CN112023119B - 胶原基生物膜补片及其制备方法和应用 - Google Patents

胶原基生物膜补片及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112023119B
CN112023119B CN202010883557.XA CN202010883557A CN112023119B CN 112023119 B CN112023119 B CN 112023119B CN 202010883557 A CN202010883557 A CN 202010883557A CN 112023119 B CN112023119 B CN 112023119B
Authority
CN
China
Prior art keywords
collagen
drying
temperature
patch
freeze
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010883557.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN112023119A (zh
Inventor
潘洋
胡晓彤
谭荣伟
佘振定
李丽花
张文强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Qikang Medical Devices Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Qikang Medical Devices Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Qikang Medical Devices Co ltd filed Critical Shenzhen Qikang Medical Devices Co ltd
Priority to CN202010883557.XA priority Critical patent/CN112023119B/zh
Publication of CN112023119A publication Critical patent/CN112023119A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112023119B publication Critical patent/CN112023119B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/26—Mixtures of macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/23—Carbohydrates
    • A61L2300/236—Glycosaminoglycans, e.g. heparin, hyaluronic acid, chondroitin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/32—Materials or treatment for tissue regeneration for nerve reconstruction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明涉及一种胶原基生物膜补片及其制备方法和应用。上述胶原基生物膜补片的厚度为2mm～8mm，包括层叠设置的致密层和多孔层，致密层的厚度为10μm～50μm，致密层的孔径小于10μm或致密层为无孔结构，多孔层的孔径为10μm～300μm，制备致密层和多孔层的原料包括胶原蛋白和糖胺聚糖，致密层和所述多孔层一体成型。上述胶原基生物膜补片中致密层用于防止脑脊液泄露，多孔层用于吸收多余的脑脊液，以及有利于成纤维细胞长入，从而促进缺损部位硬脑(脊)膜的再生。且致密层的厚度较薄，不会影响多孔层的性能，因此，上述胶原基生物膜补片有助于缺损后的硬脑(脊)膜的再生。

Description

胶原基生物膜补片及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，特别是涉及一种胶原基生物膜补片及其制备方法和应用。
背景技术
脑和脊髓的表面包有三层被膜，由外向内依次为硬膜、蛛网膜和软膜。它们有支持、保护脑和脊髓的作用。硬脑(脊)膜主要由胶原纤维、成纤维细胞和少量弹性纤维平行排列而成。硬脑(脊)膜可能会在创伤或者颅内、脊柱外科切割手术中受损，可能造成脑脊液(CSF)泄露，从而造成较多不良反应，如脑疝、瘢痕形成导致的粘连以及假性脑膜膨出等。因此，在硬脑(脊)膜出现破损、撕裂后进行手术修补非常重要和关键。
目前，临床上使用的硬脑(脊)膜补片主要分为：自体组织、同种异体材料、脱细胞基材料、胶原基材料以及人工合成材料。另外以使用方式分，可以分为缝合型与免缝合型。自体组织虽然修补效果好，免疫原性风险低，但是其会对病人供区产生二次伤害。同种异体材料存在免疫排斥风险。脱细胞基材料力学强度高，缝合强度高，但是手术中需缝合，手术时间长，且结构致密，降解时间较长，容易造成材料被成纤维细胞包裹而不降解，长时间作为异体存在于病人体内。人工合成材料(如聚乳酸)降解时间虽然可控，但是其降解产物多为酸性，容易引起炎症反应。胶原基材料为疏松多孔海绵状，多孔结构有利于成纤维细胞长入再生硬脑(脊)膜组织，三维多孔结构能够打断成纤维细胞有序排列的情况，减少了胶原纤维的定向排列，从而减少瘢痕组织的产生。因而，胶原基硬脑(脊)膜修复材料被广泛应用。
但是，传统的胶原基硬脑(脊)膜材料在进行一些有挑战性的临床位点的硬膜修补时(如颅后窝)，存在由于其多孔结构而导致的脑脊液泄漏的情况。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够防止脑脊液泄露的胶原基生物膜补片。
此外，还有必要提供一种胶原基生物膜补片的制备方法和应用。
一种胶原基生物膜补片，所述胶原基生物膜补片的厚度为2mm～8mm，所述胶原基生物膜补片包括层叠设置的致密层和多孔层，所述致密层的厚度为10μm～50μm，所述致密层的孔径小于10μm或所述致密层为无孔结构，所述多孔层的孔径为10μm～300μm，制备所述致密层和所述多孔层的原料包括胶原蛋白和糖胺聚糖，所述致密层和所述多孔层一体成型。
在其中一个实施例中，所述多孔层的孔径为50μm～150μm。
在其中一个实施例中，所述胶原基生物膜补片还包括表层，所述表层层叠在所述多孔层远离所述致密层的一侧；
所述表层包括由胶原纤维构成的网络结构，所述表层的孔径小于10μm，所述胶原纤维的直径为50nm～1000nm；或者，所述表层为含有孔洞的胶原膜，在所述表层中，每50μm×50μm的区域，存在1个～50个孔洞。
在其中一个实施例中，所述表层的厚度为5μm～20μm。
在其中一个实施例中，所述胶原基生物膜补片的孔隙率大于90％。
一种胶原基生物膜补片的制备方法，包括如下步骤：
将胶原蛋白和糖胺聚糖混合，制备复合液；
将所述复合液置于冻干模具中，先在0℃～10℃下进行预冷处理，然后由0℃～-40℃降温至-20℃～-60℃并在-20℃～-60℃下进行预冻处理；及
将预冻处理后的所述复合液进行冷冻干燥，制备胶原基生物膜补片，所述冷冻干燥的步骤包括：先在-20℃～-60℃下抽真空，再将温度升至-30℃～-10℃下进行一次干燥，然后将温度升至4℃～10℃下进行二次干燥，最后将温度升至10℃～30℃下进行三次干燥。
在其中一个实施例中，所述预冷处理的温度为2℃～6℃；及/或，所述预冷处理的时间为0.5h～4h，优选地，时间为1h～2h。
在其中一个实施例中，所述由0℃～-40℃降温至-20℃～-60℃的步骤中，降温速率为0.1℃/min～1.0℃/min；及/或，所述预冻处理的时间为0.5h～4h，优选地，时间为1h～2h；及/或，所述预冻处理的温度为-40℃～-50℃。
在其中一个实施例中，所述冷冻干燥的步骤中，真空度为0.2mbar～0.3mbar；及/或，
所述抽真空的时间为10min～60min，所述将温度升至-30℃～-10℃的升温时间为10min～60min，所述一次干燥的时间为180min～600min；及/或，
所述将温度升至4℃～10℃的升温时间为20min～90min，所述二次干燥的时间为60min～240min；及/或，
所述将温度升至10℃～30℃的升温时间为30min～240min，所述三次干燥的时间为60min～240min。
在其中一个实施例中，所述抽真空的温度为-40℃～-50℃。
在其中一个实施例中，所述将胶原蛋白和糖胺聚糖混合的步骤包括：
将所述胶原蛋白分散在酸性试剂中制备胶原浆液，将所述糖胺聚糖溶解在酸性试剂中制备糖胺溶液；
将所述胶原浆液和所述糖胺溶液混合，制备复合液；
其中，所述胶原浆液的质量浓度为0.3％～1.0％；所述糖胺聚糖为硫酸软骨素，所述糖胺聚糖的加入量为所述胶原蛋白质量的2％～15％。
在其中一个实施例中，所述冻干模具的底部厚度为0.5mm～5mm。
在其中一个实施例中，所述冷冻干燥的步骤之后，还包括将冷冻干燥后的复合膜进行交联的步骤，所述交联选自物理交联及化学交联中的至少一种，所述物理交联的温度为100℃～120℃，时间为10h～40h；所述化学交联采用甲醛蒸汽进行交联。
在其中一个实施例中，所述冷冻干燥的步骤之后，还包括灭菌的步骤，灭菌方式选自环氧乙烷灭菌、钴60辐照灭菌和电子束辐照灭菌中的一种。
在其中一个实施例中，所述环氧乙烷灭菌的工艺参数为：预真空度为-20kPa～-40kPa，环氧乙烷浓度为5kg～7kg，灭菌温度为45℃～55℃，灭菌湿度为30％～70％，环氧乙烷作用时间为300min～400min，换气真空度为-10kPa～-30kPa，换气次数为3次～5次，换气时间为20min～40min；所述钴60辐照灭菌和所述电子束辐照灭菌的剂量为15kGy～25kGy。
由上述的胶原基生物膜补片或上述的胶原基生物膜补片的制备方法制备的胶原基生物膜补片在制备硬脑膜或硬脊膜的修复材料中的应用。
上述胶原基生物膜补片包括致密层和多孔层，致密层和多孔层的原料包括胶原蛋白和糖胺聚糖，加入糖胺聚糖能够对胶原蛋白进行交联重组，使得重组后的胶原蛋白分子链结构稳定，提高胶原蛋白作为致密层和多孔层的原料时的抗渗漏性。此外致密层的孔径较小，甚至几乎无孔，从而用于防止脑脊液泄露，多孔层为胶原基支撑的海绵状多孔结构，用于吸收多余的脑脊液，以及有利于成纤维细胞的长入，从而促进缺损部位硬脑(脊)膜的再生。且致密层的厚度较薄，不会影响多孔层的性能，因此，上述胶原基生物膜补片有助于缺损后的硬脑(脊)膜的再生，可以作为神经外科手术中硬脑(脊)膜的再生支架。
附图说明
图1为一实施方式的胶原基生物膜补片的制备方法的工艺流程图；
图2为实施例2制备的胶原基生物膜补片的致密层的SEM图；
图3为实施例2制备的胶原基生物膜补片的多孔层的SEM图；
图4为实施例2制备的胶原基生物膜补片的表层的SEM图；
图5为实施例3制备的胶原基生物膜补片的致密层的SEM图；
图6为实施例3制备的胶原基生物膜补片的多孔层的SEM图；
图7为实施例3制备的胶原基生物膜补片的表层的SEM图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将结合具体实施方式对本发明进行更全面的描述。具体实施方式中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体地实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的胶原基生物膜补片为片状，该胶原基生物膜补片可以为硬脑膜补片或硬脊膜补片。上述胶原基生物膜补片的厚度为2mm～8mm。具体地，胶原基生物膜补片包括层叠设置的致密层和多孔层，致密层的厚度为10μm～50μm。例如，致密层的厚度为10μm、20μm、30μm、40μm或50μm。致密层的孔径小于10μm或致密层为无孔结构。制备致密层的原料包括胶原蛋白和糖胺聚糖。致密层能够作为有效屏障，防止脑脊液泄露。且上述致密层的厚度较薄，对胶原基生物膜补片的孔隙率影响较小。
多孔层的孔径为10μm～300μm。优选地，多孔层的孔径为50μm～150μm。制备多孔层的原料包括胶原蛋白和糖胺聚糖。具体地，多孔层为海绵状结构。多孔层和致密层为一体成型。多孔层能够吸收多余的脑脊液并有利于成纤维细胞的长入，从而促进缺损部位硬脑脊膜的再生。此外，三维多孔结构还能够打断成纤维细胞有序排列的情况，减少胶原纤维的定向排列，从而减少瘢痕组织的产生。
具体地，胶原基生物膜补片还包括表层，表层层叠在多孔层远离致密层的一侧，表层包括由胶原蛋白纤维构成的网络结构，表层的孔径小于10μm，胶原蛋白纤维的直径为50nm～1000nm；或者，表层为含有孔洞的胶原膜，在表层中，每50μm×50μm的区域，存在1个～50个孔洞。具体地，表层的厚度为5μm～20μm。在其中一个实施例中，表层的厚度为5μm、10μm、15μm或20μm。具体地，制备表层的原料包括胶原蛋白和糖胺聚糖。表层、多孔层和致密层为一体成型。
具体地，胶原基生物膜补片的孔隙率大于90％。
上述胶原基生物膜补片能够覆盖在损失或缺损的硬膜的外表面，作为脑膜/脊膜组织的修复材料，用于修复受损的硬脑膜/硬脊膜组织以及保护中枢神经系统组织。
上述胶原基生物膜补片包括致密层和多孔层，致密层和多孔层的原料包括胶原蛋白和糖胺聚糖，加入糖胺聚糖能够对胶原蛋白进行交联重组，使得重组后的胶原蛋白分子链结构稳定，提高胶原蛋白作为致密层和多孔层的原料时的抗渗漏性。此外致密层的孔径较小，甚至几乎无孔，从而用于防止脑脊液泄露，多孔层为胶原基支撑的海绵状多孔结构，用于吸收多余的脑脊液，以及有利于成纤维细胞的长入，从而促进缺损部位硬脑(脊)膜的再生。且致密层的厚度较薄，不会影响多孔层的性能，因此，上述胶原基生物膜补片有助于缺损后的硬脑(脊)膜的再生，可以作为神经外科手术中硬脑(脊)膜的再生支架。
请参阅图1，一实施方式的胶原基生物膜补片的制备方法，包括如下步骤：
步骤S110：将胶原蛋白分散在酸性试剂中制备胶原浆液，将糖胺聚糖溶解在酸性试剂中制备糖胺溶液。
其中，酸性试剂选自盐酸、醋酸、柠檬酸及乳酸中的一种。优选地，酸性试剂为醋酸。具体地，酸性试剂的浓度为0.005mol/L～0.5mol/L。
胶原浆液的质量浓度为0.3％～1.0％。具体地，胶原浆液的质量浓度为0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％或1.0％。糖胺聚糖选自透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸乙酰肝素及硫酸角质素中的至少一种。优选地，糖胺聚糖为硫酸软骨素。糖胺聚糖的加入量为胶原蛋白质量的2％～15％。优选地，糖胺聚糖的加入量为胶原蛋白质量的4％～10％。例如，糖胺聚糖的加入量为胶原蛋白质量的4％、5％、6％、8％或10％。采用糖胺聚糖作为交联剂，对胶原蛋白分子进行交联重组，使得重组后的胶原蛋白分子链结构稳定。
具体地，将胶原蛋白分散在酸性试剂中制备胶原浆液的步骤为：将冻干的胶原蛋白片分散在酸性试剂中，并依次进行均质处理、真空脱泡处理，得到胶原浆液。在其中一个实施例中，采用均质机进行均质处理，采用真空干燥箱进行真空脱泡处理。通过均质处理使得胶原蛋白在酸性试剂中分散均匀。
步骤S120：将胶原浆液和糖胺溶液混合，制备复合液。
具体地，步骤S120为：在胶原浆液中缓慢滴加糖胺溶液，滴加完毕后，依次进行均质处理、真空脱泡处理，得到复合液。通过均质处理使得胶原浆液和糖胺溶液充分混合，得到均匀的复合液。均质处理和真空脱泡处理的工艺可以为本领域常用的工艺。
步骤S130：将复合液置于冻干模具中，先在0℃～10℃下进行预冷处理，然后由0℃～-40℃降温至-20℃～-60℃并在-20℃～-60℃下进行预冻处理。
具体地，将复合液置于冻干模具的步骤之后，预冷处理的步骤之前，还包括：将复合液在冻干模具中流延平整，然后静置使液面水平的步骤。
其中，预冷处理在冰箱中进行。优选地，预冷处理的温度为2℃～6℃。在其中一个实施例中，预冷处理的温度为2℃、3℃、4℃、5℃或6℃。预冷处理的时间0.5h～4h，优选地，时间为1h～2h。在其中一个实施例中，预冷处理的时间为1h、1.2h、1.5h、1.6h、1.8h或2h。通过预冷处理使得复合液能够先在一个较低的温度下稳定，但未结冰，进而使得后续降温更为均匀。
预冻处理在冻干机中进行。优选地，预冻处理的温度为-40℃～-50℃。在其中一个实施例中，预冻处理的温度为-40℃、-42℃、-45℃、-46℃、-48℃或-50℃。预冻处理的时间为0.5h～4h，优选地，时间为1h～2h。在其中一个实施例中，预冻处理的时间为1h、1.2h、1.5h、1.6h、1.8h或2h。通过预冻处理使得复合液变为固态(结冰态)。
具体地，由0℃～-40℃降温至-20℃～-60℃的步骤中，降温速率为0.1℃/min～1.0℃/min。例如，降温速率为0.1℃/min、0.2℃/min、0.3℃/min、0.4℃/min、0.5℃/min、0.6℃/min、0.8℃/min或1.0℃/min。优选地，由-10℃～-40℃降温至-20℃～-60℃。例如，由-10℃降温至-20℃～-60℃、由-15℃降温至-20℃～-60℃、由-20℃降温至-20℃～-60℃、由-25℃降温至-30℃～-60℃、由-35℃降温至-40℃～-60℃或由-40℃降温至-45℃～-60℃等。
在实际应用时，可以将冻干机设置为由室温以0.1℃/min～1.0℃/min的速率匀速降温至冷冻处理的温度，当冻干机降温至0℃～-40℃时，优选地，降温至-10℃～-40℃时，将承装有复合液的冻干模具置于冻干机中，随冻干机以0.1℃/min～1.0℃/min的速率降温至-20℃～-60℃，优选地，降温至-40℃～-50℃，并保温0.5h～4h，优选地，保温1h～2h。
发明人发现，直接将预冷处理后的含有复合液的冻干模具放入冷冻干燥机中随冷冻干燥机由室温进行程序降温至预设温度，由于冻干机降温较慢，因而形成的是顶部、底部以及四面均存在一层膜，其中四面的膜可以利用裁切去除，只剩顶部和底部形成有致密膜。在实际使用中，防渗漏性就更好，但是缺点是细胞长入较慢。
发明人进一步发现能够通过将预冷处理后的含有复合液的冻干模具放入更低温度的冻干机中，底部就能以更快的速率冷冻，因而底部不会形成致密层，只有顶部有致密层，更贴近于实际使用。因此，在本实施方式中，先在0℃～10℃下进行预冷处理，然后由0℃～-40℃降温至-20℃～-60℃并在-20℃～-60℃下进行预冻处理。
具体地，冻干模具的材质为铝合金或不锈钢。冻干模具底部的厚度为0.5mm～5.0mm。优选地，冻干模具底部的厚度为1mm～4mm。在其中一个实施例中，冻干模具底部的厚度为1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm。发明人发现，为了与预冻处理、冷冻干燥处理的工艺相配合，需要冻干模具底部的厚度大于0.5mm，复合膜的底部才会形成膜状结构。
步骤S140：将预冻处理后的复合液进行冷冻干燥，制备复合膜，冷冻干燥的步骤包括：先在-20℃～-60℃下抽真空，再将温度升至-30℃～-10℃下进行一次干燥，然后将温度升至4℃～10℃下进行二次干燥，最后将温度升至10℃～30℃下进行三次干燥。
其中，冷冻干燥的步骤中，真空度为0.2mbar～0.3mbar。在其中一个实施例中，真空度为0.2mbar、0.25mbar或0.3mbar。抽真空的时间为10min～60min。在其中一个实施例中，抽真空的时间为10min、20min、30min、40min、50min或60min。
具体地，温度升至-30℃～-10℃的升温时间为10min～60min。在其中一个实施例中，升温时间为10min、20min、30min、40min、50min或60min。
在-30℃～-10℃下进行一次干燥的时间为180min～600min。在其中一个实施例中，一次干燥的时间为180min、240min、300min、360min、420min、480min、540min或600min。在其中一个实施例中，一次干燥的温度为-30℃、-25℃、-20℃、-15℃或-10℃。
将温度升至4℃～10℃的升温时间为20min～90min。在其中一个实施例中，升温时间为20min、30min、40min、60min、70min、80min或90min。
在4℃～10℃下进行二次干燥的时间为60min～240min。在其中一个实施例中，二次干燥的时间为60min、120min、180min或240min。在其中一个实施例中，二次干燥的温度为4℃、5℃、6℃、8℃或10℃。
将温度升至10℃～30℃的升温时间为30min～240min。在其中一个实施例中，升温时间为30min、60min、120min、180min或240min。
在10℃～30℃下进行三次干燥的时间为60min～240min。在其中一个实施例中，三次干燥的时间为60min、120min、180min或240min。在其中一个实施例中，三次干燥的温度为10℃、15℃、20℃、25℃或30℃。
具体地，在一些实施例中，步骤S140为：
在-20℃～-60℃下抽真空至真空度为0.2mbar～0.3mbar，时间为10min～60min；
保持真空度为0.2mbar～0.3mbar，在10min～60min内，将温度升至-30℃～-10℃；
保持真空度为0.2mbar～0.3mbar，在-30℃～-10℃下，保温180min～600min，进行一次干燥；
保持真空度为0.2mbar～0.3mbar，在20min～90min内，将温度升至4℃～10℃；
保持真空度为0.2mbar～0.3mbar，在4℃～10℃下，保温60min～240min，进行二次干燥；
保持真空度为0.2mbar～0.3mbar，在30min～240min内，将温度升至10℃～30℃；
保持真空度为0.2mbar～0.3mbar，在10℃～30℃下，保温60min～240min，进行三次干燥。
通过调整上述冷冻干燥及预冷预冻处理中的工艺参数，特别是预冻阶段工艺参数，一步法即可形成多层结构，较其他需要多步冷冻法才能形成多层结构的方法，方法更为高效、简洁。
步骤S150：对复合膜进行交联、灭菌，制备胶原基生物膜补片。
其中，交联的方式选自物理交联及化学交联中的至少一种。物理交联的温度为100℃～120℃，时间为10h～40h，优选地，时间为20h～40h。化学交联采用甲醛蒸汽进行交联。在实际应用中，可以采用质量分数为5％～30％的甲醛溶液挥发出的甲醛蒸汽对冻干后的复合膜进行交联改性。如需物理交联和化学交联，则先进行物理交联，再进行化学交联。
通过交联能够加强胶原蛋白分子链间的连接使胶原蛋白的理化性质改变而具有不同性质的生物/物理功能。通过交联改性还可以提高复合膜的强度。
具体地，灭菌方式选自环氧乙烷灭菌、钴60辐照灭菌和电子束辐照灭菌中的一种。
环氧乙烷灭菌的工艺参数为：预真空度为-20kPa～-40kPa，环氧乙烷浓度为5kg～7kg，灭菌温度为45℃～55℃，灭菌湿度为30％～70％，环氧乙烷作用时间为300min～400min，换气真空度为-10kPa～-30kPa，换气次数为3次～5次，换气时间为20min～40min。钴60辐照灭菌和电子束辐照灭菌的剂量为15kGy～25kGy。灭菌之后，将灭菌后的复合膜剪裁成实际使用的合适尺寸，得到胶原基生物膜补片。灭菌结束后测定无菌和环氧乙烷残留符合规定要求。
采用上述步骤S110～步骤S150能够制备得到胶原基生物膜补片，该胶原基生物膜补片可以为硬脑膜补片或硬脊膜补片。胶原基生物膜补片为片状，厚度为2mm～8mm。具体地，胶原基生物膜补片包括层叠设置的致密层和多孔层，致密层的厚度为10μm～50μm，致密层的孔径小于10μm或致密层为无孔结构。制备致密层的原料包括胶原蛋白和糖胺聚糖。致密层能够作为有效屏障，防止脑脊液泄露。且上述致密层的厚度较薄，对胶原基生物膜补片的孔隙率影响较小。
多孔层的孔径为10μm～300μm。优选地，多孔层的孔径50μm～150μm。制备多孔层的原料包括胶原蛋白。具体地，多孔层为海绵状结构。多孔层能够吸收多余的脑脊液并有利于成纤维细胞的长入，从而促进缺损部位硬脑脊膜的再生。
具体地，胶原基生物膜补片还包括表层，表层层叠在多孔层远离致密层的一侧，表层为由胶原蛋白纤维构成的网络结构，胶原蛋白纤维构成的孔径小于10μm，胶原蛋白纤维的直径为50nm～1000nm；或者，表层为含有孔洞的胶原膜，在表层中，每50μm×50μm的区域，存在1个～50个孔洞。具体地，表层的厚度为5μm～20μm。根据上述制备方法，致密层为制备过程中，复合液远离冻干模具的一侧表面经冷冻干燥后所形成的膜层，表层为制备过程中，复合液与冻干模具接触的一侧表面经冷冻干燥后所形成的膜层。
具体地，胶原基生物膜补片的孔隙率大于90％。
上述胶原基生物膜补片能够覆盖在损失或缺损的硬膜的外表面，作为脑膜/脊膜组织的修复材料，用于修复受损的硬脑膜/硬脊膜组织以及保护中枢神经系统组织。
上述胶原基生物膜补片包括致密层和多孔层，致密的胶原层用于防止脑脊液泄露，多孔层为胶原基支撑的海绵状结构，用于吸收多余的脑脊液，以及有利于成纤维细胞的长入，从而促进缺损部位硬脑(脊)膜的再生。且上述胶原基生物膜补片为免缝合型，具有生物降解性能可控、生物可吸收和免疫原性低的优点，孔隙率高，有助于缺损后的硬脑脊膜的再生，可以作为神经外科手术中硬脑(脊)膜的再生支架。
上述胶原基生物膜补片的制备方法至少具有以下优点：
(1)上述胶原基生物膜补片的制备方法将胶原蛋白和糖胺聚糖分别分散溶解，然后混合制备复合液，并将复合液依次进行预冷、预冻及冷冻干燥处理，使得在胶原蛋白海绵多孔层的基础上，增加了顶层和底层，更有利于防止脑(脊)液泄露。
(2)在传统方法需要多步冷冻法形成多层结构的限制下，上述制备方法通过调整冻干工艺参数，特别是预冻阶段工艺参数，一步法即可形成多层结构，实现形式更为效率、简洁。
(3)上述胶原基生物膜补片的制备方法制备得到的胶原基生物膜补片具有免疫原性低、生物可吸收、降解性能可控、孔隙率高等优点，有助于缺损后的硬脑(脊)膜的再生，可以作为缺损部位硬脑(脊)膜的再生支架。
一实施方式的胶原基生物膜补片在制备硬脑膜或硬脊膜的修复材料中的应用。
以下为具体实施例部分：
实施例1
本实施例的复合液的制备过程具体如下：
(1)将10g胶原蛋白溶解在1000mL 0.05mol/L的醋酸溶液中，搅拌均匀并真空脱泡，得到胶原浆液。
(2)称取1g硫酸软骨素，溶解于200mL 0.05mol/L的醋酸溶液中，得到硫酸软骨素溶液。
(3)使用滴管将硫酸软骨素溶液滴加到胶原浆液中复合，并使用MICCRA D-9均质机进行均质，均质参数为：C档，90s。然后使用真空干燥机进行脱泡，得到复合液。
(4)将复合液倒入冻干模具中进行流延，并静置1h使液面水平。
实施例2
本实施例的胶原基生物膜补片的制备过程具体如下：
(1)将装有实施例1制备的复合液的冻干模具放入4℃冰箱中进行预冷2h，冻干模具材质为不锈钢，冻干模具的底部厚度为1mm。
(2)将冻干机设置为常温匀速降温至-60℃，降温速率为0.8℃/min。在冻干机降温至-10℃后，将承装有复合液的冻干模具快速放入冻干机中，随冻干机一同以0.8℃/min的速率程序降温至-60℃，并在-60℃下放置1h。
(3)对复合液进行冷冻干燥，得到复合膜，冷冻干燥的过程具体为：
抽真空阶段：温度：-60℃，时间：30min，真空度：0.2mbar；
第一升温阶段：温度升温至-20℃，升温时间：20min，真空度：0.2mbar；
第一干燥阶段：干燥温度：-20℃，干燥时间：480min，真空度：0.2mbar；
第二升温阶段：温度升温至10℃，升温时间：40min，真空度：0.2mbar；
第二干燥阶段：干燥温度：10℃，干燥时间：60min，真空度：0.2mbar；
第三升温阶段：温度升至20℃，升温时间：30min，真空度：0.2mbar；
第三干燥阶段：干燥温度：20℃，干燥时间：240min，真空度：0.2mbar。
(4)取出冻干后的复合膜放入110℃真空干燥箱中进行高温物理交联36h。
(5)取出高温物理交联后的复合膜，使用甲醛蒸汽进行化学交联，交联时间2h。
(6)使用电子束对交联后的复合膜进行灭菌，灭菌剂量为15kGy，灭菌后制得胶原基生物膜补片。使用时，用裁切刀将胶原基生物膜补片裁切成目标尺寸即可。
实施例3
本实施例的胶原基生物膜补片的制备过程具体如下：
(1)将装有实施例1制备的复合液的冻干模具放入0℃中进行预冷1h，冻干模具的材质为铝合金，冻干模具的底部厚度为4mm；
(2)将冻干机设置为常温匀速降温至-50℃，降温速率为0.5℃/min。在冻干机降温至0℃后，将承装有复合液的冻干模具快速放入冻干机中，随冻干机一同以0.8℃/min的速率程序降温至-50℃，并在-50℃下放置1.5h。
(3)对复合液进行冷冻干燥，得到复合膜，冷冻干燥的过程具体为：
抽真空阶段：温度：-40℃，时间：30min，真空度：0.2mbar；
第一升温阶段：温度升温至-10℃，升温时间：60min，真空度：0.2mbar；
第一干燥阶段：干燥温度：-10℃，干燥时间：600min，真空度：0.2mbar；
第二升温阶段：温度升温至4℃，升温时间：90min，真空度：0.2mbar；
第二干燥阶段：干燥温度：4℃，干燥时间：240min，真空度：0.2mbar；
第三升温阶段：温度升至20℃，升温时间：180min，真空度：0.2mbar；
第三干燥阶段：干燥温度：20℃，干燥时间：180min，真空度：0.2mbar。
(4)取出冻干后的复合膜放入105℃真空干燥箱中进行高温物理交联24h。
(5)取出高温物理交联后的复合膜，使用环氧乙烷进行灭菌。环氧乙烷灭菌参数为：预真空度为-30kPa，环氧乙烷浓度为6kg，灭菌温度为50℃，灭菌湿度为50％，环氧乙烷作用时间为350min，换气真空度为-20kPa，换气次数为5次，换气时间为30min。灭菌后得到胶原基生物膜补片。使用时，用裁切刀，将胶原基生物膜补片裁切成目标尺寸即可。
实施例4
本实施例的胶原基生物膜补片的制备过程具体如下：
(1)将装有实施例1制备的复合液的冻干模具放入10℃中进行预冷4h，冻干模具的材质为铝合金，冻干模具的底部厚度为0.6mm；
(2)将冻干机设置为常温匀速降温至-60℃，降温速率为1.0℃/min。在冻干机降温至-40℃后，将承装有复合液的冻干模具快速放入冻干机中，随冻干机一同以1.0℃/min的速率程序降温至-60℃，并在-60℃下放置1h。
(3)对复合液进行冷冻干燥，得到复合膜，冷冻干燥的过程具体为：
抽真空阶段：温度：-60℃，时间：10min，真空度：0.25mbar；
第一升温阶段：温度升温至-30℃，升温时间：50min，真空度：0.25mbar；
第一干燥阶段：干燥温度：-30℃，干燥时间：180min，真空度：0.25mbar；
第二升温阶段：温度升温至5℃，升温时间：50min，真空度：0.25mbar；
第二干燥阶段：干燥温度：5℃，干燥时间：150min，真空度：0.25mbar；
第三升温阶段：温度升至12℃，升温时间：120min，真空度：0.25mbar；
第三干燥阶段：干燥温度：12℃，干燥时间：210min，真空度：0.25mbar。
(4)取出冻干后的复合膜放入105℃真空干燥箱中进行高温物理交联24h。
(5)取出高温物理交联后的复合膜，使用环氧乙烷进行灭菌。环氧乙烷灭菌参数为：预真空度为-30kPa，环氧乙烷浓度为6kg，灭菌温度为50℃，灭菌湿度为50％，环氧乙烷作用时间为350min，换气真空度为-20kPa，换气次数为5次，换气时间为30min。灭菌后得到胶原基生物膜补片。使用时，用裁切刀，将胶原基生物膜补片裁切成目标尺寸即可。
实施例5
本实施例的胶原基生物膜补片的制备过程具体如下：
(1)将装有实施例1制备的复合液的冻干模具放入6℃中进行预冷2h，冻干模具的材质为铝合金，冻干模具的底部厚度为4mm；
(2)将冻干机设置为常温匀速降温至-20℃，降温速率为0.2℃/min。在冻干机降温至-5℃后，将承装有复合液的冻干模具快速放入冻干机中，随冻干机一同以0.2℃/min的速率程序降温至-20℃，并在-20℃下放置2h。
(3)对复合液进行冷冻干燥，得到复合膜，冷冻干燥的过程具体为：
抽真空阶段：温度：-20℃，时间：60min，真空度：0.3mbar；
第一升温阶段：温度升温至-10℃，升温时间：10min，真空度：0.3mbar；
第一干燥阶段：干燥温度：-10℃，干燥时间：540min，真空度：0.3mbar；
第二升温阶段：温度升温至8℃，升温时间：25min，真空度：0.3mbar；
第二干燥阶段：干燥温度：8℃，干燥时间：90min，真空度：0.3mbar；
第三升温阶段：温度升至28℃，升温时间：240min，真空度：0.3mbar；
第三干燥阶段：干燥温度：28℃，干燥时间：60min，真空度：0.3mbar。
(4)取出冻干后的复合膜放入105℃真空干燥箱中进行高温物理交联24h。
(5)取出高温物理交联后的复合膜，使用环氧乙烷进行灭菌。环氧乙烷灭菌参数为：预真空度为-30kPa，环氧乙烷浓度为6kg，灭菌温度为50℃，灭菌湿度为50％，环氧乙烷作用时间为350min，换气真空度为-20kPa，换气次数为5次，换气时间为30min。灭菌后得到胶原基生物膜补片。使用时，用裁切刀，将胶原基生物膜补片裁切成目标尺寸即可。
对比例1
对比例1的胶原基生物膜补片的制备过程具体如下：
(1)将冻干机设置为常温匀速降温至-60℃，降温速率为0.8℃/min。在冻干机降温至-10℃后，将承装有实施例1制备的复合液的冻干模具快速放入冻干机中，随冻干机一同以0.8℃/min的速率程序降温至-60℃，并在-60℃下放置1h。其中冻干模具的材质为不锈钢，冻干模具的底部厚度为1mm。
(3)对复合液进行冷冻干燥，得到复合膜，冷冻干燥的过程具体为：
抽真空阶段：温度：-60℃，时间：30min，真空度：0.2mbar；
第一升温阶段：温度升温至-20℃，升温时间：20min，真空度：0.2mbar；
第一干燥阶段：干燥温度：-20℃，干燥时间：480min，真空度：0.2mbar；
第二升温阶段：温度升温至10℃，升温时间：40min，真空度：0.2mbar；
第二干燥阶段：干燥温度：10℃，干燥时间：60min，真空度：0.2mbar；
第三升温阶段：温度升至20℃，升温时间：30min，真空度：0.2mbar；
第三干燥阶段：干燥温度：20℃，干燥时间：240min，真空度：0.2mbar。
(4)取出冻干后的复合膜放入110℃真空干燥箱中进行高温物理交联36h。
(5)取出高温物理交联后的复合膜，使用甲醛蒸汽进行化学交联，交联时间2h。
(6)使用电子束对交联后的复合膜进行灭菌，灭菌剂量为15kGy，灭菌后制得胶原基生物膜补片。使用时，用裁切刀将胶原基生物膜补片裁切成目标尺寸即可。
对比例2
对比例2的胶原基生物膜补片的制备过程具体如下：
(1)将装有实施例1制备的复合液的冻干模具放入4℃冰箱中进行预冷2h，冻干模具材质为不锈钢，冻干模具的底部厚度为1mm。
(2)对复合液进行冷冻干燥，得到复合膜，冷冻干燥的过程具体为：冷冻温度设置为(I)-7℃/30min/呈持续状态；(II)-40℃/200min/呈曲线状态；(III)-40℃/70min/呈持续状态；过程中冷冻干燥机冷柜的温度保持-80℃。升华阶段的温度设置为(I)0℃/保持18h；(2)二次升温的温度设置为20℃，时间为40min。上述所有程序进行过程中真空度设置在200mtorr。
(3)取出冻干后的复合膜放入110℃真空干燥箱中进行高温物理交联36h。
(4)取出高温物理交联后的复合膜，使用甲醛蒸汽进行化学交联，交联时间2h。
(5)使用电子束对交联后的复合膜进行灭菌，灭菌剂量为15kGy，灭菌后制得胶原基生物膜补片。使用时，用裁切刀将胶原基生物膜补片裁切成目标尺寸即可。
对比例3
对比例3的胶原基生物膜补片的制备过程具体如下：
(1)将装有实施例1制备的复合液的冻干模具放入4℃冰箱中进行预冷2h，冻干模具材质为不锈钢，冻干模具的底部厚度为1mm。
(2)对复合液进行冷冻干燥，常温匀速降温至-40℃，然后保温360min。
(3)对复合液进行冷冻干燥，得到复合膜，冷冻干燥的过程具体为：
抽真空阶段：温度：-10℃，时间：780min，真空度：0.2mbar；
第一干燥阶段：干燥温度：-12℃，干燥时间：420min，真空度：0.2mbar；
第二干燥阶段：干燥温度：-5℃，干燥时间：360min，真空度：0.2mbar；
第三干燥阶段：干燥温度：0℃，干燥时间：90min，真空度：0.2mbar；
第四干燥阶段：干燥温度：25℃，干燥时间：90min，真空度：0.2mbar。
(4)取出冻干后的复合膜放入110℃真空干燥箱中进行高温物理交联36h。
(5)取出高温物理交联后的复合膜，使用甲醛蒸汽进行化学交联，交联时间2h。
(6)使用电子束对交联后的复合膜进行灭菌，灭菌剂量为15kGy，灭菌后制得胶原基生物膜补片。使用时，用裁切刀将胶原基生物膜补片裁切成目标尺寸即可。
对比例4
对比例4的胶原基生物膜补片的制备过程具体如下：
(1)将装有实施例1制备的复合液的冻干模具放入4℃冰箱中进行预冷2h，冻干模具材质为不锈钢，冻干模具的底部厚度为0.2mm。
(2)将冻干机设置为常温匀速降温至-40℃，降温速率为0.8℃/min。在冻干机降温至-10℃后，将承装有复合液的冻干模具快速放入冻干机中，随冻干机一同以0.8℃/min的速率程序降温至-60℃，并在-60℃下放置1h。
(3)对复合液进行冷冻干燥，得到复合膜，冷冻干燥的过程具体为：
抽真空阶段：温度：-60℃，时间：30min，真空度：0.2mbar；
第一升温阶段：温度升温至-20℃，升温时间：20min，真空度：0.2mbar；
第一干燥阶段：干燥温度：-20℃，干燥时间：480min，真空度：0.2mbar；
第二升温阶段：温度升温至10℃，升温时间：40min，真空度：0.2mbar；
第二干燥阶段：干燥温度：10℃，干燥时间：60min，真空度：0.2mbar；
第三升温阶段：温度升至20℃，升温时间：30min，真空度：0.2mbar；
第三干燥阶段：干燥温度：20℃，干燥时间：240min，真空度：0.2mbar。
(4)取出冻干后的复合膜放入110℃真空干燥箱中进行高温物理交联36h。
(5)取出高温物理交联后的复合膜，使用甲醛蒸汽进行化学交联，交联时间2h。
(6)使用电子束对交联后的复合膜进行灭菌，灭菌剂量为15kGy，灭菌后制得胶原基生物膜补片。使用时，用裁切刀将胶原基生物膜补片裁切成目标尺寸即可。
以下为测试部分：
1、防渗漏性测试
将实施例2和实施例3制备的胶原基生物膜补片(10cm×10cm规格)在新鲜(无抗凝剂)的血液中充分浸润，使用夹具夹住，保证周边密封性，夹具上方为一开口容器，底部放置一个烧杯，往上方容器中加入10mL纯水，观察胶原基生物膜补片的防渗漏性。结果显示，胶原基生物膜补片5min内均不会发生渗漏，没有水通过胶原基生物膜补片进入到下方烧杯中。
采用同样的方式对实施例4～实施例5和对比例1～对比例4中制备的胶原基生物膜补片的防渗漏性进行测试，测试结果为：实施例4～实施例5所制备的胶原基生物膜补片在3min内均不会发生渗漏。对比例1～对比例4中的胶原基生物膜补片虽然在3min内也不会发生渗漏，但对比例1～对比例3中的胶原基生物膜补片没有致密层，表层为与中间层类似的多孔结构，防渗漏效果较实施例1～实施例5的胶原基生物膜补片较差。
2、SEM结果
通过扫描电镜(SEM)观察实施例2制备得到的胶原基生物膜补片的结构，得到如图2～图4所示。其中，图2为实施例2制备的胶原基生物膜补片的致密层的SEM图，图3为实施例2制备的胶原基生物膜补片的多孔层的SEM图。图4为实施例2制备的胶原基生物膜补片的表层的SEM图。从图中可以看出，实施例2的胶原基生物膜补片的致密层几乎无孔，多孔层(横截面)可见疏松多孔海绵结构，孔径在50μm～100μm，表层为直径在50nm～2μm胶原纤维构成的网络状结构。致密层和表层分别平铺在多孔层的顶部和底部。
通过扫描电镜观察实施例3制备得到的胶原基生物膜补片的结构，得到如图5～图7所示。其中，图5为实施例3制备的胶原基生物膜补片的致密层的SEM图，图6为实施例3制备的胶原基生物膜补片的多孔层的SEM图。图7为实施例3制备的胶原基生物膜补片的表层的SEM图。从图中可以看出，实施例3的胶原基生物膜补片的致密层几乎无孔，多孔层(横截面)可见疏松多孔海绵结构，孔径在100μm～200μm，表层为致密的胶原膜，可见零星孔洞。
同样，对实施例4～实施例5和对比例1～对比例4制备的胶原基生物膜补片的结构进行观察，结果如下：对比例1～对比例3顶部和底部均为通孔，孔径在50～200μm之间，具体地，对比例1没有经过预冷处理，虽然在形貌结构上与实施例2类似，但孔结构更加不均匀。对比例2和对比例3中所制备的胶原基生物膜补片均不存在致密层结构。对比例4的生物膜补片因为底部太薄而出现冷胀冷缩形成的翘起，造成底部制冷不均匀，而出现纤维网络、膜结构混杂、不均匀的情况。
3、厚度结果
采用SEM方法对实施例2～实施例5和对比例1～对比例4制备的胶原基生物膜补片的厚度及各层的厚度进行测试，采用GB/T 1966-1996多孔陶瓷显气孔率、容重试验方法对胶原基生物膜补片的孔隙率进行测试，得到如下表1所示结果。
表1
Figure BDA0002654861700000191
从上表中可以看出，实施例1～实施例5所制备的胶原基生物膜补片具有致密层、表层和中间的多孔层，表层为纳米纤维网络结构或致密的膜结构。对比例1～对比例3所制备的胶原基生物膜补片没有致密层，整体为多孔结构，表层为微米尺寸的片状结构形成的多孔结构，与中间层的多孔层结构相似。对比例4的胶原基生物膜补片因为模具底部太薄而出现冷胀冷缩形成的翘起，会造成底部制冷不均匀，而出现纤维网络、膜结构混杂、不均匀的情况。
从以上实验数据中可以看出，实施例1～实施例5所制备的胶原基生物膜补片在中间多孔层的两侧分别含有一定厚度的致密层和表层，提高了抗渗漏性，且致密层和表层的厚度较薄，不会影响多孔层的性能，从而使多孔层吸收多余的脑脊液。对比例1～对比例3所制备的胶原基生物膜补片中不含有致密层，表层与中间多孔层结构类似，抗渗漏性较实施例差。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (14)

1.一种胶原基生物膜补片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将胶原蛋白和糖胺聚糖混合，制备复合液；
将所述复合液置于冻干模具中，先在0℃～10℃下进行预冷处理1h～2h，然后由-10℃～-40℃降温至-40℃～-50℃并在-40℃～-50℃下进行预冻处理1h～2h，所述冻干模具底部的厚度为0.5mm～5.0mm；及
将预冻处理后的所述复合液进行冷冻干燥，制备胶原基生物膜补片，所述冷冻干燥的步骤包括：先在-20℃～-60℃下抽真空10min～60min，再将温度升至-30℃～-10℃下进行一次干燥180min～600min，然后将温度升至4℃～10℃下进行二次干燥60min～240min，最后将温度升至10℃～30℃下进行三次干燥60min～240min。
2.根据权利要求1所述的胶原基生物膜补片的制备方法，其特征在于，所述预冷处理的温度为2℃～6℃。
3.根据权利要求1所述的胶原基生物膜补片的制备方法，其特征在于，所述由-10℃～-40℃降温至-40℃～-50℃的步骤中，降温速率为0.1℃/min～1.0℃/min。
4.根据权利要求1～3任一项所述的胶原基生物膜补片的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的步骤中，真空度为0.2mbar～0.3mbar；及/或，
所述将温度升至-30℃～-10℃的升温时间为10min～60min；及/或，
所述将温度升至4℃～10℃的升温时间为20min～90min；及/或，
所述将温度升至10℃～30℃的升温时间为30min～240min；及/或，
所述抽真空的温度为-40℃～-50℃。
5.根据权利要求1所述的胶原基生物膜补片的制备方法，其特征在于，所述将胶原蛋白和糖胺聚糖混合的步骤包括：
将所述胶原蛋白分散在酸性试剂中制备胶原浆液，将所述糖胺聚糖溶解在酸性试剂中制备糖胺溶液；
将所述胶原浆液和所述糖胺溶液混合，制备复合液；
其中，所述胶原浆液的质量浓度为0.3％～1.0％；所述糖胺聚糖为硫酸软骨素，所述糖胺聚糖的加入量为所述胶原蛋白质量的2％～15％；及/或，
所述冷冻干燥的步骤之后，还包括将冷冻干燥后的复合膜进行交联的步骤，所述交联选自物理交联及化学交联中的至少一种；所述物理交联的温度为100℃～120℃，时间为10h～40h；所述化学交联采用甲醛蒸汽进行交联。
6.根据权利要求1所述的胶原基生物膜补片的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的步骤之后，还包括灭菌的步骤，灭菌方式选自环氧乙烷灭菌、钴60辐照灭菌和电子束辐照灭菌中的一种。
7.根据权利要求6所述的胶原基生物膜补片的制备方法，其特征在于，所述环氧乙烷灭菌的工艺参数为：预真空度为-20kPa～-40kPa，环氧乙烷浓度为5kg～7kg，灭菌温度为45℃～55℃，灭菌湿度为30％～70％，环氧乙烷作用时间为300min～400min，换气真空度为-10kPa～-30kPa，换气次数为3次～5次，换气时间为20min～40min；所述钴60辐照灭菌和所述电子束辐照灭菌的剂量为15kGy～25kGy。
8.一种胶原基生物膜补片，其特征在于，由权利要求1～7任一项所述的胶原基生物膜补片的制备方法制备得到。
9.根据权利要求8所述的胶原基生物膜补片，其特征在于，所述胶原基生物膜补片的厚度为2mm～8mm，所述胶原基生物膜补片包括层叠设置的致密层和多孔层，所述致密层的厚度为10μm～50μm，所述致密层的孔径小于10μm或所述致密层为无孔结构，所述多孔层的孔径为10μm～300μm。
10.根据权利要求9所述的胶原基生物膜补片，其特征在于，所述多孔层的孔径为50μm～150μm。
11.根据权利要求9所述的胶原基生物膜补片，其特征在于，所述胶原基生物膜补片还包括表层，所述表层层叠在所述多孔层远离所述致密层的一侧；
所述表层包括由胶原纤维构成的网络结构，所述表层的孔径小于10μm，所述胶原纤维的直径为50nm～1000nm；或者，所述表层为含有孔洞的胶原膜，在所述表层中，每50μm×50μm的区域，存在1个～50个孔洞。
12.根据权利要求11所述的胶原基生物膜补片，其特征在于，所述表层的厚度为5μm～20μm。
13.根据权利要求8～12任一项所述的胶原基生物膜补片，其特征在于，所述胶原基生物膜补片的孔隙率大于90％。
14.由权利要求8～13任一项所述的胶原基生物膜补片在制备硬脑膜或硬脊膜的修复材料中的应用。
CN202010883557.XA 2020-08-28 2020-08-28 胶原基生物膜补片及其制备方法和应用 Active CN112023119B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010883557.XA CN112023119B (zh) 2020-08-28 2020-08-28 胶原基生物膜补片及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010883557.XA CN112023119B (zh) 2020-08-28 2020-08-28 胶原基生物膜补片及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112023119A CN112023119A (zh) 2020-12-04
CN112023119B true CN112023119B (zh) 2023-04-07

Family

ID=73587601

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010883557.XA Active CN112023119B (zh) 2020-08-28 2020-08-28 胶原基生物膜补片及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112023119B (zh)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107050519B (zh) * 2016-12-22 2021-04-13 天新福（北京）医疗器材股份有限公司 复层可吸收生物膜的制备方法
CN107029296B (zh) * 2017-03-03 2020-09-29 北京博辉瑞进生物科技有限公司 一种引导骨再生的骨膜修补片、制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112023119A (zh) 2020-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2289569B1 (en) Collagen device and method of preparing the same
JP4854084B2 (ja) 創傷被覆材および生命を脅かす重篤な出血を抑制するための方法
US8932619B2 (en) Dural repair material
KR20010052714A (ko) 콜라겐재 및 그의 제조 방법
US8269058B2 (en) Absorbable tissue dressing assemblies, systems, and methods formed from hydrophilic polymer sponge structures such as chitosan
JP5224250B2 (ja) 医用代用膜
US20060041320A1 (en) Suturable adhesion-preventing membrane
WO2014206308A1 (zh) 组织修复支架及其制备方法和用途
JP2007516050A (ja) 生命を脅かす重大な出血を制御するための創傷包帯および方法
WO1998022157A1 (fr) Materiau collagene et son procede de production
EP2173293A1 (en) Absorbable tissue dressing assemblies, systems, and methods formed from hydrophilic polymer sponge structures such as chistosan
Yu et al. Current developments in dural repair: a focused review on new methods and materials
JP4968976B2 (ja) コラーゲン材及びその製法
EP2381968B1 (en) Biopolymeric membrane for wound protection and repair
US20150073564A1 (en) Tubular Porous Foam Scaffolds with Gradient Pores for Tissue Engineering
CN112023119B (zh) 胶原基生物膜补片及其制备方法和应用
US10772988B2 (en) Vascular patch using silk matrix and method of manufacturing the same
CN114225110B (zh) 一种胶原基硬脑膜及其制备方法
CN115554467A (zh) 一种颅骨修复材料及其制备方法
KR102350122B1 (ko) 키토산을 주성분으로 하는 흡수성 지혈제 패드 및, 그 제조방법
CN114053486A (zh) 一种可吸收生物活性膜及其制备方法和用途
CN114028611B (zh) 一种可吸收双层人工骨膜及其制备方法和应用
JP2010029684A (ja) コラーゲン材及びその製法
CN115814161A (zh) 软组织修复材料及其制备方法
CN115487345A (zh) 基于丝素蛋白的止血水凝胶和止血海绵及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant