CN107029296B - 一种引导骨再生的骨膜修补片、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种引导骨再生的骨膜修补片、制备方法和应用。所述骨膜修补片的特征在于：包括高孔隙率的疏松活性层与低孔隙率的致密基底层，包括胶原蛋白、多糖物质和活性因子，疏松活性层还包括引导骨再生活性因子，所述骨膜修补片植入体内可被降解吸收。该修补片形成了上层疏松、下层致密的双层复合结构，有利于细胞的长入，能提高组织的修复速度，致密层为免疫原去除基质基底层有隔离作用，有效保护被修复的组织；添加了骨形态发生蛋白用于骨膜损伤与缺损修复。

Description

一种引导骨再生的骨膜修补片、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医用生物材料领域，具体为一种用于修复因创伤、骨折、肿瘤等原因引起的骨膜损伤、缺损，或配合骨移植材料植入防止材料脱出的骨膜修补片、制备方法和应用。

背景技术

由于老龄化、创伤、肿瘤等原因造成骨折、骨不连、骨延迟愈合、骨缺损等是临床上常见的骨科疾病，其治疗研究关注于骨移植材料，而忽视骨膜重修复的重要性。而事实上，骨膜具有丰富的微血管能让骨组织重新恢复血供，从而促进骨缺损部位愈合，提高骨修复成功率高；并且可作为骨组织与周围组织的重要界面，防止肌肉、肌腱、筋膜等组织长入骨缺损处，为成骨细胞、间充质干细胞提供生长微环境，促进骨组织再生与重建。因此一旦骨膜缺失无法恢复，骨缺损将难以自愈合。

目前报道的骨膜修复材料都存在不足之处，采用脱细胞基质材料基质破坏较大，DNA残留过高，免疫原性去除不彻底，易引起免疫排斥反应；采用壳聚糖、丝素蛋白等天然生物材料多采用电纺丝技术构建三维结构，无法达到天然细胞外基质的多孔网络效果；采用人工合成可降解高分子材料则会在降解过程中造成局部酸性过强，易引起炎症反应；而胶原蛋白膜则力学强度不足，降解过快，使用化学交联剂会造成组织感染、炎症与纤维包裹；或者基质中需要添加BMP、VEGF、bFGF等生长因子提高材料对组织的诱导再生能力。因此还没有一种较好的骨膜修复材料，既能起到屏障作用，可将骨损伤部位与周围组织有效隔离，防止周围组织中的成纤维细胞侵入骨损伤部位和骨移植材料脱出，又能引导骨膜组织再生修复，形成血管化组织为骨再生提供营养物质与氧气，为成骨细胞、间充质干细胞重建骨组织提供生长微环境。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种具有多层结构、低免疫原性、降解可控、保留细胞外基质三维结构与生长因子的引导骨再生的骨膜修补片。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种引导骨再生的骨膜修补片，该修补片包括高孔隙率的疏松活性层与低孔隙率的致密基底层，疏松活性层和致密基底层均包括胶原蛋白、多糖物质和活性因子，疏松活性层还包括引导骨再生活性因子，所述骨膜修补片植入体内能被降解吸收。

本发明上述的疏松活性层和致密基底层是从结构角度的描述，实际上二者都是由小肠粘膜下层制造，包括的胶原蛋白、多糖物质和活性因子均是制造过程从小肠粘膜下层本身保留的物质，疏松活性层还包括引导骨再生活性因子如骨形态发生蛋白是另行加入的物质。

本发明所述的高孔隙率的疏松活性层为孔隙率75～90％的三维网状多孔结构。

本发明所述的低孔隙率的致密基底层为孔隙率45～70％的三维网状多孔结构。

上述特定的孔隙率的限定是因为：致密层用于隔离保护，防止软组织长入骨创面；而疏松层适于血管化、成骨细胞长入，致密层与疏松层各自的孔隙率范围最大程度上保证了上述效果的实现。

本发明所述的胶原蛋白为包含I型、III型、IV型和VI型胶原蛋白的组合物，这些组合物是小肠粘膜下层基质材料的基本组分。

本发明所述的多糖物质为包含硫酸软骨素和透明质酸的组合物。

本发明所述的活性因子包含纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、整合素及生长因子。

本发明所述的引导骨再生活性因子包括诱导骨形成活性物质，优选骨形态发生蛋白。

本发明所述的骨膜修补片植入体内能被降解吸收，具体的能降解吸收的时间为3-6个月。软组织创面恢复通常在两周左右恢复，而硬组织创面(例如骨创面)恢复通常在三个月以上，六个月是骨重建完成的时间。因此，在3个月时仍需要骨膜修复材料存在以实现软组织的隔离。至少在3个月内不能完全降解；且在6个月以后完成降解即可。

作为一些实施方式，本发明所述引导骨再生的骨膜修补片，长1-20cm，宽1-10cm，厚度1-3mm。

本发明还提供一种上述引导组织再生的骨膜修补片的制备方法，包括以下步骤：采用动物小肠粘膜下层组织(动物小肠粘膜下层)作为原料，然后经过包括组织前置处理、病毒灭活、清洗、免疫原消除、清洗、浆料制备、活性层制备、干燥、复合成型和真空冷冻干燥的步骤，获得清除动物源病毒风险、细胞成分、DNA成分和α-Gal抗原，保留细胞外基质成分的引导骨再生的骨膜修补片。

所述动物为哺乳动物，优选猪或牛。

本发明上述具体的引导骨再生的骨膜修补片的制备方法，其特征在于：步骤包括：

(1)原料的前置处理：取小肠粘膜下层组织材料进行前置处理；

(2)病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织进行病毒灭活；

(3)清洗过程：清洗步骤(2)获得的小肠粘膜下层组织；

(4)免疫原去除：采用的免疫原去除液进行免疫原去除，免疫原去除液为溶有胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液，免疫原去除过程在多频超声环境下进行；

(5)清洗过程：进行清洗，清洗过程在超声波清洗机中进行，得到小肠粘膜下层基质材料；

(6)小肠粘膜下层基质浆料制备：使用低温破碎装置破碎由步骤(5)得到的小肠粘膜下层基质材料，向破碎后的所述基质材料加入醋酸溶液，形成小肠粘膜下层基质材料浆料；

(7)活性层材料制备：将由步骤(6)得到的浆料冷冻干燥后破碎并过筛，得到小肠粘膜下层基质颗粒，将骨形态发生蛋白溶液(BMP)与所述颗粒混合，形成膏状混合物；

(8)干燥：将步骤(5)中得到的小肠粘膜下层基质材料固定于成型模具并与成型模具一同放入烘箱中干燥；

(9)复合成型：在由步骤(8)得到的小肠粘膜下层材料上覆盖由步骤(7)中得到的已经加入骨形态发生蛋白的小肠粘膜下层基质浆料；

(10)真空冷冻干燥：将步骤(9)中得到的复合材料置于真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥。

本发明步骤(2)的过氧乙酸-乙醇溶液，其中过氧乙酸的体积百分比浓度为0.1％-5％、乙醇的体积百分比浓度为5％-40％(用水配置成溶液)，过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(3-20)︰1，灭活时间2-4小时，温度范围为10-40℃。

所述步骤(3)中清洗过程为：在超声波清洗机中用pH值为7.2-7.4的PBS溶液清洗，然后用水清洗至检测电导率为10μS/cm以下终止，得到小肠粘膜下层基质材料，其中PBS溶液pH值范围为6-8，所使用的水为经过纯化处理的纯化水，超声频率优选40kHz，功率优选3000W以上。

所述步骤(4)中的免疫源去除液包括：溶解有胰蛋白酶和EDTA的pH值为6-8的PBS溶液；所述免疫源去除液中胰蛋白酶质量百分比浓度为0.01-0.2％，EDTA的浓度0.1-1mmol/L；进一步包括：免疫源去除液中胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.02-0.05％，EDTA的浓度为0.4-0.8mmol/L，免疫源去除液的pH值为7.0-8.0，优选为7.2-7.5；所述免疫源去除液与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1；所述步骤(4)中多频超声至少包括两个超声频率，低频频率范围为20-40KHz，高频频率为60-90KHz，其中低频处理5-40min，高频处理5-40min，温度范围为20-35℃。

所述步骤(5)中清洗过程为：在超声波清洗机中用PBS溶液清洗，然后用降温的注射用水清洗至检测清洗前后的注射用水电导率差为1μS/cm以下终止，得到小肠粘膜下层基质材料。其中PBS溶液pH值范围为6-8，超声频率优选40kHz，功率优选3000W以上。

所述步骤(6)中的小肠粘膜下层基质浆料制备，具体的为：使用低温破碎装置破碎由步骤(5)处理得到的小肠粘膜下层基质材料，向破碎后的所述基质材料加入醋酸溶液形成小肠粘膜下层基质材料浆料；其中所述醋酸溶液的质量百分比浓度0.1％-0.8％，优选0.2％-0.3％，小肠粘膜下层基质材料与醋酸溶液质量比为1:25-1:500，优选1:50-1:100。

所述步骤(7)的活性层材料制备包括：将上述获得的浆料进行冷冻干燥，然后用破碎装置将已经冻干的小肠粘膜下层基质蓬松块体破碎成颗粒，过筛筛选出粒径400μm以下颗粒；将质量百分比为0.01％-0.1％的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)溶液加入到所述颗粒中，颗粒质量与骨形态发生蛋白溶液的质量比为1:1-5:1，温度20℃，混合后静置24小时备用，得到膏状混合物。

本发明上述步骤(8)所述的成型模具由带针底板、盖板与压块三部分组成，将一或多层小肠粘膜下层基质材料平铺于所述带针底板上，覆盖所述盖板，所述盖板上压5-10公斤的压块，使得材料平整、水分从四周溢出并且材料上下层之间紧密接触；开启烘箱风机，预热至25-40℃，将小肠粘膜下层基质材料和模具放于烘箱中，时间8-16小时，将用于提供压力的盖板和重物板缓缓取下，再次放于烘箱中干燥，时间需2-6小时后干燥完成。烘干后的小肠粘膜下层基质作为基底层；本发明提到的模具的结构可以参考发明专利ZL201310203588.6和ZL201310203602.2。

所述步骤(9)包括：在步骤(8)处理获得的烘干型的小肠粘膜下层基质上覆盖步骤(7)中得到的膏状混合物，使所述膏状混合物均匀平铺在烘干的小肠粘膜下层基质的上表面，浆料厚度为1-3mm。

本发明步骤(10)所述的真空冷冻干燥，具体为：将由步骤(9)得到的复合材料放置于真空冷冻干燥机中；先预冻至-45℃，保温1-2小时；然后开启真空泵，调节温度至-15℃，保温5-7小时，再调节温度至0℃，保温2小时，最后调节温度至25℃，保温4小时，冷冻干燥装置的腔室内的压强为1-50Pa，完成真空冷冻干燥，得到最终目标产物。

本发明上述的引导骨再生的骨膜修补片的制备方法，步骤还包括：(11)包装，(12)灭菌解析。

本发明进一步提供上述引导骨再生的骨膜修补片的应用。具体为：可用于填充拔牙窝、牙槽嵴的扩展与重建、牙周骨缺损充填、牙槽嵴骨增量术、上颌窦提升术、窦底抬高、水平向骨增量、垂直向骨增量的骨膜缺损修复，隔离周围组织，引导骨组织再生；也可用于各类骨折、骨缺损、脊柱融合、骨肿瘤、骨不连、关节融合等造成骨膜缺损时的骨膜缺损修复，隔离周围组织，引导骨组织再生。

本发明的引导骨再生的骨膜修补片，其中的基底层提供组织隔离作用、保护受损组织，活性层促进骨膜修复，引导骨组织再生。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

(1)采用胰蛋白酶和EDTA，使细胞与细胞外基质之间的连接被破坏；采用低频超声对细胞进行破碎，同时使用高频超声作用于破碎的细胞及细胞外基质，进一步使细胞脱离细胞外基质，达到脱细胞目的。采用上述方式，对整个细胞脱离基质过程中的各个步骤进行强化，使细胞被从基质上完全脱离，到达最佳的免疫原去除效果。

(2)成型工艺技术：本发明引导骨再生的骨膜修补片为双层结构，起到物理隔离与为骨膜再生提供微环境的双重作用，采用烘干与冻干相结合的方式，形成了上层疏松、下层致密的双层复合结构。二者孔隙率的控制非常关键，特定的孔隙率使得疏松层为含有引导骨再生的活性层，孔隙率大，有利于细胞的长入，能提高组织的修复速度，致密层为免疫原去除基质基底层有隔离作用，有效保护被修复的组织；

(3)基质破碎技术：首先采用低温破碎装置将小肠粘膜下层组织粉碎碎，然后通过醋酸膨化处理，再经过冻干形成蓬松状、可大量吸水的疏松结构，制备过程中形成浆料便于涂布成型；

(4)添加骨形态发生蛋白技术：利用小肠微粉的强力吸水能力，加入含有骨形态发生蛋白的溶液，可以使溶液迅速充分的进入微粉颗粒内部，再经过冻干，使骨形态发生蛋白存在于小肠微粉孔径表面并在植入体内后释放；

(5)本发明补片用于骨膜损伤与缺损修复：既能起到屏障作用，可将骨损伤部位与周围组织有效隔离，防止周围组织中的成纤维细胞侵入骨损伤部位和骨移植材料脱出，又能引导骨膜组织再生修复，形成血管化组织为骨再生提供营养物质与氧气，为成骨细胞、间充质干细胞重建骨组织提供生长微环境。

附图说明

图1所示的是本发明一种引导骨再生的骨膜修补片的层结构示意图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。

实施例1：

一种引导骨再生的骨膜修补片，按如下述方法制备：

(1)组织前置处理：

取小肠粘膜下层组织材料(如可以是猪小肠粘膜下层SIS，或者牛小肠粘膜下层，均适应于本发明的实施例)分割成规定尺寸，剔除无用组织(例如淋巴组织)，用水清洗，然后将清洗后的小肠粘膜下层组织材料置于筛网等滤水装置上，静置五分钟以上，将水滤干。

(2)病毒灭活：

采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料，该过程可在不锈钢桶中进行，浓度过氧乙酸采用体积百分比0.1％，乙醇采用体积百分比5％，灭活时间2小时，溶液与小肠粘膜下层组织材料体积比为8：1，温度范围为20℃。

(3)清洗过程：

完成病毒灭活后在超声波清洗机中用PBS溶液清洗，然后用水清洗至检测电导率为10μS/cm以下终止。其中PBS溶液pH值为7.2-7.4，水为经过纯化处理的纯化水，超声频率40kHz，超声功率3000W。

(4)免疫原去除：

采用的免疫原去除液为含有质量百分比浓度0.1％的胰蛋白酶和浓度为0.4mmol/L的EDTA的pH值为7.2-7.4的PBS溶液，超声振荡处理30min，温度20℃，溶液与小肠粘膜下层组织材料体积比为20：1；多频超声包括至少两个超声频率，低频频率范围为25KHz，高频频率为65KHz，其中低频处理10min，高频处理15min，温度范围为20-35℃，超声波功率在5000W以上。

(5)清洗过程：完成免疫原去除后在超声波清洗机中用PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)清洗，然后用22℃的注射用水清洗至清洗前后检测注射用水电导率差值为1μS/cm以下终止，得到小肠粘膜下层基质材料。其中PBS溶液pH值为7.2-7.4。

(6)小肠粘膜下层基质浆料制备：低温破碎装置破碎由步骤(5)得到的小肠粘膜下层基质材料；低温破碎装置可用液氮冷冻破碎装置，将液氮与小肠粘膜下层材料送入液氮冷却破碎装置，小肠粘膜下层材料被液氮冷冻，利用破碎装置的高速旋转刀头进行破碎。向破碎后的所述基质材料加入醋酸溶液形成小肠粘膜下层基质材料浆料；其中所述醋酸溶液质量百分比浓度为0.3％，小肠粘膜下层基质材料与醋酸溶液质量比为1:60。形成小肠粘膜下层浆料。

(7)活性层材料制备：将由步骤(6)得到的浆料冷冻干燥后破碎并过筛，得到小肠粘膜下层基质颗粒；将质量百分比浓度为0.02％的骨形态发生蛋白(BMP)水溶液与所述颗粒混合，颗粒与骨形态发生蛋白溶液的质量比为1:1，温度20℃，混合后静置24小时备用，得到膏状混合物。

(8)干燥

将由步骤(5)处理得到的一层或多层小肠粘膜下层基质材料平铺于成型模具的带针底板上，覆盖盖板，所述盖板上压5-10公斤的压块，使得材料平整、水分从四周溢出并且材料上下层之间紧密接触。开启烘箱风机，预热至25-40℃，将小肠粘膜下层基质材料和模具放于烘箱中，时间10小时，将用于提供压力的盖板和重物板缓缓取下，再次放于烘箱中干燥，3小时后干燥完成。

(9)复合成型

在(8)步骤中烘干的小肠粘膜下层基质材料上覆盖步骤(7)中得到的膏状混合物，使用刮平工具将膏状混合物均匀平铺在烘干的小肠粘膜下层基质材料的上表面，厚度为1～3mm。

(10)真空冷冻干燥

将步骤(9)中得到的复合材料放置于真空冷冻干燥机中，关闭冻干室的门，打开循环泵约1min，开启压缩机对冻干箱致冷，将产品预冻至-45℃，保温2小时，开启真空泵，调节产品温度约-15℃升华，6小时后，调节产品温度0℃，保温2小时，调节产品温度25℃，保温4小时，真空冷冻干燥完成。真空干燥过程中冻干室气压为1-50Pa。

通过以上方法可以得到引导骨再生的骨膜修补片。修补片中包括经历先烘干再冷冻得到的小肠粘膜下层基质材料形成的致密层以及经历先破碎后冻干的小肠粘膜下层基质材料形成的疏松层。

实施例2

本发明制备方法还可以进一步包括以下步骤：

(11)包装

烘干的产品取出后，在模具上切割，采用双层特卫强包装袋包装，该过程需要无菌转运与操作。

(12)灭菌解析：产品采用环氧乙烷灭菌，灭菌条件：温度40℃，保温时间4h，湿度70％，浓度为500mg/L，灭菌时间6h；解析过程：通风的解析室中，温度控制在20℃之间，时间约14天。

由图1可以看到，引导骨再生的骨膜修补片包括两个部分：冻干的疏松部分1和烘干的致密部分2。冻干的疏松部分1包括小肠粘膜下层冻干颗粒，并包括骨形态发生蛋白；而致密部分2包括一层或多层小肠粘膜下层材料。

对本实施例所得材料进行化学成分检测，结果如下表1所示：

蛋白(％)	碳水化合物(％)	脂类(％)	水分％	灰分％	生长因子％
						75-85	15-25	<1	<5	<1	<2

对实施例中样品进行性能检测，检测项目与结果如下：

1)胶原蛋白亚型鉴别：采用免疫组化染色法检测I、III、IV型和VI型胶原蛋白，3μm厚连续切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。将切片移入电饭煲水浴中(内含0.01mol/L，pH6.0的枸橼酸三钠缓冲液)，温度保持在95-100℃，煮20min，进行抗原修复，取出后在室温下自然冷却。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，5min×3次。二步法免疫组化：分别滴加I、III、IV型和VI型胶原蛋白单克隆抗体一抗，浓度1：100，4℃冰箱过夜室温下孵育60min，PBS洗涤3次。滴加Envision反应液，室温下孵育30min。PBS洗涤3次。0.05％的3，3一二氨基联苯胺+0.03％的H₂O₂显色5-10min。流水洗，苏木精衬染。递增梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规树脂封固。结果表明，显微镜下观察四种染色标本皆可见棕黄染色，为阳性，表明样品中可检测到I、III、IV型和VI型胶原蛋白。

2)多糖物质含量检测：取10个样品，取样，浸提，用Biocolor硫酸软骨素检测试剂盒测试硫酸软骨素含量，样品中硫酸软骨素含量平均值为5627±243μg/g；用透明质酸检测试剂盒测试透明质酸(HA)含量，结果显示，样品的透明质酸(HA)保留量平均值为302±73μg/g。

3)活性因子种类鉴别：将样品裁剪成20×20mm尺寸的3个样品，PBS浸泡24h后,固定于4％多聚甲醛5-10min，用0.1mol/LPBS洗3次，每次5min，然后用玻璃细管转至涂有多聚赖氨酸的玻片上,进行免疫组织化学染色。LN抗体、FN抗体和整合素效价均为1∶100，0.5％胰酶消化3-5min暴露抗原，0.1％Triton X100作用10min增加抗体的穿透性。免疫组织化学染色显阳性，表面样品中包含纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、整合素及其配体的等物质。

4)生长因子残留量：对实施例中样品采用ELISA法检测样品中碱性生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)含量，并对免疫原去除前动物组织作为对照。结果发现碱性生长因子(bFGF)免疫原去除前后含量分别为2312±202ng/L、1142±124ng/L，保留生长因子45％以上；血管内皮生长因子(VEGF)含量免疫原去除前后含量分别为810±66ng/L、341±23ng/L，保留生长因子30％以上。

5)病毒检测：选择伪狂犬病毒为指示病毒，采用实时定量PCR法检测病毒的DNA拷贝数，检测3批样品。结果：病毒DNA拷贝数为0。

6)DNA残留：依据生物制剂残留DNA检测方法《中国药典》2015年版第四部，采用荧光染色法检测实施例所提供的样品DNA残留量，结果：实施例所提供的样品的DNA残留量平均为3.15±0.42ng/mg。

7)半乳糖苷酶(α-Gal)清除率：取动物源性生物材料Gal阳性参考品，Gal抗原阴性参考品各2mg，加裂解液1ml，裂解30-90min，配制成20、10、5、2.5、1.25、0.625μg的Gal标准曲线样品，测试免疫原去除前后的测试品各取50mg，加裂解液2ml，裂解30-90min；取裂解液与M86抗体反应后的上清液，加入96孔板，加二抗，加显色剂，采用ELISA方法450nm检测吸光度值，按标准曲线计算出样品的Gal值，免疫原去除处理前材料的Gal值为22.61±2.40×1014/mg，实施例中样品的Gal值为0.13±0.01×1014/mg，半乳糖苷酶(α-Gal)清除率在99.43％。

8)细菌内毒：按照GB/T 14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法》进行检测，共3批样品，结果：细菌内毒小于20EU/包装。

9)孔隙率：按照阿基米德原理，以乙醇作为浸提介质，计算样品致密基底层孔隙率为48.09±5.12％，疏松活性层孔隙率为85.23±6.89％

10)缝合抗拉强度：按照实施例制备样品，用3-0非吸收缝合线在修补片一端边缘2毫米处，将缝合线与修补片的另一端固定在拉力仪上，以20mm/min的速度进行拉伸，直到缝合点被撕裂，记录最大力值，结果显示，最大值可达13N。

11)抗张强度：按照实施例制备样品，将样品裁剪成2×5cm尺寸，在相对湿度为40％-60％，温度为22℃±2℃的条件下放置2h后立即进行试验。将试样两端固定在拉伸试验机的夹头上，以100mm/min的速度依次向外拉伸直到试样断裂，纵向试样和横向试样分别进行试验。最后的测定结果显示纵向抗张强度可达78N，横向抗张强度可达65N。

12)环氧乙烷残留量：按GB/T14233.1-2008《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》中9的规定的方法试验，结果：产品环氧乙烷残留量不超过10μg/包装。

13)重金属检查：铅、铬按GB/T 14233.1-2008中5.9.1《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》规定的方法试验，汞、砷按GB/T 14233.1-2008中5.9.3《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》规定的方法试验，产品检验液中铅、铬、汞、砷总重金属含量少于1μg/g。

对实施例中样品进行生物相容性实验，检测项目包括：热原、细胞毒性、迟发型超敏反应、皮内反应、急性全身毒性、Ames试验、小鼠淋巴瘤细胞突变试验、染色体畸变、植入、亚慢性毒性

1)热原

按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水。按GB/T 14233.2-2005规定的方法进行，产品无热原反应。

2)细胞毒性

按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，24±2hr制备试验液，浸提介质：含血清的MEM培养基。取试验液按照GB/T16886.5-2003中规定的试验方法进行试验，结果产品的细胞毒性反应不大于1级。

3)迟发型超敏反应

按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。按照GB/T 16886.10-2005第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验方法规定进行试验，结果产品无迟发型超敏反应。

4)皮内反应

按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。按照GB/T 16886.10-2005第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验试验方法规定进行试验，结果：试验样品与溶剂对照平均记分之差小于1.0。

5)急性全身毒性

按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。取试验液按照GB/T16886.11-2011规定的试验方法进行试验，结果：产品无急性全身毒性反应。

6)Ames试验

按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和DMSO。按GB/T16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的Ames试验为阴性。

7)小鼠淋巴瘤细胞突变试验

按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和DMSO。按GB/T16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的小鼠淋巴瘤细胞突变试验为阴性结果

8)染色体畸变试验

按质量比1：5浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和DMSO，按GB/T16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的染色体畸变试验为阴性

9)植入

按GB/T16886.6-1997规定的方法进行，结果：肌肉植入1周：样品周围可见嗜中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润，应无囊腔形成；肌肉植入4周：样品周围可见少量巨噬细胞和淋巴细胞，胶原纤维和纤维母细胞增生，有纤维囊腔形成；肌肉植入12周：样品周围可见少量淋巴细胞、胶原纤维、纤维囊腔较致密规整。

10)亚慢性毒性

按GB/T 16886.11规定的方法进行，结果：无亚慢性毒性反应。

对实施例中样品进行动物实验，观察骨膜生长、材料降解、引导骨生成效果。选择Beagle犬在前肢造桡骨骨膜缺损，并取皮质骨作骨缺损模型，覆盖补片，对侧腿为空白对照。动物实验过程：用速眠新注射液1.5ml+盐酸氯胺酮注射液0.19+阿托品0.5mg混合液按0.4ml/kg，行肌肉注射麻醉。麻醉成功后，将动物仰卧，用绷带将其双后腿及嘴巴系住固定，褪毛(注意避免损破皮肤)、碘伏消毒、铺无菌巾。于前臂中段掌侧取弧形切口，切开皮肤及皮下组织，暴露腿骨，造骨膜、骨缺损模型。实验组骨缺损处嵌插植入实施例中样品，对照组不植入任何材料，术中不予固定，无菌生理盐水冲洗后，逐层缝合。术后未予外固定，为预防感染，每只犬给予青霉素80万单位肌肉注射，1次/天，连续3天，分笼喂养。实验结果如下表2所示。HE病理切片结果表明骨膜形成血供良好，未发现明显的炎症反应。

表2本发明实施例样品使用效果

综上，本发明的引导骨再生的骨膜修补片，具有如下的优势：

(1)保留细胞外基质中胶原蛋白纤维的三维空间结构；

(2)双层结构，起到物理隔离与为骨膜再生提供微环境的双重作用，采用烘干与冻干相结合的方式，形成了上层疏松、下层致密的双层复合结构。疏松层为含有引导骨再生的活性层，孔隙率大，有利于细胞的长入，能提高组织的修复速度，致密层为免疫原去除基质基底层有隔离作用，有效保护被修复的组织；

(3)力学强度高，可控降解，与骨组织再生周期同步；

(4)促进组织血管化，降低引起感染、炎症或纤维包裹的风险；

(5)DNA残留能够达到10ng/mg以下，较同类产品低30-50ng/mg、半乳糖苷酶去除率较高，能够达到99％以上；

(6)保留细胞外基质中活性生长因子，添加骨形态蛋白(BMP)。

本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (17)

1.一种引导骨再生的骨膜修补片，其特征在于：该修补片包括高孔隙率的疏松活性层与低孔隙率的致密基底层，疏松活性层和致密基底层均包括胶原蛋白、多糖物质和活性因子，所述疏松活性层的所述活性因子包括骨形态发生蛋白，所述骨膜修补片植入体内能被降解吸收；

所述骨膜修补片采用动物小肠粘膜下层组织作为原料，步骤包括：

（1）原料的前置处理：取动物小肠粘膜下层组织材料进行前置处理；

（2）病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织进行病毒灭活；

（3）清洗过程：清洗小肠粘膜下层组织；

（4）免疫原去除：采用的免疫原去除液为溶有胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液，免疫原去除过程在多频超声环境下进行；

（5）清洗过程：进行清洗，清洗过程在超声波清洗机中进行，得到小肠粘膜下层基质材料；

（6）小肠粘膜下层基质浆料制备：使用低温破碎装置破碎由步骤（5）得到的小肠粘膜下层基质材料，向破碎后的所述基质材料加入醋酸溶液，形成小肠粘膜下层基质材料浆料；

（7）活性层材料制备：将由步骤（6）得到的浆料冷冻干燥后破碎并过筛，得到小肠粘膜下层基质颗粒，将骨形态发生蛋白溶液（BMP）与所述颗粒混合，形成膏状混合物；

（8）干燥：将步骤（5）中得到的小肠粘膜下层基质材料固定于成型模具上、并与成型模具一同放入烘箱中进行干燥；

（9）复合成型：在（8）步骤中烘干型的产品上覆盖步骤（7）得到的膏状混合物；

（10）真空冷冻干燥：将步骤（9）中得到的材料与模具置于真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥。

2.根据权利要求1所述的骨膜修补片，其特征在于，疏松活性层和致密基底层由哺乳动物的小肠粘膜下层组织材料制成。

3.根据权利要求2所述的骨膜修补片，其特征在于，疏松活性层和致密基底层由猪或牛的小肠粘膜下层组织材料制成。

4.根据权利要求1所述的引导骨再生的骨膜修补片，其特征在于：所述的疏松活性层为三维网状多孔结构，其孔隙率为75~90%；所述的致密基底层为三维网状多孔结构，其孔隙率为45~70%。

5.根据权利要求1所述的引导骨再生的骨膜修补片，其特征在于：所述的胶原蛋白为包含I型、III型、IV型和VI型胶原蛋白的组合物；所述的多糖物质为包含硫酸软骨素和透明质酸的组合物；所述的活性因子包含纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、整合素及骨形态发生蛋白。

6.根据权利要求1所述的引导骨再生的骨膜修补片，其特征在于：所述的植入体内能被降解吸收时间为3-6个月。

7.根据权利要求1所述的引导骨再生的骨膜修补片，其特征在于：所述该修补片的长1-20cm、宽1-10cm、厚度1-3mm。

8.一种引导骨再生的骨膜修补片的制备方法，其特征在于：采用动物小肠粘膜下层组织作为原料，步骤包括：

（1）原料的前置处理：取动物小肠粘膜下层组织材料进行前置处理；

（2）病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织进行病毒灭活；

（3）清洗过程：清洗小肠粘膜下层组织；

（4）免疫原去除：采用的免疫原去除液为溶有胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液，免疫原去除过程在多频超声环境下进行；

（5）清洗过程：进行清洗，清洗过程在超声波清洗机中进行，得到小肠粘膜下层基质材料；

（6）小肠粘膜下层基质浆料制备：使用低温破碎装置破碎由步骤（5）得到的小肠粘膜下层基质材料，向破碎后的所述基质材料加入醋酸溶液，形成小肠粘膜下层基质材料浆料；

（7）活性层材料制备：将由步骤（6）得到的浆料冷冻干燥后破碎并过筛，得到小肠粘膜下层基质颗粒，将骨形态发生蛋白溶液（BMP）与所述颗粒混合，形成膏状混合物；

（8）干燥：将步骤（5）中得到的小肠粘膜下层基质材料固定于成型模具上、并与成型模具一同放入烘箱中进行干燥；

（9）复合成型：在（8）步骤中烘干型的产品上覆盖步骤（7）得到的膏状混合物；

（10）真空冷冻干燥：将步骤（9）中得到的材料与模具置于真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥。

9.根据权利要求8所述的引导骨再生的骨膜修补片的制备方法，其特征在于：

所述步骤（2）的过氧乙酸-乙醇溶液，其中过氧乙酸的体积百分比浓度为0.1%-5%、乙醇的体积百分比浓度为5%-40%，过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为3-20︰1，灭活时间2-4小时，温度范围为10-40℃；

所述步骤（3）中清洗过程为：在超声波清洗机中用PBS溶液清洗，然后用水清洗至检测电导率为10μS/cm以下终止，得到小肠粘膜下层基质材料，其中PBS溶液pH值范围为6-8，所使用的水为经过纯化处理的纯化水；

所述步骤（4）中的免疫原去除液包括：溶解有胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液；所述免疫原去除液中胰蛋白酶质量百分比浓度为0.01-0.2%，EDTA的浓度0.1-1mmol/L，免疫原去除液的pH值为7.0-8.0，所述免疫原去除液与小肠粘膜下层组织材料体积比为20-40︰1；所述步骤（4）中多频超声至少包括两个超声频率，低频频率范围为20-40KHz，高频频率为60-90KHz，其中低频处理5-40min，高频处理5-40min，温度范围为20-35℃，超声功率5000W以上；

步骤（5）中清洗过程为：在超声波清洗机中用PBS溶液清洗，然后用降温的注射用水清洗至检测清洗前后的注射用水电导率差为1μS/cm以下终止，得到小肠粘膜下层基质材料，其中PBS溶液pH值范围为6-8；

所述的步骤（6）小肠粘膜下层基质浆料制备为：使用低温破碎装置破碎由步骤（5）处理得到的小肠粘膜下层基质材料，向破碎后的所述基质材料加入醋酸溶液形成小肠粘膜下层基质材料浆料；其中所述醋酸溶液的质量百分比浓度为0.1%-0.8%，浆料中的小肠粘膜下层基质材料与醋酸溶液质量比为1:25-1:500；

所述的步骤（7）活性层制备为：向小肠粘膜下层基质颗粒中加骨形态发生蛋白溶液，骨形态发生蛋白溶液的质量百分比浓度为0.01-0.1%，小肠粘膜下层基质颗粒与骨形态发生蛋白溶液的质量比为1-10:2；

所述的步骤（10）真空冷冻干燥为：将由步骤（9）得到的复合材料放置于真空冷冻干燥机中，先预冻至-45℃，保温1-2小时；然后开启真空泵，调节温度至-15℃，保温5-7小时，再调节温度至0℃，保温2小时，最后调节温度至25℃，保温4小时，冷冻干燥装置的腔室内的压强为1-50Pa，完成真空冷冻干燥。

10.据权利要求9所述的引导骨再生的骨膜修补片的制备方法，其特征在于：所述的步骤（4）免疫原去除液中胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.02-0.05%，EDTA的浓度为0.4-0.8mmol/L，免疫原去除液的pH值为7.2-7.5；所述的步骤（8）干燥温度25-40℃后，时间为8-16小时；所述的步骤（6）醋酸溶液的质量百分比浓度为0.2%-0.3%，浆料中的小肠粘膜下层基质材料与醋酸溶液质量比为1:50-1:100。

11.一种根据权利要求1-7任一项所述的引导骨再生的骨膜修补片在制备骨膜修补材料中的用途，其特征在于：所述骨膜修补材料用于填充拔牙窝、牙槽嵴的扩展与重建、牙槽嵴骨增量术、上颌窦提升术、窦底抬高的骨膜缺损修复，隔离周围组织，引导骨组织再生。

12.一种根据权利要求1-7任一项所述的引导骨再生的骨膜修补片在制备骨膜修补材料中的用途，其特征在于：所述骨膜修补材料用于牙周骨缺损充填的骨膜缺损修复，隔离周围组织，引导骨组织再生。

13.一种根据权利要求1-7任一项所述的引导骨再生的骨膜修补片在制备骨膜修补材料中的用途，其特征在于：所述骨膜修补材料用于水平向骨增量、垂直向骨增量的骨膜缺损修复，隔离周围组织，引导骨组织再生。

14.一种根据权利要求1-7任一项所述的引导骨再生的骨膜修补片在制备骨膜修补材料中的用途，其特征在于：所述骨膜修补材料用于脊柱融合、骨肿瘤、关节融合造成骨膜缺损时的骨膜缺损修复，隔离周围组织，引导骨组织再生。

15.一种根据权利要求1-7任一项所述的引导骨再生的骨膜修补片在制备骨膜修补材料中的用途，其特征在于：所述骨膜修补材料用于各类骨折造成骨膜缺损时的骨膜缺损修复，隔离周围组织，引导骨组织再生。

16.一种根据权利要求1-7任一项所述的引导骨再生的骨膜修补片在制备骨膜修补材料中的用途，其特征在于：所述骨膜修补材料用于骨缺损造成骨膜缺损时的骨膜缺损修复，隔离周围组织，引导骨组织再生。

17.一种根据权利要求1-7任一项所述的引导骨再生的骨膜修补片在制备骨膜修补材料中的用途，其特征在于：所述骨膜修补材料用于骨不连造成骨膜缺损时的骨膜缺损修复，隔离周围组织，引导骨组织再生。

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