KR102161850B1 - 히알루론산과 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀의 조합을 유효성분으로 포함하는 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물 - Google Patents

히알루론산과 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀의 조합을 유효성분으로 포함하는 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과, 고유의 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조방법을 이용하여 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀의 조합을 유효성분으로 포함하는 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 효과적으로 그리고 빠른 시일 내에 창상을 치유할 수 있고, 특히 천연 줄기세포 유래 엑소좀과 히알루론산의 조합 또는 다른 성분들과의 조합 보다 창상 치료 내지는 창상 치료 촉진 효과가 우수하다.

Description

히알루론산과 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀의 조합을 유효성분으로 포함하는 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물 {Composition for wound healing or accelerating wound healing comprising the combination of hyaluronic acid and lyophilized exosomes derived from stem cell}
본 발명은 히알루론산에 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀을 함유시켜 준비된 히알루론산과 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀의 조합을 유효성분으로 포함하는 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 약학 조성물, 의약외품, 피부 외용제 또는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 창상 치료 또는 창상 치료를 촉진(accelerating wound healing)하는 방법에 관한 것이다.
창상은 통증, 출혈, 및 조직 파괴의 기능장애 등을 초래할 뿐만 아니라 세균의 감염에 대해 무방비 상태가 되어 2차적 감염이나 패혈증을 유발할 수 있다. 따라서 창상은 흉터를 최소화하고 피부 조직 등에 기능 장애를 남기지 않으면서 빠른 시일 내에 치유되는 것이 필요하다.
창상 치유의 첫 번째 단계는 지혈을 위한 응고, 세균 및 괴사 조직을 파괴하기 위한 호중구의 보충, 그리고 대식세포의 보충을 수반한다. 두 번째 단계 동안, 혈관 신생(angiogenesis)이 발생하며, 이때 내피세포가 창상 부위로 이동하고 이와 동시에 섬유아세포가 창상 부위로 이동하여 육아 조직(granulation tissue)을 생산하는데 도움을 주게 된다. 육아 조직의 형성에 의해 재상피화(re-epithelialization)가 일어난다. 최종 단계인 재형성 단계(remodeling phase)에서는 콜라겐 분해(degradation)와 합성(synthesis) 사이의 섬세한 균형이 나타나면서 콜라겐 리모델링, 혈관성숙(vascular maturation) 등이 나타난다.
창상 치유에는 각질형성세포(keratinocytes), 섬유아세포(fibroblasts), 내피세포(endothelial cells), 대식세포(macrophage) 등과 같은 세포들이 협력하는데, 이러한 세포들의 이동, 증식 및 분화와 같은 과정은 다양한 성장인자나 사이토카인에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로 성장인자 및 사이토카인을 이용한 창상 치료 방법이 개발되고 있다.
그러나 성장인자 및 사이토카인을 이용한 창상 치료 방법은 치료 기간이 길고 여러 단백질들의 복합작용에 의한 상처 치유 메카니즘을 고려할 때 한가지 특정 성장인자나 사이토카인은 만족할 만한 치료 효과를 나타내지 못하는 문제점이 있다. 또한 중간엽 줄기세포가 성장인자 및 사이토카인을 분비하는 점에 착안하여 중간엽 줄기세포 배양액을 창상 치유에 사용하는 방법이 제안되고 있다. 그러나 활성화되지 않은 중간엽 줄기세포의 경우 세포로부터 분비되는 사이토카인 및 성장인자의 양이 적은 문제점이 있고, 중간엽 줄기세포 배양액에는 세포가 성장하면서 분비한 노폐물, 오염방지를 위해 첨가된 항생제, 동물유래 혈청 등의 성분도 포함되어 있기 때문에 창상 부위에 사용할 경우 각종 위험에 노출될 가능성이 높다.
한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
그러나 엑소좀을 이용한 특정 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 엑소좀의 생리활성을 증가시키면서 안정적으로 유지시켜 주는 기술의 개발, 엑소좀의 사용 편의성 개선 관련 기술 개발, 및 다른 물질들과의 조합에 따른 생리활성 증강과 같은 기술의 개발은 미진한 상황이다.
본 발명자들은 줄기세포 유래 엑소좀의 새로운 응용분야 및 엑소좀의 생리활성을 증가시키면서 안정적으로 유지시켜 주는 기술 등에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 고유의 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조방법을 이용하여 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀과 히알루론산을 조합한 경우 천연 줄기세포 유래 엑소좀과 히알루론산의 조합 또는 다른 성분들과의 조합 보다 창상 치료 효과가 우수한 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
대한민국 등록특허공보 제10-1293762호 (2013.08.05) 대한민국 등록특허공보 제10-1592864호 (2016.02.11)
본 발명의 목적은 히알루론산에 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀을 함유시켜 준비된 히알루론산과 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀의 조합을 유효성분으로 포함하는 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물을 제공하는데 있다..
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 약학 조성물, 의약외품, 피부 외용제 또는 기능성 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 창상 치료 또는 창상 치료를 촉진(accelerating wound healing)하는 방법을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과, 고유의 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조방법을 이용하여 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀의 조합을 유효성분으로 포함하는 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "창상(wound)"은 생체가 손상된 상태를 의미하며, 생체 내부 또는 외부 표면을 이루는 조직, 예를 들면 피부, 근육, 신경조직, 뼈, 연조직, 내부기관 또는 혈관조직이 분단 또는 파괴된 병리학적 상태를 포괄한다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서 창상은 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 자상, 절상, 결출상(avulsion), 욕창, 와창, 방사선 조사에 의한 조직의 파괴, 관통상(penetrated wound), 총상(gun shot wound), 화상, 동상, 수술상, 성형수술 후 봉합 부위, 화학적 창상 등을 포함하며 개체의 어떠한 부분에 대한 손상이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "히알루론산 또는 히알루로난(hyaluronan)"은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체 고분자 물질로, 결합조직 및 피부에 고농도로 존재한다. 그 밖에 히알루론산은 닭벼슬, 체액, 안구의 유리액, 관절의 활액, 동물의 완충조직, 태반 등에서 발견된다. 히알루론산 또는 그의 염은 생체적합성, 생분해성 및 안정성이 우수하여 주름 개선용 필러, 관절염 개선 또는 치료제 등으로 활용되고 있다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 줄기세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 배아줄기세포, 성체줄기세포, 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 또는 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 와튼젤리 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다. 상기 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간 유래 줄기세포일 수 있다.
그러나 본 발명에서 사용되는 줄기세포 유래 엑소좀은 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 효과가 있고 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 줄기세포 유래 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들의 분리방법에 따라 분리된 줄기세포 유래 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 발명의 일 구체예의 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물에 있어서, 상기 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀은 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조보호제를 이용하여 동결건조된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예의 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물에 있어서, 상기 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀은, 줄기세포 유래 엑소좀과, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 유효성분으로 포함하는 동결건조제제로서 준비되는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 중량비는 1:1:1이다.
본 발명의 일 구체예의 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물에 있어서, 상기 동결건조제제는 아스코르브산 및 레티놀을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어, 메티오닌, 만니톨, 트레할로오스, 아스코르브산 및 레티놀의 중량비는 9:9:9:0.5:0.5이다.
본 발명의 일 구체예의 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물은 상기 동결건조제제와, 희석제를 포함한다. 예를 들어, 상기 희석제는 주사용수, 생리적 식염수, 인산염 완충용액, 정제수, 탈이온수, 트레할로오스 용액일 수 있다. 또한, 상기 희석제는 히알루론산 또는 히알루론산염(예를 들어, 히알루론산 나트륨)을 추가로 포함할 수 있다. 일례로서, 상기 조성물은 현탁액일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물에 있어서, 상기 히알루론산 겔은 가교되지 않은 히알루론산 겔 또는 가교된 히알루론산 겔일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물은 약학 조성물, 의약외품, 피부 외용제 또는 기능성 화장료 조성물일 수 있다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형일 수 있고, 상기 의약외품 또는 상기 피부외용제는 액제, 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제, 또는 에어로졸제일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물이 약학 조성물로 사용되는 경우 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 유효량은 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약학 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 적합한 투여량은 창상의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
한편. 본 발명의 일 구체예의 조성물이 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀의 조합 이외에, 그 작용(예를 들어, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 창상 치료제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 기능성 화장료 조성물은 창상 치료 촉진 또는 창상 개선 등의 목적으로 사용될 수 있으며, 기능성 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물은 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 의약외품, 피부외용제 및/또는 기능성 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하거나, 상기 의약외품 또는 상기 피부외용제를 창상 부위에 도포하는 단계를 포함하는, 창상 치료 또는 창상 치료를 촉진(accelerating wound healing)하는 방법을 제공한다. 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.
본 발명의 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물은 효과적으로 그리고 빠른 시일 내에 창상을 치유할 수 있다.
특히, 본 발명의 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물은 천연 줄기세포 유래 엑소좀과 히알루론산의 조합 또는 다른 성분들과의 조합 보다 창상 치료 내지는 창상 치료 촉진 효과가 우수하다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 줄기세포 유래 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 1A"는 NTA(nanoparticle tracking analysis)에 의해 얻어진 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 1B"는 TEM(transmitted electron microscopy)으로 촬영된 입자 이미지 사진이다. "도 1C"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 줄기세포 유래 엑소좀의 포지티브 마커에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 1D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 줄기세포 유래 엑소좀의 네거티브 마커에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 1E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 줄기세포 유래 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD9, CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 2는 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 유래 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 3은 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 동결건조된 엑소좀의 양호한 성상을 나타내는 사진이다.
도 4a 내지 도 4g는 동결건조 보호제 성분의 조합을 다르게 하고 동결건조를 수행한 후, 동결건조 보호제 성분 조합별로 동결건조 엑소좀의 성상을 촬영한 사진이다.
도 5는 창상 유발 돼지모델에 창상을 유발한 후 하이드록시에틸셀룰로오스(G1), 히알루론산(G2), 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀과 히알루론산 조합(G3), 천연 줄기세포 유래 엑소좀과 하이드록시에틸셀루로오스 조합(G4), 및 천연 줄기세포 유래 엑소좀과 히알루론산 조합(G5)이 각각 처리되는 창상 부위를 표시한 것이다.
도 6은 창상 유발 돼지모델에서 본 발명에 따라 히알루론산에 고유의 동결건조방법으로 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀을 함유시켜 준비된 히알루론산과 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀의 조합(G3)을 처리한 경우 대조군(G1, G2) 및 다른 실험군(G4, G5)에 비해 창상이 빠른 시일 내에 회복하는 것을 나타내는 창상 부위 사진들이다.
도 7은 창상 유발 돼지모델에 창상을 유발하고 각 실험군(G1, G2, G3, G4, G5) 별로 창상 부위를 처리한 후 각 실험군별로 창상 치유 효과를 비교하기 위해 창상 면적(wound area)을 0일차 대비 7일차, 14일차 및 19일차에 측정하여 수치화한 결과를 나타내는 꺽은선 그래프이다.
도 8은 창상 유발 돼지모델에 창상을 유발하고 각 실험군(G1, G2, G3, G4, G5) 별로 창상 부위를 처리한 후 각 실험군별로 창상 치유 효과를 비교하기 위해 창상 봉합 크기(wound closure area)를 0일차 대비 7일차, 14일차 및 19일차에 측정하여 수치화한 결과를 나타내는 막대 그래프이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.
엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제
실시예 1에서 0.22 ㎛ 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff;MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다.
실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석
분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 NTA, TEM 분석 결과는 도 1A 및 도 1B에 도시하였다.
도 1C는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 포지티브 마커에 대한 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD63, CD9, CD81, Alix 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD63, 항-CD9, 항-CD81, 항-Alix 및 항-TSG101을 사용하였다.
도 1D는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 네거티브 마커에 대한 웨스턴 블랏을 수행한 결과이다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-GM130 및 항-칼넥신(Calnexin)을 사용하였다. GM130 및 칼넥신(Calnexin)은 엑소좀의 특성 분석 시 엑소좀에 존재하지 않아야 하는 네거티브 마커이다. 도 1D에 도시된 바와 같이 GM130 및 칼넥신(Calnexin)은 지방줄기세포의 파쇄물에서는 존재하는 것으로 확인되었지만, 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀에서는 존재하지 않는 것으로 확인되었다. 따라서, 도 1C 및 도 1D의 결과를 종합할 때, 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀은 포지티브 마커 및 네거티브 마커 특성분석을 만족하는 엑소좀임을 알 수 있다.
도 1E는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD9, CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD81에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD81 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD9 (PE-Mouse anti-human CD9)(BD에서 구입), PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정
인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.
비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 본 발명의 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 2).
실시예 5: 엑소좀의 동결건조
실시예 5-1: 동결건조 조건
엑소좀의 동결건조를 위해 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조 보호제를 준비하였다. 아스코르브산 및 레티놀을 각각 0.5 mg/mL로 함유하고 있는 1 mL의 수용액[(주)바이오에프디엔씨(대한민국 전남 화순군 소재)에서 외주 제작]에 상기 동결건조 보호제를 첨가한 수용액을 준비하였다. 본 실시예에서는 동결건조 보호제를 아스코르브산 및 레티놀을 함유하고 있는 용액에 첨가하였으나, 주사용수, 정제수, 생리적 식염수, 또는 탈이온수에 동결건조 보호제를 첨가하여 수용액을 준비할 수도 있다. 상기 수용액 내의 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 농도는 각각 9 mg/mL가 되도록 하였다.
동결건조 보호제가 함유된 수용액에 실시예 2에서 준비된 엑소좀(5×108 입자)을 혼합한 후 동결건조 장비(제조사: VIRTIS, ITME No.: 34424)를 이용하여 하기 표 1의 조건으로 동결건조를 수행하였다. 동결건조는 하기 표 1의 조건 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 순서로 진행하였다.
동결건조 조건
총 시간 (min) 4320
조건 시간 (min) 온도 (℃) 압력 (mmHg)
1 700 -50 760
2 60 -50 760
3 999 -50 0
4 999 -50 0
5 999 -50 0
6 370 -50 0
7 120 -20 0
8 73 10 0
메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스를 포함하는 동결건조 보호제를 처리하여 엑소좀을 동결건조 후 성상을 확인한 결과, 색은 유백색이며 다공성의 스폰지 형상을 유지하는 양호한 성상을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 3). 즉, 본 발명의 엑소좀의 동결건조 방법에서는 감압 하에서의 건조 시간을 길게 하고 동결건조 보호제를 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 조합으로 구성함으로써 우수한 성상을 나타내는 동결건조 제품을 수득할 수 있었다.
실시예 5-2: 동결건조 보호제 성분에 따른 동결건조 엑소좀의 성상 비교
한편, 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스 (이하, 동결건조 보호제 성분이라 함) 중 적어도 1종을 포함하는 다양한 동결건조 보호제를 사용하여 엑소좀을 동결건조한 경우의 엑소좀의 성상을 비교하였다. 상기 실시예 5-1에 기재된 방법에 따라 동결건조 보호제 성분 단독, 2가지 성분의 조합, 또는 3가지 성분 조합을 첨가한 7가지 종류의 수용액을 준비하였다. 상기 수용액 내에서 각 동결건조 보호제 성분의 농도는 9 mg/mL가 되도록 하였다. 상기 실시예 5-1의 동결건조 조건 및 방법에 따라, 동결건조 보호제 성분의 각 조합이 함유된 수용액에 실시예 2에서 준비된 엑소좀(5×108 입자)을 혼합한 후 동결건조를 수행하였다.
동결건조된 엑소좀 제품들에 대한 외형 성상을 촬영하고 평가하였다(도 4a 내지 도 4g). 동결건조된 엑소좀 제품의 케익 모양의 좋고 나쁨에 따라 가장 좋은 것은 5점으로 하고 가장 나쁜 것은 1점으로 하여 외형 성상을 상대 평가하였다. 동결건조 보호제 성분 조합별로 동결건조 엑소좀 제품의 성상을 평가한 결과는 하기 표 2와 같다.
동결건조 보호제 성분별 동결건조 엑소좀 제품의 성상 비교
동결건조 보호제 성분 조성 만니톨 트레할로오스 메티오닌 메티오닌+
트레할로오스		 메티오닌+
만니톨		 트레할로오스+
만니톨		 메티오닌+만니톨+트레할로오스(본 발명)
평가점수 1 1 4 3 4 2 5
도면 도 4a 도 4b 도 4c 도 4d 도 4e 도 4f 도 4g
도 4a 내지 도 4g 및 상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 조합으로 구성된 동결건조 보호제를 사용하여 엑소좀을 동결건조한 경우가 제품 외형 성상이 가장 양호하였고, 상기 3가지 성분 중 1가지 또는 2가지 성분이 빠진 조합으로 동결건조한 엑소좀은 제품 외형 성상이 본 발명의 경우 보다 불량함을 알 수 있었다.
실시예 6: 창상유발 돼지동물모델에서 창상 치유 효과 확인
실시예 6-1: 창상 유발 및 시료 처리
특정병원체 부재(SPF) 숫컷 마이크로 피그(micro pig)(대한민국 경기도 소재의 메디키네틱스 주식회사에서 입수)를 마취한 다음, 등쪽 피부를 제모하고 70% 알코올 및 포비돈을 이용하여 피부를 소독하였다. 약 30 mm×30 mm 크기로 창상을 총 20군데 유발하며, 진피부분까지 제거하였다. 아래와 같은 각 실험군을 준비하고 도 5에 도시된 바와 같이 각 실험군의 투여물질을 4군데의 창상 유발 부위들에 국소 트레싱(topical dressing)하여 처리하였다. 각 실험군에 사용되는 투여물질은 투여물질을 구성하는 각각의 물질을 각 시린지에 충전한 후 시린지들을 루어-락 커넥터(luer-lock connector)로 체결하고 1:1 비율(각 물질의 부피를 1 mL로 함)로 혼합하여 제조하였다. 각 실험군 마다 1회 사용되는 투여물질의 전체 부피는 2 mL이 되도록 하였다.
(1) 하이드록시에틸셀루로오스 (HEC): 25 mg/mL의 인산염 완충 식염수(PBS) 내의 하이드록시에틸셀루로오스(Sigma-aldrich에서 구입) 1 mL와 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스(이하, "비히클"이라 함) 1 mL를 1:1 비율로 혼합하여 제조한 투여물질 사용 (도 5에서 "G1"으로 표기);
(2) 히알루론산 (HA): 24 mg/mL의 PBS 내의 히알루론산(가교되지 않은 히알루론산으로 주식회사 엑소코바이오의 아쿠아 필러제품) 1 mL와 비히클 1 mL를 혼합하여 제조한 투여물질 사용 (도 5에서 "G2"로 표기);
(3) 동결건조된 엑소좀과 HA의 조합: 실시예 5-1에서 준비된 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제(5×109 입자/vial) 4개 바이알을, 24 mg/mL의 PBS 내의 히알루론산(가교되지 않은 히알루론산으로 주식회사 엑소코바이오의 아쿠아 필러제품) 1 mL에 혼합하여 제조한 투여물질 사용 (도 5에서 "G3"로 표기);
(4) 천연 엑소좀과 HEC의 조합: 실시예 2에서 준비된 줄기세포 유래 엑소좀 원액 (4×1010 입자/mL) 1 mL와, 25 mg/mL의 PBS 내의 하이드록시에틸셀루로오스(Sigma-aldrich에서 구입) 1 mL를 혼합하여 제조한 투여물질 사용 (도 5에서 "G4"로 표기);
(5) 천연 엑소좀과 HA의 조합: 실시예 2에서 준비된 줄기세포 유래 엑소좀 원액 (4×1010 입자/mL) 1 mL와, 24 mg/mL의 PBS 내의 히알루론산(가교되지 않은 히알루론산으로 주식회사 엑소코바이오의 아쿠아 필러제품) 1 mL를 혼합하여 제조한 투여물질 사용 (도 5에서 "G5"로 표기).
상기와 같은 각 실험군에 사용되는 투여물질을 각 실험군의 4군데의 창상 유발 부위들에 각각 0.5 mL씩 도말한 후, 도말된 부위가 건조되는 것을 막고 외부 물질의 유입방지를 위해 투여물질이 처리된 창상 유발 부위들을 투명 필름(3M에서 구입)으로 봉했다. 각 실험군의 4군데의 창상 부위들에 대해 투여물질을 3주 동안 일주일에 3회씩 총 9회 처리하였다.
실시예 6-2: 창상 사진 촬영 및 면적 분석
실시예 6-1에 따라 창상을 유발한 후 0일차(창상 유발 당일), 7일차, 14일차 및 19일차에 창상 유발 부위들에 대한 사진을 촬영하였으며(도 6 참조), 각 실험군(G1, G2, G3, G4, G5) 별로 창상 치유 효과를 비교하기 위해 창상의 크기를 각 실험군 별로 동일한 배율로 촬영하였다. 창상 면적 분석은 Image J software (NIH, Bethesda, MD) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 창상 크기 변화 또는 창상 치유 효과는 각 창상 부위 마다 창상 유발 첫날의 창상 면적에 대한 7일차, 14일차 및 19일차에 측정된 창상 면적의 비율로 수치화할 수 있다(도 7).
실시예 6-3: 창상유발 돼지모델의 창상 면적 및 창상 봉합 면적 변화
창상유발 돼지모델을 이용하여 각 실험군의 창상 치유 효능을 확인하기 위해 3주간 창상의 테두리 및 창상의 봉합(wound closure) 상태를 비교분석하였다.
창상유발 후 실시예 6-1의 각 실험군의 투여물질을 3주 동안 일주일에 3회씩 총 9회 창상 부위에 처리하였고, 창상 부위를 보호필름으로 봉하였다. 또한, 실시예 6-2에 따라 창상 부위의 사진 촬영과 창상 면적 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 6 내지 도 8에 도시된 바와 같이 본 발명에 따라 히알루론산에 고유의 동결건조방법으로 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀을 함유시켜 준비된 히알루론산과 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀의 조합(G3)을 처리한 경우 대조군(G1, G2) 및 다른 실험군(G4, G5)에 비해 창상이 빠른 시일 내에 회복하는 것을 확인할 수 있었다.
동결건조된 엑소좀과 HA의 조합(G3)을 처리한 경우 창상유발 후 7일차에는 대조군(G1, G2)과 대비하여 유의미한 창상 치유 효과가 관찰되지 않았으나, 14일차에 빠르게 창상이 수축하였으며, 19일차에는 창상의 크기가 최대 80% 감소하였다. 또한 동결건조된 엑소좀과 HA의 조합(G3) 또는 천연 엑소좀과 HA의 조합(G5)은 대조군(G1, G2) 및 천연 엑소좀과 HEC의 조합(G4)에 비해 유의미하게 창상 치유 회복 속도가 빠름을 확인하였다(도 7 및 도 8).
이러한 결과를 종합하면, 본 발명의 히알루론산에 고유의 동결건조방법으로 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀을 함유시켜 준비된 히알루론산과 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀의 조합(G3)은 히알루론산 단일 물질(G2)이나 하이드록시에틸셀룰로오스 단일 물질(G1)에 비해 창상 치유 촉진 효과가 우수할 뿐만 아니라, 천연 줄기세포 유래 엑소좀과 히알루론산의 조합(G5)에 비해서도 상대적으로 창상 치유 촉진 효과가 우수한 것을 알 수 있다.
상기와 같은 결과는 종래에 알려진 천연 줄기세포 유래 엑소좀에 의한 창상 치유 촉진 효과나 천연 줄기세포 유래 엑소좀과 히알루론산의 조합에 의한 창상 치유 촉진 효과로부터 예측할 수 없는 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제와 히알루론산의 독특한 조합에 의한 시너지 효과를 설명하는 것이라고 할 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (15)

  1. (A) 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과,
    (B1) 줄기세포 유래 엑소좀과, (B2) 메티오닌, 만니톨 및 트레할로오스의 조합으로 이루어진 동결건조보호제를 유효성분으로 포함하는, (B) 줄기세포 유래 엑소좀의 동결건조제제를 유효성분으로 포함하는, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 동결건조제제는 아스코르브산 및 레티놀을 추가로 함유하는, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서,
    상기 동결건조제제와, 희석제를 포함하는 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 희석제는 주사용수, 생리적 식염수, 인산염 완충용액, 정제수, 탈이온수 또는 트레할로오스 용액인 것을 특징으로 하는, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 희석제는 히알루론산 또는 히알루론산염을 추가로 포함하는, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물.
  8. 제1항 또는 제4항에 있어서,
    상기 히알루론산 겔은 가교되지 않은 히알루론산 겔 또는 가교된 히알루론산 겔인, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물.
  9. 제1항 또는 제4항에 있어서,
    약학 조성물, 의약외품, 또는 피부 외용제인, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형인 것을 특징으로 하는, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 의약외품 또는 상기 피부외용제는 액제, 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제, 또는 에어로졸제인 것을 특징으로 하는, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물.
  12. 청구항 제9항의 약학 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 창상 치료 또는 창상 치료를 촉진(accelerating wound healing)하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 포유동물은 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지인 창상 치료 또는 창상 치료를 촉진(accelerating wound healing)하는 방법.
  14. 청구항 제9항의 의약외품 또는 피부외용제를 인간을 제외한 포유동물의 창상 부위에 도포하는 단계를 포함하는, 창상 치료 또는 창상 치료를 촉진(accelerating wound healing)하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 포유동물은 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지인 창상 치료 또는 창상 치료를 촉진(accelerating wound healing)하는 방법.
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