CN107137768A

CN107137768A - 一种脱细胞羊膜粉的制备方法

Info

Publication number: CN107137768A
Application number: CN201710237111.8A
Authority: CN
Inventors: 刘洪�; 杨熙
Original assignee: Suzhou Nuopu Regenerative Medicine Co Ltd
Current assignee: Suzhou Nuopu Regenerative Medicine Co Ltd
Priority date: 2017-04-12
Filing date: 2017-04-12
Publication date: 2017-09-08
Anticipated expiration: 2037-04-12
Also published as: CN107137768B

Abstract

本发明公开了一种脱细胞羊膜粉的制备方法，包括1)、将羊膜清洗、剪碎；2)、在4℃的振荡器中洗涤12～24小时；3)、在4℃的振荡器中用1％的Triton x‑100和氢氧化铵洗涤1～3天；4)、在4℃的振荡器中用去离子水洗涤12～24小时；然后用PBS洗涤12～24小时；5)、‑80℃保存24小时，然后冻干；6)、低温环境下研磨成粉7)、消毒后‑80℃储存。本发明采用相对温和的脱细胞方法去除了羊膜的细胞并进行灭菌处理，整个过程中严格控制低温环境，对羊膜中的活性物质进行有效的保护；所制得的冷冻羊膜粉末可以制成羊膜胶或喷雾等多种形式，更有利于创面利用胶原与蛋白小分子，为创面愈合提供更有效的营养支持，其生长因子等活性物质可持续促上皮化。

Description

一种脱细胞羊膜粉的制备方法

技术领域

本发明涉及一种脱细胞羊膜粉的制备方法。

背景技术

羊膜是胎盘的最内层，包裹着羊水的光滑的、无血管、神经及淋巴、具有弹性一层生物半透膜；羊膜中存在Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原和纤维粘连蛋白、层粘连蛋白等多种蛋白成分及一些生长因子，如表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)等，这些生长因子能促进上皮细胞的增殖、迁移、分化，增强上皮细胞的粘附性，促上皮化，减轻瘢痕；

羊膜可促进结膜干细胞分化为结膜上皮细胞、促进结膜上皮向角膜上皮转化，促进角膜缘干细胞增殖及提供一个有助于其生长的微环境，促进角膜上皮细胞移行、促进角膜基质胶原纤维增生、抑制结膜下纤维组织增生、抑制新生血管增生，具有抗炎、抗菌等功能；羊膜上皮细胞不表达hla-a、b、c、dr抗原或β2微球蛋白，表达ib抗原、限制ia抗原，这些特点使羊膜表达低抗原性；羊膜中含有多种胶原及蛋白成分，可以为创面愈合提供丰富的营养支持；

羊膜的生物学特性和医学研究均证明羊膜作为敷料应用于创面时相比其他很多人工合成敷料具有明显的优势；人羊膜上皮细胞不表达hla-a、b、c、dr抗原或β2微球蛋白，表达ib抗原、限制ia抗原，这些特点使羊膜表达低抗原性；羊膜的结构与羊膜中的胶原和多种活性物质不仅可以使羊膜发挥较好的屏障作用，而且还具有抗菌消炎、促愈合、减轻挛缩等作用；羊膜内的胶原、蛋白成分和活性因子，在作为敷料应用于伤口时营养成份的利用和活性因子的释放率可以加快创面愈合速度和提高创面愈合质量。但新鲜生物羊膜为单层结构，厚度薄，易卷曲折叠，滑动脱落，有效作用时间短，在应用创面时会有一定局限性；人们对新鲜羊膜做处理使其在保留天然优良性能的同时改良缺陷和不同，使其具有更大价值。

专利CN103114073B公布了一种人羊膜的脱细胞方法，采用表面活性剂TritonX-100、胰脂酶、DNA酶结合作用，属于化学与生物方法相结合的较彻底的脱细胞方法，但这类方法形成会导致蛋白成分和生长因子的大量流失，可做为较理想的组织工程的支架材料，但作为敷料应用于创面时的作用会大大下降；

专利CN200510046856.3公开了一种干燥活性羊膜的制备方法，可以将新鲜羊膜脱细胞后冷冻干燥，有延长了羊膜的保质期，随取随用的优点，但仍然是单层结构，厚度薄，质感脆，在不规则创面的应用上的适应性差。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的羊膜的脱细胞方法不够温和，同时具有抗原性和其他来源于供体的风险的缺陷，提供一种能适应不同创面的脱细胞羊膜粉的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

1、一种脱细胞羊膜粉的制备方法,其特征在于，包括以下步骤：

1)、将新鲜的羊膜清洗，去除表面血迹，剪成碎片；新鲜的羊膜清洗时使用无菌水、无菌盐水或培养基；可将羊膜剪成面积为5×5cm的碎片，可以用无菌剪刀和镊子，手术刀或切片机，也可以按用途更改尺寸；新鲜的羊膜取自新鲜的胎盘，可以是人源，也可以是动物源；

2)、在4℃的振荡器中用去离子水洗涤12～24小时,每4～6小时更换一次去离子水；

3)、在4℃的振荡器中用质量分数为0.1～2％的Triton x-100和氢氧化铵混合液洗涤1～3天，每天更换洗涤液；本步骤还可用细胞刮刀等器具轻刮羊膜表面后震荡细胞等机械方法达到脱去羊膜上皮细胞的目的。

4)、在4℃的振荡器中用去离子水洗涤12～24小时,每4～6小时更换一次去离子水；然后用PBS洗涤12～24小时，每4～6小时更换PBS；

5)、-80℃保存24小时后进行冻干，将泥浆状支架置于一次性无菌平皿中，转移至冻干机冷阱中预冷2～5小时，开启真空冻干24～48小时，无菌收料；还可以采用将羊膜碎片放在无水乙醇或干冰中迅速冷冻，再放在冷冻干燥器中以-20℃冻干直至干燥的方法实现；

6)、将羊膜碎片放入钢桶中浸入液氮中预冷后，钢桶放入冷冻研磨机中研磨频率为40～80Hz，研磨时间为20～60s，形成粒径<250um的羊膜粉。

7)、消毒后-80℃储存备用。优选的，采用15～30KGy的γ射线辐照灭菌。

进一步的，振荡器的转数为120～150rpm。

进一步的，步骤3)中除Triton X-100和氢氧化铵的方法外，还可用细胞刮刀等器具轻刮羊膜表面后震荡细胞等机械方法达到脱去羊膜表层上皮细胞的目的。

进一步的，步骤5)中将冷冻后的羊膜碎片放入冻干机冷阱中预冷2-5小时，开启真空冻干24～48小时。

进一步的，步骤2)-7)中严格控制不高于4℃的低温环境，冻干、研磨工艺过程中控制低温环境以保护羊膜中的活性因子。

进一步的，以步骤7)中的脱细胞羊膜粉末为中间产品，消化后制成可溶羊膜、进一步交联后制成羊膜胶、喷雾、药膏等其他形式添加到辅料、药物中应用或直接应用于创面。

进一步的，以步骤7)中的脱细胞羊膜粉末与胶原、透明质酸、壳聚糖等生物大分子聚合物及PPO、PEO等合成聚合物或其他材料交联应用于组织工程或其他领域。

本发明与现有技术相比，具备如下优点：

(1)本发明采用相对温和的脱细胞方法对羊膜进行脱细胞并进行灭菌处理，避免了羊膜的免疫原性和其他来源于供体的风险，这使脱细胞后的羊膜在应用于人体时避免了免疫排斥的问题；

(2)洗涤、脱细胞和研磨工艺过程中严格控制低温环境，研磨时间短，减少过程中活性物质的损失，对羊膜中包括人表皮生长因子(EGF)、人成纤维细胞生长因子(FGF)人肝细胞生长因子(HGF)、人血管内皮生长因子(VEGF)、人神经生长因子(NGF)、胰岛素样生长因子(IGF)等生长因子在内的各种活性物质进行有效的保护(如表一)，胶原蛋白等分子和生长因子等活性因子的保留比较充分，可以为创面愈合提供更有效的营养支持，其生长因子等活性物质可持续促上皮化，预防和减轻炎症以及加速愈合；

(3)与厚度薄，易卷曲与移动，在创面上作用时间短，且对不规则创面的应用上有一定的局限性的单层羊膜相比，所制得的冷冻羊膜粉及羊膜胶或喷雾，可以应用于不规则形状和深度伤口的治疗或添加到辅料、药物中应用，适应性广泛；

(4)本发明制得的羊膜粉末粒径小，更有利于创面利用胶原与蛋白小分子，为创面愈合提供更有效的营养支持，其生长因子等活性物质可持续促上皮化，加速创面愈合；抑制新生血管和纤维组织增生，减少瘢痕生成，增加愈合质量；

(5)本发明制得的冻干羊膜可作为一种支架材料与胶原、透明质酸、壳聚糖等生物大分子聚合物及PPO、PEO等合成聚合物或其他材料交联应用于组织工程或其他领域。冻干脱细胞羊膜粉中含有丰富的胶原和各种生长因子，可作为制成护肤保养品的原材料使用。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

一种脱细胞羊膜粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、收集新鲜的人类胎盘，将羊膜从胎盘内侧剥离，将新鲜的羊膜清洗，去除表面血迹，剪成碎片；新鲜的羊膜清洗时使用无菌水、无菌盐水或培养基；可将羊膜剪成面积为5×5cm的碎片，可以用无菌剪刀和镊子，手术刀或切片机，也可以按用途更改尺寸；新鲜的羊膜取自新鲜的胎盘，可以是人源，也可以是动物源；

3)、在4℃的振荡器中用质量分数为0.1～2％的Triton x-100和氢氧化铵混合液洗涤1～3天，每天更换洗涤液；本步骤还可以使用还可以采用轻刮羊膜表面配合震荡羊膜等机械方法来实现脱细胞的目的；

5)、-80℃保存24小时后冻干，将泥浆状支架置于一次性无菌平皿中，转移至冻干机冷阱中预冷2～5小时，开启真空冻干24～48小时，无菌收料；此外，还可以采用将羊膜碎片放在无水乙醇或干冰中迅速冷冻，再放在冷冻干燥器中以-20℃冻干直至干燥的方法实现；

7)、消毒后-80℃储存备用。优选的，采用15～30KGy的γ射线或电子束辐照灭菌。

脱细胞羊膜粉蛋白含量分析实验：

比色法来衡量总蛋白，胶原蛋白，弹性蛋白和糖胺聚糖含量；

ELISA试剂盒测定生长因子含量；包括：人表皮生长因子(EGF)、人成纤维细胞生长因子(FGF)、人血管内皮生长因子(VEGF)、人肝细胞生长因子(HGF)。

结果如下表所示：

表一、脱细胞羊膜粉的蛋白含量及细胞因子含量

名称	含量(mg/g)	名称	含量(ng/g)
				总蛋白	163.6	EGF	11.393
弹性蛋白	30.44	FGF	1.529
				胶原蛋白	105.2	VEGF	4.84
糖胺聚糖	0.82	HGF	26.791

对本发明中蛋白含量和几种生长因子的含量检测结果显示，按本发明的方法制作的羊膜粉末对胶原蛋白等分子和生长因子等活性因子的保留比较充分，可以为创面愈合提供更有效的营养支持，其生长因子等活性物质可持续促上皮化，加速创面的愈合。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种脱细胞羊膜粉的制备方法,其特征在于，包括以下步骤：

1)、将新鲜的羊膜清洗，去除表面血迹，剪成碎片；

3)、在4℃的振荡器中用质量分数为0.1～2％的Triton X-100和氢氧化铵混合液洗涤1～3天，每天更换洗涤液；

5)、-80℃保存24小时后冻干，将泥浆状支架置于一次性无菌平皿中，注意无菌操作，转移至冻干机冷阱中预冷，开启真空，按照预设的冻干工艺冻干，无菌收料。

6)、将冻干后的羊膜碎片放入钢桶中浸入液氮中预冷后，钢桶放入冷冻研磨机中研磨成粉；

7)、将羊膜粉辐照灭菌后-80℃储存备用。

2.如权利要求1或2所述的脱细胞羊膜粉的制备方法，其特征在于，步骤2)-4)中温度保持在4℃，振荡器的转数为120～150rpm。

3.如权利要求1所述的脱细胞羊膜的制备方法，其特征在于，将所得5)所得的无菌脱细胞冻干羊膜碎片放入液氮中预冷2min后在冷冻研磨机中，研磨频率为40～80Hz，研磨时间为20～60s，形成粒径<250um的羊膜粉。

4.如权利要求1或4所述的脱细胞羊膜粉的制备方法，其特征在于，所述步骤6)中采用15～30KGy的γ射线或电子束辐照灭菌。

5.如权利要求1所述的脱细胞羊膜粉的制备方法,其特征在于，步骤3)中除Triton X-100和氢氧化铵的方法外，还可用器具轻刮羊膜表面后震荡细胞达到脱去羊膜表层上皮细胞的目的。

6.如权利要求1所述的脱细胞羊膜粉的制备方法,其特征在于，步骤5)中将冷冻后的羊膜碎片放入冻干机冷阱中预冷2-5小时，开启真空冻干24～48小时。

7.如权利要求1所述的脱细胞羊膜粉的制备方法,其特征在于，步骤2)-7)中严格控制不高于4℃的低温环境，冻干、研磨工艺过程中控制低温环境以保护羊膜中的活性因子。

8.如权利要求1所述的脱细胞羊膜粉的制备方法,其特征在于，以步骤7)中的脱细胞羊膜粉末为中间产品，消化后制成可溶羊膜、进一步交联后制成羊膜胶、喷雾、药膏添加到辅料、药物中应用或直接应用于创面。

9.如权利要求1所述的脱细胞羊膜粉的制备方法,其特征在于，以步骤7)中的脱细胞羊膜粉末与生物大分子聚合物及合成聚合物交联应用于组织工程领域。