CN101361989A - 双层膜状组织修补材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种双层膜状组织修补材料及其制备方法，本发明是由脱细胞膜状生物衍生材料作为表层，由成纤维细胞复合于生物支架材料内部形成基层，两者嵌合构成；其致密的表层结构可有效地减少水分、电解质和蛋白质由创面的丢失，阻止细菌对受损创面的入侵、繁殖，防止创面感染，有利于上皮增殖和生长；基层可直接修复创面，促进创周细胞的长入和血管的生成、诱导干细胞向皮肤细胞的分化，对创面愈合具有促进作用；与已有产品相比本发明有以下优点：可促进创面皮肤的再生，增强创面愈合后皮肤的弹性、柔韧性和机械耐磨性，减少瘢痕增生，控制挛缩，有良好的生物相容性，提高移植的成功率，改善愈合质量；材料来源广泛、生产方法简单；所制备的双层膜状组织修补材料适用于炎症、溃疡、烧烫伤、医源性等原因造成的皮肤缺损的临床治疗。

Description

双层膜状组织修补材料及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程的生物材料技术领域，具体涉及一种双层膜状组织修补材料及其制备方法。

背景技术

皮肤是覆盖和保护体表的重要组织器官。由于炎症、溃疡、外伤、烧伤、肿瘤术后以及先天性畸形等原因常造成皮肤的缺损和异常。对于暴露的皮肤创面，在传统上使用最多的就是纱布。纱布多由棉花、软麻布和亚麻布加工而成，属于惰性材料，对创面的愈合无直接促进作用。随着对伤口愈合研究的深入，人们认识到不仅要覆盖创面，还必须帮助伤口愈合。由细胞外基质构成的生物材料就是其中比较理想的一类产品，其主要成分包括胶原、非胶原糖蛋白、弹力纤维、糖胺多糖、蛋白聚糖、与基质代谢相关的酶及细胞因子；为细胞的生存及活动提供适宜的场所，不仅是细胞的机械支持组织，而且是供给营养和免疫应答的场所，决定细胞的粘附与迁移，在创伤修复和纤维化、细胞的生长、分化、代谢和肿瘤发生及转移中起重要作用，并作为组织替代材料用于临床研究，在多种组织器官的修复中发挥着重要的作用。

组织修补材料的促愈合作用表现在：具有一定的止血促凝作用，还可诱导多种细胞增殖分化；胶原蛋白不但可作为伤口凝血块的基底，而且是粒细胞、巨噬细胞、纤维母细胞的趋化性物质，为各种细胞的游走、附着、增殖提供支架。组织修补材料在创面最终降解为机体修复细胞所必需的氨基酸，为创面修复提供营养物质。

目前已商品化的双层膜状生物材料有Integra(Integra LifeSciences公司生产)，为双层基质的人工皮肤，真皮部分由牛肌腱的胶原蛋白及硫酸软骨素制成具有一定孔洞大小的支架，表皮层则由硅胶膜组成，可以控制伤口水气的蒸散，在伤口愈合过程，真皮层会与伤口结合，表皮层的硅胶膜可以在真皮层愈合后去除，再进一步做自体皮肤移植，美国FDA已在1996年核准Integra在烧烫伤治疗使用；其不足主要在于，由于其表面有不可降解的硅胶膜，不易观察创面早期的感染情况，不利于创缘表皮细胞的爬行和创面的封闭，后期揭掉硅胶膜还需要二次手术。

发明内容

本发明的目的就是提供一种双层膜状组织修补材料及其制备方法，具有制备周期短、成本低、方法简便、易于操作的优点；所制备的双层膜状组织修补材料具有止血、防止体液流失、保护创面并促进创面愈合的功能，有良好的生物相容性，能用于修复皮肤缺损、控制创面感染、治疗难愈性的创面，同时还具有形状、大小和厚度易于改变的优点。

本发明所提出的双层膜状组织修补材料，其特征在于：是由脱细胞膜状生物衍生材料作为表层，由成纤维细胞合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子复合于生物支架材料内部形成基层，两者嵌合构成；所述的脱细胞膜状生物衍生材料为天然生物组织经脱细胞处理后所形成膜状生物医用材料，包括脱细胞小肠粘膜下层、脱细胞真皮基质、脱细胞筋膜、脱细胞膀胱粘膜下层、脱细胞羊膜、脱细胞硬脑膜的任一种；所述的成纤维细胞为自体或异体来源的成纤维细胞，或是可向成纤维细胞分化的干细胞，包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、造血干细胞、皮肤干细胞、间充质干细胞、肌肉干细胞，肝脏干细胞、神经干细胞的任一种；所述的生物支架材料是能为细胞生长提供三维空间的支撑材料，包括纤维蛋白原、纤维蛋白、海藻酸盐、胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、壳聚糖、水凝胶、明胶、聚乳酸、聚羟基乙酸的任一种或是几种的混合。

本发明所述的双层膜状组织修补材料的制备方法，包括有细胞获取、脱细胞膜状生物衍生材料制备以及双层膜状组织修补材料的构建，具体步骤如下：

步骤1).成纤维细胞的获取：成纤维细胞来自人体组织，细胞按常规的培养方法进行体外培养和大规模扩增培养；

步骤2).脱细胞膜状生物衍生材料的制备：将取自同种或异种的皮肤真皮层、或筋膜、或小肠粘膜下层、或羊膜、或硬脑膜任一种膜状生物材料，置于含有过氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒1小时以上，用磷酸盐缓冲液(PBS溶液)清洗；(若是采用较厚的生物材料，如皮肤真皮层，此时需置于-80℃冷冻半小时以上，确保材料内外温度达到一致，取出后自然解冻，如此反复冻融2～5次，使细胞完全破裂崩解，用PBS溶液清洗)；将其置于0.1～1M的NaOH溶液浸泡进行脱脂、脱细胞处理；再用PBS溶液浸洗至pH中性，将其再置入含有DNA酶和α-半乳糖苷酶的混合溶液中，37℃环境下处理25分钟以上，去除残留的DNA和α-ga1天然抗原成分，降低免疫原性，用PBS溶液清洗；为了使其与支架材料结合牢固，采用机械方法在其材料上均匀制孔，孔径0.1～1mm，间距0.5～5mm；将无孔的脱细胞生物衍生材料与有孔的脱细胞生物衍生材料叠加压紧使其紧密结合，干燥灭菌后成为双层脱细胞膜状生物衍生材料，备用；

其中，所述的过氧乙酸和乙醇的体积终浓度分别为0.1～0.5％和2～10％；所述DNA酶和α-半乳糖苷酶的终浓度分别为30～50U/ml和10～25U/ml；

步骤3).专用培养液的配制，其组分按体积百分比包括有：商用最低必需培养液DMEM 67.5％、商用培养液F12 22.5％、胎牛血清5～15％，碱性成纤维细胞生长因子2～100ng/ml、表皮细胞生长因子2～100ng/ml、胰岛素1～50ng/ml、氢化可的松10～500ng/ml、腺嘌呤0.2～0.25mM、转铁蛋白1～10μg/ml；

步骤4).双层膜状组织修补材料的构建：先配制生物支架材料的凝胶溶液；将制备的双层脱细胞生物衍生材料浸透凝胶溶液后，置于37℃环境下预固化；将体外培养的成纤维细胞按10⁴～10⁶个/ml的浓度混合于凝胶溶液中，再按0.1～1ml/cm²滴加到预固化的脱细胞生物衍生材料的有孔面上，置于5％CO₂环境中37℃条件下固化；再置入专用培养液中培养2～3天后，将其置于培养器皿内的培养支架上继续培养6～10天，培养期间每天换液，双层膜状组织修补材料培养完成；上述的培养条件均为37℃，5％CO₂环境；

其中，所述的生物支架材料的凝胶溶液可以按以下配制：在4℃条件下，按质量比将胶原7～10∶壳聚糖0.5～1∶透明质酸2～3∶硫酸软骨素0.5～1混合，用0.1～0.5M的醋酸将其配制成浓度为6～20mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射后，按其体积加入10％的胎牛血清，再加入DMEM培养基使其终浓度达到10mg/ml，调节pH值至7.2～7.4，制成凝胶溶液；也可采用其他凝胶溶液的配方配制；

步骤5).干燥保存：将培养的双层膜状组织修补材料浸泡于冷冻保护液中25分钟以上，经冷冻干燥后灭菌消毒，得到可长期保存的双层膜状组织修补材料；所述的冷冻保护液为Hanks平衡盐溶液中加有0.1～10％葡萄糖、0.1～5％蔗糖、0.1～5％海藻糖、0.1～0.5％人血清白蛋白(均为重量比)。

本发明的制备方法具有成本低、方法简便、原料来源不受限制、提高了产品的生物相容性、便于临床使用的优点；所制备的双层膜状组织修补材料与已有的产品相比具有以下优点：具有表层和基层双层结构，表层结构与基层嵌合在一起，结合紧密；脱细胞膜状生物衍生材料所形成的较致密的表层结构可以有效地减少水分、电解质和蛋白质由创面的丢失，有效阻止细菌对受损创面的入侵、繁殖，防止创面感染，诱导创周表皮细胞向创面的迁移，有利于上皮的增殖和生长；基层由与皮肤真皮成分接近的成纤维细胞合成分泌的细胞外基质和多种细胞生长因子构成，可引导创周细胞的长入、血管的生成、诱导干细胞向皮肤细胞的分化，因此可以明显促进创面的愈合；并可以促进创面皮肤的再生，增强创面愈合后的皮肤弹性、柔韧性和机械耐磨性，减少瘢痕增生，控制挛缩，良好的生物相容性可改善愈合质量，同时保存期大大延长。

本发明所制备的双层膜状组织修补材料，大小厚度可以控制，生产周期短，而且无明显免疫排斥反应以及良好的生物相容性。其在临床应用中的主要作用有：(1)作为皮肤大面积缺损患者的创面覆盖和供皮区的覆盖；(2)修复营养不良和感染创面；(3)治疗慢性难愈性溃疡创面；(4)术后创面的覆盖和预防感染；(5)充当组织加强物，替代筋膜，修复膜性缺损。

具体实施方式

以下结合实例对本发明技术方案做进一步的详细说明。

实施例1：

步骤1).成纤维细胞的获取：取新生儿切除术后包皮组织，消毒后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，去除皮下脂肪及肌肉层，将皮肤剪成条状，用4U/ml中性蛋白酶液消化2小时；去除表皮层，将真皮组织剪碎，用625U/ml的胶原酶液消化2.5小时，收获成纤维细胞培养；将原代培养的成纤维细胞使用细胞工厂、或旋转瓶培养系统、或生物反应器等方法进行扩大培养；

步骤2).双层脱细胞小肠粘膜下层的制备：将新鲜猪空肠用蒸馏水冲洗干净，切成所需片段，置于含有0.2％过氧乙酸和8％乙醇的水溶液中浸泡消毒1小时，用PBS液漂洗；机械刮除小肠粘膜、肌层和浆膜，用PBS漂洗干净，获得粘膜下层；再将其置入1M的NaOH溶液中，于4±2℃条件下浸泡10分钟，用PBS液漂洗至pH中性；将其置入含有40U/ml DNA酶和10U/ml α-半乳糖苷酶的混合溶液中浸泡1小时，用PBS液漂洗干净；获得脱细胞小肠粘膜下层；使用制孔机在其上均匀制孔，孔径0.2mm，间距0.5mm，用无孔的脱细胞小肠粘膜下层与有孔的脱细胞小肠粘膜下层各取相同大小叠加、压紧使其紧密结合，干燥后环氧乙烷灭菌，制成双层脱细胞小肠粘膜下层；

步骤3).专用培养液的配制，各组分按体积百分比包括有：商用最低必需培养液DMEM 67.5％、商用培养液F12 22.5％、胎牛血清10％，碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml、表皮细胞生长因子5ng/ml、胰岛素5ng/ml、氢化可的松20ng/ml、腺嘌呤0.25mM、转铁蛋白5μg/ml。

步骤4).双层膜状组织修补材料的构建：在4℃条件下，按质量比将胶原10∶壳聚糖1∶透明质酸2∶硫酸软骨素0.5混合，用0.1M的醋酸将其配制成浓度为10mg/ml的溶液，冰浴下紫外线照射，按其体积加入10％的胎牛血清，再加入DMEM培养基使其终浓度为10mg/ml，调节pH值7.2～7.4，成为凝胶溶液；将制备的双层脱细胞小肠粘膜下层浸透凝胶溶液，于37℃环境下预固化30分钟；将体外培养的成纤维细胞按10⁶个/ml的浓度混合于上述凝胶溶液中，再按1ml/cm²滴加到预固化的双层脱细胞小肠粘膜下层的有孔面上，于5％CO₂环境中37℃条件下固化30分钟后，加入专用培养液培养3天后，再将其置于培养器皿内的培养支架上继续培养6天，期间每天换液，双层膜状组织修补材料培养完成；上述的培养条件均为37℃，5％CO₂环境；

步骤5).干燥保存：将完成培养后的双层膜状组织修补材料浸泡于冷冻保护液中30分钟，冷冻保护液为Hanks平衡盐溶液中加有1％葡萄糖、2％蔗糖、1％海藻糖、0.1％人血清白蛋白(均为重量比)，再将其冷冻干燥后，钴60灭菌消毒。

本实例制备的双层膜状组织修补材料包含有人成纤维细胞所合成、分泌的细胞外基质和生长因子，可直接参与创面的修复，适于皮肤组织缺损的修复材料；其经细胞失活处理后可长期保存，便于临床使用。

实施例2：

步骤1).成纤维细胞的获取：参照文献Dermal matrix as a carrier forin vivo delivery of human adipose-derived stem cells.Biomaterials.2008 Apr；29(10)：1431-42.已证明脂肪间充质干细胞可以分化为成纤维细胞。取手术中废弃的健康脂肪组织，消毒后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，剪碎脂肪组织，用625U/ml的胶原酶液消化150分钟，将收获的脂肪间充质干细胞接种至培养瓶培养；再用细胞工厂、或旋转瓶培养系统、或生物反应器的方法进行扩大培养；

步骤2).脱细胞真皮制备：将新鲜猪皮肤用蒸馏水冲洗干净，机械去除表皮层和皮下组织层，切成0.4mm厚度、5cm²大小，置于含有0.2％(v/v)过氧乙酸和5％(v/v)乙醇的水溶液中浸泡消毒1小时，用PBS漂洗；再置于-80℃冷冻半小时，确保材料内外温度达到一致，取出后自然解冻，如此反复冻融3次，使细胞完全破裂崩解，用PBS溶液清洗；将其置入0.3M的NaOH溶液中，于4±2℃条件下浸泡30分钟，用PBS漂洗至pH中性；再将其置入含有30U/ml DNA酶和20U/ml α-半乳糖苷酶的溶液中浸泡1小时，用PBS漂洗干净，获得脱细胞真皮；使用制孔机在脱细胞真皮上均匀制孔，孔洞直径1mm，间距3mm，再用无孔的脱细胞真皮与有孔的脱细胞真皮各取相同大小叠加、压紧使其紧密结合，干燥后环氧乙烷灭菌，形成双层脱细胞真皮；

步骤3).专用培养液的配制，各组分按体积百分比包括有：商用最低必需培养液DMEM 67.5％、商用培养液F12 22.5％、胎牛血清10％，碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml、表皮细胞生长因子10ng/ml、胰岛素5ng/ml、氢化可的松20ng/ml、腺嘌呤0.15mM、转铁蛋白5μg/ml；

步骤4).双层膜状组织修补材料的构建：在4℃条件下，按质量比将胶原8∶壳聚糖1∶透明质酸3∶硫酸软骨素1混合，用0.3M的醋酸将其配制成浓度为6mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射，按其体积加入10％的胎牛血清，再加入DMEM培养基使其终浓度达到10mg/ml，调节pH值为7.2～7.4，成为凝胶溶液；将制备的双层脱细胞真皮浸透凝胶溶液后，于37℃环境下预固化；将体外培养的脂肪间充质干细胞按5×10⁵个/ml的浓度混合于凝胶溶液中，再将该凝胶溶液按1ml/cm²滴加到预固化的双层脱细胞真皮的有孔面上，置于5％CO₂环境37℃条件下固化后，加入专用培养液培养2天，再将其置于培养器皿内的培养支架上继续培养9天，期间每天换液，双层膜状组织修补材料培养完成；上述的培养条件均为37℃，5％CO₂环境；

步骤5).干燥保存：将完成培养后的双层膜状组织修补材料浸泡于冷冻保护液中60分钟，冷冻保护液为Hanks平衡盐溶液中加5％葡萄糖、0.5％蔗糖、4％海藻糖、0.2％人血清白蛋白(均为重量比)，再经冷冻干燥后，环氧乙烷灭菌消毒。

本实例制备的双层膜状组织修补材料包含有人脂肪间充质干细胞所合成、分泌的细胞外基质和生长因子，适于皮肤组织缺损的修复材料，同时具有脂肪间充质干细胞来源不受限制、增殖旺盛、分泌能力强的优点。经冷冻干燥处理后可长期保存12个月，便于临床使用。

Claims (6)

1.一种双层膜状组织修补材料，其特征在于，其是由脱细胞膜状生物衍生材料作为表层，由成纤维细胞合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子复合于生物支架材料内部形成基层，两者嵌合构成；所述的脱细胞膜状生物衍生材料为天然生物组织经脱细胞处理所形成的膜状生物医用材料；所述的成纤维细胞为自体或异体来源的成纤维细胞，或是可向成纤维细胞分化的干细胞；所述的生物支架材料是能为细胞生长提供三维空间的支撑材料。

2.制备权利要求1所述双层膜状组织修补材料的方法，包括有细胞获取、脱细胞膜状生物衍生材料制备的步骤，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1).成纤维细胞的获取：成纤维细胞来自人体组织，按常规的培养方法进行体外培养和大规模扩增；

步骤2).脱细胞膜状生物衍生材料的制备：采用皮肤真皮层、筋膜、小肠粘膜下层、羊膜、硬脑膜的任一种膜状生物材料制备；将材料置于含有过氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不低于1小时，用磷酸盐缓冲液清洗；将其置于NaOH溶液浸泡处理；用磷酸盐缓冲液浸洗至pH中性，再将其置入含有DNA酶和α-半乳糖苷酶的混合溶液中，37℃环境下处理25分钟以上，用磷酸盐缓冲液浸洗后，在其上均匀制孔，再将无孔的与有孔的脱细胞生物衍生材料叠加压紧使其紧密结合，干燥灭菌，成为双层脱细胞膜状生物衍生材料；

步骤3).专用培养液的配制，其组分按体积百分比包括有：商用最低必需培养液DMEM 67.5％、商用培养液F12 22.5％、胎牛血清5～15％，碱性成纤维细胞生长因子2～100ng/ml、表皮细胞生长因子2～100ng/ml、胰岛素1～50ng/ml、氢化可的松10～500ng/ml、腺嘌呤0.2～0.25mM、转铁蛋白1～10μg/ml；

步骤4).双层膜状组织修补材料的构建：先配制生物支架材料的凝胶溶液；将制备的双层脱细胞膜状生物衍生材料浸透凝胶溶液后，置于37℃环境下预固化；将体外培养的成纤维细胞按10⁴～10⁶个/ml的浓度混合于凝胶溶液中，再按0.1～1ml/cm²滴加到预固化的脱细胞膜状生物衍生材料的有孔面上，置于5％CO₂环境中37℃条件下固化；再置入专用培养液中培养2～3天后，将其置于培养器皿内的培养支架上继续培养6～10天，培养期间每天换液，培养完成；上述的培养条件均为37℃，5％CO₂环境；

步骤5).干燥保存：将培养的双层膜状组织修补材料浸泡于冷冻保护液中25分钟以上，经冷冻干燥后灭菌消毒，得到双层膜状组织修补材料。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中在所述脱细胞膜状生物衍生材料制孔的孔径为0.1～1mm，间距为0.5～5mm。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中所述的过氧乙酸和乙醇的体积终浓度分别为0.1～0.5％和2～10％；所述DNA酶和α-半乳糖苷酶的终浓度分别为30～50U/ml和10～25U/ml。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中所述的浸泡消毒清洗后，NaOH溶液浸泡前，将材料置于-80℃冷冻半小时以上，取出后自然解冻，如此反复冻融2～5次，用磷酸盐缓冲液清洗后再于NaOH溶液浸泡。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤5)中所述的冷冻保护液为Hanks平衡盐溶液中按重量比加有0.1～10％葡萄糖、0.1～5％蔗糖、0.1～5％海藻糖、0.1～0.5％人血清白蛋白。