CN115006597B - 一种口腔修复膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种口腔修复膜，包括：复合细胞外基质层；设置于所述复合细胞外基质层上的胶原蛋白海绵层；所述复合细胞外基质层由2～4层细胞外基质层复合得到。本发明口腔修复膜包含致密层和疏松层，致密层孔径小于5μm，能阻止绝大部分细胞长入，起到隔离软组织长入骨缺损区的作用；疏松层孔径大于20μm，吸渗能力强，有利于骨细胞在骨缺损区的生长。多层膜状细胞外基质经真空复合后，作为口腔修复膜的致密层；紧密贴附在致密层的胶原蛋白海绵层作为口腔修复膜的疏松层。本文提供的口腔修复膜致密层和疏松层明显，隔离效果好，力学性能良好。

Description

一种口腔修复膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及组织修复材料技术领域，尤其是涉及一种口腔修复膜及其制备方法。
背景技术
近些年来，牙周组织再生技术、骨增量技术、牙种植体手术应用日益广泛，这些技术都较多的用到口腔修复膜。针对骨量不足的种植体手术，需要同时用到骨粉和口腔修复膜，口腔修复膜放在骨粉和口腔软组织之间；其中口腔修复膜的疏松面靠近骨缺损区，用来固定骨粉，同时多孔的疏松面能较好的吸收渗血，有利于骨组织在骨缺损区的生长；口腔修复膜的致密面靠近软组织，能有效阻挡生长速度较快的结缔组织细胞和上皮细胞进入骨缺损区，为骨再生提供生长空间。
细胞外基质是一类优秀的生物材料，通常由羊膜，猪、牛、羊等哺乳动物的小肠粘膜下层、皮肤、心包、膀胱经过脱细胞、脱脂、病毒灭活处理后得到，主要成为为胶原蛋白，含有少量的糖蛋白、糖胺聚糖、生长因子等活性物质，生物安全性好，生物活性高、具有一定的三维孔结构。
纯化胶原蛋白来源包括猪皮、牛皮、猪骨、牛骨、牛跟腱、鱼皮等。胶原蛋白海绵由纯化后的胶原蛋白在一定条件下冷冻干燥而成，孔结构较好，吸渗液能力强。
除卵子细胞外，人体细胞的直径一般只有10μm左右，最小的血小板直径为2微米。除成熟的红血球和血小板外，所有细胞都至少有一个细胞核，是调节细胞生命活动、控制分裂、分化，遗传，变异的控制中心。
口腔修复膜种类繁多，传统的合金材料及高分子材料来源的口腔修复膜由于其生物相溶性差，不可降解等劣势被逐渐淘汰；胶原类口腔修复膜占据主要市场，但市场上已有的同类型产品，或多或少存在一些缺陷或优势不明显：交联后的胶原不易降解，影响创面的愈合；致密面不能阻止软组织侵入骨缺损区，达不到屏蔽膜的预期要求；疏松面吸渗性不好，不能有效锁住渗血，诱导骨再生效果不好；口腔膜手感僵硬，贴附型不好，导致手术操作不方便。
因此，提供一种吸渗能力强、力学性能好的口腔修复膜是非常必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种口腔修复膜，本发明提供的口腔修复膜致密面疏松面明显、贴附性能好、吸渗能力强，力学性能好。
本发明提供了一种口腔修复膜，包括：
复合细胞外基质层；
设置于所述复合细胞外基质层上的胶原蛋白海绵层；
所述复合细胞外基质层由2～4层细胞外基质复合得到。
优选的，所述复合细胞外基质层的厚度为0.2～0.4mm；孔径为5μm以下。
优选的，所述胶原蛋白海绵层的厚度为0.2～0.4mm；孔径20微米至200微米。
本发明提供了一种口腔修复膜的制备方法，包括：
A)将细胞外基质真空复合，得到复合细胞外基质层；
B)将胶原蛋白凝胶涂覆在所述复合细胞外基质层上，经固定成型，冷冻干燥得到口腔修复膜；
所述胶原蛋白凝胶为：由粉碎后的细胞外基质粉或纯化后胶原蛋白粉制得。
优选的，所述细胞外基质的数量为2～4层。
优选的，步骤A)具体为：
将第一层细胞外基质至于模具上，纯化水湿润，得到第一层细胞外基质层；
将第二层细胞外基质叠加铺于第一层细胞外基质层上；重复上述操作，叠加到需要的层数；
采用医用聚丙烯网覆盖在最后一层细胞外基质层上，然后压上不锈钢网孔板，得到复合层；
将复合层真空复合，得到复合细胞外基质层。
优选的，所述真空复合的真空度为0～50pa；真空复合的时间为20min～24h。
优选的，所述胶原蛋白凝胶制备方法具体为：
将细胞外基质粉与盐酸、胃蛋白酶混合搅拌，得到胶原蛋白溶液；
将胶原蛋白溶液与氢氧化钠、PBS混合，搅拌，去除气泡，静置，得到胶原蛋白凝胶。
优选的，由膜状组织制得基质层；
基质层采用0.05％～0.5％的PAA溶液浸泡震荡15min～3h，而后依次采用PBS溶液、纯化水清洗；
采用0.05％～0.2％的胰酶、0.05％～0.2％的SDS混合溶液继续震荡清洗1～4h，而后依次采用PBS溶液、纯化水清洗，得到未脱脂的细胞外基质；
将未脱脂的细胞外基质冻干、浸泡脱脂、风干、清洗、二次冻干得到细胞外基质。
优选的，所述胶原蛋白粉的来源为松质骨、猪皮、鱼皮或牛跟腱。
与现有技术相比，本发明提供了一种口腔修复膜，包括：复合细胞外基质层；设置于所述复合细胞外基质层上的胶原蛋白海绵层；所述复合细胞外基质层由2～4层细胞外基质复合得到。本发明口腔修复膜包含致密层和疏松层，致密层孔径小于5μm，能阻止绝大部分细胞长入，起到隔离软组织长入骨缺损区的作用；疏松层孔径大于20μm，吸渗能力强，有利于骨细胞在骨缺损区的生长。多层膜状细胞外基质经真空复合后，作为口腔修复膜的致密层。紧密贴附在致密层的胶原蛋白海绵层作为口腔修复膜的疏松层。本发明提供的口腔修复膜致密层和疏松层明显，隔离效果好，力学性能良好。
附图说明
图1为本发明的口腔修复膜示意图；
图2为实施例1的细胞外基质层的天然胶原蛋白结构电镜扫描图；
图3为实施例1的细胞外基质层经真空复合后的胶原蛋白结构电镜扫描图；
图4实施例1的胶原蛋白海绵层的电镜扫描图；
图5为实施例1的细胞外基质层(即致密层)孔径与真空度和真空复合时间的关系图；
图6为实施例1，胶原蛋白海绵层(即疏松层)孔径与胶原蛋白凝胶浓度的关系图。
具体实施方式
本发明提供了一种口腔修复膜及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种口腔修复膜，包括：
复合细胞外基质层；
设置于所述复合细胞外基质层上的胶原蛋白海绵层；
所述复合细胞外基质层由2～4层细胞外基质层复合得到。
本发明提供的口腔修复膜包括复合细胞外基质层。
本发明提供的复合细胞外基质层由2～4层细胞外基质复合得到。具体可以为2层细胞外基质复合；3层细胞外基质复合或者4层细胞外基质复合。
所述复合优选为真空复合。
本发明所述真空复合的真空度优选为0～50pa；更优选为2～40pa；真空复合的时间优选为20min～24h；更优选为20min～10h；最优选为20min～2h。
本发明所述复合细胞外基质层的厚度为0.2～0.4mm；孔径为5μm以下。
本发明所述复合细胞外基质层作为口腔修复膜的致密层。
本发明提供的口腔修复膜包括设置于所述复合细胞外基质层上的胶原蛋白海绵层。
本发明所述胶原蛋白海绵层是由胶原蛋白凝胶涂覆得到。
所述胶原蛋白凝胶优选为：由粉碎后的细胞外基质粉或纯化后胶原蛋白粉制得。
本发明所述胶原蛋白粉的来源优选为松质骨、猪皮、鱼皮或牛跟腱。
本发明优选所述胶原蛋白海绵层的厚度为0.2～0.4mm；孔径为几十微米至几百微米。
本发明疏松层为胶原蛋白海绵层。
本发明所述细胞外基质层通过真空复合而成，复合细胞外基质处于半湿状态，一面光滑，一面有聚丙烯网片留下的网格结构，胶原蛋白凝胶均匀涂抹在网格结构的一面，能增加胶原蛋白凝胶与细胞外基质复合层的粘连度。
上述复合层经低温固定成型，冷冻干燥后灭菌得到口腔修复膜。
本发明复合细胞外基质层，由于真空施压的作用，各层细胞外基质之间紧密链接在一起，无分层现象。
本发明提供了一种口腔修复膜的制备方法，包括：
A)将细胞外基质真空复合，得到复合细胞外基质层；
B)将胶原蛋白凝胶涂覆在所述复合细胞外基质层上，经固定成型，冷冻干燥得到口腔修复膜；
所述胶原蛋白凝胶为：由粉碎后的细胞外基质粉或纯化后胶原蛋白粉制得。
本发明提供的口腔修复膜的制备方法首先将细胞外基质真空复合，得到复合细胞外基质层。
本发明所述细胞外基质的数量为2～4层。
按照本发明，步骤A)具体为：
将第一层细胞外基质置于于模具上，纯化水充分湿润；
将第二层细胞外基质叠加铺于第一层细胞外基质层上；重复上述操作，叠加到需要的层数；
采用医用聚丙烯网覆盖在最后一层细胞外基质层上，然后压上不锈钢网孔板，得到复合层；
将复合层真空复合，得到复合细胞外基质层。
本发明首先将冻干后的细胞外基质叠放在一起，用模切机裁剪成统一尺寸大小。
在不锈钢模具上，将第一层细胞外基质至于模具上，纯化水充分湿润；第二层细胞外基质采取完全叠加的方式置于在第一层细胞外基质上，用纯化水完全湿润，以此类推，叠加到需要的层数。最后一层细胞外基质上用医用聚丙烯网覆盖住，然后压上带密集细孔的不锈钢网孔板，得到复合层。
将复合层真空复合，得到复合细胞外基质层。即为：将上述叠放在一起的不锈钢板、细胞外基质、聚丙烯网一起放入带有吸嘴的软质可密封塑料袋中，吸嘴连上真空泵，开启真空泵，持续抽气，维持密封袋真空度在0～50pa之间，20min～24h后取下得到复合细胞外基质。本发明所述真空复合的真空度优选为0～50pa；更优选为2～40pa；真空复合的时间优选为20min～24h；更优选为20min～10h；最优选为20min～2h。
每层细胞外基质的上皮细胞面为光滑面，基质面为粗糙面，叠加置于时，光滑面向下，粗糙面向上。
按照本发明，所述细胞外基质的制备方法具体为：
由膜状组织制得基质层。新鲜膜状组织去除多余部分留下基质层；所述新鲜膜状组织包括但不限于新鲜猪小肠、新鲜剖腹产胎盘组织。具体的：新鲜剖腹产胎盘组织去除多余部分留下上皮细胞层和基质层。
基质层采用0.05％～0.5％的PAA溶液浸泡震荡15min～3h；优选的，基质层采用0.1％～0.4％的PAA溶液浸泡震荡20min～2h。
而后依次采用PBS溶液、纯化水清洗；用PBS溶液、纯化水清洗残留PAA溶液。
采用0.05％～0.2％的胰酶、0.05％～0.2％的SDS混合溶液继续震荡清洗1～4h，优选的，采用0.05％～0.1％的胰酶、0.05％～0.1％的SDS混合溶液继续震荡清洗1～3h，而后依次采用PBS溶液、纯化水清洗，得到清洗后的细胞外基质；所述清洗为清洗上一步残液。
将清洗后的细胞外基质冻干、浸泡脱脂、风干、清洗、二次冻干得到细胞外基质。
将细胞外基质用冷冻干燥机进行冻干。冻干后的细胞外基质用有机脱脂试剂浸泡脱脂，间隔4小时更换一次脱脂试剂，共脱脂4～16小时。脱脂试剂可以是氯仿、乙醚、异丙醇中的一种或几种。脱脂后的细胞外基质在通风厨中自然风干；风干后的细胞外基质用纯化水多次清洗后二次冻干，得到细胞外基质。本发明所述冻干参数具体为：(1)负20℃预冻1-4小时；(2)负50℃冷冻干燥4-8小时(3)负40℃升温干燥4-8小时(4)升温至20℃保存1-4小时
细胞外基质是一类优秀的生物材料，通常由羊膜，猪、牛、羊等哺乳动物的小肠粘膜下层、皮肤、心包、膀胱经过脱细胞、脱脂、病毒灭活而成，主要成为为胶原蛋白，含有少量的糖蛋白、糖胺聚糖、生长因子等活性物质，生物安全性好，生物活性高、具有一定的三维孔结构。
本发明所述细胞外基质可以是脱细胞羊膜，猪、牛的脱细胞小肠黏膜下层、脱细胞膀胱、脱细胞心包、脱细胞腹膜。
本发明经脱细胞处理后的细胞外基质主要为胶原蛋白结构，孔结构较好，冻干后的孔径分布范围较广，其电镜扫描分析，其孔径分布在几十纳米到几百微米之间，孔隙率达到83％。
细胞外基质经过真空复合层压后，结构变得致密，大部分孔结构封闭，平均孔径小于5微米。
将胶原蛋白凝胶涂覆在所述复合细胞外基质层上，经固定成型，冷冻干燥得到口腔修复膜。
本发明所述胶原蛋白凝胶为：由粉碎后的细胞外基质粉或纯化后胶原蛋白粉制得。所述胶原蛋白粉的来源为松质骨、猪皮、鱼皮或牛跟腱。
本发明所述胶原蛋白凝胶制备方法优选具体为：
将细胞外基质粉与盐酸、胃蛋白酶混合搅拌，得到胶原蛋白溶液。
即为：将质量为m1g的细胞外基质粉末加入到V1ml的0.01N盐酸溶液中，加入适量胃蛋白酶，室温下搅拌24～72h，得到胶原蛋白溶液。
将胶原蛋白溶液与氢氧化钠、PBS混合，搅拌，去除气泡，静置，得到胶原蛋白凝胶。
依次加入0.1V1的0.1N氢氧化钠溶液，V1/9的10倍PBS溶液。加入1倍PBS溶液调节PH致中性，加超纯水定容到体积为V，搅拌均匀，吸走气泡，将混合液密封37℃静置0.5～1h得到质量分数为m1/V的胶原蛋白凝胶。
本发明所述胶原蛋白凝胶，其质量浓度控制在2％～20％之间。
本发明胶原蛋白凝胶的厚度通过凝胶体积和细胞外基质复合层面积控制,厚度D＝V/S.
本发明将胶原蛋白凝胶均匀涂布在致密层上，用不锈钢模具固定后进行冷冻干燥，进行适当裁剪后得到口腔修复膜。
本发明低温固定成型可通过将涂抹有胶原蛋白凝胶的细胞外基质复合层放入模具中，置入超低温冰箱中1-3h，确保半湿状态下的细胞外基质层和胶原蛋白凝胶层固化。固化好的样品连同模具一起快速放入已经预冻好的冻干机中进行冷冻干燥。冻干好的样品，从模具中取出，细胞外基质层的厚度为0.1～0.3mm，胶原海绵层厚度在0.2～0.4mm，口腔修复膜的厚度为0.3～0.7mm。
本发明提供了一种口腔修复膜，包括：复合细胞外基质层；设置于所述复合细胞外基质层上的胶原蛋白海绵层；所述复合细胞外基质层由2～4层细胞外基质层复合得到。本发明口腔修复膜包含致密层和疏松层，致密层孔径小于5μm，能阻止绝大部分细胞长入，起到隔离软组织长入骨缺损区的作用；疏松层孔径大于20μm，吸渗能力强，有利于骨细胞在骨缺损区的生长。多层膜状细胞外基质经真空复合后，作为口腔修复膜的致密层。本发明提供的口腔修复膜力学性能良好。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种口腔修复膜及其制备方法进行详细描述。
实施例1
1.脱细胞猪小肠粘膜下层基质制备
(1)新鲜猪小肠笔直剖开，去除多余部分留下基质层，剪成适当长度，用0.1％的PAA溶液浸泡震荡60min。
(2)换液，用PBS溶液、纯化水清洗残留PAA溶液。
(3)0.05％的胰酶、0.05％的SDS混合溶液高速震荡清洗1h。
(4)换液，用PBS溶液、纯化水清洗上一步残夜。
(5)上一步的细胞外基质用冷冻干燥机进行冻干。
(6)冻干后的细胞外基质用氯仿浸泡脱脂，间隔4小时更换一次脱脂试剂，脱脂16小时。
(7)上一步的脱脂细胞外基质在通风橱中自然风干
(8)风干后的细胞外基质用纯化水多次清洗后二次冻干，得到脱细胞猪小肠粘膜下层基质
2、胶原蛋白凝胶制备：
(1)将质量为1000mg的脱细胞猪小肠粘膜下层基质粉末加入到90ml的0.01N盐酸溶液中，加入100mg胃蛋白酶，室温下搅拌24-72h，得到胶原蛋白溶液。
(2)依次加入9ml的0.1N氢氧化钠溶液，10ml的10倍PBS溶液
(3)加入1倍PBS溶液调节PH致中性，加超纯水定容到体积为200ml，搅拌均匀，小心吸走气泡，将混合液密封植入37℃静置0.5-1h得到质量分数为5％的胶原蛋白凝胶。
3、口腔修复膜致密层的制备
(1)冻干后脱细胞猪小肠下层基质，用模切机裁剪成50mm*100mm大小。
(2)在不锈钢模具上，置于第一层脱细胞猪小肠下层基质，第二层脱细胞猪小肠下层基质采取完全叠加的方式置于在第一层上，用纯化水完全湿润
(3)用网孔大小为5mm*5mm的医用聚丙烯网覆盖住，然后压上带密集细孔的不锈钢网孔板。
(4)将上述叠放在一起的不锈钢板、脱细胞猪小肠下层基质、聚丙烯网一起放入带有吸嘴的软质可密封塑料袋中，吸嘴连上真空泵，开启真空泵，持续抽气，维持密封袋真空度在0-50pa之间，20min后取下得到口腔修复膜的致密层。
4、口腔修复膜的制备
将15ml 2中胶原蛋白凝胶均匀涂布在致密层上，用不锈钢模具固定后进行冷冻干燥，进行适当裁剪后得到口腔修复膜，其中致密层厚约0.2mm，疏松层厚约0.3mm。
本案例制得的口腔修复膜做以下测试
1.拉伸强度：制成宽度10mm的试样，在相对湿度为40％—60％，温度为22℃±2℃的条件下放置2h。将试样的两端固定在拉力机的夹具上，两夹具间距30mm，以100mm/min稳定的速度拉伸，直到断裂，测得拉伸强度为14N/cm
2.断裂伸长率：制成宽度10mm的试样，在相对湿度为40％—60％，温度为22℃±2℃的条件下放置2h。将试样的两端固定在拉力机的夹具上，两夹具间距30mm，以100mm/min稳定的速度拉伸，直到断裂，测得断裂伸长率为53％
3.所述口腔修复膜用纯化水湿润后，缝合线距一端边缘3mm缝合，拉力机以100mm/min速度啦缝线和样品的另一端，其平均撕裂力为3.2N.
4.所述口腔修复膜纯化水浸提24h，测定浸提液PH为6.7左右。
5.所述口腔修复膜，按照药典2020版中‘重金属检查法’测定，重金属含量小于10mg/kg。
6.所述口腔修复膜，按照药典2020版“氮测定法第三法定氮仪法”测定，总蛋白含量约为96％.
7.所述口腔修复膜，按照YY/T 1511-2017中附录B方法测定，羟脯氨酸含量为约10％。
8.所述口腔修复膜，按照YY 0954-2015附录B中方法测定，杂蛋白含量约为1％.
9.所述口腔修复膜,按GB 5009.6-2016规定的方法测定，脂肪含量为1.2％。
10.所述口腔修复膜，按YY/T 0606.25-2014规定的方法测定，DNA残留量为37ng/mg。
11.所述口腔修复膜，进行组织切片并进行HE染，用显微镜观察，无细胞核残留。
12.所述口腔修复膜，进行扫描电镜分析，致密面平均孔径小于5μm，疏松层平均孔径大于20μm。
结果见图2和图3所示，其中图2为实施例1的细胞外基质层的天然胶原蛋白结构电镜扫描图；图3为实施例1的细胞外基质层经真空复合后的胶原蛋白结构电镜扫描图；由图2和图3可以看出，真空复合后，细胞外基质层的胶原蛋白孔结构变得致密。图4实施例1的胶原蛋白海绵层的电镜扫描图；可以看出孔结构疏松。图5为实施例1的细胞外基质层(即致密层)孔径与真空度和真空复合时间的关系图；可以看出一定范围内，真空度越低，真空复合时间越长，致密层孔径越小。图6为实施例1，胶原蛋白海绵层(即疏松层)孔径与胶原蛋白凝胶浓度的关系图。由图可以看出可以看出一定范围内，胶原蛋白凝胶浓度越大，胶原蛋白海绵的孔径越小。实施例2
1.脱细胞生物羊膜基质制备
(1)新鲜剖腹产胎盘组织，去除多余部分留下上皮细胞层和基质层，用0.15％的PAA溶液浸泡震荡60min。
(2)换液，用PBS溶液、纯化水清洗残留PAA溶液。
(3)0.15％的胰酶、0.1％的SDS混合溶液高速震荡清洗1h。
(4)换液，用PBS溶液、纯化水清洗上一步残夜。
(5)上一步的细胞外基质用冷冻干燥机进行冻干。
(6)冻干后的细胞外基质用乙醚浸泡脱脂，间隔4小时更换一次脱脂试剂，脱脂24小时。
(7)上一步的脱脂细胞外基质在通风橱中自然风干
(8)风干后的细胞外基质用纯化水多次清洗后二次冻干，得到脱细胞生物羊膜基质
2.胶原蛋白凝胶制备：
(1)将质量为2000mg的脱细胞生物羊膜基质粉碎后加入到90ml的0.01N盐酸溶液中，加入200mg胃蛋白酶，室温下搅拌24-72h，得到胶原蛋白溶液。
(2)依次加入9ml的0.1N氢氧化钠溶液，10ml的10倍PBS溶液
(3)加入1倍PBS溶液调节PH致中性，加超纯水定容到体积为200ml，搅拌均匀，小心吸走气泡，将混合液密封植入37℃静置0.5-1h得到质量分数为10％的胶原蛋白凝胶。
3.口腔修复膜致密层的制备
(1)冻干后脱细胞生物羊膜基质，用模切机裁剪成50mm*100mm大小。
(2)在不锈钢模具上，置于第一层脱细胞生物羊膜基质，第二层脱细胞生物羊膜基质采取完全叠加的方式置于在第一层上，用纯化水完全湿润，依次类推，总共4层脱细胞生物羊膜基质。
(3)用网孔大小为5mm*5mm的医用聚丙烯网覆盖住，然后压上带密集细孔的不锈钢网孔板。
(4)将上述叠放在一起的不锈钢板、脱细胞生物羊膜基质、聚丙烯网一起放入带有吸嘴的软质可密封塑料袋中，吸嘴连上真空泵，开启真空泵，持续抽气，维持密封袋真空度在0-50pa之间，60min后取下得到口腔修复膜的致密层。
4.口腔修复膜的制备
将10ml 2中胶原蛋白凝胶均匀涂布在致密层上，用不锈钢模具固定后进行冷冻干燥，进行适当裁剪后得到口腔修复膜，其中致密层厚约0.4mm，疏松层厚约0.2mm。
本案例制得的口腔修复膜与案例1的区别在于：致密层的细胞外基质层为生物羊膜；胶原蛋白凝胶的原材料为生物羊膜来源；脱细胞条件有所改变；致密层真空复合时间更长，层数更多；胶原蛋白凝胶浓度升高；胶原海绵层厚度降低；
本案例口腔修复膜做以下测试：
1.拉伸强度：制成宽度10mm的试样，在相对湿度为40％—60％，温度为22℃±2℃的条件下放置2h。将试样的两端固定在拉力机的夹具上，两夹具间距30mm，以100mm/min稳定的速度拉伸，直到断裂，测得拉伸强度为18N/cm
2.断裂伸长率：制成宽度10mm的试样，在相对湿度为40％—60％，温度为22℃±2℃的条件下放置2h。将试样的两端固定在拉力机的夹具上，两夹具间距30mm，以100mm/min稳定的速度拉伸，直到断裂，测得断裂伸长率为65％
3.所述口腔修复膜用纯化水湿润后，缝合线距一端边缘3mm缝合，拉力机以100mm/min速度啦缝线和样品的另一端，其平均撕裂力为4.2N.
4.所述口腔修复膜纯化水浸提24h，测定浸提液PH为6.7左右。
5.所述口腔修复膜，按照药典2020版中‘重金属检查法’测定，重金属含量小于10mg/kg。
6.所述口腔修复膜，按照药典2020版“氮测定法第三法定氮仪法”测定，总蛋白含量约为96％.
7.所述口腔修复膜，按照YY/T 1511-2017中附录B方法测定，羟脯氨酸含量为约10％。
8.所述口腔修复膜，按照YY 0954-2015附录B中方法测定，杂蛋白含量约为1％.
9.所述口腔修复膜,按GB 5009.6-2016规定的方法测定，脂肪含量为0.8％。
10.所述口腔修复膜，按YY/T 0606.25-2014规定的方法测定，DNA残留量为25ng/mg。
11.所述口腔修复膜，进行组织切片并进行HE染，用显微镜观察，无细胞核残留。
12.所述口腔修复膜，进行扫描电镜分析，致密面平均孔径小于3μm，疏松层平均孔径大于20μm。
实施例3
1.脱细胞生物羊膜基质制备
(1)新鲜剖腹产胎盘组织，去除多余部分留下上皮细胞层和基质层，用0.3％的PAA溶液浸泡震荡120min。
(2)换液，用PBS溶液、纯化水清洗残留PAA溶液。
(3)0.05％的胰酶、0.2％的SDS混合溶液高速震荡清洗2h。
(4)换液，用PBS溶液、纯化水清洗上一步残夜。
(5)上一步的细胞外基质用冷冻干燥机进行冻干。
(6)冻干后的细胞外基质用乙醚浸泡脱脂，间隔4小时更换一次脱脂试剂，脱脂32小时。
(7)上一步的脱脂细胞外基质在通风橱中自然风干
(8)风干后的细胞外基质用纯化水多次清洗后二次冻干，得到脱细胞生物羊膜基质
2.胶原蛋白凝胶制备：
(4)将质量为2000mg的脱细胞猪小肠粘膜下层基质粉碎后加入到90ml的0.01N盐酸溶液中，加入200mg胃蛋白酶，室温下搅拌24-72h，得到胶原蛋白溶液。
(5)依次加入9ml的0.1N氢氧化钠溶液，10ml的10倍PBS溶液
(6)加入1倍PBS溶液调节PH致中性，加超纯水定容到体积为200ml，搅拌均匀，小心吸走气泡，将混合液密封植入37℃静置0.5-1h得到质量分数为10％的胶原蛋白凝胶。
3.口腔修复膜致密层的制备
(5)冻干后脱细胞生物羊膜基质，用模切机裁剪成50mm*100mm大小。
(6)在不锈钢模具上，置于第一层脱细胞生物羊膜基质，第二层脱细胞生物羊膜基质采取完全叠加的方式置于在第一层上，用纯化水完全湿润，依次类推，总共4层脱细胞生物羊膜基质。
(7)用网孔大小为5mm*5mm的医用聚丙烯网覆盖住，然后压上带密集细孔的不锈钢网孔板。
(8)将上述叠放在一起的不锈钢板、脱细胞生物羊膜基质、聚丙烯网一起放入带有吸嘴的软质可密封塑料袋中，吸嘴连上真空泵，开启真空泵，持续抽气，维持密封袋真空度在0-50pa之间，120min后取下得到口腔修复膜的致密层。
4.口腔修复膜的制备
将10ml 2中胶原蛋白凝胶均匀涂布在致密层上，用不锈钢模具固定后进行冷冻干燥，进行适当裁剪后得到口腔修复膜，其中致密层厚约0.4mm，疏松层厚约0.2mm。
本案例制得的口腔修复膜与案例2的区别在于：胶原蛋白凝胶的原材料为猪小肠粘膜下层来源；脱细胞条件有所改变；致密层真空复合时间更长；
本案例口腔修复膜做以下测试：
1.拉伸强度：制成宽度10mm的试样，在相对湿度为40％—60％，温度为22℃±2℃的条件下放置2h。将试样的两端固定在拉力机的夹具上，两夹具间距30mm，以100mm/min稳定的速度拉伸，直到断裂，测得拉伸强度为18N/cm
2.断裂伸长率：制成宽度10mm的试样，在相对湿度为40％—60％，温度为22℃±2℃的条件下放置2h。将试样的两端固定在拉力机的夹具上，两夹具间距30mm，以100mm/min稳定的速度拉伸，直到断裂，测得断裂伸长率为60％
3.所述口腔修复膜用纯化水湿润后，缝合线距一端边缘3mm缝合，拉力机以100mm/min速度啦缝线和样品的另一端，其平均撕裂力为4.2N.
4.所述口腔修复膜纯化水浸提24h，测定浸提液PH为6.7左右。
5.所述口腔修复膜，按照药典2020版中‘重金属检查法’测定，重金属含量小于10mg/kg。
6.所述口腔修复膜，按照药典2020版“氮测定法第三法定氮仪法”测定，总蛋白含量约为96％.
7.所述口腔修复膜，按照YY/T 1511-2017中附录B方法测定，羟脯氨酸含量为约10％。
8.所述口腔修复膜，按照YY 0954-2015附录B中方法测定，杂蛋白含量约为1％.
9.所述口腔修复膜,按GB 5009.6-2016规定的方法测定，脂肪含量为0.7％。
10.所述口腔修复膜，按YY/T 0606.25-2014规定的方法测定，DNA残留量为35ng/mg。
11.所述口腔修复膜，进行组织切片并进行HE染，用显微镜观察，无细胞核残留。
12.所述口腔修复膜，进行扫描电镜分析，致密面平均孔径小于2μm，疏松层平均孔径大于20μm。
实施例4
1.脱细胞猪小肠粘膜下层基质制备
(1)新鲜猪小肠笔直剖开，去除多余部分留下基质层，剪成适当长度，用0.1％的PAA溶液浸泡震荡60min。
(2)换液，用PBS溶液、纯化水清洗残留PAA溶液。
(3)0.4％的胰酶、0.5％的SDS混合溶液高速震荡清洗30min。
(4)换液，用PBS溶液、纯化水清洗上一步残夜。
(5)上一步的细胞外基质用冷冻干燥机进行冻干。
(6)冻干后的细胞外基质用异丙醇浸泡脱脂，间隔4小时更换一次脱脂试剂，脱脂72小时。
(7)上一步的脱脂细胞外基质在通风橱中自然风干；
(8)风干后的细胞外基质用纯化水多次清洗后二次冻干，得到脱细胞猪小肠粘膜下层基质。
2.胶原蛋白凝胶制备：
(1)将纯化后的质量为1000mg的胶原蛋白粉加入到90ml的0.01N盐酸溶液中，加入100mg胃蛋白酶，室温下搅拌24-72h，得到胶原蛋白溶液。
(2)依次加入9ml的0.1N氢氧化钠溶液，10ml的10倍PBS溶液。
(3)加入1倍PBS溶液调节PH致中性，加超纯水定容到体积为200ml，搅拌均匀，小心吸走气泡，将混合液密封植入37℃静置0.5-1h得到质量分数为5％的胶原蛋白凝胶。
3.口腔修复膜致密层的制备
(1)冻干后脱细胞猪小肠下层基质，用模切机裁剪成50mm*100mm大小。
(2)在不锈钢模具上，置于第一层脱细胞猪小肠下层基质，第二层脱细胞猪小肠下层基质采取完全叠加的方式置于在第一层上，用纯化水完全湿润
(3)用网孔大小为5mm*5mm的医用聚丙烯网覆盖住，然后压上带密集细孔的不锈钢网孔板。
(4)将上述叠放在一起的不锈钢板、脱细胞猪小肠下层基质、聚丙烯网一起放入带有吸嘴的软质可密封塑料袋中，吸嘴连上真空泵，开启真空泵，持续抽气，维持密封袋真空度在0-50pa之间，300min后取下得到口腔修复膜的致密层。
4.口腔修复膜的制备
将15ml 2中胶原蛋白凝胶均匀涂布在致密层上，用不锈钢模具固定后进行冷冻干燥，进行适当裁剪后得到口腔修复膜，其中致密层厚约0.2mm，疏松层厚约0.3mm。
本案例制得的口腔修复膜与案例3的区别在于：致密层的细胞外基质层为猪小肠粘膜下层基质；胶原蛋白凝胶的原材料为纯化后的胶原蛋白粉；脱细胞条件有所改变；致密层真空复合时间更长；
本案例制得的口腔修复膜做以下测试
1.拉伸强度：制成宽度10mm的试样，在相对湿度为40％—60％，温度为22℃±2℃的条件下放置2h。将试样的两端固定在拉力机的夹具上，两夹具间距30mm，以100mm/min稳定的速度拉伸，直到断裂，测得拉伸强度为13N/cm
2.断裂伸长率：制成宽度10mm的试样，在相对湿度为40％—60％，温度为22℃±2℃的条件下放置2h。将试样的两端固定在拉力机的夹具上，两夹具间距30mm，以100mm/min稳定的速度拉伸，直到断裂，测得断裂伸长率为56％
3.所述口腔修复膜用纯化水湿润后，缝合线距一端边缘3mm缝合，拉力机以100mm/min速度啦缝线和样品的另一端，其平均撕裂力为3.5N.
4.所述口腔修复膜纯化水浸提24h，测定浸提液PH为6.7左右。
5.所述口腔修复膜，按照药典2020版中‘重金属检查法’测定，重金属含量小于10mg/kg。
6.所述口腔修复膜，按照药典2020版“氮测定法第三法定氮仪法”测定，总蛋白含量约为96％.
7.所述口腔修复膜，按照YY/T 1511-2017中附录B方法测定，羟脯氨酸含量为约10％。
8.所述口腔修复膜，按照YY 0954-2015附录B中方法测定，杂蛋白含量约为1％。
9.所述口腔修复膜,按GB 5009.6-2016规定的方法测定，脂肪含量为0.5％。
10.所述口腔修复膜，按YY/T 0606.25-2014规定的方法测定，DNA残留量为20ng/mg。
11.所述口腔修复膜，进行组织切片并进行HE染，用显微镜观察，无细胞核残留。
12.所述口腔修复膜，进行扫描电镜分析，致密面平均孔径小于2μm，疏松层平均孔径大于20μm。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种口腔修复膜，其特征在于，包括：
复合细胞外基质层；所述复合细胞外基质层的制备方法具体为：将第一层细胞外基质置于模具上，纯化水湿润，得到第一层细胞外基质层；将第二层细胞外基质叠加铺于第一层细胞外基质层上；重复上述操作，叠加到需要的层数；采用医用聚丙烯网覆盖在最后一层细胞外基质层上，然后压上不锈钢网孔板，得到复合层；将复合层真空复合，得到复合细胞外基质层；所述真空复合的真空度为0~50pa；真空复合的时间为60min~2h；
所述细胞外基质的制备方法具体为：由膜状组织制得基质层；基质层采用0.15%~0.4%的PAA溶液浸泡震荡1~3h，而后依次采用PBS溶液、纯化水清洗；采用0.05%~0.2%的胰酶、0.1%~0.2%的SDS混合溶液继续震荡清洗1~4h，而后依次采用PBS溶液、纯化水清洗，得到未脱脂的细胞外基质；将未脱脂的细胞外基质冻干、浸泡脱脂、风干、清洗、二次冻干得到细胞外基质；
设置于所述复合细胞外基质层上的胶原蛋白海绵层；
所述复合细胞外基质层由2~4层细胞外基质复合得到；
所述复合细胞外基质层的厚度为0.2~0.4mm；孔径为5μm以下；
所述胶原蛋白海绵层的厚度为0.2~0.4mm；孔径为20微米至200微米。
2.一种权利要求1所述的口腔修复膜的制备方法，其特征在于，包括：
A）将第一层细胞外基质置于模具上，纯化水湿润，得到第一层细胞外基质层；
将第二层细胞外基质叠加铺于第一层细胞外基质层上；重复上述操作，叠加到需要的层数；
采用医用聚丙烯网覆盖在最后一层细胞外基质层上，然后压上不锈钢网孔板，得到复合层；
将复合层真空复合，得到复合细胞外基质层；
所述真空复合的真空度为0~50pa；真空复合的时间为60min~2h；
所述细胞外基质的制备方法具体为：由膜状组织制得基质层；基质层采用0.15%~0.4%的PAA溶液浸泡震荡1~3h，而后依次采用PBS溶液、纯化水清洗；采用0.05%~0.2%的胰酶、0.1%~0.2%的SDS混合溶液继续震荡清洗1~4h，而后依次采用PBS溶液、纯化水清洗，得到未脱脂的细胞外基质；将未脱脂的细胞外基质冻干、浸泡脱脂、风干、清洗、二次冻干得到细胞外基质；
B）将胶原蛋白凝胶涂覆在所述复合细胞外基质层上，经固定成型，冷冻干燥得到口腔修复膜；
所述胶原蛋白凝胶为：由粉碎后的细胞外基质粉或纯化后胶原蛋白粉制得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述细胞外基质的数量为2~4层。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白凝胶制备方法具体为：
将细胞外基质粉与盐酸、胃蛋白酶混合搅拌，得到胶原蛋白溶液；
将胶原蛋白溶液与氢氧化钠、PBS混合，搅拌，去除气泡，静置，得到胶原蛋白凝胶。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述纯化后胶原蛋白粉的来源为松质骨、猪皮、鱼皮或牛跟腱。
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