CN102552979A - 一种角膜板层材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种角膜板层材料的制备方法，本发明是将哺乳动物眼球的角膜-巩膜复合体通过脱细胞处理、羊膜上皮干细胞培养、TSP-1诱导分泌以及脱细胞角膜基质与羊膜上皮干细胞共培养、定型与包装灭菌等步骤制备；所获得角膜板层移植材料实现了生物相容性、稳定性、透明度、力学强度、生物活性五者间的提升与平衡；最大限度地保留了角膜胶原分子和板层结构的完整，比传统方法制备的脱细胞角膜基质拉伸强度大，具有接近于正常角膜的含水率与透明度；并富集了多种细胞生长因子和TSP-1，具有特异地抗炎和抗血管化的作用，极大地增强了角膜板层材料的生物活性，可以广泛用于复杂的眼表缺损的修复，如炎症和血管化长入的角膜溃疡等。

Description

一种角膜板层材料的制备方法

技术领域

本发明属于组织工程学医用生物材料技术领域，具体涉及一种移植用角膜板层材料的制备方法。

背景技术

角膜按结构分为上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层以及内皮细胞层。外伤、微生物感染、病变等因素都会造成角膜功能缺失和视力下降，严重的会形成角膜盲。对于角膜内皮受损，需要行穿透性角膜移植；对于内皮细胞层完好的角膜上皮及基质层损伤，可以采用角膜板层移植修复。角膜基质损伤通常伴有角膜溃疡，复杂的炎症反应、血管化，导致角膜基质不断降解。在复杂炎症情况下，即便是异体角膜移植也很难获得长期有效结果。我国角膜溃疡患者病灶的严重化、晚期化是一个严峻的客观事实，给临床提出了苛刻的要求，需要更具生物活性的角膜板层材料。目前的角膜移植材料为捐献的异体角膜，由于来源非常有限，极大地限制了角膜移植术的开展。我国角膜盲患者有200万以上，每年新增约30万，大部分为角膜基质损伤，因此适用于临床移植的高生物活性角膜板层材料是目前的迫切需求。

理想的角膜板层材料应具备：1)良好的生物相容性，移植后不会激发机体的免疫排斥反应；2)具有承受缝线牵拉的力学强度和韧性，以及材料在创面的稳定性；3)良好的透明度；4)高生物活性，能促进角膜板层材料与角膜植床之间的融合，抑制角膜植床的炎症和血管化。细胞生长因子具有提高角膜板层材料生物活性的作用，主要包括表皮细胞生长因子(EGF)，角质细胞生长因子(KGF)，肝细胞生长因子(HGF)，转化生长因子(TGF-β)等；另外，血小板反应素-1(Thrombospondin-1，TSP-1)具有多种功能作用，能广泛参与血管抑制、免疫调节、TGF-β通路等。

目前的技术水平尚很难通过合成或组装的方式获得成分及结构与天然角膜接近的角膜板层材料，所以脱细胞角膜材料是比较理想的选择。其是以动物源性角膜(如猪、牛等)为原料，采用物理(冻融、渗透压)、化学(酸、碱、去垢剂)、生物酶(蛋白酶、核酸酶、磷脂酶)等方法及其组合去除异种角膜的细胞成分，得到无免疫原性的脱细胞角膜基质。脱细胞角膜基质的优点在于其含有类似于天然角膜的胶原排列结构，具有较好的力学性能。

所有脱细胞方法在去除免疫原性的同时，无一例外地会对角膜基质结构和生物活性造成破坏。因此，理想的脱细胞角膜板层材料应尽量减小脱细胞的力度，保证板层材料无免疫原性的同时，提高其生物活性。

目前脱细胞角膜基质的制备方法，都存在有一定的安全性风险以及生物活性不足的缺点。例如，1)中国专利申请(200410018107.5)公开了一种无细胞的异种角膜基质及制备方法和用途，是采用离子型或非离子型去垢剂结合核酸酶法去除细胞组分，再将基质脱水干燥；由于引入了具有免疫原性的核酸酶，在后续操作中很难保证完全洗脱，存在的残留会提高免疫原性；所制备角膜板层材料的生物活性较低。2)中国专利申请(200710027698.6)公开的脱细胞角膜基质及其制备方法，采用离子型或非离子型去垢剂脱细胞，在一定程度上去除了细胞组分，但是脱细胞不彻底，胶原端肽抗原决定簇结构仍然存在，所得到的脱细胞角膜基质具有较高的免疫原性和安全风险。与此相同，中国专利申请(200810026972.2)公开的脱细胞基质制备方法，采用磷脂酶与非离子型去垢剂组合进行脱细胞，其在生物活性上有所改进，但未从根本上解决安全性的问题。3)中国专利申请(200510120794.6)公开的生物型人工角膜，采用冻融-去垢剂-胰酶-超声进行异种角膜的脱细胞处理，用环氧化物进行交联，用酸酐或甲基化试剂封闭羟基、氨基、巯基等活性基团；该方法虽能提高角膜基质的力学性能，但脱细胞方法中的冷冻处理会损伤胶原分子结构，造成胶原分子间以及板层结构的排列紊乱；其采用的交联和封闭程度过高，降低了材料的生物活性以及与植床的融合能力。

目前采用脱细胞角膜基质制备的角膜板层材料的生物活性，可以通过添加一种或多种细胞因子组合物进行增强，如表皮细胞生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)等；但这种添加方式一般具有较高的制备成本，另外还缺乏对角膜溃疡、炎症、血管化等病理微环境的针对性治疗作用。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提出一种角膜板层材料的制备方法，所制备的角膜板层材料含有细胞生长因子和TSP-1，更接近天然角膜的板层结构，具有良好的生物相容性、力学性能、结构稳定性和透明度，并具有高生物活性以及TSP-1特异的抗炎、抗血管化作用，以期提高对复杂角膜板层缺损的治疗效果。

本发明所提出角膜板层材料的制备方法，包括以下步骤：

材料前处理：将哺乳动物眼球的角膜-巩膜复合体用医用酒精浸泡2小时后，转入4℃生理盐水中浸泡备用。

步骤一、脱细胞处理：将角膜-巩膜复合体置于含10～50ml/L曲拉通X-100(Triton X-100)的1mol/L氯化钠水溶液中，4℃振荡5小时；再将角膜-巩膜复合体置于含Triton X-100为2ml/L和乙二胺四乙酸钠(EDTA)为0.1g/L的水溶液中，4℃振荡5小时；将本步骤反复操作不少于6次；

为使脱细胞更彻底，可以再采用以下任一种溶液继续脱细胞：1g/L十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液、10g/L脱氧胆酸钠水溶液或20ml/L吐温20(tween20)水溶液，在室温下振荡8～48h，得到脱细胞角膜-巩膜复合体；

步骤二、羊膜上皮干细胞的获取：取原代羊膜上皮干细胞进行培养，当长到60％以上融合度时，用含有4g/L胰酶的PBS缓冲液消化6分钟后，将细胞悬液600g离心5分钟获取细胞；为了更好地富集羊膜上皮干细胞的干细胞性，采用培养液A重悬，并以1×10⁴/cm²的密度接种原代羊膜上皮干细胞进行传代培养，得到羊膜上皮干细胞；所述培养液A的组成为，在商用角质细胞基础培养基(MCDB 153培养基)中含有，表皮细胞生长因子2ng/ml、人胰岛素10mg/L、牛脑垂体提取物(BPE)2～20ml/L、L-谷氨酰胺2×10^-3mol/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1.18g/L、花生四烯酸2mg/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲状腺氨酸20pg/ml、亚硒酸钠5μg/ml和转铁蛋白100mg/L；根据传代次数，可以得到第1～5代的羊膜上皮干细胞；

步骤三、诱导分泌TSP-1以及脱细胞角膜-巩膜复合体与羊膜上皮干细胞共培养：将第1～5代羊膜上皮干细胞以1×10⁴/cm²的密度接种于细胞培养容器中培养，当细胞融合度长到50％以上时，更换培养液B诱导TSP-1表达；另将脱细胞角膜-巩膜复合体用医用酒精浸泡30分钟，并以无菌PBS缓冲液涮洗3次后置于插入式细胞培养皿中，再将该培养皿置入上述细胞培养容器中培养3天，实现脱细胞角膜-巩膜复合体与羊膜上皮干细胞的共培养；得到含细胞生长因子和TSP-1的脱细胞角膜基质；所述培养液B的组成为，在商用MCDB 153培养基中含有，肝细胞生长因子(KGF)10ng/ml、L-谷氨酰胺2×10^-3mol/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1.6g/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲状腺氨酸20pg/ml、亚硒酸钠5μg/ml、血管紧张肽II为20～50ng/ml；

本步骤实现了脱细胞角膜-巩膜复合体与羊膜上皮干细胞的共培养，并以培养液B诱导羊膜上皮干细胞分泌TSP-1，TSP-1随即与体系内的脱细胞角膜基质结合并实现富集。该诱导培养液不含动物源性添加物，降低安全性风险；并优化了维持细胞生长的最低营养要求，添加的血管紧张肽II特异性地促进羊膜上皮干细胞合成TSP-1，使其表达水平较含血清培养液提高3倍以上；此外，该培养液同时促进羊膜上皮干细胞表达EGF、HGF、KGF、TGF-β等细胞因子，使这些细胞因子也能在脱细胞角膜基质中富集，提高生物活性。

步骤四、定型处理：将脱细胞角膜基质在4℃下用体积浓度40％的甘油水溶液震荡10分钟，更换体积浓度50％的甘油水溶液震荡10分钟，再更换体积浓度90％的甘油水溶液震荡30分钟，至其厚度回复到0.3～0.4mm时定型结束，得到定型后的含细胞生长因子和TSP-1的脱细胞角膜基质材料；

步骤五、包装与灭菌：用生理盐水涮洗材料表面后包装，经辐照灭菌于4℃条件下保存；得到含细胞生长因子和TSP-1的角膜板层材料。

本发明对异种角膜脱细胞、脱抗原的方法做了改进，在保证材料生物相容性的前提下，最大限度地减少脱细胞过程对材料的损伤；鉴于脱细胞角膜板层材料的生物活性普遍不足的缺点，通过与羊膜上皮干细胞的共培养提高板层材料内的EGF，HGF，KGF，TGF-β等生长因子的水平，提高生物活性，从而实现具有较高生物相容性、机械强度、稳定性、透明度、生物活性的角膜板层材料的制备；此外，通过对羊膜上皮干细胞进行TSP-1诱导分泌，使角膜板层材料富集TSP-1并具有较高的特异的抗炎、抗血管化作用，可用于治疗多种复杂的带有严重炎症和血管化的角膜疾病。

与现有技术相比，本发明的脱细胞方法仅使用高低渗、胰酶或去垢剂等，方法简单、效果好、成本低；本发明采用无血清培养液富集羊膜上皮干细胞，使细胞传代能力更强，一般羊膜上皮干细胞传代至第三代就出现明显老化，而本发明可以使羊膜上皮干细胞传至第5代以上，同时减少了动物源性因子污染的风险；本发明采用羊膜上皮干细胞与脱细胞角膜共培养方式提高了脱细胞角膜的生物活性，与新鲜羊膜组织或羊膜提取物相比，具有病毒风险和质量标准可控，原材料更均一，更有利于建立标准化和扩大化生产的优点；本发明采用特定的无动物源性成分的TSP-1诱导培养液诱导羊膜上皮干细胞特异地高表达TSP-1，使其在角膜板层材料中富集，增强特异性抗炎和抑制血管化的作用；本发明在生物活性增补后对角膜板层材料进行定型，能控制制备厚度为0.3～0.4mm的角膜板层材料，方便临床的直接使用。

与现有产品相比，本发明所制备的角膜板层材料(1)具有较好的生物相容性、天然胶原的排列方式和板层结构，以及与天然角膜相似的吸水率(约75％)，具有较高的透明度，(550nm)透光率为92％；(2)具有较好的拉伸强度，最大拉力为14～16牛顿，而传统方法制备的脱细胞角膜基质的最大拉力仅3～4牛顿；(3)具有较好的稳定性，经兔眼板层移植实验证明，本发明产品在植床上1月内不发生降解现象，与植床融合良好，而传统方法制备的脱细胞角膜基质在10天左右即出现降解；(4)具有较好的生物活性，含有丰富的高浓度细胞生长因子，其中EGF为1653±231ng/g，KGF为723±169ng/g，HGF为1223±131ng/g，TGF-β为194±90ng/g；经兔眼板层移植实验证明，本发明产品完全实现上皮化仅需3天，而经冻融-去垢剂-胰酶方法制备的脱细胞角膜基质的完全上皮化为7～14天；(5)含有高浓度的TSP-1(2239±471ng/g)，具有显著的抑制碱烧伤炎症、抑制血管化形成的作用。

附图说明

附图1为采用传统方法与本发明制备的角膜材料对比照片。其中，图A为传统方法制备的脱细胞角膜基质组织学(HE)染色照片，可以看出有零星的细胞残留，而且基质结构排列紊乱；图B为本发明制备的角膜板层材料(HE)染色照片，可以看出细胞成分去除彻底，胶原结构排列有序。

附图2为本发明制备的角膜板层材料移植大鼠皮下的HE染色照片。移植两周后未发现炎性细胞和淋巴细胞的聚集，说明具有较好的生物相容性。

附图3为本发明制备的角膜板层材料角膜囊袋移植术后HE染色照片。两周后未发现单核细胞和巨噬细胞的浸润，说明具有较好的生物相容性。

附图4为本发明制备的角膜板层材料浸提液修复动物角膜碱烧伤的有效性实验的照片。(浸提液是将本发明制备的角膜板层材料采用无菌PBS缓冲液浸提24小时得到)。其中，图A为术后2天，可见碱烧伤后的大面积白斑；图B为术后7天，使用材料浸提液后明显减少白斑形成，并且没有发现血管化现象；图C为术后14天，白斑面积进一步减少，没有发生血管化现象；图D为术后21天，眼表白斑和血管化基本消失。结果表明本发明制备的角膜板层材料的浸提液能抑制碱烧伤炎症、抑制血管化形成。

附图5为采用TSP-1诱导培养液(培养液B)修复动物角膜碱烧伤的有效性实验的照片(为图4的对比实验)。其中，图A为术后2天，可见碱烧伤后的大面积白斑；图B为术后7天，依旧可见大面积白斑；图C为术后14天，白斑开始向角膜基质溃疡转变，并且有血管化长入；图D为术后21天，白斑转变成严重的溃疡，伴有严重的基质炎症和血管化现象。结果表明单纯的培养液不能抑制碱烧伤验证和血管化。

附图6为采用本发明制备的角膜板层材料修复兔角膜板层缺损过程的照片，其中A为1周照片，B为4周照片，C为3月照片。可以看出在移植1周、4周及3月过程中角膜基质与植床融合并透明的变化。

具体实施方式

实例中采用的插入式细胞培养皿由密理博(Millipore)公司生产，型号为PIHP01250-0.4mPCF。

实施例1、

将来源于屠宰场的牛眼球处理，取角膜-巩膜复合体用医用酒精浸泡2小时后，转入4℃生理盐水中浸泡，备用；

步骤一、脱细胞处理：将角膜-巩膜复合体置于含10ml/L曲拉通X-100的1mol/L氯化钠水溶液中，4℃振荡5小时；再将角膜-巩膜复合体置于含曲拉通X-100为2ml/L和EDTA为0.1g/L的水溶液中，4℃振荡5小时；将本步骤反复操作6次；再用10g/L脱氧胆酸钠水溶液室温下振荡40小时；得到脱细胞角膜-巩膜复合体；

步骤二、羊膜上皮干细胞的获取：取原代羊膜上皮干细胞采用原代细胞培养液进行扩大培养；原代细胞培养液的组成为，在商用高糖型DMEM培养液中含有，EGF为10ng/ml、人胰岛素10mg/L、胎牛血清150ml/L、L-谷氨酰胺2×10^-3mol/L、非必需氨基酸10ml/L、2-巯基乙醇5.5×10^-5mol/L和丙酮酸钠2×10^-3mol/L；得到原代羊膜上皮干细胞；

当原代羊膜上皮干细胞长到60％以上融合度时，用含有4g/L胰酶的PBS缓冲液消化6分钟后收集细胞悬液，600g离心5分钟获取细胞；再采用培养液A重悬进行传代培养；培养液A的组成为，在商用MCDB 153培养基中含有，表皮细胞生长因子2ng/ml、人胰岛素10mg/L、BPE为2ml/L、L-谷氨酰胺2×10^-3mol/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1.18g/L、花生四烯酸2mg/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲状腺氨酸20pg/ml、亚硒酸钠5μg/ml和转铁蛋白100mg/L；得到羊膜上皮干细胞；传代一次，得到第1代羊膜上皮干细胞；

步骤三、诱导分泌TSP-1以及脱细胞角膜-巩膜复合体与羊膜上皮干细胞共培养：取第1代羊膜上皮干细胞以1×10⁴/cm²的密度接种于六孔细胞培养板中培养，当细胞融合度长到50％以上时，更换培养液B诱导TSP-1表达；另将脱细胞角膜-巩膜复合体在医用酒精浸泡半小时，以无菌PBS缓冲液涮洗3次后置于插入式细胞培养皿中，再将该培养皿置入上述细胞培养板中培养3天，实现脱细胞角膜-巩膜复合体与羊膜上皮干细胞的共培养；得到含细胞生长因子和TSP-1的脱细胞角膜基质；培养液B的组成为，在商用MCDB153培养基中含有，KGF为10ng/ml、L-谷氨酰胺2×10^-3mol/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1.6g/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲状腺氨酸20pg/ml、亚硒酸钠5μg/ml和血管紧张肽II为50ng/ml；

步骤四、定型处理：将脱细胞角膜基质在4℃下用体积浓度40％的甘油水溶液震荡10分钟，更换体积浓度为50％的甘油水溶液震荡10分钟，再更换体积浓度为90％的甘油水溶液震荡半小时，至其厚度到0.4mm时定型结束，得到定型后的含TSP-1和细胞生长因子的脱细胞角膜基质材料；

步骤五、包装与灭菌：用生理盐水涮洗材料表面后包装，经辐照灭菌后4℃条件下保存；得到含细胞生长因子和TSP-1的角膜板层材料。

本实例是以牛角膜为原料制备较大直径的材料，具有方便保存和运输的特点，临床使用时只需将其在生理盐水中常温复水后即可使用。角膜移植后具有较好的透明度，产品具有抑制植床血管化和炎症的能力，调节创面微环境向正常环境转变，能促进材料与炎性植床的融合。

实施例2、

将来源于屠宰场的猪眼球处理，取角膜-巩膜复合体用医用酒精浸泡2小时后，转入4℃生理盐水中浸泡，备用；

步骤一、脱细胞处理：将角膜-巩膜复合体置于含50ml/L曲拉通X-100的1mol/L氯化钠水溶液中，4℃振荡5小时；再将角膜-巩膜复合体置于含曲拉通X-100为2ml/L和EDTA为0.1g/L的水溶液中，4℃振荡5小时；将本步骤反复操作8次；得到脱细胞角膜-巩膜复合体；

步骤二、羊膜上皮干细胞的培养：取原代羊膜上皮干细胞进行培养；当细胞融合度长到60％以上时，用含有4g/L胰酶的PBS缓冲液消化6分钟后收集细胞悬液，600g离心5分钟获取细胞；再采用培养液A重悬，并以1×10⁴/cm²的密度接种到培养瓶中培养；培养液A的组成为，在商用MCDB 153培养基中含有，表皮细胞生长因子2ng/ml、人胰岛素10mg/L、BPE为20ml/L、L-谷氨酰胺2×10^-3mol/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1.18g/L、花生四烯酸2mg/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲状腺氨酸20pg/ml、亚硒酸钠5μg/ml和转铁蛋白100mg/L；得到羊膜上皮干细胞传代五次，得到第5代羊膜上皮干细胞；

步骤三、诱导分泌TSP-1以及脱细胞角膜-巩膜复合体与羊膜上皮干细胞共培养：将第5代羊膜上皮干细胞以1×10⁴/cm²的密度接种于六孔细胞培养板中培养，当细胞融合度长到50％以上时，更换培养液B诱导TSP-1表达；另将脱细胞角膜-巩膜复合体在医用酒精浸泡半小时，以无菌PBS缓冲液涮洗3次后置于插入式细胞培养皿中；再将该培养皿置入上述细胞培养板中培养3天，实现脱细胞角膜-巩膜复合体与羊膜上皮干细胞的共培养；得到含TSP-1和细胞生长因子的脱细胞角膜基质；培养液B的组成为，在商用MCDB153培养基中含有，KGF为10ng/ml、L-谷氨酰胺2×10^-3mol/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1.6g/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲状腺氨酸20pg/ml、亚硒酸钠5μg/ml和血管紧张肽II为20ng/ml；

步骤四、定型处理：将脱细胞角膜基质在4℃下用体积浓度40％的甘油水溶液震荡10分钟，更换体积浓度为50％的甘油水溶液震荡10分钟，再更换体积浓度为90％的甘油水溶液震荡半小时，至其厚度到0.3mm时定型结束，得到定型的含TSP-1和细胞生长因子的脱细胞角膜基质材料；

步骤五、包装与灭菌：用生理盐水涮洗材料的表面后包装，经辐照灭菌后4℃条件下保存；得到含细胞生长因子和TSP-1的角膜板层材料。

所制备的角膜板层材料厚度为0.3mm，具有较高的柔韧度，适于中浅度植床的适应症；本实例产品简单复水后即可使用，临床使用方便。

以角膜板层移植试验验证本实例产品修复兔角膜碱烧伤板层缺损的治疗效果。使用时打开产品无菌包装，根据需要用角膜环钻对角膜板层材料进行环切，直径通常为5～8mm；在兔眼表面用环钻制造与材料直径相同的缺损，分离环线内碱烧伤组织，然后用显微刀进行板层分离(厚度为300μm)；将角膜板层材料与角膜缺损植床进行缝合，并在后期观察愈合情况(见附图6)；可以看出在移植1周、4周及3月过程中角膜基质与植床融合并透明的变化。

Claims (2)

1.一种角膜板层材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、脱细胞处理：将哺乳动物眼球的角膜-巩膜复合体置于含10～50ml/L曲拉通X-100的1mol/L氯化钠水溶液中，4℃振荡5小时；再将角膜-巩膜复合体置于含曲拉通X-100为2ml/L和乙二胺四乙酸钠为0.1g/L的水溶液中，4℃振荡5小时；将本步骤反复操作不少于6次，得到脱细胞角膜-巩膜复合体；

步骤二、羊膜上皮干细胞的获取：取原代羊膜上皮干细胞进行培养，当长到60％以上融合度时，用含有4g/L胰酶的PBS缓冲液消化6分钟后，将细胞悬液600g离心5分钟获取细胞，用培养液A重悬，并以1×10⁴/cm²的密度接种原代羊膜上皮干细胞进行传代培养，得到羊膜上皮干细胞；所述培养液A的组成为，在商用MCDB 153培养基中含有，表皮细胞生长因子2ng/ml、人胰岛素10mg/L、牛脑垂体提取物2～20ml/L、L-谷氨酰胺2×10^-3mol/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1.18g/L、花生四烯酸2mg/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲状腺氨酸20pg/ml、亚硒酸钠5μg/ml和转铁蛋白100mg/L；按传代次数得到第1～5代的羊膜上皮干细胞；

步骤三、诱导分泌TSP-1以及脱细胞角膜-巩膜复合体与羊膜上皮干细胞共培养：将第1～5代羊膜上皮干细胞以1×10⁴/cm²的密度接种于细胞培养容器中培养，当细胞融合度长到50％以上时，更换培养液B诱导TSP-1表达；另将脱细胞角膜-巩膜复合体用医用酒精浸泡30分钟，并以无菌PBS缓冲液涮洗3次后置于插入式细胞培养皿中，再将该培养皿置入上述细胞培养容器中培养3天，得到含细胞生长因子和TSP-1的脱细胞角膜基质；所述培养液B的组成为，在商用MCDB 153培养基中含有，肝细胞生长因子10ng/ml、L-谷氨酰胺2×10^-3mol/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1.6g/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲状腺氨酸20pg/ml、亚硒酸钠5μg/ml、血管紧张肽II为20～50ng/ml；

步骤四、定型处理：将脱细胞角膜基质在4℃下用体积浓度40％的甘油水溶液震荡10分钟，更换体积浓度50％的甘油水溶液震荡10分钟，再更换体积浓度90％的甘油水溶液震荡30分钟，至其厚度回复到0.3～0.4mm时定型结束，得到定型的含细胞生长因子和TSP-1的脱细胞角膜基质材料；

步骤五、包装与灭菌：用生理盐水涮洗材料表面后包装，经辐照灭菌于4℃条件下保存；得到含细胞生长因子和TSP-1的角膜板层材料。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将步骤一得到的脱细胞角膜-巩膜复合体再采用以下任一种溶液继续脱细胞：1g/L十二烷基磺酸钠水溶液、10g/L脱氧胆酸钠水溶液或是20ml/L吐温20水溶液，在室温下振荡8～48h，得到脱细胞角膜-巩膜复合体。

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