声振荡处理的超声至少包括两个频率，其中低频率范围为15-30KHz，高频范围为60-90KHz，其中低频处理5-30min，高频处理5-30min，温度范围为20-35℃；超声功率5000W以上。
步骤(3)的清洗过程包括：采用pH6-8中的PBS溶液超声处理，PBS溶液与小肠粘膜下层组织材料体积比为20-40：1之间，每次10-30分钟，清洗2-4次，检测清洗后的溶液的pH为6-8之间停止清洗；然后采用注射用水(降温后的)清洗，注射用水与小肠粘膜下层组织材料的体积比为20-40：1，检测清洗前后注射用水电导率差为1μS/cm以下终止。清洗过程可在超声波清洗机中进行；频率优选40kHz，功率优选3000W以上。
本发明步骤(4)中的小肠粘膜下层基质浆料的制备，包括使用低温破碎装置破碎由步骤(3)得到的破碎的小肠粘膜下层基质材料，向破碎后的所述基质材料加入醋酸溶液形成小肠粘膜下层基质材料浆料；其中所述醋酸溶液质量百分比浓度0.1％-0.8％，优选0.2％-0.3％，小肠粘膜下层基质材料与醋酸溶液质量比为1:25-1:500，优选1:50-1:100。
所述步骤(5)中的第一成型模具包括带针底板、盖板与压块；具体的结构图可以参考发明专利ZL201310203588.6和ZL201310203602.2；将一或多层小肠粘膜下层基质材料平铺于所述带针底板上，覆盖所述盖板，所述盖板上压5-10公斤的压块，使得材料平整、水分从四周溢出并且材料上下层之间紧密接触。
所述步骤(6)中，所述第二成型模具的所述凹坑可以为半球形、圆台形、圆锥形、圆柱形、棱柱、棱锥或棱台形；或者所述凹坑可以是不规则的块形适应鼓室的形状；将由步骤(4)得到的小肠粘膜下层基质材料浆料填入到第二成型模具中的一个或多个凹坑并刮平，使所有凹坑中的浆料的表面(裸露于凹坑开口侧的上表面)基本上在同一个平面上，将由步骤(5)得到的小肠粘膜下层基质材料覆盖于所述平面上，与所述浆料接触，优选在所述小肠粘膜下层基质材料上放置有5-10公斤的压块，以提供紧密接触；冷冻干燥步骤中，预冻至-45℃，保温1-2小时，然后调节温度至-15℃，保温5-7小时，再调节温度至0℃，保温1-4小时，最后调节温度至25℃，保温2-6小时。
所述步骤(6)中，凹坑直径为0.1-20mm，例如0.5-2mm，4-8mm，或者12-18mm。
本发明上述的制备步骤还包括成型的打孔包装步骤和灭菌解析步骤。
本发明进一步提供一种耳科修复材料的应用方法，具体为：
一种耳科修复材料的应用，可用于修复鼓膜穿孔、修复鼓膜破损或鼓室重建。
本发明中注射用水的使用标准依照国家药典中规定。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
(1)采用胰蛋白酶和EDTA，使细胞与细胞外基质之间的连接被破坏；采用低频超声对细胞进行破碎，同时使用高频超声作用于破碎的细胞及细胞外基质，进一步使细胞脱离细胞外基质，达到脱细胞目的。采用上述方式，对整个细胞脱离基质过程中的各个步骤进行强化，使细胞从基质上完全脱离。到达最佳的免疫原去除效果。通过上述脱细胞方法制备的生物组织基质材料为多孔结构，为提供细胞生长的支架。
(2)成型工艺技术：用两次成型工具得到一侧带有凸起结构的小肠粘膜下层基质材料，该凸起结构能够在鼓膜破损和鼓室修复过程中起到支撑作用，而在穿孔修复过程中起到缓冲保护作用；
(3)双层复合技术：采用烘干与冻干相结合的方式，形成了具有固定层和多孔层的双层复合结构；多孔层孔隙率大，有利于细胞的长入，能提高组织的修复速度，由于该凸起结构的密度小孔隙率高，因此不会影响体内分解时间；
(4)本发明的修补片用于但不限于耳科重建中的组织修复，具有可诱导患者自身细胞长入，为细胞重建受损组织提供模板，修复为血管化、功能化的组织或器官，并且免疫原去除基质会逐步降解，与重建组织再生过程基本同步，最终免疫原去除基质补片完全被宿主组织代替的优点。
附图说明
图1所示的是根据本发明一个实施方式的耳科修复材料的侧视示意图；
图2所示的是根据本发明一个实施方式的耳科修复材料的俯视示意图；
图3所示的是根据本发明另一个实施方式的耳科修复材料的侧视示意图；
图4所示的是根据本发明另一个实施方式的耳科修复材料的俯视示意图；
图5所示的是根据本发明另一个实施方式的耳科修复材料的示意图；
图6所示的是根据本发明的一个实施方式的动物实验数据图。
上述附图仅用于对本发明技术方案的解释，从而有助于本领域技术人员对本发明的理解，并非用于限制本发明。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
本发明所述小肠粘膜下层基质材料取自哺乳动物，猪小肠粘膜下层基质材料或牛小肠粘膜下层基质材料均适用于本发明的实施例。
实施例1：
本实施例耳科修复材料按如下述方法制备：
(1)组织前置处理：取小肠粘膜下层组织材料进行分割，剔除淋巴组织，用自来水冲洗，再用纯化水冲洗至表面无污渍，将冲洗后的小肠粘膜下层组织材料放置于滤网等滤水装置上，静置5分钟以上，将水滤干。
(2)病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料，该过程可在不锈钢桶中进行，过氧乙酸浓度(体积百分比)采用0.6％，乙醇浓度(体积百分比)采用7％，灭活时间2小时，溶液与小肠粘膜下层组织材料比例(体积比)为9：1，温度范围为20℃；完成后在超声波清洗机中先用pH值为7的PBS溶液超声处理，PBS溶液与小肠粘膜下层组织材料体积比为20:1，再用纯化水清洗数次至清洗液检测电导率为10μS/cm以下终止，纯化水与小肠粘膜下层组织材料体积比为20:1。
(3)免疫原去除：采用包含浓度(质量百分比)为0.1％的胰蛋白酶溶液和浓度0.5mmol/L的EDTA的pH＝7的PBS溶液，超声振荡处理，超声至少包括两个频率，其中低频率范围为25KHz，高频范围为75KHz，其中低频处理15min，高频处理8min，温度范围为20-35℃，溶液与小肠粘膜下层组织材料比例(体积比)为30：1，整个过程需要在多频超声装置中进行，超声波功率至少在5000W；多频超声至少包括两个频率，其中低频率范围为18KHz，高频范围为80KHz，其中低频处理15min，高频处理8min，温度范围为20-35℃。清洗过程包括：采用pH7.2-7.5的PBS溶液中超声处理，溶液与小肠粘膜下层组织材料体积比为30：1之间，每次30分钟；清洗2-4次，检测pH为6-8之间；采用降温的注射用水清洗，注射用水与小肠粘膜下层组织材料比例为30：1，检测清洗前后注射用水电导率差为1μS/cm以下终止。清洗过程可在超声波清洗机中进行；频率40kHz，功率3000W，得到小肠粘膜下层基质材料。
(4)小肠粘膜下层基质浆料制备：
低温破碎装置破碎由步骤(3)得到的小肠粘膜下层基质材料；低温破碎装置为用液氮冷冻破碎装置，将液氮与小肠粘膜下层材料送入液氮冷却破碎装置，小肠粘膜下层材料被液氮冷冻，利用破碎装置的高速旋转刀头进行破碎。向破碎后的所述基质材料加入醋酸溶液形成小肠粘膜下层基质材料浆料；其中所述醋酸溶液质量百分比浓度为0.3％，小肠粘膜下层基质材料与醋酸溶液质量比为1:60。
(5)干燥：该步过程在热循环烘箱中进行，优选洁净度为百级的烘箱。第一成型模具由带针底板、盖板与压块三部分组成，将一或多层小肠粘膜下层基质材料平铺于所述带针底板上，覆盖所述盖板，所述盖板上压5-10公斤的压块，使得材料平整、水分从四周溢出并且材料上下层之间紧密接触，然后放入烘箱中。开启烘箱风机，预热至40℃，保持时间约16小时。
(6)冷冻干燥：使用第二成型模具，其中第二成型模具带有半球形凹坑，半球形凹坑具有1mm的直径，将浆料放置于第二成型模具表面，使浆料填充第二成型模具的凹坑，然后刮平浆料，使所有凹坑中的浆料的表面基本上在同一个平面上，将由步骤(5)得到的小肠粘膜下层基质材料覆盖于所述平面上，与所述浆料接触，并在所述小肠粘膜下层基质材料上放置有5-10公斤的压块，以使经步骤(5)干燥的小肠粘膜下层材料与浆料紧密接触；将模具连同上面的基质材料一同放置于真空冷冻干燥机中，关闭冻干室的门，打开循环泵约1min，开启压缩机对冻干箱致冷，将产品预冻至-45℃，保温约2小时，开启真空泵，调节产品温度约-15℃升华，约6小时后，调节产品温度0℃，保温2小时，调节产品温度25℃，保温4小时。
本实施例中的制备方法还可以包括以下步骤：
(7)包装：烘干的产品取出后，在模具上切割成固定的形状，采用双层特卫强包装袋包装，该过程需要无菌转运与操作。
(8)灭菌解析：产品采用环氧乙烷灭菌，灭菌条件：温度40℃，保温时间4小时，湿度70％，环氧乙烷浓度为500mg/L，灭菌时间6小时；解析过程：通风的解析室中，温度控制在20℃之间，时间约14天。
本发明的耳科修复材料，其中的凸起部的形状或排列密度可以采用附图1-4所示，为半球状；或者如附图5所示，其中的凸起部的形状为圆台状。
实施例2：
对实施例1中样品进行性能检测，检测项目与结果如下：
1)DNA残留：依据生物制剂残留DNA检测方法《中国药典》2015年版第四部，采用荧光染色法检测实施例1所提供的样品DNA残留量，结果：实施例1所提供的样品的DNA残留量小于3.64±0.96ng/mg。
2)半乳糖苷酶(α-Gal)清除率：取动物源性生物材料Gal阳性参考品，Gal抗原阴性参考品各2mg，加裂解液1ml，裂解30-90min，配制成20、10、5、2.5、1.25、0.625μg的Gal标准曲线样品，测试免疫原去除前后的测试品各取50mg，加裂解液2ml，裂解30-90min；取裂解液与M86抗体反应后的上清液，加入96孔板，加二抗，加显色剂，采用ELISA方法450nm检测吸光度值，按标准曲线计算出样品的Gal值，免疫原去除处理前材料的Gal值为17.79±1.89×1014/mg，实施例1中样品的Gal值为0.13±0.01×1014/mg，半乳糖苷酶(α-Gal)清除率在99.27％以上。
3)病毒检测：选择伪狂犬病毒为指示病毒，采用实时定量PCR法检测病毒的DNA拷贝数，检测3批样品。结果：病毒DNA拷贝数为0。
4)细菌内毒：按照GB/T 14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法》进行检测，共3批样品，结果：细菌内毒小于20EU/包装。
5)胶原蛋白亚型鉴别：采用免疫组化染色法检测I、III、IV型和VI型胶原蛋白，3μm厚连续切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。将切片移入电饭煲水浴中(内含0.01mol/L，pH6.0的枸橼酸三钠缓冲液)，温度保持在95-100℃，煮20min，进行抗原修复，取出后在室温下自然冷却。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，5min×3次。二步法免疫组化：分别滴加I、III、IV型和VI型胶原蛋白单克隆抗体一抗，浓度1：100，4℃冰箱过夜室温下孵育60min，PBS洗涤3次。滴加Envision反应液，室温下孵育30min。PBS洗涤3次。0.05％的3，3一二氨基联苯胺+0.03％的H2O2显色5-10min。流水洗，苏木精衬染。递增梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规树脂封固。结果表明，显微镜下观察四种染色标本皆可见棕黄染色，为阳性，表明样品中可检测到I、III、IV型和VI型胶原蛋白。
6)多糖物质含量检测：取10个样品，取样，浸提，用Biocolor硫酸软骨素检测试剂盒测试硫酸软骨素含量，样品中硫酸软骨素含量平均值为5236±185μg/g；用透明质酸检测试剂盒测试透明质酸(HA)含量，结果显示，样品的透明质酸(HA)保留量平均值为296±23μg/g。
7)活性因子种类鉴别：将样品浸泡PBS24h后，固定于4％多聚甲醛5-10min，用0.1mol/LPBS洗3次，每次5min，然后用玻璃细管转至涂有多聚赖氨酸的玻片上,进行免疫组织化学染色。LN抗体、FN抗体和整合素效价均为1∶100，0.5％胰酶消化3-5min暴露抗原，0.1％Triton X100作用10min增加抗体的穿透性。免疫组织化学染色显阳性，表面样品中包含纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、整合素及其配体的等物质。
8)生长因子残留量：对实施例1中样品采用ELISA法检测样品中碱性生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)含量，并对免疫原去除前动物组织作为对照。结果发现碱性生长因子(bFGF)免疫原去除前后含量分别为2155±189ng/L、828±90ng/L，保留生长因子35％以上；血管内皮生长因子(VEGF)含量免疫原去除前后含量分别为633±51ng/L、249±16ng/L，保留生长因子35％以上。
9)抗张强度：按照实施例1制备样品，将样品裁剪成2×5cm尺寸，在相对湿度为40％-60％，温度为22℃±2℃的条件下放置2h后立即进行试验。将试样两端固定在拉伸试验机的夹头上，以100mm/min的速度依次向外拉伸直到试样断裂，纵向试样和横向试样分别进行试验。最后的测定结果显示纵向抗张强度可达30N，横向抗张强度可达15N。
10)环氧乙烷残留量：按GB/T14233.1-2008《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》中9的规定的方法试验，结果：产品环氧乙烷残留量不超过10μg/包装。
11)重金属检查：铅、铬按GB/T 14233.1-2008中5.9.1《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》规定的方法试验，汞、砷按GB/T 14233.1-2008中5.9.3《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》规定的方法试验，产品检验液中铅、铬、汞、砷总重金属含量少于1μg/g。
实施例3
对实施例1中样品进行生物相容性实验，检测项目包括：热原、细胞毒性、迟发型超敏反应、皮内反应、急性全身毒性、Ames试验、小鼠淋巴瘤细胞突变试验、染色体畸变、植入、亚慢性毒性。
1)热原
按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水。按GB/T 14233.2-2005规定的方法进行，产品无热原反应。
2)细胞毒性
按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，24±2hr制备试验液，浸提介质：含血清的MEM培养基。取试验液按照GB/T16886.5-2003中规定的试验方法进行试验，结果产品的细胞毒性反应不大于1级。
3)迟发型超敏反应
按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。按照GB/T 16886.10-2005第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验方法规定进行试验，结果产品无迟发型超敏反应。
4)皮内反应
按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。按照GB/T 16886.10-2005第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验试验方法规定进行试验，结果：试验样品与溶剂对照平均记分之差小于1.0。
5)急性全身毒性
按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。取试验液按照GB/T16886.11-2011规定的试验方法进行试验，结果：产品无急性全身毒性反应。
6)Ames试验
按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和DMSO。按GB/T16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的Ames试验为阴性。
7)小鼠淋巴瘤细胞突变试验
按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和DMSO。按GB/T16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的小鼠淋巴瘤细胞突变试验为阴性结果。
8)染色体畸变试验
按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和DMSO，按GB/T16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的染色体畸变试验为阴性。
9)植入
按GB/T16886.6-1997规定的方法进行，结果：肌肉植入1周：样品周围可见嗜中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润，应无囊腔形成；肌肉植入4周：样品周围可见少量巨噬细胞和淋巴细胞，胶原纤维和纤维母细胞增生，有纤维囊腔形成；肌肉植入12周：样品周围可见少量淋巴细胞、胶原纤维、纤维囊腔较致密规整。
10)亚慢性毒性
按GB/T 16886.11规定的方法进行，结果：无亚慢性毒性反应。
实施例4：
动物实验:
动物实验模型，以60只Wistar大鼠为实验动物模型，所有动物先用戊巴比妥钠腹腔麻醉(0.3ml/100g)，在电耳镜下用灼热针尖在大鼠双侧鼓膜后下象限制成约1.5mm×1.5mm紧张部的圆形穿孔。术后用氨苄青霉素(150mg/kg)肌肉注射预防感染，每天一次，连续5天。以耳科修复材料制作生物鼓膜修补片。60只大鼠随机分为两组，第一组30只左耳为空白对照组；右耳采用生物鼓膜修补片进行治疗。第二组左耳外耳道置无菌干棉球；右耳采用生物鼓膜修补片进行治疗。分别于术后1天、3天、5天、7天和10天时，每组处死6只大鼠，解剖颞骨，剥离听泡外侧壁，取出完整鼓膜，观察鼓膜修复情况。对取得的鼓膜标本用10％甲醛固定，石蜡包埋，切片，常规HE染色，采用免疫组化两步法检测。免疫组化结果用配对样本(同体比较)的t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。结果发现，光镜下生物鼓膜修补片3天时上皮细胞增厚，细胞由扁平细胞变成多边形，细胞间距增加，核质比增大，上皮层与纤维层分离，上皮增生明显。5天时大部分鼓膜纤维层也增厚，内层柱状上皮也增生。7天时鼓膜已基本愈合，且结构与正常鼓膜接近。空白对照组与对照组在10天时只有3只(共6只)观察到完整鼓膜穿孔修复。免疫组化图像分析，生物鼓膜修补片与空白组、无菌干棉球组相比TGF-α、bFGF表达值差异有统计学意义，p<0.05。因此，生物鼓膜修补片可提高TGF-α、bFGF在鼓膜穿孔愈合中的表达，并延长其表达时间，缩短穿孔鼓膜的愈合时间，促进穿孔愈合，愈合组织更接近正常鼓膜组织结构。具体结果可见附图6所示。
综上，本发明一种免疫原去除基质耳科修复材料：
(1)DNA残留能够达到10ng/mg以下，较同类产品低30-50ng/mg、半乳糖苷酶去除率较高，能够达到99％；
(2)免疫原去除过程，通过控制产品的超声功率，能够在高功率的情况下，达到破碎细胞、DNA的效果，在低功率的情况下，将破碎的细胞内物质有效的清洗掉；
(3)力学强度更强，能够承受更大的力学性能，能够有效的控制降解时间，使植入体内后与人体组织重生过程相匹配；
(4)采用烘干与冻干相结合的方式，形成了一层固定层、一层多孔层的双层复合结构；疏松层孔隙率大，有利于细胞的长入，能提高组织的修复速度。
本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (18)

1.一种耳科修复材料，其特征在于：所述修复材料由经免疫原去除处理的小肠粘膜下层基质材料制成，所述修复材料包括基层和设置在所述基层上的一个或多个凸起部；
所述耳科修复材料通过包括以下操作步骤的方法制备：
（1）组织前置处理：取小肠粘膜下层组织材料进行初处理；
（2）病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活；完成后在超声波清洗机中清洗；
（3）免疫原去除：采用含有胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液，使用包含至少两个频率的超声进行超声振荡处理；完成后在超声波清洗机中清洗，得到免疫原去除后的小肠粘膜下层基质材料；
（4）小肠粘膜下层基质材料浆料制备：使用低温破碎装置破碎由步骤（3）处理后的小肠粘膜下层基质材料，向破碎后的所述基质材料加入醋酸溶液，形成小肠粘膜下层基质材料浆料；
（5）干燥：将由步骤（3）处理后的免疫原去除的小肠粘膜下层基质材料固定于第一成型模具上，然后将模具在热循环烘箱中进行干燥；
（6）冷冻干燥：采用带有一个或多个凹坑的第二成型模具，将由步骤（4）处理后的小肠粘膜下层基质材料浆料填入凹坑中，刮平浆料；然后将由步骤（5）得到的干燥后的免疫原去除的小肠粘膜下层基质材料平铺于所述第二成型模具中的被刮平的所述浆料上，将所述第二成型模具置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的耳科修复材料，其特征在于：所述的凸起部呈半球形、圆锥形、矩形或圆台形形状。
3.根据权利要求1所述的耳科修复材料，其特征在于：所述的基层至少由层状经干燥处理的小肠粘膜下层基质材料构成，所述的凸起部由经破碎和干燥处理的小肠粘膜下层基质材料构成。
4.根据权利要求1所述的耳科修复材料，其特征在于，所述的小肠粘膜下层组织材料取自哺乳动物。
5.根据权利要求4所述的耳科修复材料，其特征在于，所述哺乳动物为猪或牛。
6.一种耳科修复材料的制备方法，其特征在于：包括以下操作步骤：
（1）组织前置处理：取小肠粘膜下层组织材料进行初处理；
（2）病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活；完成后在超声波清洗机中清洗；
（3）免疫原去除：采用含有胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液，使用包含至少两个频率的超声进行超声振荡处理；完成后在超声波清洗机中清洗，得到免疫原去除后的小肠粘膜下层基质材料；
（4）小肠粘膜下层基质材料浆料制备：使用低温破碎装置破碎由步骤（3）处理后的小肠粘膜下层基质材料，向破碎后的所述基质材料加入醋酸溶液，形成小肠粘膜下层基质材料浆料；
（5）干燥：将由步骤（3）处理后的免疫原去除的小肠粘膜下层基质材料固定于第一成型模具上，然后将模具在热循环烘箱中进行干燥；
（6）冷冻干燥：采用带有一个或多个凹坑的第二成型模具，将由步骤（4）处理后的小肠粘膜下层基质材料浆料填入凹坑中，刮平浆料；然后将由步骤（5）得到的干燥后的免疫原去除的小肠粘膜下层基质材料平铺于所述第二成型模具中的被刮平的所述浆料上，将所述第二成型模具置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥。
7.根据权利要求6所述的耳科修复材料的制备方法，其特征在于：
所述步骤（2）中，过氧乙酸-乙醇溶液，其中过氧乙酸的体积百分比浓度为0.1%-5%、乙醇的体积百分比浓度为5%-40%，过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(3-20)︰1，灭活时间2-4小时，温度范围为10-40℃。
8.根据权利要求6所述的耳科修复材料的制备方法，其特征在于：
所述步骤（3）中，免疫原去除液为含有胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液；所述免疫原去除液中胰蛋白酶质量百分比浓度为0.01-0.2%，EDTA的浓度为0.1-1mmol/L；免疫原去除液pH值为7.0-8.0；所述免疫原去除液与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1；多频超声振荡处理，多频超声至少包括两个频率，其中低频率范围为15-30KHz，高频范围为60-90KHz，其中低频处理5-30min，高频处理5-30min，温度范围为20-35℃，超声功率5000W以上。
9.根据权利要求8所述的耳科修复材料的制备方法，其特征在于：
所述免疫原去除液中胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.02-0.05%，EDTA的浓度为0.4-0.8mmol/L。
10.根据权利要求8所述的耳科修复材料的制备方法，其特征在于：
所述免疫原去除液pH值为7.2-7.5。
11.根据权利要求6所述的耳科修复材料的制备方法，其特征在于：
所述步骤（4）中的小肠粘膜下层基质浆料制备包括使用低温破碎装置破碎由步骤（3）得到的小肠粘膜下层基质材料，向破碎后的所述基质材料加入醋酸溶液形成小肠粘膜下层基质材料浆料；其中所述醋酸溶液质量百分比浓度0.1%-0.8%，小肠粘膜下层基质材料与醋酸溶液质量比为1:25-1:500。
12.根据权利要求11所述的耳科修复材料的制备方法，其特征在于：
所述醋酸溶液质量百分比浓度为0.2%-0.3%。
13.根据权利要求11所述的耳科修复材料的制备方法，其特征在于：
所述小肠粘膜下层基质材料与醋酸溶液质量比为1:50-1:100。
14.根据权利要求6所述的耳科修复材料的制备方法，其特征在于：
在所述步骤（4）中，将小肠粘膜下层和液氮送入破碎装置中，小肠粘膜下层材料被液氮冷冻，利用破碎装置的高速旋转刀头进行破碎，破碎时间1-60min，得到小肠粘膜下层组织的颗粒。
15.根据权利要求6所述的耳科修复材料的制备方法，其特征在于：
所述步骤（6）中第二成型模具凹坑最大直径为0.1-20mm。
16.根据权利要求15所述的耳科修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（6）中第二成型模具凹坑最大直径为0.5-2mm，4-8mm，或者10-18mm。
17.根据权利要求1-5中任意一种耳科修复材料在制备耳科修复植入物材料中的应用，其特征在于，所述耳科修复植入物用于鼓膜穿孔修复、鼓膜重建和鼓室重建。
18.根据权利要求1-5中任意一种耳科修复材料在制备耳科修复植入物材料中的应用，其特征在于，所述耳科修复植入物用于鼓膜缺损修复。
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