KR20150128481A

KR20150128481A - 세포외기질 및 온도감응성 고분자를 포함하는 생체 피부용 조성물

Info

Publication number: KR20150128481A
Application number: KR1020140055929A
Authority: KR
Inventors: 이희영; 조용우
Original assignee: 주식회사 아디포젤; 메디칸(주)
Priority date: 2014-05-09
Filing date: 2014-05-09
Publication date: 2015-11-18

Abstract

본 발명은 세포외기질 및 온도감응성 고분자를 포함하는 피부질환 또는 피부상처 치료용 조성물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 피부외용제에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 세포의 성장과 분화를 도우며 조직 내에서 많이 분포하고 있는 인간 지방조직 유래의 세포외기질을 포함하고 있어 생체적합성이 우수하며, 온도변화에 따라 가역적으로 졸-젤 상전이가 일어나 도포면적을 조절할 수 있으며 피부에 자극이 덜한 분무제형으로의 적용이 가능한 효과가 있다.

Description

세포외기질 및 온도감응성 고분자를 포함하는 생체 피부용 조성물{COMPOSITION FOR APPLICATION OF SKIN COMPRISING OF EXTRACELLULAR MATRIX AND THERMO SENSITIVE MACROMOLECULE}

본 발명은 세포외기질 및 온도감응성 고분자를 포함하는 생체 피부용 조성물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 피부외용제에 관한 것이다.

피부는 인체를 외부 자극으로부터 보호하고 수분의 손실을 막아주며 체온조절, 세균침입 방지 등 중요한 생명보호기능을 수행하는 가장 큰 조직 중 하나이다. 피부조직은 외부의 자극을 일차적으로 보호해주며 케라틴으로 구성된 표피와 피부 탄력 및 틀을 제공하고 세포외기질 (80% 이상이 교원섬유 (collagen)와 탄력섬유(elastin))로 이루어진 진피층으로 나누어진다. 손상된 피부의 치유과정은 일련의 과정(염증기(inflammation), 육아기(granulation), 상피화기(epithelialization), 섬유증식기(fibroplasia), 수축기(contraction)) 을 통해 진행되며, 특히 섬유증식기 과정에서는 섬유아세포에 의해 새로운 세포외기질이 합성되며, 합성된 세포외기질은 피부의 구조를 회복시키고 피부의 장력강도(tensile strength)를 증가시키는 역할을 한다.

한편, 피부가 손상된 후 흉터를 남기지 않고 빠른 회복을 유도하기 위해서 감염 및 염증의 조절, 습윤 환경의 유지, 피부구조의 빠른 회복 유도, 피부 재생을 돕는 성장인자 함유 등 복합적인 기능을 갖는 치료제의 개발이 요구되고 있다. 일반적으로 피부 치료용 습윤 드레싱은 일반적으로 키토산과 같은 지혈용 친수성 용액을 동결, 동결건조, 압반으로 압축, 대류식 오븐을 통한 가열, 감마조사를 이용한 멸균 등과 같은 5가지 이상의 절차를 거친 후 추가적인 친수성 중합체를 가지고 스펀지를 제조하여 얻는다. 상기 제조는 복잡한 과정과 많은 시간이 소요되고, 만들어진 피부 치료용 습윤 드레싱은 환부의 면이 넓거나 환부의 형상이 복잡하거나 환부가 신축하는 경우에는 부착에 어려움이 있고, 장시간 부착 시에는 환부에 피부질환과 같은 부작용을 일으키는 문제점이 있다. 또한 도포제 및 접착테이프 등을 약물과 함께 사용해야 하기 때문에 사용상 불편하고 접착력 또한 문제가 되고 있다.

한편 피부치료용 하이드로겔의 기존 제조방법의 경우 수분을 적절히 함유하기 위해 친수성 관능기를 포함하여 물을 흡수할 수 있는 고분자(알지네이트 및 기타 생중합체, 카르복시기 함유 다량체와 올리고사카라이드의 공중합체)등을 사용하고 치료를 위한 성장인자들을 내포하거나 공유결합시켜 하이드로겔을 제조한다. 하지만 세포의 주변 미세환경을 조성하여 조직재생을 유도하기 위해서는 다양한 인자들과 물질들이 유기적으로 혼합되어 있어야 하는데 기존의 치료용 하이드로겔은 주로 단성분의 물질을 젤화시키므로 적절한 미세환경 조성에 어려움이 있다.

2차 감염을 일으키지 않으며 간편하게 사용이 가능한 피부질환 또는 피부상처 치료 약제를 제공하기 위해, 본 발명은 세포외기질 및 온도감응성 고분자를 포함하는 생체 피부용 조성물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 피부 외용제를 제공하고자 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 국한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하고자, 본 발명의 일구현예는 23℃ 미만의 온도범위에서 졸상태를 유지하고, 생체 피부의 접촉시 젤상태로 변형되는 온도감응성 고분자를 포함하는 고분자 복합물질에 관한 것이다. 상기 생체 피부의 온도는 23℃ 내지 42℃의 범위를 갖는 것을 특징으로 하며, 상기 온도감응성 고분자는 23℃ 미만의 온도조건에서는 젤상태에서 졸상태로 상전이가 일어나는 가역반응을 수행하는 것이 고분자 복합물질이다.

본 발명의 일 구현예는 세포외기질 및 온도감응성 고분자를 포함하는 생체 피부용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 피부외용제, 및 상기 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 고분자 복합물질 및 생체피부용 조성물은 온도조건의변화에 따라 졸-젤 상변이가 가역적으로 일어날 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

일 구현예는 세포외기질 및 온도감응성 고분자를 포함하는 피부 외용제, 또는 생체 피부용 조성물에 관한 것으로, 예를 들면, 피부질환 또는 피부상처 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 분무제형으로서 피부치료 또는 피부상처 치료에 적용하기 위해 적정 온도 범위에서 졸-젤 상전이가 될 수 있다. 본 발명에 따른 세포외기질 및 온도감응성 고분자를 포함하는 조성물이 인체의 피부에 접촉하는 경우, 피부온도 조건에서 졸-젤 상전이가 일어날 수 있으며, 예컨대, 상기 조성물은 23℃ 이상 내지 42℃ 이하의 온도범위, 예를 들면 32℃ 내지 42℃ 또는 33 내지 38℃에서 졸-젤 상전이가 될 수 있으며, 상기 온도 범위에서 조성물은 졸-젤 상전이가 됨에 따라 피부에 닿는 즉시 수분 이내에 겔화되어 경화가 될 수 있다. 상기 23℃ 미만의 온도범위 조건에서는 졸상태를 유지하다가, 상기 23℃ 이상 내지 42℃ 이하의 온도범위의 피부와 접촉시 젤로 상전이 일어날 수 있다.

본 발명에 있어서, 온도감응성 고분자는 수용액 중에서 온도 변화에 따른 고분자의 급격한 용해도의 차이에 의하여 상전이가 가역적으로 나타나는 물질이다. 즉, 온도감응성 고분자는 온도 변화에 따라 액상에서 수화젤로 상전이가 가역적으로 나타나는 물질을 말한다. 예컨대, 온도감응성 고분자는 메틸 셀룰로오스, 하이드록시 프로필 메틸 셀룰로오스, 하이드록시 프로필 셀룰로오스, 플루로닉, 폴리포스파젠, 폴록사머(Poloxamer), Poly(NIPAAM), PEO-PPO-PEO 공중합체, PEG-PLGA-PEG 공중합체 및 MPEG-PCL 블록 공중합체 등으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 메틸 셀룰로오스일 수 있다. 상기 온도감응성 고분자의 분자량은 중량평균 분자량이 100 내지 100,000인 것일 수 있다.

상기 온도감응성 고분자는 조성물의 졸-젤 상전이 현상을 일으키게 하는 기능을 한다. 예컨대, 메틸 셀룰로오스의 경우 친수성 부분과 소수성 부분을 갖는데, 친수성 부분은 수용액의 물분자와 수소결합 등에 의한 분자간의 상호작용을 형성하여, 온도 상승에 따른 물분자가 열에너지에 의해 운동에너지가 증가하여도 강한 상호작용에 의해 친수성 부분 주위에는 일부 물분자가 존재하는 반면, 소수성 부분은 물분자와 수소결합을 형성할 만큼 강력한 상호작용을 하지 않아 온도 상승에 따라 물분자와의 상호작용이 와해되어 물분자가 떨어져 나가면서 소수성 부분이 응집하게 되어, 졸-젤 상전이 현상이 일어나게 된다(도 1).

상기 조성물이 피부치료 또는 피부상처 치료에 적용하기 위한 적정 온도 범위에서 졸-젤 상전이가 될 수 있도록, 상기 세포외기질과 온도감응성 고분자의 혼합비는 적절하게 조절될 수 있다. 예컨대, 상기 세포외기질과 온도감응성 고분자의 혼합비는 중량비를 기준으로 1.5:8.5 내지 5:5일 수 있다. 상기 혼합비 범위를 벗어나는 경우 졸-젤 상전이가 일어나지 않거나, 피부치료 또는 피부상처 치료에 적용하기 위한 적정 온도 범위 외에서 졸-젤 상전이가 일어날 수 있다.

상기 조성물이 피부치료 또는 피부상처 치료에 적용하기 위한 적정 온도 범위에서 졸-젤 상전이가 될 수 있도록, 상기 세포외기질의 함량은 적절히 조절될 수 있다. 예컨대, 상기 세포외기질의 함량은 전체 조성물 대비 15 ~ 50 중량%일 수 있다. 상기 세포외기질의 함량이 전체 조성물 대비 15 중량% 미만이거나 50 중량% 초과하는 경우 졸-젤 상전이가 일어나지 않거나, 피부치료 또는 피부상처 치료에 적용하기 위한 적정 온도 범위 외에서 졸-젤 상전이가 일어날 수 있다.

피부치료 또는 피부상처 치료에 적용하기 위한 적정 온도 범위, 즉 본 발명의 조성물이 접촉시 피부온도 조건에서 에서 졸-젤 상전이가 될 수 있도록, 상기 온도감응성 고분자의 함량은 적절히 조절될 수 있다. 예컨대, 예컨대, 상기 조성물은 22 내지 42, 예를 들면 32 내지 42℃ 또는 33 내지 38℃에서 졸-젤 상전이가 될 수 있으며, 이러한 조건을 만족할 수 있도록, 예를 들면, 상기 온도감응성 고분자의 함량은 전체 조성물 대비 50 ~ 85 중량% 일 수 있다. 상기 온도감응성 고분자의 함량이 전체 조성물 대비 50 중량% 미만이거나 85 중량% 초과하는 경우 졸-젤 상전이가 일어나지 않거나, 피부치료 또는 피부상처 치료에 적용하기 위한 적정 온도 범위 외에서 졸-젤 상전이가 일어날 수 있다. 상기 범위는 세포외기질을 온도감응성 고분자, 예컨대 메틸셀룰로오즈와 혼합한 조성물에 한정되어 있다.

상기 조성물은 세포외기질 및 온도감응성 고분자의 혼합을 위하여 용액을 포함할 수 있다. 상기 용액은 세포외기질 및 온도감응성 고분자를 용해시킬 수 있는 물질을 의미한다. 예컨대, 상기 용액은 PBS(phosphate buffered saline), TBS(tris buffered saline), DMEM(Dulbeco? Modified Eagle Medium), 및 DW(distilled water)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

상기 조성물의 세포외기질, 온도감응성 고분자, 및 용액의 함량은 발명의 목적을 위해 적절히 조절될 수 있다. 예컨대, 전체 조성물 대비 15 ~ 50 wt%의 세포외기질 및 50 ~ 85 wt%의 온도감응성 고분자 용액을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 피부질환 또는 피부상처의 치료효과를 향상시키기 위해 세포, 성장인자, 약물 등을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 조성물은 줄기세포나 피부구성세포와 같은 세포; VEGF, EGF, IGF, PDGF, 또는 FGF와 같은 성장인자; 항암제와 같은 약물 등을 더 포함할 수 있다.

상기 세포외기질은 인간 지방조직에서 유래된 것일 수 있다. 지방조직은 피하조직 및 장기주변에 존재하는 결합조직으로, 조직의 형태를 유지시키며 활동하는데 필요한 에너지를 저장시키는 역할을 하고, 조직 내에는 지방세포를 비롯하여 지방유래줄기세포, 섬유아세포, 및 면역세포 등의 세포성분과 콜라겐 등의 다양한 세포외기질이 풍부하게 존재하여 조직재생 효과가 뛰어나다(도 2).

상기 세포외기질은 피부재생에 유효한 것으로 공지된 모든 물질을 포함한다. 예컨대, 상기 세포외기질은 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 피브린, 피브리노겐, 글리코사미노글리칸, 히알루론산, 프로테오글리칸, 라미닌, 헤파린 설페이트, 콘드로틴 설페이트 및 케라틴 설페이트로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것일 수 있다. 상기 세포외기질은 피부재생에 유효하게 작용하며, TGF-beta, basic FGF, EGF, VEGF 등 손상된 피부조직 재생에 도움을 주는 성장인자들을 포함하고 있어 피부재생을 촉진시킨다.

상기 피부질환 또는 피부상처는 외계로부터의 자극이나 병원체에 의한 피부손상을 포함한 피부의 병적인 모든 상태를 포함하며, 상기 피부는 인체의 전 표면을 포함한 것으로 손발톱, 근육과 분비선 모두를 포함한다. 예컨대, 상기 피부질환 또는 피부상처는 창상, 여드름, 피부 염증, 피부 알레르기, 자상, 화상, 교상, 열상, 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 것일 수 있다.

상기 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 치료부위에 도포된다. 상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적으로 피부질환 또는 피부상처 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 투여시간, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 치료용 조성물은 다른 치료제와 병용하여 도포될 수 있고 종래 치료제와는 순차적 또는 동시에 도포될 수 있으며, 단일 또는 다중 도포될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

다른 일 구현예는 상기 조성물을 포함하는 피부외용제를 제공한다. 상기 피부외용제는 다양한 방식 또는 형태로 치료에 적용될 수 있으나, 바람직하게는 피부에 국소적으로 도포되어 적용가능한 피부외용제의 제형일 수 있다. 예컨대, 연고제, 겔제, 크림제, 리니멘트제, 로션제, 액제, 패치, 또는 분무제 등의 제형으로 제조할 수 있다.

상기 피부외용제는 분무제형일 수 있다. 상기 조성물을 분무제형으로, 예컨대 스프레이 방식으로 피부에 분사함으로써 마취가 필요없고 면적에 상관없이 원하는 부위에 원하는 도포를 할 수 있으며, 손이나 도구를 통해 도포함으로써 발생하는 2차 감염에 대한 문제가 없다. 또한 사용에 대한 번거로움이 없으며 작은 입자형태로 분사되므로 손상부위에 고르게 분포되어 적은 양으로도 피부질환 또는 피부상처의 치료효과를 얻을 수 있어 경제적으로 활용성이 매우 높은 것이 특징이다.

일례로 화상의 경우, 치료용 조성물을 분사함에 따라 면적에 상관없이 화상부위에 도포가 가능하며, 인간의 사체 또는 동물의 진피조직의 탈세포화 등 화학적인 처리를 통해 제조된 인공피부조직의 공급량 부족으로 인한 넓은 면적의 상처 부위에 대한 치료의 한계점을 극복할 수 있다.

다른 일례로 피부 염증의 경우, 치료용 조성물을 분사함에 따라 2차적인 세균 감염률이 낮고 분사 후 수분 이내에 젤화되어 외부로부터 세균의 침입을 막아주는 장점이 있다.

또 다른 일례로 여드름의 경우, 치료용 조성물을 국소부위에 분사할 수 있어 간편한 치료가 가능하다.

상기 피부외용제를 위한 제제에는 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다.

상기 피부외용제를 제제화할 경우, 상기 조성물 외에 첨가물 등을 적절하게 배합하여 제조할 수 있다. 상기 첨가물은 당업계에서 통상적으로 이용되는 것으로, 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합이 가능하다. 예컨대 항염증 및/또는 피부 자극 완화용도로서 방부제, 향료, 항균제, 미백제, 비탄민류 또는 색소를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 일 구현예는 피부질환 또는 피부상처 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법은 지방조직을 분쇄한 후 원심분리하여 탈리된 지질을 준비하는 단계; 상기 탈리된 지질에 프로테아제 억제인자를 포함하는 완충액을 첨가하여 원심분리하는 단계; 상기 원심분리한 후의 상층액을 투석하여 투석액을 얻는 단계; 상기 투석액을 원심분리한 후 상층액을 회수하여 세포외기질을 얻는 단계; 상기 세포외기질을 온도감응성 고분자와 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 탈리된 지질을 준비하는 단계에서 분쇄는 지방조직을 블레이드가 구비된 분쇄기를 이용하여 수행될 수 있으며, 원심분리는 발명의 목적에 따라 적절한 조건에서 수행될 수 있으며, 필요에 따라 2회 이상 수행될 수 있다. 상기 분쇄 및 원심분리를 통해 지방조직으로부터 지질, 혈액, 세포 등을 제거할 있으며, 필요에 따라 탈리된 지질을 세척하는 단계를 추가로 수행하여 제거되지 않은 지질이나 면역반응을 일으킬 수 있는 세포 등을 제거할 수 있다.

상기 탈리된 지질에 프로테아제 억제인자를 포함하는 완충액을 첨가하여 원심분리하는 단계에서 완충액은 단백질의 폴딩(folding)을 풀어주는 역할을 하는 것으로 공지된 것을 말한다. 예컨대, 상기 완충액은 구아니딘(guanidine) 또는 요소(urea) 완충액일 수 있다. 상기 프로테아제 억제인자는 Aprotinin, Bestatin, Calpain inhibitor Ⅰ, Calpain inhibitor Ⅱ, Chymostatin, E-64, Leupeptin, α2-Macroglobulin, Pefabloc SC, Pepstatin, PMSF, TLCK-HCl, Trypsin inhibitor(chicken, egg white) 및 Trypsin inhibitor (soybean) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 완충액 내에서 단백질의 분해나 변형으로부터 보호하는 역할을 한다. 상기 단계에서 원심분리는 발명의 목적에 따라 적절한 조건에서 수행될 수 있으며, 필요에 따라 2회 이상 수행될 수 있다.

상기 원심분리한 후의 상층액을 투석하여 투석액을 얻는 단계는 적절한 조건에서 수행될 수 있다. 상기 단계를 통해 단백질의 손상을 유발할 수 있는 물질, 예컨대 구아니딘(guanidine) 또는 요소(urea) 완충액을 제거할 수 있다.

상기 투석액을 원심분리한 후 상층액을 회수하여 세포외기질을 얻는 단계에서 원심분리는 적절한 조건에서 수행될 수 있으며, 필요에 따라 2회 이상 수행될 수 있다. 상기 세포외기질을 얻는 단계 후에 필요에 따라 염을 제거하거나 동결건조하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.

상기 홉합하는 단계는 각각 용액에 용해된 세포외기질과 온도감응성 고분자를 혼합하는 것일 수 있다. 이때 사용되는 용액은 세포외기질과 온도감응성 고분자를 모두 용해시킬 수 있는 것을 말한다. 예컨대 상기 용액은 PBS(phosphate buffered saline), TBS(tris buffered saline), DMEM(Dulbeco? Modified Eagle Medium), 및 DW(distilled water)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

상기 혼합비율은 조성물이 피부치료 또는 피부상처 치료에 적용하기 위한 적정 온도 범위에서 졸-젤 상전이가 될 수 있도록 적절하게 조절될 수 있다. 예컨대, 상기 세포외기질과 온도감응성 고분자의 혼합비는 중량비를 기준으로 1:6 내지 1:2, 또는 1:6 내지 1:1일 수 있다. 상기 혼합비가 1:6 내지 1:1 범위를 벗어나는 경우 졸-젤 상전이가 일어나지 않거나, 피부치료 또는 피부상처 치료에 적용하기 위한 적정 온도 범위 외에서 졸-젤 상전이가 일어날 수 있다.

온도감응성 고분자, 세포외기질, 피부질환 또는 피부상처용 조성물에 관한 것은 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 조성물은 세포의 성장과 분화를 도우며 조직 내에서 많이 분포하고 있는 인간 지방조직 유래의 세포외기질을 포함하고 있어 생체적합성이 우수하며, 온도변화에 따라 가역적으로 졸-젤 상전이가 일어나 도포면적을 조절할 수 있으며 피부에 자극이 덜한 분무제형으로의 적용이 가능한 효과가 있다.

도 1은 메틸 셀룰로오스의 온도상승에 따른 졸-겔 상전이 현상을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 인간 지방조직의 구조 및 성분을 나타낸 것이다.
도 3은 지방조직으로부터 세포외기질을 추출하는 과정의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 세포외기질과 메틸 셀룰로오스의 혼합하여 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물을 제조하는 과정의 모식도를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 4-1에 따른 4℃ 및 37℃에서의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물의 졸-젠 상전이를 나타낸 그림이다.
도 6a는 는 대조구인 메틸 셀룰로오스 조성물(A)과 실시예 1의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물(B)의 유변학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 대조구인 메틸 셀룰로오스 조성물(A)과 실시예 2의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물(B)의 유변학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6c는 대조구인 메틸 셀룰로오스 조성물(A)과 실시예 3의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물(B)의 유변학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 5에 따른 스프레이 분사 장비의 그림을 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 2의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물에 NIH 3T3를 담지하여 세포독성실험을 수행하고, 1일 및 3일 간격으로 측정된 live/dead assay의 분석결과를 나타내는 형광사진이며, 살아있는 세포는 녹색이며, 사멸한 세포는 적색이고, 크기자(scale bars)는 250 마이크로미터를 나타낸다.
도 9는 실시예 3의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물을 래트의 상처에 분사시킨 동물실험으로서, 0, 7일, 14일 및 21일 간격으로 시간에 따른 그룹별 상처부위의 사진을 나타낸다.
도 10은, 실시예 3의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물을 래트의 상처에 분사시킨 동물실험으로서, 0, 7일, 14일 및 21일 간격으로 시간에 따른 그룹별 혈관 생성 확인 결과를 나타내는 사진이며, 크기자(scale bars)는 200 마이크로미터를 나타낸다.
도 11은, 실시예 3의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물을 래트의 상처에 분사시킨 동물실험으로서, 0, 7일, 14일 및 21일 간격으로 시간에 따른 그룹별 상처부위에서 적출한 피부조직에 대한 면역조직화학적 분석을 통해 상처치유 정도를 나타내는 도면이며, 크기자(scale bars)는 200 마이크로미터를 나타내며, 상처의 경계는 검은색 화살표로 표시하며, 근육, 케라틴 및 사이토플라즘은 적색으로, 콜레겐은 녹색으로, 핵은 흑색으로 표시하였다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 세포외기질 - 메틸 셀룰로오스 조성물 제조(1 w/v% 세포외기질 용액과 6 w/v%의 메틸셀룰로오스의 혼합)

1-1: 지방조직으로부터 세포외기질 추출

지방조직으로부터 세포외기질을 추출하는 과정은 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 비만 환자로부터 추출되어 폐기된 지방조직을 증류수를 넣고 분쇄한 다음, 16,500xg 4℃에서 5분간 원심분리하여 지질을 탈리시켰다. 상기 탈리된 지질과 지질이 탈리되지 않은 지방조직을 NaCl상에서 세척하였고, 20,000 xg 4℃에서 30 분간 원심분리한 후, 원심분리한 후의 침전물을 urea buffer에 프로테아제 억제인자(protease inhibitor)(입수처: Roche, 모델명: protease inhibitor cocktail tablets, Product No. 11697498001)와 함께 넣고 4 ℃에서 12시간동안 교반시켰다. 그 후 20,000 xg 4 ℃에서 60분간 원심분리 하였고, 상층액을 4 ℃에서 투석(dialysis)을 하루 동안 진행하였다. 침전물은 guanidine buffer에 프로테아제 억제인자를 함께 넣고 이전단계와 동일하게 4 ℃에서 12시간동안 교반시킨 후 20,000 xg 4 ℃에서 60분간 원심분리 하였고, 상층액은 4 ℃에서 투석(dialysis)을 하루 동안 진행하였다. 투석액은 20,000 xg 4 ℃에서 60분간 원심분리를 하였고, 상층액을 회수하여 filter-3K 원심분리를 통해 수용액 내 염을 제거하였다. 염이 제거된 수용액을 회수하여 액상형태의 세포외기질을 얻었고, 얻은 세포외기질의 성분은 elastin assay, soluble collagen assay kit, sulfated glycosaminoglycan assay assay 및 laminin ELISA 를 이용하여 분석하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

성분	함량 ( mg / mL )
elastin	16.463 ±1.440
collagen	4.572 ±0.136
laminin	1.038 ±0.064
GAGs	0.021 ±0.004
fibronectin	0.144 ±0.054

1-2: 세포외기질과 메틸 셀룰로오스의 혼합

세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물 제조과정을 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1-1에 따라 지방조직으로부터 추출된 세포외기질 분말을 PBS(phosphate buffered saline) 용액에 첨가하여 4℃에서 24시간동안 교반하여 용해시켰고, 세포외기질이 용해된 용액을 공극크기가 40 ㎛인 필터를 이용하여 세포외기질 이외의 불순물을 제거하여 최종농도가 5% (w/w)인 세포외기질이 용해된 PBS 용액을 제조하였다.

한편, 메틸 셀룰로오스를 PBS 용액에 첨가하여 90℃에서 1시간동안 교반한 후 4℃에서 24시간동안 용해시켜 최종농도가 7.5% (w/v)인 메틸 셀룰로오스가 용해된 PBS 용액을 제조하였다.

상기 5% (w/v)의 세포외기질이 용해된 PBS용액과 7.5% (w/v) 메틸 셀룰로오스가 용해된 PBS 용액을 부피비 2:8로 (중량비로는 1:6) 혼합하고 4 ℃에서 1시간동안 교반하여 세포외기질-메틸 셀룰로오스 하이드로젤 [1% (w/v) 세포외기질, 6% (w/v)의 메틸 셀룰로오스]을 제조하였으며, 대조구로서 메틸 셀룰로오스를 PBS 용액에 첨가하여 90 ℃에서 1시간동안 교반한 후 4 ℃에서 24시간동안 두어 최종농도가 6% (w/v)인 메틸 셀룰로오스가 용해된 PBS 용액을 제조하여 메틸 셀룰로오스 하이드로젤을 준비하였다.

실시예 2. 세포외기질 - 메틸 셀룰로오스 조성물 제조[6% (w/v) 세포외기질 , 3% (w/v)의 메틸 셀룰로오스]

상기 실시예 1과 같은 방법으로 최종 농도가 15% (w/v)인 세포외기질이 용해된 PBS 용액을 제조하여 7.5% (w/v) 메틸 셀룰로오스가 용해된 PBS 용액과 부피비 8:2 (중량비로는 1:2)로 혼합한 것 이외에는 동일한 방법으로 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물[3% (w/v) 세포외기질, 6% (w/v)의 메틸 셀룰로오스]을 준비하였다.

실시예 3. 세포외기질 - 메틸 셀룰로오스 조성물 제조[6% (w/v) 세포외기질 , 6% (w/v)의 메틸 셀룰로오스]

상기 실시예 1과 같은 방법으로 최종 농도가 30 % (w/v)인 세포외기질이 용해된 PBS 용액을 제조하여 7.5% (w/v) 메틸 셀룰로오스가 용해된 PBS 용액과 혼합한 것 이외에는 동일한 방법으로 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물[6% (w/v) 세포외기질, 6% (w/v)의 메틸 셀룰로오스]을 준비하였다.

실시예4 . 졸-젤 상전이 분석

4-1. 졸-젤 상전이의 육안 관찰

상기 실시예 3에서 제조된 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물을 4℃ 및 37℃에서 졸-젤 상전이를 육안으로 확인하였고, 그 결과를 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5는 4℃ 및 37℃에서의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물의 졸-젠 상전이를 나타낸 그림이다.

도 5에 나타난 바와 같이, 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물은 4℃ 에서는 졸 상태이지만 37℃에서는 젤 상태임을 확인하였다. 이는 온도 증가에 따라 조성물 내의 소수성 부분의 회합이 일어난 결과 졸-젤 상전이 현상이 일어난 것이다.

4-2. 유변학적 분석을 통한 세포외기질 - 메틸 셀룰로오스 조성물의 졸-젤 상전이 분석

상기 실시예 1, 2 및 3에서 각각 제조된 3가지의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물과 대조구인 메틸 셀룰로오스 조성물을 유변학 측정 장비인 레오미터(rheometer)(입수처: Malvern, 모델명: Gemini)를 사용하여 온도에 따른 졸-젤 상전이를 분석하였고, 그 결과를 도 6a, 도 6b, 및 6c에 나타내었다.

도 6a는 대조구인 메틸 셀룰로오스 조성물(A)과 실시예 1의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물(B)의 유변학적 분석 결과를, 도 6b는 대조구인 메틸 셀룰로오스 조성물(A)과 실시예 2의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물(B)의 유변학적 분석 결과를, 도 6c는 대조구인 메틸 셀룰로오스 조성물(A)과 실시예 3의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물(B)의 유변학적 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 6a 내지 도 6c의 그래프에 기재된 G’은 저장탄성률(storage modulus or elastic modulus)로 고체의 탄성 성질을 나타내며, G”은 손실탄성률(loss modulus or viscous modulus)로 액체의 점성 성질을 나타낸다. G’이 G”값을 역전하는 것은 물질의 점성 성질 보다 탄성 성질이 증가하는 시점으로 물질의 졸-젤 상전이가 일어난다고 볼 수 있으며, 세로축 단위는 modulus의 단위 Pa (N/m²) 를 의미한다.

도 6a, 도 6b, 및 도 6c에 나타난 바와 같이, 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물 내 세포외기질의 농도가 증가할수록 졸-젤 상전이 온도가 낮은 것을 확인하였다. 실제 치료제로서 효율적인 상전이 온도는 32 ℃ 내지 36 ℃임을 고려한다면, 세포외기질 6% (w/v), 메틸 셀룰로오스 6% (w/v)의 함량이 가장 적합함을 확인하였다.

실시예 5. 세포외기질 - 메틸 셀룰로오스 조성물의 분사

상기 실시예 3의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물을 도 7에 나타낸 스프레이 분사 장비를 하기 표 2의 조건으로 분사하였고, 37℃에서 수 분이내 졸-젤 상전이가 일어나는 것을 확인하였다.

구분	값
Gel Viscosity	500~600 cP
Working pressure	15~35 psi
Nozzle size	0.5 mm
Working distance	~ 25 cm

실시예 6. 세포외기질 - 메틸 셀룰로오스 조성물의 세포독성실험

상기 실시예 2의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물에 NIH 3T3를 담지하여 세포독성실험을 진행하였다. 1일 3일 간격으로 live/dead assay를 실시하였다. (LIVE/DEAD(®)Viability/Cytotoxicity Kit, Invitrogen, L-3224)형광현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 세포를 관찰하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8은 실시예 2의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물에 NIH 3T3를 담지하여 세포독성실험을 수행하고, 1일 및 3일 간격으로 측정된 live/dead assay의 분석결과를 나타내는 형광사진이며, 살아있는 세포는 녹색이며, 사멸한 세포는 적색이고, 크기자(scale bars)는 250 마이크로미터를 나타낸다.

세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물에 담지된 mouse fibroblast는 3일 동안 잘 생존하였으며, 1일째에 비해 세포 증식도 이루어 졌음을 확인하였다 (Green color: 살아있는 세포, Red color: 죽은 세포). 따라서, 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물은 세포에 적합하다는 결과를 얻었다.

실시예 7. 세포외기질 - 메틸 셀룰로오스 조성물의 피부질환 및 피부상처의 치료효과 실험

6주차 암컷 래트의 피부에 직경 1.3 cm 상처를 낸 후, 대조군으로 처리를 하지 않은 래트와 실험군으로 실시예 3의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물을 분사시킨 래트를 구분하여 진행하였다. 0일, 7일, 14일, 및 21일 간격으로 상처의 크기 및 수축을 디지털 카메라로 이미지를 촬영하여 크기 변화를 관찰하였으며, 날짜 별로 적출한 피부조직을 조직학적 및 면역조직화학적 분석을 통해 상처치유 정도를 비교하였다. 그 결과를 도 9, 도 10, 및 11에 나타내었다.

도 9는 실시예 3의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물을 래트의 상처에 분사시킨 동물실험으로서, 0, 7일, 14일 및 21일 간격으로 시간에 따른 그룹별 상처부위의 사진을 나타낸다.

도 10은, 실시예 3의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물을 래트의 상처에 분사시킨 동물실험으로서, 0, 7일, 14일 및 21일 간격으로 시간에 따른 그룹별 상처부위에서 적출한 피부조직에 대한 면역조직화학적 분석을 통해 상처치유 정도를 나타내는 도면이며, 크기자(scale bars)는 200 마이크로미터를 나타내며, 상처의 경계는 검은색 화살표로 표시하며, 근육, 케라틴 및 사이토플라즘은 적색으로, 콜레겐은 녹색으로, 핵은 흑색으로 표시하였다.

도 11은, 실시예 3의 세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물을 래트의 상처에 분사시킨 동물실험으로서, 0, 7일, 14일 및 21일 간격으로 시간에 따른 그룹별 혈관 생성 확인 결과를 나타내는 사진이며, 크기자(scale bars)는 200 마이크로미터를 나타낸다. 도 11은 21일째 래트 상피세포에 대해 CD31을 이용하여 신생 혈관의 분포와 밀도를 분석한 결과로서, 흰색 화살표는 신생혈관 생성을 나타내고, 섹션은 DAPI로 대비염색을 수행하였으며, 이러한 염색은 핵을 청색으로 표시한다.

세포외기질-메틸 셀룰로오스 조성물 처리군 (ECM/MC hydrogel)과 상기 조성물에 사람의 지방유래 줄기세포(human adipose-derived stem cells, hASC)를 담지한 실험군(ECM/MC hydrogel + hASC)의 상처는 아무것도 처리하지 않은 대조군의 상처에 비해 크기가 빨리 감소하였다. 실험군의 상피조직 재생 및 혈관 생성이 대조군에 비해 빠르게 유도되었으며, 반면 대조군에서는 상처의 수축이 심하여 21일 후에도 흉터가 남아있었다. 따라서, 세포외기질-메틸 셀룰로우스 조성물은 그 자체로도 피부 상처 치유를 위해 효과적이며, 세포를 담지하여 상처부위에 전달하기 위한 전달체로서도 효과적임을 동물실험을 통해 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

23℃미만의 온도범위에서 졸상태를 유지하고, 생체 피부의 접촉시 젤상태로 변형되는 온도감응성 고분자를 포함하는 고분자 복합물질.
제1항에 있어서, 상기 생체 피부의 온도는 23℃ 내지 42℃의 범위를 갖는 것을 특징으로 하는 고분자 복합물질.
제1항에 있어서, 상기 온도감응성 고분자는 23℃ 미만의 온도조건에서는 젤상태에서 졸상태로 상전이가 일어나는 가역반응을 수행하는 것이 고분자 복합물질.
세포외기질 및 온도감응성 고분자를 포함하며, 23℃ 이상 내지 42℃ 이하의 온도를 갖는 피부에 접촉시 조성물의 상(phase)이 졸에서 젤로 전이가 일어나는 것인, 생체 피부용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물은 23℃ 초과 내지 42℃이하의 피부에 접촉시 조성물의 상(phase)이 졸에서 젤로 전이가 일어나는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 전체 조성물의 중량비를 기준으로 15 내지 50중량%의 세포외기질과 50 내지 85 중량%의 온도감응성 고분자를 포함하는 조성물.
제4항에 있어서, 상기 온도감응성 고분자는 메틸 셀룰로오스, 하이드록시 프로필 메틸 셀룰로오스, 하이드록시 프로필 셀룰로오스, 플루로닉, 폴록사머(Poloxamer), Poly(NIPAAM), PEO-PPO-PEO 공중합체, PEG-PLGA-PEG 공중합체 및 MPEG-PCL 블록 공중합체로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것인 조성물.
제4항에 있어서, 상기 세포외기질은 인간 지방조직에서 유래된 것인 조성물.
제4항에 있어서, 상기 세포외기질은 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 피브린, 피브리노겐, 글리코사미노글리칸, 히알루론산, 프로테오글리칸, 라미닌, 헤파린 설페이트, 콘드로틴 설페이트 및 케라틴 설페이트로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것인 조성물.
제4항에 있어서, 상기 조성물은 피부질환 또는 피부상처 치료용인 조성물.
제10항에 있어서, 상기 피부질환 또는 피부상처는 창상, 여드름, 피부 염증, 피부 알레르기, 자상, 화상, 교상, 열상, 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 피부외용제.
제12항에 있어서, 상기 피부외용제는 연고제, 겔제, 크림제, 리니멘트제, 로션제, 액제, 패치, 또는 분무제의 제형인 피부외용제.
지방조직을 분쇄한 후 원심분리하여 탈리된 지질을 준비하는 단계;
상기 탈리된 지질에 프로테아제 억제인자를 포함하는 완충액을 첨가하여 원심분리하는 단계;
상기 원심분리한 후의 상층액을 투석하여 투석액을 얻는 단계;
상기 투석액을 원심분리한 후 상층액을 회수하여 세포외기질을 얻는 단계;
상기 세포외기질을 온도감응성 고분자와 혼합하는 단계를 포함하는 생체 피부용 조성물의 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 혼합하는 단계는 각각 용액에 용해된 세포외기질과 온도감응성 고분자를 혼합하는 것이며,
상기 용액은 PBS(phosphate buffered saline), TBS(tris buffered saline), DMEM(Dulbeco? Modified Eagle Medium), 및 DW(distilled water)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 제조방법.
제10항에 있어서, 전체 조성물의 중량비를 기준으로 15 내지 50중량%의 세포외기질과 50 내지 85 중량%의 온도감응성 고분자를 포함하는 것인 제조방법.
제14에 있어서, 상기 온도감응성 고분자는 메틸 셀룰로오스, 하이드록시 프로필 메틸 셀룰로오스, 하이드록시 프로필 셀룰로오스, 플루로닉, 폴록사머(Poloxamer), Poly(NIPAAM), PEO-PPO-PEO 공중합체, PEG-PLGA-PEG 공중합체 및 MPEG-PCL 블록 공중합체로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것인 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 세포외기질은 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 피브린, 피브리노겐, 글리코사미노글리칸, 히알루론산, 프로테오글리칸, 라미닌, 헤파린 설페이트, 콘드로틴 설페이트 및 케라틴 설페이트로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것인 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 피부질환 또는 피부상처는 창상, 여드름, 피부 염증, 피부 알레르기, 자상, 화상, 교상, 열상, 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.