CN115227862A - 治疗用水凝胶敷料的制备与使用 - Google Patents

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Abstract

本发明讨论了从羊膜组织等生物材料制备医用生物材料的系统和方法。在一些实施例中，羊膜组织被研磨并用于产生水凝胶。材料和制备方法的变化导致一定的产品特性，例如蛋白质活性的保存和/或增稠时间，适用于各种治疗用途。作为说明性示例，精细研磨的羊膜组织的水凝胶可以冷冻干燥并冷冻研磨至适合用于眼科、口腔或其他治疗的粒度。在一些实施例中，本发明包括高效且有效的低温研磨工艺和机械工程设计，以制造用于工业大规模制造的精细、均匀尺寸和高度溶解的粉末颗粒。这是在保持被研磨生物材料原有的重要物理、化学和生物学特性的同时完成的。示例性包括研磨羊膜组织、蛋白质、胶原蛋白、粘多糖和冻干组织，以产生医用生物材料。

Description

治疗用水凝胶敷料的制备与使用
技术领域
本申请涉及选择性优化用于治疗目的的水凝胶的制备与开发。
背景
治疗性敷料由人体组织和动物组织制备。由于这些材料所含天然生物成分能够减少炎症、促进愈合和/或具有其他优势，因此材料非常有益。例如，参见美国申请专利US2018-0100139 Al。但是实际应用方面，传统方法制备的组合物缺少许多治疗用途所需的满意特性。因此，此类组合物构成在诸多应用中不适用。
概述
本发明公开了生物材料制备水凝胶的改进方法。可以操作并控制获得材料(如水凝胶)多种特性。例如，可对制备步骤进行设定，使制得的水凝胶具备特定治疗用途所需的特性。一些实例中，制备涉及组织(如羊膜组织)低温研磨(得到细度符合需求的粉末)，向粉末中添加液体(以获得治疗用水凝胶)。低温研磨可以防止破坏组织中的生物活性组分。可以利用粉末颗粒的细度控制水凝胶在使用时的增稠速率，以便选择特定治疗流程所需的增稠时间和/或固化时间。而且，细度还支持实现在喷雾系统中进行粉末再水化。某些实例中，制备涉及到粉末的低温灭菌。这种精准温度控制灭菌在保持组织源性粉末有用生物活性成分同时杀灭微生物。
本发明的水凝胶可应用于各种治疗，包括皮肤和皮下应用、口腔应用和食道应用、眼科应用、阴道应用和尿路应用、外科应用等。水凝胶应用其他示例，如申请文件其他部分所述。
本发明的各种实例包括组织源性粉末的制备方法。可对粉末进行配方设定，在添加液体(如水、盐水及其他生物相容性液体等)之后形成糊剂或水凝胶。各种实施示例包括、粉末、水凝胶生产方法、各种传递系统和/或处理方法。
例如，这些方法包括去细胞化、化学变化、物理变化、灭菌和/或添加治疗用复合物等，以便制备治疗性材料(组合物)。治疗性材料可以包含在固体(如冰冻干粉末)、凝胶、糊剂、液体等物质中。可对治疗性材料进行设定，以便应用于多种医疗用途。例如，利用治疗组合物抑制不良组织的生长(如纤维化和组织增生)、减少炎症、输送治疗成分(如抗生素)、治疗眼外伤、治疗烧伤等。虽然以前也有提出了将组织源性水凝胶用作一种治疗手段，但是诸多应用中，难以做到在保持所需生物活性的同时制备适当的水凝胶。本发明的各种实施示例攻破了这些技术壁垒。
本发明的各种实施示例包括了一种治疗组合物，这种治疗组合物包括细胞外基质，其中，细胞外基质源自去细胞化人体组织或动物组织，经物理处理、化学处理及生物处理，从而改变免疫反应或其他生物过程；添加载体基质到细胞外基质中，并对其进行设定，从而控制治疗组合物的粘度、粘附性、固化和生物降解速率。依需细胞外基质可选择性地来源于人体组织或者源自动物组织。
本发明的各种实例包括生物活性水凝胶的制备方法，包括：羊膜组织接收；冰冻干燥羊膜组织；在低于-10℃的温度下研磨羊膜组织，制备羊膜组织颗粒粉末，而且至少50％的粒径小于200微米；向冻干粉添加再水化液体，制备水凝胶。
本发明的各种实例包括以下物质组成的生物活性水凝胶系统：羊膜组织的再水化冻干粉，其中至少50％的冻干粉粒径小于200微米，而且在-10℃的温度下研磨羊膜组织，保持冻干粉所含活性材料的生物活性。
本发明的各种实例包括以下物质组成的治疗系统：细胞外基质，其中细胞外基质源自于去细胞化的人体组织或动物组织，并经化学处理，以改变免疫反应；添加载体基质到细胞外基质中，并对其进行设定，从而控制治疗组合物的粘度、粘附性、固化和生物降解速率。
本发明的各种实例包括一种治疗系统，而该治疗系统所含的组合物包括：细胞外基质，其中细胞外基质源自于去细胞化的人体组织或动物组织，并经化学处理，以改变免疫反应；添加载体基质到细胞外基质中，并对其进行设定，从而控制治疗组合物的粘度、粘附性、固化和生物降解速率。
本发明的各种实例包括一种治疗系统，而该治疗系统所含的组合物包括：经过研磨的羊膜组织粉末，其颗粒细度为D50(μm)或小于200μm，而且羊膜研磨温度低于0℃、-10℃、-20℃或-30℃，以保持羊膜组织的生物活性。
本发明的各种实例包括治疗组合物的制备方法，包括：羊膜组织获得；混合羊膜组织，该混合选项包含组分均匀化和/或添加的附加治疗组分；低温研磨羊膜组织，该研磨选项包括和/或冰冻干燥，并使粉末的粒径(D50)小于200μm、100μm或50μm。
本发明的各种实例包括使用本文件所述的粉末或再水化粉末治疗本文件所述的任何一种疾病之方法，其中本文件所述的疾病包括关节损伤或关节退化、支架内再狭窄、妊娠纹、扩张纹、视网膜撕裂、视网膜脱落、黄斑裂孔、眼表创伤、干眼症、眼内损伤、老年性黄斑病变(AMD)、视网膜色素上皮细胞(RPE)再生、阴道外伤或肛门外伤、口腔疾病、放射性治疗损伤、痤疮、除皱、保湿、皮肤调理(褐斑、色素沉着过度和皮肤轻度发红)、胃反流损伤、放射烧伤、皮肤填充和皮肤丰盈。
附图概述
图1所示是根据本发明的各种实例制备治疗用水凝胶的方法。
图2所示是根据本发明的各种实例的“研磨方法200”。可将这些方法作为图1所示“研磨步骤130”的一部分执行(可选)。
图3所示是根据本发明的各种实例研磨的示例性间歇型研磨系统。
图4所示是根据本发明的各种实例，研磨以及没有研磨情况下的生物活性测定结果。
图5所示是根据本发明的各种实例，通过ELISA分析测定的、作为载体在水凝胶中释放的重组人表皮细胞生长因子(hEGF)的量。
图6所示是根据本发明的各种实例，水凝胶在滴注化学试剂后，对于防止与治疗宫腔粘连的效果。
图7所示是根据本发明的各种实例，通过角膜化学(碱)烧伤的动物研究，水凝胶对眼表创伤和干眼症的效果。
图8所示是根据本发明的各种实例，通过角膜机械损伤的动物研究，水凝胶对眼表创伤的效果。
图9A和9B所示是根据本发明的各种实例，用高度稀释的水凝胶在体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞。
图10所示是根据本发明的各种实例，用水凝胶治疗放射性皮炎和疼痛真实患者的病例研究。
图11所示是根据本发明的各种实例，用(喷雾式)水凝胶治疗口腔黏膜炎和疼痛真实患者的病例研究。
图12所示是根据本发明的各种实例，用水凝胶治疗放化疗诱发的放射性皮炎患者自我报告的真实病例研究。
图13所示是根据本发明的各种实例，用水凝胶治疗放化疗诱发的口腔黏膜炎真实患者自我报告的病例研究。
图14所示是根据本发明的各种实例，用水凝胶治疗放射性阴道炎患者自我报告的真实病例研究。
图15所示是根据本发明的各种实例，放射性直肠炎的病例患者自我报告研究。
图16所示是根据本发明的各种实例，用水凝胶治疗普通痤疮患者的真实病例研究。
图17所示是根据本发明的各种实例，结合激光治疗用水凝胶治疗妊娠纹患者的真实病例研究。
图18A和18B所示是根据本发明的各种实例，在中胚层微注射中，用水凝胶进行皮肤再生、补水、填充和丰盈获得改善的患者满意度真实病例研究。
详细说明
通常对本发明的各种实例的粉末进行设定，从而进行再水化，以形成糊剂、水凝胶或溶液。然后，可将糊剂、水凝胶或溶液应用于本申请文件所述的治疗方法。粉末和/或水凝胶包括源自于活体材料以及选项组分的一种或多种附加组分。例如，材料可能包括人体组织或动物组织、细胞、蛋白质、胶原蛋白、粘多糖、羊膜组织、胎盘组织、羊膜囊组织、脐带组织、软骨、干细胞、酶、激素、细菌、酵母、藻类等。例如，一种或多种可选组分，可能包括：微量元素、抗代谢剂、抗真菌剂、镇痛药、肌细胞、分化干细胞、皮肤细胞、神经细胞、免疫细胞、维生素、病毒、生物组合物、细胞、交联材料、水凝胶基质结构、粘度控制化合物、交联化合物、药物、抗炎剂、抗体、T细胞、疫苗、免疫系统抑制剂或促进剂、抗生素、抗病毒剂、酶、肽、噬菌体、增稠剂、缓冲剂、盐、脂肪(如omega-3s)、天然油、芦荟、矿物油、抗氧化剂、着色剂、化妆品、纤维蛋白、干细胞支架、保湿剂、防晒霜、茶提取物、维生素C7透明质酸、乳酸、α-羟基酸或β-羟基酸、胶原蛋白、胶体、激素、防腐剂、甜味剂、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽等。在本申请文件中，有时将这些可选组分和再水化液体称为“载体基质”，因为它们载有研磨组织和附加组分。在用于制备粉末的研磨过程之前和/或之后，可以添加/组合成这些组分的不同组合。在各种实例中，干燥粉末的保质期为3-5年或超过5年。各种实例中，治疗用水凝胶包括人体或动物羊膜组织。
粉末或再水化粉末可能包含的具体激素包括生长激素、干扰素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇、雌激素、亲吻促动激素、瘦素、促黑素细胞激素(MSH)、褪黑激素、去甲肾上腺素、催产素、多肽YY、黄体酮、催乳素、前列腺素、松弛素、血清素、生长抑素、甲状腺激素、维生素D等。
在一个典型示例中，将哺乳动物羊膜组织与胶原蛋白增稠剂混合，在将其研磨成粉末之前进行均质化。研磨之后、干燥之前，向所得粉末添加抗生素。可以通过再水化、光照、接触空气或与活化剂混合而增稠。例如，粉末或再水化液体的一些实例中有光敏交联剂。
在一个典型示例中，研磨前对人体组织和/或动物组织进行均质化，并与干细胞进行混合，研磨之后，向所得粉末中添加设定为干细胞生长的基础材料。与干细胞混合之前，对人体组织或动物组织进行灭菌。
在一个典型示例中，将猪的羊膜组织与激素混合并进行均质化。进行组织匀浆化后，对混合物进行冰冻干燥(即冻干)和研磨，以制备粉末。就以下目的选择激素：促进生长、减少炎症、增加或减少血管形成、刺激干细胞生长、将干细胞生长分化为特定的细胞类型(即分化)、保持神经生长或血管生长。
在一个典型示例中，研磨前将羊膜组织与增稠剂混合，然后进行均质化与冰冻干燥。对研磨后的粉末进行再水化后，可以选择增稠剂来控制水凝胶或糊剂的增稠。
在一个典型示例中，粉末包含研磨组织，将其添加至某种液体来制备水凝胶或糊剂，其中液体包含缓冲剂、盐、增稠剂、抗生素和/或本文公布使用(本申请文件公开的各种实例所用粉末)组分的其他任何材料组合。在一个典型示例中，任何制备的眼科用品。以粉末的形式提供，并在现场将粉末与纯化水混合。粉末包括去细胞化猪胎盘组织、羧甲基纤维素钠、氯化钠、氯化钾和作为防腐剂的任何聚季铵盐-1。
在各种实例中，如本申请文件示例所述，在研磨、组织匀浆化、冷却、灭菌、干燥和/或再水化之前、期间和/或之后，以任何顺序混合粉末、水凝胶、糊剂或溶液的组分。
图1所示是根据本发明的各种实例，制备治疗用水凝胶的方法。通过改变水化的液体量，按图示方法即可适用于任何制备治疗用糊剂或溶液。方法包括制备研磨粉末，从而获得所需特性，然后针对各种治疗目的(部分治疗目的如本申请文件其他部分所述)对粉末进行灭菌和再水化。图1所示的步骤可选择顺序执行。在“获得组织步骤110”中，获得所需特性的组织。组织包括人体组织或动物组织。例如，组织可能包括人体、猪、家禽、绵羊、野猪、马、牛、羊、鼠、软体动物、两栖动物、兔或其他哺乳动物、鱼等动物的羊膜组织、动物胚胎组织和/或其他的适当来源。例如，在某些实例中，基质源自于羊膜组织(如胎盘、液囊或脐带)和鱼皮的混合物。在具体示例中，组织包括源自于家养的兔、猪、绵羊或牛的胎盘组织。在某些实例中，对组织进行选择，以获得具有多种治疗特性的组分，如抗炎化合物、生长刺激剂、抗菌特性、抗瘢痕特性等。羊膜组织可选择胎衣或在动物屠宰期间获取。在替代示例中，“获取组织步骤110”包括了获取培养细胞(如细菌、酵母菌、藻类)，而不是获取或只是获取更高级别的组织。此外，可选择组织包括羊膜囊组织、羊水、眼组织、淋巴结组织、神经组织、脐带组织等的一种或多种。例如，在各种实例中，细胞外基质源自于各种组织，例如皮肤、真皮、膀胱、小肠、间皮、心包、心脏瓣膜、阔筋膜、肝、肺、心脏、脂肪、骨骼、血管、神经导管、软骨、角膜、乳房、结肠、胎盘、羊膜、以及其他组织和器官。
在“混合步骤120”中，将获取的组织和附加组分(本申请文件其他部分所述的一种或多种组分)混合。可在图1和图2所示多个步骤的之前或之后，分多个阶段执行“混合步骤120”。例如，可将组织与增稠剂、生长激素、抗生素和/或抗炎剂混合之后再行研磨，并在灭菌之后将所得粉末与干细胞混合。可选择组织包含细胞外基质，添加的辅料作为载体基质。
“混合步骤120”包括组织或附加组分的组织匀浆化。例如，可在冰冻干燥之前、研磨之前和/或再水化之前对组织进行均质化。至少应在研磨期间完成部分“混合步骤120”。
“混合步骤120”可选择性进一步包括组织的去细胞化。可以利用以下物理方法完成去细胞化：1)细胞内冰晶破坏细胞膜的多次冻-融循环；2)促使细胞破裂的外力和静水压力；3)脉冲电场破坏细胞膜的非热不可逆电穿孔。也可利用化学方法完成去细胞化：1)利用酸性的碱处理，溶解细胞的细胞质组分并破坏核酸；2)利用渗透压休克分解细胞的低渗溶液和高渗溶液(而且渗透压休克可以破坏DNA-蛋白质相互作用)；3)使用可以破坏DNA-蛋白质的相互作用、脂质与脂质的相互作用和脂质与蛋白质的相互作用、使用较小程度破坏蛋白质与蛋白质的相互作用的非离子去污剂(Triton-x 100)；4)使用可以溶解细胞与核膜、并倾向于使蛋白质变性的离子去污剂(如十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、Triton X-200)；5)使用具有非离子去污剂和离子去污剂特性的两性离子去污剂(如CHAPS(丙磺酸内盐)、磺基三甲铵乙内酯-10(SB-10)和磺基三甲铵乙内酯-16(SB-16))；6)使用可以通过脱水分解细胞、同时可以溶解并去除脂质的醇；7)使用可以通过脱水分解细胞、同时可以溶解并去除脂质的丙酮；8)使用可以与金属形成稳定复合物、并能破坏蛋白质与蛋白质相互作用的磷酸三丁酯(TBP)。可以用以下生物方法完成去细胞化：1)使用各种酶(比如可以促进核糖核酸链和脱氧核糖核酸链水解的核酸酶、可以切割精氨酸和赖氨酸C侧肽键的胰蛋白酶，以及可以切割特定缩氨酸的分散酶，主要为纤连蛋白和IV型胶原蛋白)；2)使用非酶制剂，例如：a)可以结合金属离子、从而破坏ECM(细胞外基质)细胞粘附的螯合剂(EDTA(乙二胺四乙酸)、EGTA(乙二醇双四乙酸))；(b)可以抑制(维持天然ECM超微结构需要的)多种蛋白酶的抑制剂(苯甲基磺酰氟、抑肽酶、亮肽素)。
在“研磨步骤130”中，对组织和全部或部分附加组分进行研磨制备粉末。已经开发了多种研磨系统与方法。在各种实例中，这些系统与方法所得粉末的细度符合要求，即细度较小且细度差异较小。所得粉末通常高度易溶于水或其他生物兼容性液体。例如，粉末可以以干燥形式存储，然后与液体混合以制备溶液、糊剂或水凝胶。根据各种实例和粉末外观，进行粉末制备所用生产工艺的设定，应该适宜保护制备粉末用研磨生物材料的化学特性和生物特性，同时实现所需的细度。在不同条件下(如利用不同的研磨方法获取所需的粉末)，可选择性多次重复“研磨步骤130”。
可选择性进行低温研磨，可以和/或研磨的材料包含冰冻干燥组分。如本申请文件其他部分的论述，可以在温控研磨机中进行研磨，而且研磨机的设定应能够保持研磨材料在研磨过程中处于不同的温度范围(可选择低于室温)。为了保持研磨组分的生物活性和/或治疗活性，应选择性地选择温度。
“研磨步骤130”的更多细节如本申请其他部分所述，如图2。在某些实例中，作为“混合步骤120”的一个小步骤，向研磨所得的粉末中添加附加组分。
在“灭菌步骤140”中，对“研磨步骤130”制得的粉末进行灭菌。在“灭菌步骤140”中，虽然可以使用众所周知的灭菌方法，但是本发明的各种实例中包含专用的灭菌方法，这些灭菌方法的设定可以在杀灭不符合要求的污染物/成分(如不符合要求的病毒和/或细菌)的同时，保留粉末所需的生物活性和/或治疗特性。在某些实例中，在研磨之前执行“灭菌步骤140”。例如，可将组织浸泡在置于(室温，140-160转/分钟)摇振器上的0.15％-0.18％的过乙酸溶液/4％-4.8％的乙醇溶液(或Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚))中2小时。然后在(室温，140-160转/分钟)摇振器上用去离子水冲洗三次，每次冲洗10分钟。对原组织和研磨后的组织进行灭菌。
在说明示例中，“灭菌步骤140”包括了提供一定剂量灭菌放射的同时冷却粉末。例如，这种放射包括α粒子、高能电子、高能离子、中子、质子、伽马射线、X射线和/或紫外线。在灭菌过程中冷却粉末包括使用制冷剂、热电冷却、蒸发冷却等。
在另一说明示例中，“灭菌步骤140”包括了灭菌过程中相对于灭菌放射源移动的粉末，从而最大程度地减小灭菌放射引起的局部发热。例如，通过光栅将高能电子束引导至粉末薄层上，即可实现相对移动。或将粉末放入密封小瓶并进行旋转，同时将小瓶暴露于电子束或其他灭菌放射源。标准的电子束剂量可以是15KgY。在“灭菌步骤140”过程中，选择同时使用移动和冷却，从而在实现所需要的灭菌目标同时，最大程度减小对粉末需要活性的损害。例如，如果将粉末用于体外治疗，则可能需要规定灭菌标准。冷却和相对移动结合可以实现本标准，同时优化所需生物特性功能的保护。通过放射源脉冲辐射，实现灭菌过程相对移动的优点。
可选的“存储步骤150”中，存储“研磨步骤130”所得的粉末，备用。通过可控室温下存储、10℃、5℃或0℃以下存储、干粉方式的存储和/或添加防腐剂(如抗氧化剂)，可以延长粉末的保持期。在某些实例中，将粉末存储于密封小瓶和/或密封传递装置(例如，参见“应用步骤170”)。可以用真空或惰性气体存储粉末。
在选择“再水化步骤160”中，对“研磨步骤130”所得的粉末进行再水化。为了确保获得产物为糊剂、水凝胶或溶液状态，可以选择粉末进行再水化处理液体的用量。并且，液体的用量也可以用于控制水凝胶的粘度。在各种实例中，用于对粉末进行再水化处理的液体包括水、盐水、生理盐水、高渗盐水、缓冲盐水、缓冲液、食用油、果汁、乳制品等。选择适用预期用途的液体。例如，为了匹配所治疗的身体部位的pH值，可以调整水化液的盐浓度和/或pH值(由此制得的水凝胶)。(对于心脏或尿道等而言，眼部的pH值和盐浓度均有一定差异。)用于粉末再水化的液体，选择包含本申请文件所述的一种或多种附加组分水凝胶。
在某些实例中，需使用前立即执行“再水化步骤160”。例如，通过再水化制备的水凝胶可能在水化之后数小时之内增稠(粘度增加)。如本申请文件的其他部分所述，颗粒的细度越小，增稠越快。这就为某些示例提供了优势，例如，在某些眼科修复中，可能需要30分钟、20分钟或15分钟以下的增稠时间，以便外科医生无需在手术期间因等候所需粘度而长时间等待。
在干燥粉末用于治疗的实例中，“再水化步骤160”是可选步骤。例如，用作干燥伤口敷料的组成部分涂抹于伤口，或作为涂层附着于套管、定量管或培养管。在某些实例中，当粉末与体液接触时才会发生再水化。例如，在缝合线涂有粉末的应用中，当缝合线在伤口缝合过程中穿透身体时才会发生再水化。
在“应用步骤170”中，将“研磨步骤150”制得的粉末、或由此生成的糊剂、水凝胶、或溶液用于治疗、营养或美容。一些说明示例如本申请文件其他部分所述，这些应用差异很大。
在“应用步骤170”的各种实例中，选择于再水化之后将包括研磨组织在内的粉末加入机械输送装置，形成治疗输送系统。在简单示例中，将粉末存储于已灭菌的密封小瓶中。在各种实例中，以下物质均包含粉末：化妆品、皮肤霜、防晒霜、伤口敷料、绷带(如水状胶体凝胶绷带或Band-AidTM)、滴眼剂、抗炎霜、止痒膏、伤口缝合带、外科海绵、卫生棉条、(肛门或阴道用)栓剂、注射装置、宫内节育器、支架、导管、透皮插管、鼻腔或口腔插管、透皮贴剂、经过设定后可植入活体或动物的装置等。在各种实例中，可以使用注射装置、化妆品分液器、显微针或喷雾装置、雾化器、套管、导管、支架等输送(湿润或干燥)粉末，并且可添加至(可吸收或不可吸收的)稳固手术材料或缝合材料、可饮用液体等。在任何一种机械输送装置或组合物中，可以根据具体的系统酌情对粉末进行干燥或再水化，以形成糊剂、水凝胶、喷雾剂、凝胶和/或溶液。
例如，可将粉末置于喷雾瓶中、喷洒于伤口上或口腔中、置于伤口敷料中、置于可饮用液体中，也可使用显微针进行注射和添加。在某些实例中，最终用户可以通过选择再水化体积和/或液体在水凝胶、糊剂或(粉末完全溶解的)溶液之间选择。例如，可以利用治疗组合物抑制不良组织的生长(如纤维化和组织增生)、减少炎症、输送治疗化合物(如抗生素)、治疗眼外伤、治疗烧伤等。可将粉末附着于通过设定后即可插入人体的装置，如缝合线、手术钉、海绵、套管、导管、替换关节零部件、手术棒、支撑物、螺钉或销钉、支架、电极、传感器、药物输送装置(如胰岛素泵)、穿孔、乳房植入物等。在某些实例中，将粉末或水凝胶放入增压或非增压喷射瓶。将粉末放入气溶胶喷罐。由于颗粒细度较小，因此可以实现喷涂应用。可将粉末和/或水凝胶喷于伤口、患处、其他口腔或皮肤疮口。组织源性粉末、糊剂和/或水凝胶可用于减少与穿孔和/或纹身有关的炎症并促进愈合。例如，可用于促进感染的口腔或阴道穿孔的愈合。
一般情况下，可将本发明各种实例的研磨系统(如“研磨步骤130”的研磨系统)分为“间歇型”系统和“连续型”系统。在间歇型研磨系统中，同时研磨一定量的材料，即对于所有材料，研磨同时开始、同时结束。可在容器(如碗状容器)中进行间歇型研磨。除了拟研磨的材料之外，还应向容器中加入研磨球。使用搅拌转子(如
Figure BDA0003604780330000051
10*30mm)选择移动这些研磨球。在连续型研磨系统中，在加料口添加拟研磨的材料，在出料口输出研磨材料。连续型研磨系统的示例包括螺旋研磨机。此类研磨机的多个区域设有不同的研磨机具。例如，这些机具包括经过设定可以向前输送材料的进料器结构(如单螺旋、双螺旋或多螺旋)、磨锥区、叶片区、螺旋钻头区、齿轮区或其他啮合零部件区、锥形区、滚筒区、绞碎器区、和/或研磨球区。不同区域的转速也不相同。例如，连续型研磨机的进料区可能由滚筒区和/或研磨球区隔开。尽管本申请文件出于示例目的论述了间歇型研磨系统，但是给出的说明和示例同样适用于连续型研磨系统。例如，本申请文件所述的冷却系统既适用于间歇型研磨系统，也适用于连续型研磨系统。
通过控制可优化所得产物的研磨特性包括研磨速度、研磨球大小、研磨区域、结构和细度、研磨锥度、容器温度、研磨液配方与温度、研磨时间等。在各种实例中，为了获得所需的颗粒细度和分布、同时保留所得粉末所含化合物的生物活性，对这些特性进行选择。具体而言，获得足够小的粉末细度，以实现良好的溶解性和/或适当的水凝胶增稠时间，同时让研磨温度可以保持生物活性。
在说明实例中，温控研磨罐采用夹套，而且可对其连接件进行设定，使制冷剂在壁间流动。内壁和外壁由不同的材料制成，如分别采用尼龙和不锈钢。研磨期间，在罐内放置一种或多种细度的研磨球。一般而言，研磨球罐和/或研磨零部件由硬质材料制成，如氧化锆、镍、钛、碳化物和/或不锈钢(如316L SS)。在单次研磨中，可以使用多种(1种、2种、3种、4种或更多)不同细度的研磨球。例如，在低温研磨过程中，可以同时使用直径为1毫米、2毫米、3毫米、5毫米、8毫米和10毫米的研磨球，也可以使用不同的直径组合。为了获得所需的平均颗粒细度和所需的细度要求，可以选择研磨球的数量和尺寸。使用制冷剂(如乙醇溶液，即99.7％的酒精)将研磨罐的温度保持在-50℃和-30℃之间。例如，替代制冷剂包括干冰、乙二醇、丙酮、水、乙醇、邻二甲苯、间甲苯胺、乙腈、吡啶和甲醇。替代冷却液见https://en.wikipedia.org/wiki/Cooling_bath。可以使用温度控制电子设备管理制冷剂的流量。利用搅拌转子移动研磨球，如转速为1000-2000转/分钟。
在某些实例中，研磨球有3种不同的直径，即10毫米、5毫米和2毫米，使用的研磨球数量之比为1:2:3。可以使用1种、2种、3种或更多的研磨球尺寸。研磨球的密度也可不同，如小球具有较大密度。在某些实例中，对尺寸比例为1:2:3的3种尺寸进行了测试。当然，尺寸比例也可以是1:5:10、1:3:6、1:4:20、以及其他比例。3种尺寸的研磨球可以最大程度地提高研磨过程效率。各种实例至少包括2种或3种尺寸的研磨球。最大球和最小球的直径比至少为1:3、1:4、1:5或1:10。根据所需的粉末颗粒细度，选择研磨球直径及比例。
图2所示为根据本发明的各种实例的“研磨方法200”。可将这些方法作为图1所示“研磨步骤130”的一部分执行(可选)。在这些方法中，将组织与本申请文件所述的其他任何可选组分形成的混合物研磨成具有所需特性的粉末。例如，可将人体或动物羊膜组织研磨成可以在再水化时形成溶液、糊剂或水凝胶的细粉末。在各种实例中，将粉末研磨成本申请文件其他部分所述的细度或细度分布(参见下例)。可使用间歇型工艺或连续型工艺完成研磨。通常在低温下完成研磨。例如在各种实例中，冷却系统用于在研磨期间将研磨混合物的温度保持在0℃以下。关于各种实例采用的温度范围参见本申请文件示例。组织和/或其他研磨材料在研磨前可选择进行冻干。可采用湿法或干法进行研磨。在湿磨中将研磨液添加到待研磨混合物中。可选择该种研磨液的冰点温度低于研磨温度。图2所示的步骤可选择顺序执行。例如可在添加待研磨材料之前选择研磨机具。
在本发明的各种实例中，图2所示的“方法200”用于组织的间歇型研磨。在间歇型研磨中，使用特定研磨设备一次研磨一批次材料。通常而言，多使用大型容器进行间歇型研磨，或者使用本申请文件中称为罐、器皿或大桶的容器。在研磨过程中，该等容器可以保持开启、关闭，或者密封。
可根据最终产物的期望特性，在步骤215中对所得粉末的所需粒径和细度分布进行选择。例如，发现通过选择粒径可以控制水凝胶或糊剂粉末组织的增稠速率，与含有较大颗粒的水凝胶相比，内含较小颗粒水凝胶的增稠速率更大。研究发现通过选择粒径和细度分布可以控制溶解度，较小颗粒更容易溶解。较小颗粒的产生受到保护研磨材料(包括组织)生物活性的限制。研磨过度会破坏生物结构从而显著降低生物活性。过度研磨和/或不良研磨条件也会导致生物活性材料的化学降解，从而降低生物活性。例如局部研磨产生的热可导致蛋白质的氧化、变性或发生其他反应。
在可选冷冻步骤220中，对研磨材料混合物进行冷冻。该冷冻包括冷冻干燥并选择混合步骤120，进行均质混合。可通过升华或冻干实现冷冻与干燥的同步进行。
在添加混合物步骤225中，将待研磨混合物添加到研磨罐中。添加混合物步骤225可视情况选择在冷冻步骤220之前或在全部或部分混合步骤120之前执行。例如可单独将一些组分添加到研磨槽并在其中进行混合，和/或可在研磨罐进行冷冻。
在选择研磨球步骤230中，选择一个或多个研磨球并将所选研磨球添加到研磨罐中。如本申请文件其他内容所述，可根据研磨形成粉末的所需粒度和分布来选择研磨球。
在冷却步骤235中对研磨罐进行冷却。例如通过在研磨罐的夹套内循环制冷剂来进行。制冷剂可以采取制冷剂领域已知的任何制冷剂。在各种实例中，研磨期间研磨罐的内部温度保持在低于10℃、0℃、-15℃、-25℃、-30℃、-40℃或-50℃或该等温度之间的任何范围。
在可选添加液体步骤240中,将研磨液添加到研磨罐。研磨液与被研磨材料发生接触。研磨过程中研磨液可发挥润滑剂作用，这会导致颗粒细度分布变窄和/或减少达到平均粒度所需要的研磨时间。研磨液还可用于维持被研磨材料的热传输和热平衡。研磨液也可视情况作为冷却液。例如，冷却液可预先冷却至所需研磨温度和/或设定冰浴以保持所需温度。研磨液最好在与待研磨材料接触混合时就已达到所需研磨温度。可视情况选择包括盐水、生理盐水、盐溶液和/或一种或多种醇和/或本申请文件讨论的任何适宜的冷却液或制冷剂作为研磨液。
在研磨步骤245中，使用搅拌转子在研磨罐内滚动研磨球，将材料研磨成所需粒度和细度分布的粉末。在各种实例中采用介于500-3000转/分钟、1000-3000转/分钟、1800-2000转/分钟或1500-2500转/分钟之间的研磨速度。但也可根据研磨机的尺寸和其他特性使用其他转速。研磨可以持续进行直到达到所需要的粒径，例如根据所用设备不同，研磨时间可能为5-30分钟或10-15分钟。也可选用其他研磨时间。所产生的颗粒大小与低温研磨时间直接相关。
在可选干燥步骤250中，对(现为粉末状的)研磨材料进行干燥，以(例如通过蒸发或升华)去除研磨液和/或原始研磨材料中的液体。可以在研磨系统内或在单独装置内进行干燥步骤250。可选择在负压条件下(例如真空)进行干燥。
在可选包装步骤255中，将粉末添加到合适的容器中。例如在存储步骤150之前可将干燥后的粉末添加到密封小瓶或其他可密封容器中。
在本发明的各种实例中采用图2所示的“方法200”，通过连续型研磨系统进行连续研磨。在该等实例中，材料连续给送到研磨系统的输入端，研磨后粉末则通过研磨系统输出端连续排出。研磨后粉末输出端的排出与材料在输入端的给料可以同时进行。
选择步骤215，如本申请文件其他位置所述执行工作。
在可选冷冻步骤220中，如本申请文件其他内容所述，对研磨材料的混合物进行冷却。在连续系统中，选择使用连续冻干系统执行冷冻步骤220，该系统产生连续量的冻干混合物(包括组织)并将其提供给研磨系统。
在添加混合物步骤225中，将待研磨材料(例如组织)通过输入端添加到连续研磨系统中。或者将冻干系统的输出直接连接到研磨系统的输入端。在一些实例中连续型研磨系统包括多个输入端，可添加不同的待研磨组分。例如，冻干的羊膜组织可添加到第一输入端，而防腐剂、抗生素和干细胞则可通过一个或者多个不同输入端添加到连续型研磨系统中。因此混合物的不同组分可能受到不同类型研磨材料和数量的影响。在研磨机选择步骤230中，选择一个或多个研磨机具用于连续型研磨系统。这些研磨机具可以包括本申请文件其他部分所述的研磨机具的任何组合。
在冷却步骤235中，对连续型研磨系统的至少一部分进行冷却，以使被研磨材料保持在受控温度下，例如保持在本申请文件其他部分所述的任何研磨温度或温度范围内。使制冷剂流经连续型研磨系统中的冷却夹套和/或向被研磨材料中添加冷却液来实现冷却。
在可选添加液体步骤240中，将研磨液添加到连续型研磨系统。如本申请文件其他内容所述，也可选择冷却液作为研磨液。研磨液可以选择不同于待研磨组织输入端的其他输入端添加到研磨系统中。
在研磨步骤245中，使用连续型研磨系统研磨待磨材料。在该等实例中，研磨步骤245可选择转动一个或多个研磨主轴来研磨材料，并通过研磨系统驱动材料。通过研磨步骤245获得所需粒径和细度分布的粉末。在可选干燥步骤250中，按照本申请文件其他内容所述方式，对(现为粉末状的)研磨材料进行干燥。如果研磨步骤245使用连续型研磨系统，则也可以选择采用连续型研磨系统进行干燥。在可选包装步骤255中，按照本申请文件其他部分所述方式将粉末添加到适宜容器中。
图3所示是根据本发明各种实例所采用的间歇型研磨系统300，包括研磨球310、尼龙研磨罐320，以及制冷剂循环系统330。可以选择使用制冷剂压缩机、电子设备控制着合适的温度和硅管。
本发明的各种实例还包括使用干磨-间歇型研磨生产治疗粉末和/或水凝胶。研究表明，可以控制颗粒大小并同时将理想治疗性能保持在之前未达到的水平。
干磨实验结果。
为揭示干磨过程中四种粒度研磨球比例对研磨后粉末粒径的影响，测试了四种粒度研磨球九种不同比例的研磨效果，结果如表1和表2所示。表1
Figure BDA0003604780330000081
11毫米研磨球尺寸过小，短时间内无法正确计数。因此使用重量来表示1毫米研磨球的含量。
2样品指冻干细胞外基质水凝胶。
研磨后使用Mastersizer 3000激光粒度分析仪(英国马尔文仪器有限公司)对粒度进行测定，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0003604780330000082
3D90：样本中最大90％的量在该粒径以下。
D50：样本中最大50％的量在该粒径以下。
D10：样本中最大10％的量在该粒径以下。
测试结果表明：a)在相同条件下，研磨球越多研磨后的颗粒粉末越小；以及b)相较于其他尺寸研磨球8毫米和3毫米研磨球的数量对最终粒度的影响更加显著。
本发明的各种实例还包括使用湿法间歇型研磨来生产治疗粉末和/或水凝胶。研究表明，可以控制颗粒大小并同时将理想治疗性能保持在之前未论证之水平。在部分实例中，湿磨会比干磨产生更有利的结果。
湿磨实验结果。
总体来说，相对于干磨，湿磨的效率更高，粉末粒度也更细、更均匀。鉴于此，我们也通过湿磨获得冻干粉。湿磨试验在以下条件进行：a)称取3克冻干细胞外基质水凝胶；b)向研磨罐中加入200毫升生理盐水/乙醇作为研磨介质；c)研磨时间：15分钟；d)研磨速度：2000转/分钟；以及e)向研磨罐中加入100克研磨球，且仅使用1毫米直径的研磨球。产出的颗粒细度如表3所示。
表3：
Figure BDA0003604780330000091
测试结果表明：a)与乙醇相比，生理盐水更适合作为湿法研磨过程的研磨介质；b)使用直径较小的研磨球可以获得粒径较小的冻干粉；c)湿磨比干磨效率高；以及d)研磨球相较于冻干细胞外基质水凝胶的占比越大，研磨后的冻干粉粒径越小。
生物活性
如果无法保证治疗组分生物活性，则实现小颗粒细度将毫无意义。(现有技术中常见的)传统研磨方式会产生大量热量，包括局部热量，会引发蛋白质变性等过程，继而导致生物活性丧失或遭到破坏。
将干磨法制备的最大和最小冻干粉(No.4和No.7)与湿磨法制备的冻干粉(No.10和No.11)以及未经研磨的冻干细胞外基质水凝胶(No.0)进行比较测试其生物活性。胶原蛋白(可溶性胶原蛋白测定仪器SircolTMTM，S1000型号，英国Biocolor公司)、弹性蛋白(弹性蛋白Assay-FastinTM，F2000型号，英国Biocolor公司)和糖胺聚糖(糖胺聚糖测定仪器BlyscanTM，B1000型号，英国Biocolor公司)的含量测定结果如图4所示。(与No.0样本相比***p<0.001)。
结果表明，图1和图2所示的方法可以产生具备小颗粒细度和良好生物活性的理想粉末及粉末源性糊剂、水凝胶以及溶液。颗粒大小能够促进水凝胶属性(例如增稠时间)在多种治疗方案中应用，本申请文件其他内容也讨论了其中的部分应用示例。具体而言，研究结果表明：研磨方法可以在保护蛋白质和其他治疗组分不被降解或破坏的同时，产生粒度理想的粉末产物。四种尺寸研磨球的不同比例对胶原蛋白和弹性蛋白的研磨效果没有显著影响。然而研磨后糖胺聚糖减少，表明糖胺聚糖仍然存在低温研磨过程中损耗。这说明了优化粒径和保持生物活性之间良好平衡的重要性，正如本发明各种实例所示。
在本发明的各种实例中，(保持生物活性)粉末的D50(微米)小于250、200、150、125、100、75、50或39.3，或该等数值之间的任何范围。在本发明的各种实例中，(保持生物活性)粉末的D10(微米)小于100、50、40、24或10，或该等数值之间的任何范围。在本发明的各种实例中，(保持生物活性)粉末的D90(微米)小于650、500、450、400、350、250、200、150或136，或该等数值之间的任何范围。在这些实例中，使用不同的研磨机具和研磨时间可以得到更小粒径值的D90、D50和D10。由于研磨得更细会导致生物活性降低，这限制了粒径进一步减小。预期在一些实例中，D50小于10时仍然可以保持足够的生物活性。
根据各种实例组织处理加工配方使其符合条件。
这些不同方法及其搭配组合可用于实现本申请文件所述的替代实例。
示例1)
病毒灭活：(对乙酰酸/乙醇)；
去细胞化(多次冻融循环/高渗溶液和低渗溶液/Triton X-100/脱氧胆酸钠/DNase I/MgCl2/PMSF/EDTA)；
(EDTA＝乙二胺四乙酸)
灭菌(对乙酰酸/乙醇)；
消解/溶解(猪胃蛋白酶和盐酸)；
中和/自组装交联/固化(氢氧化钠)；
可选择消泡(消泡剂)；
灭菌(电子束辐照等或其他放射法)。
示例2)
对乙酰酸/乙醇：病毒灭活。
高渗溶液和低渗溶液：渗透压休克导致细胞溶解，破坏DNA和蛋白质的相互作用。
Triton X-100：破坏DNA-蛋白质相互作用，破坏脂质-脂质和脂质-蛋白质相互作用，并在较小程度上破坏蛋白质-蛋白质相互作用。
脱氧胆酸钠：溶解细胞和核膜，使蛋白质变性。
DNase I：消化单链或双链DNA以产生单链或双链寡脱氧核苷酸。
MgCl2：镁作为辅助因子可以激活DNA酶活性。
PMSF：抑制多种蛋白酶以维持天然ECM超微结构。
EDTA：螯合二价金属离子，通过分离金属离子帮助细胞与ECM蛋白质分离，并使剩余的DNA酶失活。
猪胃蛋白酶和盐酸：在酸性环境中混合去细胞化ECM和胃蛋白酶，将蛋白质分解成更小的肽以形成均匀的水凝胶。
氢氧化钠：中和pH，诱导聚合。
可选择消泡剂：避免有菌气泡造成不良影响。
示例3)
去细胞化特征：根据定义，宿主将异种和同种异体细胞抗原视为外来物体，因此会诱发炎症反应或免疫介导性的组织排斥反应。然而各物种通常都具有ECM(细胞外基质)组分，且即使异种受体也能耐受。评价去细胞化的标准如下：每毫克干重ECM中的双链DNA应少于50纳克；DNA片段长度应小于200个碱基对；染色组织切片中无可见核物质。
消解/溶解：去细胞化冻干ECM在与猪胃蛋白酶培养48-72小时后(pH＝2-3)消解。
自组装交联/固化：由于胶原蛋白的分子结构，即独特的超螺旋三螺旋结构，胶原蛋白在合适的温度(37℃)和pH(～7.40)下通过交联进行自组装。中和后的水凝胶在37℃下培养3-5分钟即可固化。
本发明的各种实例包括一种冻干法去细胞化ECM(细胞外基质)粉末(在本申请文件中也称为“组织源性粉末”)，其可能包括附加组分并可水合产生水凝胶。制备这种组织源性粉末的替代方法包括，例如，(1)去细胞化前进行灭菌以灭活病毒；(2)消解/溶解过程后进行低温研磨，以增加组织比表面积并加速ECM消解；(3)用电动搅拌器而非热摇振器摇动溶液以便更彻底地消化组织；(4)中和后加入冻干和低温研磨物质，使水凝胶冻干粉更容易溶解；(5)选择性向水凝胶中添加消泡剂避免气泡引起的不利影响；(6)通过电子束等辐照灭菌。
根据需要将水凝胶与聚乙二醇混合以增加溶解度。依需将水凝胶通过与添加剂混合、暴露于空气中、施用于患者或与活化液混合等增加水凝胶的粘度、粘附性和/或固化时间；相对于没有载体基质的ECM组织而言。依需将水凝胶与常被用作患者眼内注射剂的添加剂(例如透明质酸钠、卡波姆)混合后增加密度。
依需通过向水凝胶中添加防腐剂来制成新型多用途伤口护理产品，该种新型产品与市场上现有胶原蛋白或无细胞组织粉末伤口护理产品不同，后者仅用于一次性使用且仅能以粉末/糊剂使用。例如将山梨酸钾添加到水凝胶中用于皮肤伤口护理、口腔伤口护理和阴道/肛门伤口护理，以满足个体患者的多种用途；将聚季铵盐-1添加到用于眼表创伤护理的水凝胶中，以满足个体患者的多种用途。这种新型多用途伤口护理产品，能够以粉末/糊剂形态施用于伤口部位，粉末/膏体可与生理盐水、等渗溶液或水进行混合以形成多用途水凝胶或喷雾，从而为伤口部位提供持续的伤口护理。或者，这种新型多用途伤口护理产品可以直接与生理盐水、等渗溶液或水混合，形成多用途水凝胶或喷雾。
流程方法叙述，可以结合图1和图2所示执行
在粗洗步骤中：清洗组织以去除不需要的物质。去除物质包括脐带和杂质，以及一些大血管和体液。测试标准：目视检查是否有异物。该步骤包括：使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗3次。测试标准：目视检查是否有血迹。在-80到25℃下反复冷冻和解冻3到5次以达到去细胞化。在去离子水流中，用网状织物反复擦洗组织5分钟，小心地去除血管和不干净组织。用去离子水在摇振器上(室温，140-160转/分钟)漂洗组织30分钟。
在去细胞化步骤中：在去离子水流中，用网状织物反复擦洗组织5分钟，小心地去除血管和脏污组织。用去离子水稀释的0.05％胰蛋白酶/0.02EDTA置于摇振器上(室温，140-160转/分钟)漂洗组织60分钟。在去离子水流中，用擦网反复摩擦组织5分钟，小心地去除血管和脏污组织。用去离子水稀释的3％胰蛋白酶置于摇振器上(室温，140-160转/分钟)漂洗组织60分钟。在去离子水流中，用擦网反复摩擦组织5分钟，小心地筛选出血管和脏污组织。用去离子水稀释的4％脱氧胆酸钠置于摇振器上(室温，140-160转/分钟)漂洗组织60分钟。在去离子水流中，用擦网反复摩擦组织5分钟，小心地去除血管和脏污组织。将组织放入装有PBS的烧杯内，在4℃下放置60分钟。在去离子水流中，用擦网反复摩擦组织5分钟，小心地去除血管和脏组织。用1％的Triton X-100置于摇振器上(室温，140-160转/分钟)漂洗组织20-60分钟。在去离子水流中，用擦网反复摩擦组织5分钟，小心地去除血管和其他多余组织。用PBS置于摇振器上(室温，140-160转/分钟)漂洗组织15分钟。用去离子水置于摇振器上(室温，140-160转/分钟)漂洗组织15分钟。重复一次。
在一个替代实例中，脱细胞过程包括以下步骤：用高渗溶液在摇振器上(室温，140-160转/分钟)漂洗组织30分钟。在摇振器上使用低渗溶液漂洗组织(140-160转/分钟；每次30分钟)。重复三次。在去离子水流中，用擦网反复摩擦组织5分钟，小心地筛选出血管和脏组织。用缓冲溶液(0.01M Tris-HCL；1％Triton X-100；0.1mM PMSF；0.1％EDTA)在摇振器上(140-160转/分钟)漂洗组织60分钟。在去离子水流中，用擦网反复摩擦组织5分钟，小心地筛选出血管和脏组织。用0.25％的脱氧胆酸钠在摇振器上(室温，140-160转/分钟)漂洗组织60分钟。在去离子水流中，用擦网反复摩擦组织5分钟，小心地筛选出血管和脏组织。用缓冲溶液(0.01M Tris-HCL；l％Tritonx-100；0.1mM PMSF；0.1％EDTA)在摇振器上(室温，140-160转/分钟)漂洗组织60分钟。在去离子水流中，用擦网反复摩擦组织5分钟，小心地筛选出血管和脏组织。用DNase I溶液(100U/mL DNase I；20mM MgCl2；0.1mM PMSF)在摇振器上(室温，80-110转/分钟)漂洗组织10个小时。在去离子水流中，用擦网反复摩擦组织5分钟，小心地筛选出血管和脏组织。用EDTA溶液(5mM EDTA)在摇振器上(室温，140-160转/分钟)漂洗组织60分钟。
在冻干步骤中：制作冻干水凝胶粉时：最好在-80℃下将组织冷冻4-8个小时，冻干48到72小时。
在消化步骤中：将冻干的ECM切成1-3cm2的小块。低温研磨冻干的去细胞化ECM，将之变成粉末。使用胃蛋白酶(最好是猪胃蛋白酶)(1mg/mL)/HCL(0.01M)(用去离子水稀释到需要的浓度)稀释去细胞化后的冻干ECM。使用电动搅拌器室温下搅拌24-48小时(180-200转/分钟)。依需确保溶液的温度不超过35℃。
在组织匀浆化步骤中：使用匀浆器持续搅拌，确保氢氧化钠均匀分布，以便水凝胶系统的pH值达到中性pH(-7.0)。
在中和和聚合步骤中：某些情况下，不得不中和水凝胶，以便诱发聚合反应：这一步是可选操作：添加0.1MNaOH总量的1/10，添加PBS获得需要的浓度。
制作水凝胶粉步骤：可选择72-96小时冻干。将冻干水凝胶低温研磨成粉末。依需用生理盐水或水溶解，或添加消泡剂生成治疗用的水凝胶。应在治疗前不久添加盐水。添加的盐水量取决于需要的水凝胶粘度。依需在添加盐水前，把粉末添加到外伤敷料上。然后保存备用。
在包装和灭菌步骤中：灭菌使用的是放射灭菌法，例如使用电子束放射灭菌。包装即密封在真空瓶中。
用途示例。
正如本申请文件所述，本发明的各种实例包括制备一种组织源性粉末(这种粉末能再水化，形成一种细胞外基质水凝胶)，及其他冻干材料，例如蛋白质、胶原蛋白、粘多糖等，冻干组织变成均匀而精细的冻干粉末，仍具有这些组织中原来的细胞外基质生物活性。制备出来的材料(粉末、糊剂、水凝胶和溶液)可用于各种治疗和非治疗用途，例如治疗各种伤口等，包括：表浅伤口和复杂伤口(褥疮、静脉性溃疡、糖尿病溃疡、慢性血管性溃疡、贯通伤口/潜伏性伤口、手术切口和引流口)，后者使用传统敷料时往往效果不佳。制备出的材料还具有再生作用，它们可创造一种类似自然细胞生长环境的微环境，促进细胞生长。
当把完整的组织膜移植进大多数组织内时，可诱发严重免疫反应。即使异种移植时，组织的非细胞组分往往更易耐受。因此，免疫原性物质主要集中在细胞内。
依需将载体基质(组织源性粉末-依需加入附加组分，经液体水化后携带生物活性的组分)设置为治疗时接触到患者后即可增加粘度、粘附性和固化。这样可扩大(或改进)羊膜组织的用途。正如本申请文件其他地方所述，可通过控制粒径和粒度分布设定水凝胶，和/或通过添加附加组分(例如增稠剂)控制粘度。
在合适的粒径、浓度和温度(例如人体温度)时，水凝胶的粘度和粘附性增加，固化时间缩短。可以测得不同浓度下水凝胶的粘度、粘附性和固化时间变化。因此，可绘制出水凝胶的粘度、粘附性和固化曲线。按测算，在37℃的温度时，水凝胶仅需3-5分钟时间即可达到合适的粘度、粘附性和固化时间。在许多应用(例如眼科手术或心血管手术)中是个重要优点。
依需将载体基质与添加剂混合、暴露于空气中、施用于患者或与活化液混合等方式以增加水凝胶的粘度、粘附性和/或固化时间；相对于没有载体基质的ECM组织而言。在某些实例中，水凝胶的增稠过程，包括发生在37℃和中性pH(～7.4)时的胶原蛋白聚合反应，是因为胶原蛋白独特的超螺旋三螺旋结构。这一过程有赖于胶原蛋白独特的特性。正如本申请文件其他地方所述，胶原蛋白可以成为本发明的各种实例粉末的附加组分，或者是使用的组织固有组分。小粒径可加速这一反应。
不同组织和器官在人体中所处的环境也各有不同。不同浓度的组织源性粉末和再水化液体，可以影响水凝胶的最终降解率。为了检测不同浓度水凝胶的生物降解率，我们用小鼠观察水凝胶在体外环境中30天内的降解率。
如本申请文件其他部分所述，在一些实例中，组织源性粉末或再水化粉末可以含有治疗剂，载体基质(例如水凝胶)用于将治疗剂送至患者体内。
如本申请文件其他部分所述，粉末中可添加附加组分(即组织以外的组分)，包括治疗剂。有些治疗剂，例如干细胞，可在灭菌后选择添加，以便保留生物功能。本发明各种实例的水凝胶，可携带不同的组分，例如药剂、外泌体、抗炎药、抗氧化剂等。这些组分可以单独使用，也可以相互组合使用。表4列出了可加入水凝胶的其他物质。
表4
Figure BDA0003604780330000121
Figure BDA0003604780330000131
在各种实例中，用于制备粉末和水凝胶的人类组织和/或动物组织，可基于这些组织内的抗炎组合物和/或抗炎作用进行选择。在一些实例中，水凝胶中含有药物组合——可减轻免疫反应(例如抗炎作用)的药物和抗生素或抗真菌(可减少病菌或真菌感染)组合。例如，用于牙科手术或穿刺伤的水凝胶，可在减轻T细胞反应同时，其含有的抗生素还能减轻炎症和降低感染几率。
炎症有积极的一面，但过度的炎症反应可延缓伤口愈合，形成疤痕，因此，可选择在水凝胶中加入药剂抑制过度的炎症反应。在治疗伤口时，水凝胶对炎症有帮助，可以促进愈合，减少疤痕组织形成。来自羊膜组织的水凝胶的特性，可能与胎盘组织的免疫特性有关。本申请文件中讨论的粉末和水凝胶制备方法，可以保留原始组织的这一特性。炎症反应过度的特点与以下各项有关：炎性细胞浸润的程度和时间；炎性细胞因子释放的程度和类型。
皮肤中的一些干细胞具有分化和增殖潜力，但伤口的形成和微环境的改变可显著限制这种能力。因此，组织源性水凝胶可刺激并改善环境促进干细胞和上皮细胞的生长，加速伤口愈合。促纤维化细胞因子如TGF-p(转化生长因子p)的过度表达，可导致纤维化。一些研究显示，水凝胶可抑制细胞因子如局部TGF-P表达和释放(与未使用水凝胶治疗的创面相比)。
本发明各种实例的粉末、水凝胶、糊剂、凝胶、喷雾剂或溶液的使用方法，可根据具体的病情而改变。在可选择的溶解步骤2.1开始的示例方法中，将一种无菌液体(例如生理盐水)添加到组织源性粉末中，以便生成水凝胶。可选择使用图1中说明的方法制备粉末。在各种实例中，本申请文件中讨论过的任何治疗剂均可加入选择溶解步骤2.1的干粉中。也可在干粉的制备过程中添加任何治疗剂或附加组分。
在应用步骤22中，生成的水凝胶用于创面或创伤处。可根据创面的性质和期望的治疗效果改变使用方法。例如，可将水凝胶注射到人体的腔洞内，涂抹在皮肤上然后用敷料包扎，抹在敷料上包扎伤口，涂在缝合处，涂在将要放置在人体内的医疗用品(例如置换用的髋关节或骨钉)上。水凝胶可用于体内和/或体外。根据需要重复步骤2.3，水凝胶反复用于伤口或创伤。例如，可用新的带有水凝胶的敷料替换先前使用的带有水凝胶的敷料。
水凝胶用作载体-
水凝胶一种载体，携带一种或多种药剂(例如外泌体)。外泌体可携带各种蛋白质、mRNA、miRNA、生长因子和/或脂质，是一种重要的信号分子，可形成新的细胞间信号系统，参与细胞通讯、细胞迁移、血管生成等。有报告称，间质干细胞强大的创面修复作用，与其分泌的外泌体有关。因此，外泌体在体外和体内的稳定性和缓慢释放极为重要。水凝胶可被用作间质干细胞外泌体的载体。众所周知，外泌体广泛存在于细胞外液中，而水凝胶恰恰类似组织的非细胞环境。因此，水凝胶可用于保持外泌体的稳定。此外，水凝胶可持久释放外泌体，避免它的过度降解。与外泌体冻干粉相比，外泌体水凝胶的作用时间更持久，而且其作用环境更接近生理状态。类似于外泌体，水凝胶也可携带其他药剂提高疗效。本申请文件中提到的任何其他治疗剂，均可以添加到水凝胶中，以便用于治疗。图4所示是根据本发明的各种实例，通过ELISA分析测定的、作为载体在水凝胶中释放的重组人表皮生长因子(hEGF)的量。
图5所示为根据本发明的各种实例，通过ELISA分析测定的、作为载体在水凝胶中释放的重组人表皮生长因子(hEGF)的量。
关节损伤或关节退行性病变的治疗。
在关节腔内，水凝胶可起到润滑作用，减轻组织间的摩擦，还可减轻炎症，和/或同时发挥弹性效应，缓解关节软骨受到的损害。
关节腔内注射高浓度水凝胶，可显著减轻滑膜组织的炎症反应，增加关节液的粘度和润滑度，保护关节软骨，促进关节软骨的愈合和再生，减轻疼痛，加大关节的活动度。水凝胶的屏障作用可有效地防止炎症介质的扩散，减少化学物质对痛觉感受器的刺激，从而缓解关节痛。可以加入水凝胶中、此类用途的治疗剂有：类固醇、抗炎剂、镇痛药(例如阿片类药物)、胶原蛋白、透明质酸和抗氧化剂等。本申请文件中提到的任何其他治疗剂，均可以添加到水凝胶中，以便用于治疗。
介入疗法和支架内再狭窄(ISR)治疗。
介入疗法是一种高科技工具的微创治疗。例如，在医学成像设备的引导下，使用专用工具如准确显像工具/内窥镜、导管和导丝等，探入人体进行诊断和治疗。介入疗法常使用数字技术扩大医生的视野。在导管的帮助下，导丝可探入医生的手无法达到的地方。通过此方式，能够以极小的创伤完成许多治疗。介入疗法具有无需手术、创伤小、恢复速度快、疗效佳等优点，是未来医学发展的趋势。然而，接受介入治疗的患者，其人体组织将不可避免地短期或长期接触到一些医疗器材。例如，心脏支架将在患者体内存留很长时间，有可能导致严重炎症反应、血栓形成和其他不良反应，有时甚至可危及生命。水凝胶可用于处理医疗用品，它在3-5分钟内固化后，可在医疗用品的表面形成一层涂层。由于水凝胶的组合物类似于天然细胞外基质，故可显著提高医疗用品的组织亲和力，避免疤痕组织的形成，减少副作用。在各种实例中，水凝胶可用作导管或分流器上的涂层。例如，水凝胶可用作导管或引流管表面的涂层，以便减少炎症反应(与不使用水凝胶涂层的导管或引流管相比)。在某些实例中，水凝胶用作重要静脉导管、留置球囊导尿管、外周静脉通道、动脉留置导管表面的涂层。本申请文件中提到的任何其他治疗剂，均可以添加到水凝胶中，以便用于治疗。
今天为止，支架内再狭窄(ISR)仍然是一个棘手问题。许多研究人员致力于找到新方法防止疤痕的产生，例如使用各种聚合物制成的薄膜覆盖支架的孔隙。然而，由于生物相容性较低，这些聚合物常常会引发严重的炎症反应。水凝胶覆盖支架表面后，可在3-5分钟内快速形成具有保护性的涂层，从而起到防止ISR的作用，有助于结缔组织和血管内皮损伤的愈合。水凝胶在人体或动物体内可生物降解，且其生物相容性较好。此外，水凝胶的自交联可给组织带来胶原蛋白基质额外的强度和柔韧度，有助于抵抗支架植入过程中的扩张力。而且，可以在水凝胶中添加治疗剂后覆盖支架，例如抗炎剂、抗氧化剂、抗凝血剂等。本申请文件中提到的任何其他治疗剂，均可以添加到水凝胶中，以便用于治疗。可选择将水凝胶粉或粉末涂抹在支架上。因为支架产生发炎的组织可以使用水凝胶粉或粉末治疗，例如治疗尿道感染或人体其他管道的感染。
预防和治疗宫腔粘连(IUA)或阿谢曼综合征-
接受过多次刮宫(D&C)术的女性发生宫腔粘连的比例较高。超过90％的IUA是由宫颈扩张和刮宫术(D&C)等子宫手术留下的疤痕组织所诱发。此外，剖宫产或用于止血的缝合线、子宫内膜异位症、生殖器官感染和放射治疗产生的疤痕组织也会诱发IUA。水凝胶可在3-5分钟内固化(可选)，并在子宫壁上形成保护层，以防止疤痕组织形成和宫腔粘连，并为宫腔内伤口愈合提供潮湿环境。在临床实践中，水凝胶还有抗炎作用，并可增强子宫内膜再生，从而改善生育力和妊娠结果。
图6所示是根据本发明的各种实例，水凝胶在滴注化学试剂之后对防止与治疗宫腔粘连的效果。
视网膜撕裂、视网膜脱落和黄斑裂孔。
玻璃体切除术是治疗视网膜撕裂、视网膜脱落和黄斑裂孔的标准而常见的一种手术。通常，采用气液交换的玻璃体切除术需要患者整天整夜保持面朝下体位，且持续时长从几天到几周不等。在玻璃体切除术和气性视网膜固定术中，可通过使用胶水或薄膜等材料对视网膜撕裂/裂孔和黄斑裂孔进行封闭，作为一种优秀新颖的方法，其用来防止玻璃体液体通过开放的视网膜撕裂流入视网膜下空间，还可避免手术后面朝下体位所需的时间。
既往研究发现，氰基丙烯酸酯、纤维蛋白胶、透明质酸钠/羧甲基纤维素可吸收膜、贻贝蛋白、转化生长因子及聚硅氧烷等多种粘合剂均有其自身的缺点，如不同程度的对眼毒性、较弱的附着力、严重的炎性反应等。鉴于上述原因，粘合剂的使用还没有成为治疗视网膜撕裂、视网膜脱落和黄斑裂孔的标准方法。迫切需要一种更有效、无毒和易于使用的材料。
在一些实例中，水凝胶的交联作用由水凝胶的可选性胶原蛋白分子结构产生。这种结构包括一个独特且不依赖于交联剂的超螺旋三螺旋。细胞外基质浓度在8-10mg/ml之间的水凝胶在37℃时，可在3-5分钟内迅速固化，以快速封闭和粘附视网膜撕裂/裂孔和黄斑裂孔，防止撕裂和裂孔扩大。在各种实例中，将载体基质、细胞外基质和/或其工艺设定成在体温(例如37℃)即可引起温度触发式增稠或固化。这种固化速度可有助于手术进行，并且是所制备水凝胶方式产生的结果。结合(交联)发生在水凝胶内，也发生在眼部周围组织的结合部位，可引起与周围组织的粘附。通过玻璃体切除术去除玻璃体液后，在某些情况下，需要进行激光手术(光凝固)或冷冻(低温固定)，以将视网膜固定在眼壁上。水凝胶的固化是不可逆的，并且足以修复视网膜撕裂和裂孔。水凝胶的应用避免了术后面朝下体位的不舒适性和挑战。此外，与传统粘合剂中较差的生物相容性相比，水凝胶100％天然，具有良好的生物相容性，并且在30天内可生物降解。水凝胶的天然细胞外基质(ECM)富含数百种蛋白质和多种生长因子和细胞因子，如表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-β(TGF-P)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF)等。这些生长因子/细胞因子在成纤维细胞/角质形成细胞迁移/增殖、间充质干细胞归巢、再上皮化和新血管形成中发挥重要作用，其被认为是组织修复和视网膜撕裂/裂孔和黄斑裂孔再生的必要条件。值得一提的是，透明质酸是水凝胶细胞外基质(ECM)的关键组分之一，是存在于视网膜下部位的主要组分，且可以作为视网膜的最佳天然细胞外基质(ECM)组分。
因此，具有上述优异特性的水凝胶在现代视网膜治疗中有明显益处：1.可作为粘合剂快速封闭/粘附视网膜撕裂/裂孔和黄斑裂孔(包括手术产生的撕裂/裂孔和黄斑裂孔)，为组织修复和再生提供视网膜的细胞外基质(ECM)微环境；2.可显著缩短术后恢复时间，因为水凝胶可在3-5分钟内固化，因此不再需要术后面朝下体位或所需时间更短；3.更好地支持局部/邻近视网膜色素上皮(RPE)细胞和视网膜前体细胞的存活、增殖和定向迁移；4.可用作干细胞(例如视网膜干前体细胞和视网膜干细胞)的体外培养和生长的优良3D基质，所述干细胞可能分化为视网膜神经元和视网膜色素上皮(RPE)细胞。含有体外培养干细胞的水凝胶可直接应用于视网膜撕裂/裂孔和黄斑裂孔。
在一些实例中，针对视网膜撕裂/裂孔和黄斑裂孔，可向水凝胶中加入消泡剂以避免因非无菌空气引起的不利影响。本申请文件中提到的任何其他治疗剂，均可以添加到水凝胶中，以便用于治疗。
治疗眼表创伤和干眼症以及抗炎。
角膜化学烧伤、机械损伤等眼表创伤是常见且严重的眼外伤。特别是角膜化学烧伤诱发角膜新生血管形成，可造成严重的视力损害，甚至失明。此外，血管一旦形成，就很难去除。因此，抑制角膜上皮细胞的新生血管再生对眼表创伤的治疗具有十分重要的意义。
水凝胶可作为一种优良的眼表液体替代物，能很好地处理眼表创伤、快速愈合创伤、预防和减少角膜新生血管形成、抗炎、抗瘢痕和抗血管生成。此外，还可用作滴眼剂，适用于临床办公室和家庭使用。鉴于其独特的自交联功能，水凝胶可在3分钟内快速形成保护膜，以保护角膜免受外部刺激，并提供生物环境保护以应对眼表创伤。
水凝胶在治疗干眼症方面也表现出很强的疗效。角膜化学(碱)烧伤动物模型常被用来评估治疗干眼症的有效性。
可以纳入水凝胶用于此类应用的治疗剂包括抗炎剂、抗氧化剂、抗血管生成剂等。本申请文件中提到的任何其他治疗剂，均可以添加到水凝胶中，以便用于治疗。
在一些实例中，会将组分添加到水凝胶(或组织/粉末前体)中，用以增加水凝胶的密度。这些情况下，水凝胶密度可以比眼玻璃体液的密度更高，以便在适当的患者位置沉入视网膜并与视网膜接触。可以添加透明质酸或卡波姆或类似物以增加密度
图7所示是通过角膜化学(碱)烧伤的动物研究，水凝胶对眼表创伤和干眼症的效果。
A.裂隙灯观察的图像。在第1天，角膜混浊、透明度显著降低，可见一些病变，两组之间的血管生成无显著差异。从第2天至第7天，各组角膜混浊程度降低，各水凝胶治疗组角膜透明度均优于模型组，但各水凝胶治疗组间差异无统计学意义。在第28天，各水凝胶治疗组的角膜变得透明，未观察到血管生成。模型组可见少量血管生成。
B.描绘H&E染色图像。在第3天，模型组角膜上皮受损，且皮下组织排列紊乱。相反，水凝胶治疗组仍有局部上皮脱落。在第7天和第14天，各治疗组的上皮完整，且有新组织生成。模型组仍有局部上皮脱离，皮下组织排列紊乱，局部出现空泡。
C.ELISA结果显示，3种细胞因子(IL-ip、IL-6、TNF-a)在模型组表达最高，在水凝胶治疗组表达较低，呈浓度依赖性(n＝2)。表明水凝胶可以减少炎性因子的表达。
图8所示是对角膜机械损伤动物研究，水凝胶对眼表创伤的效果。
A.在第1天，裂隙灯观察图像，角膜混浊，透明度显著下降。可见病变部位和血管增生。在后期，水凝胶组角膜清晰，血管增生基本消失。水凝胶组的治疗效果优于模型组。
B.H&E染色结果表明，该水凝胶促进了角膜上皮的形成，维持了角膜的完整性。
C.ELISA结果显示，3种细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)模型组表达最高，水凝胶治疗组较低，表明水凝胶具有抗炎作用(n＝2)。
眼内抗粘连、抗瘢痕、抗炎。
水凝胶可用作优异的眼内替代液和眼内抗粘连、抗瘢痕和抗炎剂，用于各种眼科手术，包括白内障摘除、人工晶状体植入、角膜移植手术、视网膜附着、青光眼激光治疗和青光眼切口手术(小梁切除术、滤过手术、引流植入手术和电烙术)。
白内障手术很少有副作用，但可能发生以下情况：眼部感染或肿胀、出血、视网膜脱落、眼睑下垂、术后12-24小时眼压暂时性升高。青光眼手术会使患者更容易患白内障。青光眼手术的其他潜在风险包括：眼睛疼痛或发红、眼压持续过高甚至过低、视力丧失、感染、炎症、眼睛出血。通过眼内注射水凝胶可以减少白内障和青光眼手术的术后并发症。
眼内炎是白内障手术的一种视觉破坏性并发症，发病率在0.028％至0.345％之间。对于眼内炎治疗，水凝胶可用作一种或多种抗菌剂(如头孢呋辛)的载体，并作为眼表水凝胶和/或眼内注射剂递送。头孢呋辛是第二代头孢菌素，对多种革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌均有杀菌作用。
该水凝胶还可以作为含有5-氟尿嘧啶(5-FU)或丝裂霉素C(MMC)等抗代谢药物的载体，以形成缓释给药系统，进而延缓青光眼术后瘢痕形成。可以使用缓冲剂来调节水凝胶，使其适合眼睛各部位的生理pH值。此外，生物相容性是人工晶状体的一个重要特征，可在短期和长期内影响人工晶状体的临床性能。理想情况下，完全生物相容的人工晶状体具有以下特征：不引起异物反应，被周围组织接受，与囊袋具有良好的相容性，并可在患者生存期内提供足够视力，且无需任何进一步的干预。眼的色素层生物相容性由眼内晶状体的炎性反应决定。将硅胶、聚甲基丙烯酸甲酯和含抗生素的水凝胶通过3D打印制成人工晶状体或用水凝胶包裹人工晶状体，不仅可以有效降低局部细菌感染的发生率，还可以进一步增加人工晶状体的生物相容性，减少局部炎症和瘢痕形成。因此，这些优势可以延长人工晶状体使用寿命，进而可以提高白内障患者的术后生活质量。
在一些实例中，通过将冻干和研磨胚胎组织加入到等渗溶液中形成治疗组合物，进而可形成一种可以用作滴眼剂的凝胶。该凝胶可施用于眼睛，并在几分钟内(例如3-4分钟内)增加粘度。该凝胶可以呈透明状，并能在眼睛上停留几个小时。这些实例可以用于眼表创伤、白内障切口、角膜移植、角膜上皮细胞再生、干眼症等。3-4分钟的固化时间以及通过粒度、交联剂、增稠剂等控制该时间，在本申请文件讨论的许多应用领域中都十分有用。
本发明的各种实例患者治疗方法包括：制备一种治疗组合物，其中含有冻干和研磨羊水等渗溶液和粉末；以及，将该治疗组合物以滴眼剂形式用于患者。
治疗组合物可设定成凝胶，以便应用于患者眼睛的外表面(可选)，该凝胶在所述表面的持续时间至少为10、20、30、60、120或180分钟。水凝胶的使用可支持角膜上皮块(例如视网膜色素上皮)的维持和/或再生。本节所述治疗，可同时应用于眼内和眼外。
可用于眼部愈合(以及本申请文件讨论的任何其他应用)的典型水凝胶制剂包括：1)去细胞化组织水凝胶，浓度至少为2mg/mL(粉末重量与再水化液体积之比)、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/m，或这些值之间的任何范围；或低于2mg/mL；2)氯化钠和/或氯化钾，3)例如，氯化钠，浓度至少为0.1％或0.2％；或在0.1％和0.2％之间；或低于0.2％。(所述百分比按重量百分比计算)；4)氯化钾，浓度至少为0.02％或0.05％；或在0.02％和0.05之间；或低于0.05％。聚乙二醇(可选)，浓度至少为0.05％或1％；或在0.05％和1％之间；或低于1％。羧甲基纤维素钠(可选)，浓度至少为0.05％或2.5％；或在0.05％和2.5％之间；或低于2.5％。透明质酸钠(可选)，浓度至少为0.1％或0.5％；或在0.1％和0.5％之间；或低于0.5％。其中所述再水化液体包括纯化水(可选)。所述粉末包括本申请文件别处所述的研磨组织，并且包括胎盘组织(可选)，例如猪、牛或人胎盘组织。
眼用水凝胶能够以液体形式包装，并进行无菌递送。例如，可以通过以下一种或多种方法来完成灭菌：无菌过滤，通过组织的低温研磨形成产品的小细度颗粒，或者通过电子束或用放射性同位素(如γ钴60)对产品进行放射。或者，这种组织源性粉末以粉末形式包装并无菌递送，使用时用普通纯化水或盐水再水化。
预防和治疗年龄相关的黄斑变性(AMD)、抗炎，并增强视网膜色素上皮(RPE)细胞的再生。
视网膜色素上皮(RPE)是介于神经视网膜和脉络膜之间的一层含有黑色素的上皮细胞，为单细胞层。其生理功能包括吸收散射光；控制视网膜空间中的液体和营养物；再生和合成视觉色素；合成生长因子和其他代谢产物；维持视网膜的附着；胞饮和消化光感受器代谢废物；维持电稳态；创伤和手术后的再生和修复。视网膜疾病的许多临床色素改变发生于色素上皮细胞。视网膜变性等疾病，如年龄相关性黄斑变性(AMD)、视网膜色素变性、青光眼及视网膜脱落等均会对视功能造成损害，尤其是视细胞的缺失会导致视功能永久丧失。
水凝胶是胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖等数百种蛋白质的丰富储库，可模拟成纤维细胞/角质形成细胞迁移/增殖、间充质干细胞归巢和再上皮化的微环境，这些微环境是减缓干性AMD(萎缩性AMD)、抑制炎性反应和促进感光细胞、RPE细胞和视网膜祖细胞再生的必要条件。该水凝胶具有抑制黄斑脉络膜新生血管(CNV)形成的能力，即湿性AMD。该水凝胶还具有治疗视网膜撕裂和黄斑裂孔、愈合视网膜伤口、抗炎和防止新血管形成的能力。
因为老化和炎症是视网膜色素上皮细胞疾病的重要风险因素，此应用水凝胶可纳入的治疗剂包括抗炎剂、抗氧化剂、干细胞等。本申请文件中提到的任何其他治疗剂，均可以添加到水凝胶中，以便用于治疗。图9A和9B显示了用高稀释水凝胶体外培养人类视网膜色素上皮细胞(RPE)。
A.细胞毒性试验。在第1天和第2天，各组间细胞增殖没有显著差异；然而，在第3天，中浓度和高浓度水凝胶组的增殖显著高于对照(CTRL)组。此外，随着水凝胶浓度的增加，对细胞增殖的影响更加明显。因此，结果表明水凝胶没有细胞毒性。
B.活性测定。在第7天，3种不同浓度水凝胶的活力显著高于对照组，表明水凝胶不仅对细胞活性无不良影响，而且有助于RPE细胞增殖。
C.H&E染色。H&E染色显示，随着培养时间的延长，细胞的形态由初期的短梭形变为后期的卵石形。而且细胞内有明显的细胞核、双极核，胞质内有丰富的黑色颗粒。同时，水凝胶组增殖能力显著高于对照组，且呈现剂量依赖性。
D.色素上皮源性因子(PEDF)、血管内皮生长因子-a(VEGF-a)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子-p(TGF-P)的免疫组织化学染色。结果表明，随着培养时间的延长，血管生长因子(PEDF)的释放量逐渐增加，而血管生成因子(VEGF-a、b-FGF和TGF-P)的释放量逐渐减少。
E.蛋白质免疫印迹。结果显示，血管生长因子(PEDF)的表达呈剂量依赖性增加。血管生成因子(VEGF-a、b-FGF和TGF-P)的表达呈剂量依赖性降低，进一步表明水凝胶具有抑制黄斑脉络膜新生血管形成(CNV)的能力。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001(与对照组相比)。
人体润滑剂：
本申请文件所述组织源性粉末可再水化为糊剂或水凝胶(可选)，并用作阴道和肛门治疗和/或人体润滑剂。例如，在这些实例中，水凝胶具有适于阴茎、肛门和/或阴道应用的pH值，旨在润滑和保湿，增强亲密性活动的容易性和舒适性，并补充身体的自然润滑。这些实例水凝胶都与天然胶乳和聚异戊二烯避孕套亲和。此外，阴道和肛门凝胶在粘膜组织上提供保护层并提供水分以促进阴道和肛门伤口愈合，包括但不限于擦伤、手术、阴道或肛门溃疡(非感染或病毒性，可能由化疗或放疗引起)、阴道或肛门狭窄(可能由化疗或放疗引起)。在这类应用中，水凝胶可包含杀精子剂、抗病毒剂和/或抗菌剂。
可用作人体润滑剂的实例制剂包括：1)去细胞化组织水凝胶，浓度至少为2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL，或这些值之间的任何范围；或低于2mg/mL；2)聚乙二醇，浓度至少为0.05％、1％、5％、10％、15％、20％，或这些值之间的任何范围；或低于20％。3)透明质酸(可选)，浓度至少为0.05％、1％、5％、10％、25％、50％、75％，或这些值之间的任何范围；或低于75％。4)山梨酸钾(可选)；5)生理盐水(可选)；6)维生素(可选)，如维生素C7、维生素E、烟酰胺(又称维生素B3)、维生素B12；7)调味剂或替代品(可选)；以及8)食品级着色剂(可选)。
如用作阴道和肛门凝胶，可以以粉末形式包装，在使用时用生理盐水或水进行再水化。以本申请文件另外描述方式灭菌。可通过注射器、冲洗器、涂药器和/或导管将再水化凝胶递送至阴道或直肠。或者，组织源性粉末以再水化的液体形式包装，通过注射器、冲洗器、涂药器和/或导管递送至阴道或直肠。
用于治疗阴道或肛门创伤愈合的水凝胶中，具有较高浓度的研磨组织。而用于个人保湿和润滑的阴道和肛门的凝胶中研磨组织浓度却要低得多，但其透明质酸浓度更高，会产生更高的凝胶粘度。烟酰胺可以作为外生殖器增白剂使用(可选)。
阴道和肛门伤口常发生于骨盆放疗期间。水凝胶可作为阴道和肛门润滑剂应用于治疗放射性阴道炎和直肠炎，或与扩张器(可选)一起应用于治疗阴道和肛门狭窄。水凝胶可在阴道和肛门壁上形成保护层，并为伤口愈合提供潮湿环境。水凝胶在治疗阴道和肛门伤口(包括擦伤、溃疡、损伤、溃疡和手术伤口)方面表现出很强的疗效。
口腔疾病和放射性治疗损伤。
低浓度的水凝胶具有一定的抗炎作用，可促进上皮细胞生长。因此，其也可以用作漱口水，以缓解患者口腔溃疡/疮、牙龈炎、拔牙后的疼痛和炎症。水凝胶还可用作口服溶液，用于修复由头颈部放疗引起的食管损伤，和/或在粘膜组织上形成保护层，以控制由化放疗、免疫疗法或其他癌症靶向治疗引起的口腔黏膜炎、口腔炎和食管炎。此外，水凝胶可用于治疗由放疗、酸反流、溃疡、疮或化学烧伤引起的食道损伤。在可以口服给药的实例中，水凝胶与可饮用液体结合或在可以咀嚼的胶囊中提供(可选)。对放疗期间因DNA损伤而导致的皮肤损伤，局部应用含抗氧化剂(如羟基酪醇、维生素C7、维生素E或维生素B12)的水凝胶也可促进伤口愈合。本申请文件中提到的任何其他治疗剂，均可以添加到水凝胶中，以便用于治疗。在身体任何部位的放射损伤都可以进行治疗。
本发明的一些实例包括一个治疗用组合物，其含有本申请文件公布的细胞外基质和载体基质，并具有适宜患者饮用或口服或鼻喷雾使用的粘度。例如，治疗组合物涵盖可饮用的水凝胶或可喷射患者口中的水凝胶。可以向治疗组合物中加入调味剂(可选)，例如草莓、薄荷或肉桂味的调味剂。
本发明的各种实例患者治疗方法，包括：对患者采用癌症治疗方法，包括化疗、放射治疗或粒子束治疗；制备一种治疗组合物，其中含有冻干和研磨羊水粉末；以及，将该治疗组合物用于患者。
治疗组合物可以以口腔喷雾或滴剂的形式给药(可选)。治疗组合物可以含有抗生素、抗炎剂、抗氧化剂、调味化合物、生长激素、干细胞、抗体、噬菌体和/或其任意组合(可选)。治疗组合物能够以口腔喷雾或滴剂的形式给药(可选)，每天3-10次。治疗组合物可以治疗烧伤，包括太阳晒伤、放射烧伤、化学烧伤和热烧伤。所治烧伤可以是患者的内部烧伤，也可以是外部烧伤。例如，治疗组合物可用于治疗喉咙的内部放射或化学灼伤。
皮炎常发生于放化疗、免疫疗法或其他癌症靶向治疗过程中。水凝胶可在皮肤表面形成保护层，并为伤口愈合提供潮湿环境。在控制癌症治疗诱发的皮炎以及控制疼痛和缓解疼痛方面，水凝胶表现出很强的疗效。图10所示是根据本发明的各种实例，利用水凝胶治疗放射性皮炎和疼痛真实患者的病例研究。
A.一名有鼻咽癌病史的女性接受了放疗联合化疗(紫杉醇)治疗。第26次放疗出现皮肤病损，第28次放疗出现溃疡。根据放射治疗肿瘤学组(RTOG)标准，患者患有严重的IV级放射性皮炎。第0天使用水凝胶，第4天后放射性皮炎明显缓解，第7天后大部分愈合。
B.一名有肺癌病史的男性接受了放化疗治疗。根据RTOG标准，第15次放疗时出现皮肤病损，第25次放疗时出现严重IV级放射性皮炎。从0天使用水凝胶，放射性皮炎在第7天明显缓解。
C.一名有喉癌病史的男性接受了线性加速器放射治疗，并将水凝胶涂在受照射部位成功预防了放射性皮炎。
图11所示是根据本发明的各种实例，利用(喷雾式)水凝胶治疗口腔黏膜炎和疼痛真实患者的病例研究。水凝胶显著减轻了口腔黏膜炎。
图12所示是利用水凝胶治疗放化疗诱发的放射性皮炎真实患者自我报告的病例研究调查。22份问卷结果显示放射性皮炎评分显著降低，提示水凝胶可以有效预防和治疗放射性皮炎，进而提高相关健康质量。
图13所示是根据本发明的各种实例，利用水凝胶治疗放化疗诱发的口腔黏膜炎真实患者自我报告的病例调查。22份问卷结果显示放射性皮炎评分显著降低，提示水凝胶可以有效预防和治疗口腔黏膜炎，进而提高相关生活质量。
图14所示是利用水凝胶治疗放射性阴道炎真实患者自我报告的病例研究调查。25份问卷结果显示放射性皮炎评分显著降低，提示水凝胶可以有效预防和治疗放射性阴道炎，进而提高相关生活质量。
图15所示是放射性直肠炎患者自我报告的病例研究调查。18份问卷结果显示放射性皮炎评分显著降低，提示水凝胶可以有效预防和治疗放射性直肠炎，进而提高相关生活质量。
3D打印。
水凝胶可用作3D打印的墨水。水凝胶在37℃下凝固3-5分钟，浓度会达到8-10mg/mL，具有一定的粘度和粘附性。用水凝胶打印的产品具有生物相容性和抗炎作用，并具有促进局部损伤修复的功能，能够根据生理条件促进组织和器官的生成。例如，我们可以用水凝胶3D打印出人工晶状体来治疗白内障。本申请文件中提到的任何其他治疗剂，均可以添加到水凝胶中，以便用于治疗。
痤疮。
痤疮是一种慢性炎症性疾病，常见于青少年，但在某些情况下会持续到成年。痤疮不仅给社会带来了经济负担，也给患者带来了沉重的心理负担，会导致抑郁甚至自杀。低浓度水凝胶作为日常护肤产品，能有效保持皮肤水分，迅速被皮肤吸收，提供抵御外界刺激的保护层，减轻局部炎症，促进开放性粉刺(黑头粉刺)的愈合。此外，水凝胶可以通过减少炎症和促进新皮肤再生，加速痤疮或激光去除纹身后的愈合过程。这种水凝胶可以在进行激光治疗后使用，和/或用于常规(如每日)局部治疗。本申请文件中提到的任何其他治疗剂，均可以添加到水凝胶中，以便用于治疗。
可以采用微针和/或硬膜下注射水凝胶来治疗痤疮。可以通过减少皮下瘢痕粘连和/或通过使用抗生素减少细菌来减轻痤疮疤痕。
图16所示是根据各种实例，患者使用水凝胶治疗普通痤疮的病例研究。A.使用水凝胶后第20天脓疱和囊肿明显消减。B.使用水凝胶后第14天，炎症和红肿明显缓解。
美肤。
测试证明，水凝胶可通过皮下注射来填充(除皱)和丰盈皮肤。为此，通过改变粉末粒径的大小、胶原蛋白或其他可生物降解增稠剂的量，可将水凝胶的降解时间(1/2寿命)至少调整2、3或4周。该应用中，水凝胶可以用来替代毒性相对较大的材料。水凝胶没有毒性，并且可具有抗氧化和/或抗炎功能。
测试证明，水凝胶可以减少生长纹，比如由怀孕引起的妊娠纹。生长纹是由皮肤下相对较深的疤痕引起的。已证明水凝胶可以通过提高弹性和/或减少组织层之间的粘连来减少疤痕。在皮肤红肿期，(可选)可以涂抹水凝胶。
预防孕期妊娠纹和膨胀纹，治疗产后妊娠纹和膨胀纹。
妊娠纹的形成主要是由于怀孕期间激素的作用。此外，腹部隆起会导致皮肤的弹力纤维和胶原纤维受损或断裂。腹部皮肤变得越来越薄，出现一些宽度和长度各异的粉色和紫色图案。分娩后，这些图案会逐渐消失，留下白色或银白色发亮的疤痕线，这就是妊娠纹。妊娠纹主要出现在腹壁，也可出现在大腿内、外侧、臀部、胸部、后腰和手臂。主要采用点阵激光疗法治疗。然而，激光治疗后会造成皮肤损伤。但如果配合使用水凝胶，不仅能促进表皮损伤的修复，还能进一步填补凹陷处缺失的胶原纤维，促进肌纤维的生长和连接。本申请文件中提到的任何其他治疗剂，均可以添加到水凝胶中，以便用于治疗。同样，可以在激光去除纹身、治疗“葡萄酒痣”或任何使用激光治疗皮肤病后使用水凝胶。
在孕期使用水凝胶，为皮肤提供保护层，向深层受损皮肤提供胶原蛋白和弹性蛋白纤维，并提供一个湿润的环境，以减少妊娠纹和膨胀纹。水凝胶可以为细胞再生提供一个自然的微环境，进一步减少妊娠纹和膨胀纹。
对于产后妊娠纹和膨胀纹，主要采用激光疗法治疗。水凝胶作为激光治疗后的伤口护理产品，不仅能促进激光损伤的伤口愈合，还能进一步填充缺失的胶原纤维，促进肌纤维的生长和连接，从而进一步减少妊娠纹和膨胀纹。本申请文件中提到的任何其他治疗剂，均可以添加到水凝胶中，以便用于治疗。同样，可以在激光去除纹身、治疗葡萄酒痣(焰色痣)或任何使用激光治疗皮肤病后使用水凝胶。
图17所示是根据本发明的各种实例，结合激光治疗利用水凝胶治疗妊娠纹真实患者的病例研究。两名受试者使用水凝胶使激光治疗后妊娠纹的严重程度显著降低。黑色箭头表示妊娠纹。
口服药物治疗
口腔和胃肠道损伤很难治疗。例如，我们不能在食道内的伤口处贴一个“创可贴”。这些组织的损伤可能由割伤、钝伤、胃酸回流、癌症、吸入或吞咽腐蚀性物质、溃疡等引起。在某些情况下，损伤可能是由于治疗其他疾病引起的。例如，对食道和口腔组织的损伤可能是由治疗癌症的放疗或化疗药物引起的。
本发明的实例包括用于患者口服的组合物。该组合物包括从胚胎组织中提取的治疗活性物质，并且还可能包括药物制剂，如抗生素、抗病毒制剂、抗癌药物、抗炎药等。
治疗组合物的制备包括，例如：羊膜组织的去细胞化、化学改变、物理改变、灭菌和/或添加治疗化合物。治疗组合物可包含于固体(如冰冻干粉末)、凝胶、糊剂、液体等物质中。可对治疗组合物进行设定，以便用于多种医疗应用。例如，可以利用治疗组合物抑制不良组织的生长(如纤维化和组织增生)、减少炎症、输送治疗化合物(如抗生素)、治疗眼外伤、治疗烧伤等。
中胚层微注射用于消除皱纹、皮肤保湿、调理(减轻褐斑、色素沉着过度和皮肤发红)，皮肤填充和皮肤丰盈。
中胚层疗法是一种非手术治疗技术，它将药物和顺势疗法制剂、植物提取物、维生素和其他成分微量注射到皮下脂肪中。水凝胶载有数百种蛋白质、胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、蛋白多糖氨基酸、多肽等丰富的营养成分，可与本申请文件讨论的任何一种治疗剂一起，通过中胚层微注射的方式，直接作用于真皮层。
因此，水凝胶能快速消除皱纹，深层保湿皮肤，减少棕色斑点、色素沉着、皮肤红肿，使皮肤丰满充盈。由于水凝胶具有生物降解性，皮肤丰满充盈效果可以持续长达4周。然而，通过中胚层微注射载有透明质酸的水凝胶可使皮肤丰满充盈效果持续6-12个月。水凝胶的颗粒细度可以通过多种低温研磨过程降低到325目(44微米)或更小，这使得水凝胶可以通过34号针进行中胚层微注射。此外，水凝胶还可载有本申请文件所述的维生素、抗氧化剂、外泌体、干细胞等任何一种治疗剂，增强抗氧化、抗衰老、抗皱、保湿功效。
图18A和18B所示是根据本发明的各种实例，在中胚层微注射中利用水凝胶进行皮肤再生、补水、填充和丰盈实现改善的真实患者满意度病例研究。这些图表表明了患者报告满意度增加比率。
A.患者左侧面部经中胚层微注射水凝胶治疗的照片，与未接受水凝胶治疗的右侧面部对比。
B-C。两名患者接受了水凝胶中胚层微注射治疗。通过VISIA全脸分析，结果显示，在治疗后第14天，患者的棕色斑点和色素沉着显著减轻。同时，研究还表明，治疗后第14天，皮肤红肿也有所缓解。
D.一项真正的专利，通过中胚层微注射水凝胶，使皮肤丰满充盈，治疗后效果可持续3周。
E.6份关于患者对中胚层微注射水凝胶改善皮肤疾病的满意度调查问卷(n＝6)。*与第0天相比，p<0.05。
本申请文件具体说明和/或描述了几个实例。但是，可以理解到，按照本申请文件的精神所作的任何修改和改进，均包含在权利要求的内容和范围内。例如，本申请文件中讨论的粉末、糊剂、水凝胶和溶液可选择性添加到动物或人类食品产品、保健产品、化妆品、医疗设备和/或药品中。本申请文件中讨论的粉末、糊剂、水凝胶和溶液的使用不限于治疗用途。例如，它们可用于营养或美容目的。羊膜组织只是作为例子来讨论，其他的组织也可以用于本申请文件中讨论的材料、系统和方法。例如，胰腺、血液、肌肉和/或神经组织；或者动物的胚胎组织。
而所述的低温研磨是指生物材料、胶原蛋白、纤维或组织的研磨。在替代实例中，在本申请文件公开的实例其采用的低温或室温研磨，应用于：1)环境和农业产业：植物种子(水稻、小麦、玉米、大豆等)，根茎、叶片的快速无铁研磨；2)电子材料行业：机械合金化，非晶材料的合成，高熵合金的制备；3)中西医结合：通常将药材(枸杞、地黄、中草药、蜂巢、粉剂等)碾碎以破坏细胞壁；4)纺织造纸行业：多纤维(棉、麻、纸、布等)物品的常规研磨；5)化工和制药行业：恒温球磨固相反应，对物料进行常规快速搅拌和铣削；6)动物饲料行业：研磨和混合组分(骨粉、鱼粉、饲料等)。这些应用中的每一种都可得益于对研磨材料中化学物质或生物活性的保存。
本申请文件所讨论的实例是本发明的例证。由于本发明的这些实例是参照插图进行描述的，所以对本申请文件所述方法和特定结构的任何修改或改动，对于行业内技术人员都显而易见。所有依赖本发明的原理做出的内容修改、改进或改动，并由此促进了技术发展，均认为是在本发明的精神和体现。因此，本发明不限于所述的实例，这些描述和附图不应认为具有限制意义。

Claims (81)

1.一种生物活性水凝胶的制备方法，包括：
羊膜组织接收；
冰冻干燥羊膜组织；
在低于-10℃的温度下研磨羊膜组织，制备羊膜组织颗粒粉末，而且至少50％的粒径小于200微米；以及
向冻干粉添加再水化液体，制备水凝胶。
2.一种生物活性水凝胶系统，包括：
羊膜组织的再水化冻干粉，其中至少50％的冻干粉粒径小于200微米，而且通过在-10℃的温度下研磨羊膜组织保持冻干粉所含生物活性材料的活性。
3.一种治疗系统，包括：
细胞外基质，其中细胞外基质源自去细胞化人体组织或动物组织，并经化学处理，以改变免疫反应；以及
为细胞外基质添加载体基质，并对其进行设定，以控制治疗组合物的粘度、粘附性、固化和生物降解速率。
4.一种包含组合物的治疗系统，包括：
细胞外基质，其中细胞外基质源自去细胞化人体组织或动物组织，并经化学处理，以改变免疫反应；以及
为细胞外基质添加载体基质，并对其进行设定，以控制治疗组合物的粘度、粘附性、固化和生物降解速率。
5.一种包含组合物的治疗系统，包括：
经过研磨的羊膜组织粉末，其颗粒D50细度为或小于200μm，而且羊膜研磨温度低于0℃、-10℃、-20℃或-30℃，以保持羊膜组织的生物活性。
6.一种制备治疗组合物的方法，包括：
羊膜组织获得；
混合羊膜组织，该混合选择性包含组织匀浆化和/或添加的附加治疗组分；
低温研磨羊膜组织，该研磨选择包括和/或冰冻干燥，并使粉末的粒径(D50)小于200μm、100μm或50μm。
7.使用本申请文件所述的粉末或再水化粉末治疗本申请文件所述的任何一种疾病的方法，其中本申请文件所述的疾病包括关节损伤或关节退化、支架内再狭窄、妊娠纹、扩张纹、视网膜撕裂、视网膜脱落、黄斑裂孔、眼表创伤、干眼症、眼内损伤、老年性黄斑病变(AMD)、视网膜色素上皮细胞(RPE)再生、阴道外伤或肛门外伤、口腔疾病、放射性治疗损伤、痤疮、除皱、保湿、皮肤调理(褐斑、色素沉着过度和皮肤轻度发红)、胃反流损伤、放射烧伤、皮肤填充和皮肤丰盈。
8.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，在低于0℃、-10℃或-20℃的温度下对粉末进行灭菌。
9.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，相应地，在杀菌放射源移动时对粉末进行灭菌。
10.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，粉末在水或盐水中再水化，形成糊剂、水凝胶或溶液。
11.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，该粉末包括本申请文件所讨论的任何附加组分。
12.上述权利要求一项中所述的制度或方法，还包括，将粉末添加到可植入人体的装置中，所述装置选择性包括导线、接头、套管、导管或支架。
13.上述权利要求一项中所述的制度或方法，还包括，将粉末再水化以产生水凝胶、糊剂或溶液。
14.上述权利要求一项中所述的制度或方法，还包括，将粉末添加到伤口敷料上。
15.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，在低于0℃、-10℃、-20℃或-30℃的温度下对羊膜组织进行研磨。
16.上述权利要求一项中所述的制度或方法，还包括，将粉末作为喷雾或凝胶施用。
17.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，羊膜组织包括胎盘组织或羊膜囊组织。
18.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，在球磨机中研磨羊膜组织。
19.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，在挤压研磨机中研磨羊膜组织。
20.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，使用循环冷却系统来维持温度。
21.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，冷却系统包括醇(如乙醇或甲醇)制冷剂。
22.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，通过向羊膜组织中添加制冷剂或向研磨机的冷却夹套中提供制冷剂来保持温度。
23.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，粒径是通过湿法研磨过程研磨羊膜组织而产生的，所述湿法研磨过程包括研磨羊膜组织和液体的混合物，所述液体可选择性地包括生理盐水和/或酒精(例如，乙醇或甲醇)
24.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，研磨机包括直径为3毫米(包括)至8毫米(包括)的研磨球。
25.上述权利要求一项中所述的制度或方法，还包括，选择粒径，优化生物活性水凝胶的增稠时间。
26.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，细胞外基质来源于人体组织。
27.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，细胞外基质来源于动物组织。
28.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，组织包括一个或多个羊膜组织、组织、羊膜囊组织、羊水、眼组织、淋巴结组织、干细胞和神经组织。
29.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，通过加热或冷冻进行细胞外基质去细胞化。
30.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，设定物理、化学和生物过程，去除刺激免疫系统部分。
31.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，设定组织的物理、化学和生物过程，从组织中去除甘油酯。
32.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，设定组织的物理、化学和生物过程减少T细胞对患者组织的反应。
33.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，水凝胶包括设定为可以改变免疫反应的化合物。
34.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，将载体基质设定为在与患者接触治疗后增加粘度、粘附性和固化时间。
35.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，将载体基质设定为在与患者接触的3-5分钟内改变组合物的粘度、粘附性和固化时间。
36.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，将载体基质通过与添加剂混合、暴露于空气中、施用于患者或与活化液混合等方式以增加水凝胶的粘度、粘附性和/或固化时间；相对于没有载体基质的细胞外基质组织而言。
37.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，载体基质设定为使组合物在体内可生物降解。
38.上述权利要求一项中所述的制度或方法，还包括一种治疗剂，所述载体基质设定为将治疗剂从组合物释放到患者体内。
39.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，治疗剂包括一种或多种药物、抗生素、抗病毒剂、抗代谢剂、抗真菌剂、干细胞、镇痛药、抗炎剂、皮肤细胞、神经细胞、抗氧化剂、免疫细胞、维生素或激素。
40.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，ECM来源于人体组织。
41.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，ECM来源于动物组织。
42.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，组织包括一个或多个羊膜组织、组织、羊膜囊组织、羊水、眼组织、淋巴结组织、干细胞和神经组织。
43.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，ECM通过加热或冷冻进行去细胞化。
44.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，设定物理、化学和生物过程，去除刺激免疫系统部分。
45.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，设定组织的物理、化学和生物过程减少T细胞对患者组织的反应。
46.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，去细胞化组织的制备方法包括：用去离子水冲洗组织，直到没有血或水；然后转移到0.15-0.18％过氧乙酸/4-4.8％乙醇溶液中，室温搅拌1-2小时；最后用水冲洗10-20分钟；将去细胞化组织置于-80℃冰箱中冷冻；在流动水中进行溶解，重复3次；经溶液1处理，然后用去离子水冲洗10分钟，振荡溶液1。溶液2和溶液3处理后，将去细胞化组织加入到DNase I溶液中连续振荡10小时。再经溶液4和溶液5处理后，得到去细胞化组织。
47.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其特征在于，溶液1包括高渗溶液和低渗溶液，这两种溶液都被重复使用。每次处理时间为30分钟。振荡1以140-160转/分钟振荡30-120分钟。
48.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其特征在于，溶液2包括1％Triton X-100，0.1mM PMSF和0.1％EDTA。这些试剂溶解在0.01M tris-HCl中。(PMSF＝PMSF)
49.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其特征在于，溶液3为0.25％-0.4％的脱氧胆酸钠溶液。
50.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，DNA溶液中DNase I浓度为100U/mL，MgCl2浓度为20mM，PMSF浓度为0.1mM。DNA溶液以80-110转/分钟的速度振荡，温度不超过37℃。温度为25℃～37℃。
51.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其特征在于，洗涤液1，溶液4，EDTA浓度为5mM-10mM。
52.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其特征在于，所述溶液4为1％的TritonX-100。
53.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，在电子束灭菌前对容器(例如，包含去细胞化组织的玻璃瓶)进行真空和冷冻处理，以减少辐照对ECM的不利影响。
54.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，添加防腐剂是为了实现临床应用的多用途。
55.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，这种新型的多用途伤口护理产品能够以粉末/糊剂形态施用于伤口部位，提示用粉末/膏体可与生理盐水、等渗溶液或水进行混合以形成多用途水凝胶或喷雾，继而为伤口部位提供持续的伤口护理。
56.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，加入透明质酸钠或卡波姆增加密度，以进行眼内应用。
57.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，可通过组织匀浆化，将去细胞化组织粉末与生理盐水、等渗溶液或水快速混合得到浓度为30mg/mL或以下浓度的分散均匀的水凝胶或去细胞化组织喷雾。
58.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，高浓度30mg/mL或以下浓度的水凝胶或去细胞化组织喷雾，粒径设定为100目以下。
59.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，100目、200目、400目或更小的粒径可以通过一个或多个低温研磨过程设定。
60.上述权利要求一项中所述的制度或方法其中，可设定高浓度30mg/mL或以下浓度的快速凝固水凝胶或去细胞化组织喷雾。固化时间可缩短至3-5分钟，这使得多种治疗方法成为可能。
61.上述权利要求一项中所述的制度或方法，还包括治疗关节损伤或关节退化；预防和治疗宫腔粘连(IUA)或阿谢曼综合征；介入疗法和支架内再狭窄(ISR)治疗；治疗眼表创伤和干眼症以及抗炎；预防和治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)、抗炎，并增强视网膜色素上皮(RPE)细胞的再生。治疗口腔疾病、阴道和肛门伤口；治疗痤疮，软化痤疮疤痕；预防孕期妊娠纹和膨胀纹，治疗产后妊娠纹和膨胀纹。中胚层微注射用于消除皱纹、皮肤保湿、和/或调理(减轻褐斑、色素沉着过度和皮肤发红)，皮肤填充和皮肤丰盈。
62.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，水凝胶包括设定为可以改变免疫反应的化合物。
63.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，将载体基质通过与添加剂混合、暴露于空气中、施用于患者或与活化液混合等方式以增加水凝胶的粘度、粘附性和/或固化时间；相对于没有载体基质的ECM组织而言。
64.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，载体基质设定为使组合物在体内可生物降解。
65.上述权利要求一项中所述的制度或方法，还包括一种治疗剂，所述载体基质设定为将治疗剂从组合物释放到患者体内。
66.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，治疗剂包括一种或多种药物、抗生素、抗病毒剂、抗代谢剂、抗真菌剂、干细胞、镇痛药、抗炎剂、皮肤细胞、神经细胞、抗氧化剂、免疫细胞、维生素或激素。
67.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，向所述工艺中加入99.7％的乙醇作为制冷剂溶液。
68.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，研磨速度可在1800-2000转/分钟之间调整。
69.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，组织包括一个或多个羊膜组织、组织、羊膜囊组织、羊水、眼组织、淋巴结组织、干细胞和神经组织。
70.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，设定物理、化学和生物过程去除刺激免疫系统部分。
71.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，设定组织的物理、化学和生物过程，从组织中去除甘油酯。
72.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，设定组织的物理、化学和生物过程减少T细胞对患者组织的反应。
73.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，水凝胶包括设定为可以改变免疫反应的化合物。
74.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，将载体基质设定为在与患者接触治疗后增加粘度、粘附性和固化时间。
75.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，将载体基质设定为在与患者接触的3-5分钟内改变组合物的粘度、粘附性和固化时间。
76.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，载体基质通过与添加剂混合、暴露于空气中、施用于患者或与活化液混合等方式以增加水凝胶的粘度、粘附性和/或固化时间；相对于没有载体基质的细胞外基质组织而言。
77.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，载体基质设定为使组合物在体内可生物降解。
78.上述权利要求一项中所述的制度或方法，还包括一种治疗剂，所述载体基质设定为将治疗剂从组合物释放到患者体内。
79.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，治疗剂包括一种或多种药物、抗生素、抗病毒剂、抗代谢剂、抗真菌剂、干细胞、镇痛药、抗炎剂、皮肤细胞、神经细胞、抗氧化剂、免疫细胞、维生素或激素，化疗药物、噬菌体、镇痛剂、羟基酪醇、肉毒杆菌毒素、染料、愈创甘油醚、右美沙芬、薄荷醇、大麻二酚、四氢大麻酚、苯佐卡因、葡萄糖酸锌、甘氨酸、果胶、右美沙芬、蜂蜜、桉树油、柠檬酸和植物提取物。
80.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，组合物放入含片、口香糖、硬糖或口腔崩解片中，可随时间在嘴里溶解，可选择包含葡萄糖、阿拉伯树胶、柠檬酸钾、大豆卵磷脂、乳糖和蔗糖的一种或多种。
81.上述权利要求一项中所述的制度或方法，其中，粉末经研磨后装入微型胶囊。
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