KR20190051434A - 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물 및 이의 응용 - Google Patents

신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물 및 이의 응용 Download PDF

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KR20190051434A
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Abstract

본 발명은 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과, 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 혼합되어 유지되는, 사포게닌과 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 포함하는 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물을 제공한다. 본 발명의 히알루론산 기반의 필러 조성물은 미용적 또는 치료적 효과가 오래 지속되면서 주사가 편리하고 환자에게 고통을 덜 주는 히알루론산 기반의 필러의 구현에 적합하게 응용될 수 있다. 또한, 본 발명의 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물은 신체의 각부에 국소적으로 적용되어 피부의 일반적 증상 개선, 즉 지질 부족을 나타내는 신체의 각부를 개선하거나 아름답게 하는데 사용될 수 있다.

Description

신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물 및 이의 응용 {New filler composition based on hyaluronic acid and its application}
본 발명은 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물 및 이의 응용에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과, 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 혼합되어 유지되는 사포게닌과 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 포함하는 히알루론산 기반의 필러 조성물 및 이의 응용에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 전술한 바와 같은 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물을 이용하여, 흉터 제거 또는 피부조직 개선, 연부조직의 결함 보정, 주름 제거 또는 개선, 윤곽교정, 조직확대, 유방 확대, 성기 확대 등을 위한 미용방법, 및 상처 치료, 흉터 치료, 관절염 등의 개선 또는 치료 방법을 제공하는 것에 관한 것이다.
아울러, 본 발명은 전술한 바와 같은 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물을 함유하는, 상처 치료, 흉터 치료, 관절염의 개선 또는 치료 등을 위한 약학 조성물을 제공하는 것에 관한 것이다.
히알루론산 또는 히알루로난(hyaluronan)은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체 고분자 물질로, 결합조직 및 피부에 고농도로 존재한다. 그 밖에 히알루론산은 닭벼슬, 체액, 안구의 유리액, 관절의 활액, 동물의 완충조직, 태반 등에서 발견된다. 히알루론산 또는 그의 염은 생체적합성, 생분해성 및 안정성이 우수하여 주름 개선용 필러, 관절염 개선 또는 치료제, 상처 치료제, 안구수술보조제, 유착방지제, 약물 전달체 등으로 활용되고 있다.
히알루론산 또는 그의 염을 이용한 필러는 예를 들어, 안면 라인 및 주름의 외양을 감소시키기 위해 환자에게 주입되는 제제이다. 히알루론산 기반의 필러는 안면 주름 및 패인 곳 등의 연부 조직에 주입되어 해당 조직에서 소실된 내인성 기질 폴리머를 대체하거나, 기존의 기질 폴리머의 기능을 향상시킴으로써 연조직 병태를 치료하는 효과를 나타낸다. 또한, 히알루론산 기반의 필러는 퇴행성 관절염 환자의 관절 내에 주사되어 증상을 개선 또는 호전시킬 수 있다.
그러나, 히알루론산이나 그의 염은 히알루로니다아제에 의해 수일 내에 분해되어, 필러로서의 효과를 유지하기 위해서는 빈번한 재주입을 필요로 한다. 주사를 통한 필러의 주입은 환자에게 고통스럽고 불편한 것이기 때문에 효과 지속 시간을 늘리는 것이 고려되었다. 필러의 효과 지속 시간을 증가시키기 위해 히알루론산 또는 그의 염을 가교결합시킨 히알루론산 필러(Cross-linked hyaluronic acid filler)가 개발되었다. 대표적으로, 디비닐술폰(DVS)을 이용하여 가교결합시킨 히알루론산 필러와, 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(BDDE)을 이용하여 가교결합시킨 히알루론산 필러가 있다. 레스틸렌(Restylane)은 1,4-부탄디올 디글리시딜에테르(BDDE)을 가교제로 사용하여 제조한 히알루론산 가교물의 하이드로겔 형태의 제품이다. 레스틸렌은 가교된 히알루론산 기반의 필러로서 널리 사용되고 있는 제품이다.
이러한 가교결합된 히알루론산 기반의 필러는 생체 내 지속 시간이 증가되는 장점이 있는 반면에, 가교 결합율이 높아지면 높은 점성으로 인하여 환자에게 주사하는 것이 힘들고 주사하는데 오랜 시간이 걸려 환자에게 고통을 주는 문제가 있다. 따라서, 생체 내 지속성을 늘리기 위해 히알루론산의 가교 결합율을 높이는데에는 한계가 있다. 이러한 관점에서 미용적 또는 치료적 효과가 오래 지속되면서 주사가 편리하고 환자에게 고통을 덜 주는 히알루론산 기반의 필러의 개발이 필요하다.
한편, 사포게닌(sapogenin)은 사포닌의 아글리콘으로서 일부는 유리된 형태로 식물계에 분포하는 다환성(多環性) 화합물의 총칭이다. 사포게닌에는 트리테르펜계 사포게닌과 스테로이드계 사포게닌이 있다. 사포게닌의 예로는 디오스게닌(diosgenin), 헤코게닌(hecogenin), 스밀라게닌(smilagenin), 사르사사포게닌(sarsasapogenin), 티고게닌(tigogenin), 야모게닌(yamogenin) 및 유카게닌(yuccagenin) 등을 들 수 있다.
상기에서 열거한 사포게닌 중 하나인 사르사사포게닌(sarsasapogenin)은 하기와 같은 화학식 1을 갖는 스테로이드 사포게닌의 하나로서, 사르사 뿌리(sarsaparilla root), 지모(知母)(Anemarrhena Asphodeloides BUNGE), 아스파라거스(Asparagus officinalis) 등의 식물에서 추출될 수 있다.
화학식 1
Figure pat00001
전술한 바와 같은 사포게닌들은 다양한 식물에서 추출가능한 천연유래 화합물로서 피의 흐름을 원활하게 하고 진해, 거담, 이뇨, 항암 등의 효능이 있는 것으로서 알려져 있다. 그러나, 사포게닌은 비수용성이고, 일부 유기용매에는 용해되지만 결정으로 되기 쉬워 제형화하기 어렵고 다양한 투여방식으로 응용되기 어려운 문제가 있다. 즉, 사포게닌은 피부에 대한 국소적 적용을 위해 사용되는 생리학적으로 허용가능한 용매에서 높은 융점(204~207℃ 부근)을 가지고 이러한 용매에서 재결정화되는 경향을 가지기 때문에 용해하는 것이 어렵고 제제화하는 것이 어렵다고 알려져 있다.
이와 관련하여, 미국특허 6,294,157 B1호는 소정의 효능을 얻기에 충분한 양으로 사포게닌을 함유하는 조성물로서, 사포게닌을 실온에서 정상적인 저장상태로 충분한 기간 동안 유지할 수 있는 생리학적으로 허용가능한 용해계를 기술하고 있다. 상기 미국특허 6,294,157 B1호는 적어도 8개의 탄소 원자를 갖는 분지된 지방산 및/또는 적어도 8개의 탄소 원자를 갖는 분지된 지방 알코올의 유화 특성을 갖지 않는 에스테르와, 8개의 탄소 원자를 갖는 분지된 지방 알코올을 포함하는 용해계를 사용한 사포게닌 조성물을 개시하고 있다.
또한, 대한민국 공개특허 제10-2012-0128596호는 사포게닌의 유도체들과 이의 염들을 기술하고 있고 이러한 유도체들과 염들이 신경계 질환이나 손상에 사용될 수 있는 것을 개시하고 있다.
그러나, 종래의 사포게닌 제형은 경시안정성, 피부로의 스며듬, 가벼운 사용감, 촉촉함, 유효성분의 효율적인 전달을 위한 약물동력학적 우수성 등의 면에서 여전히 개선할 필요가 있다. 또한, 전술한 바와 같이 사포게닌은 제형화하기 어렵고 다양한 투여방식으로 응용되기 어려운 문제점 때문에 다양한 생체적합성 소재와 결합시킨 새로운 제형의 개발에 제한이 따른다.
한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 거동을 제어하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)' 또는 '세포외 소포체(extracellular vesicle)'가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, mRNA, miRNA, DNA 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 거동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 거동, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
하지만, 현재까지 이러한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 히알루론산 기반의 필러 및/또는 사포게닌과 접목시켜 상처 치료, 주름 제거 또는 개선, 관절염 개선 또는 치료 등에 활용하고자 한 연구는 알려진 바가 없다.
본 발명자들은 줄기세포로부터 유래된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 새로운 용도에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 사포게닌과 함께 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 혼합한 조성물이 주사가 용이하면서도 히알루론산이 분해되는 과정 또는 분해 후 주사 부위 주변으로 방출되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체와 사포게닌에 의해 히알루론산 필러로부터 얻고자 하는 미용 또는 치료적 효과를 오래 지속할 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
대한민국 등록특허공보 제10-1062320호 (2011.09.05) 대한민국 공개특허공보 제10-2008-0109774호 (2008.12.17) 대한민국 등록특허공보 제10-1514831호 (2015.04.24) 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0125293호 (2012.11.14) 대한민국 등록특허공보 제10-1459070호 (2014.11.17) 미국특허 6,294,157 B1호 (2001.09.25) 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0128596호 (2012.11.27) 대한민국 공개특허공보 제10-2016-0116802호 (2016.10.10)
Pin Li et al., Progress in Exosome Isolation Techniques, Theranostics, 2017, 7(3): 789-804 (2017.01.26) Coumans et al., Methodological Guidelines to Study Extracellular Vesicles, Circulation Research, 2017, 120:1632-1648 (2017.05.12)
본 발명의 목적은 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물 및 이의 응용을 제공하는 것으로서, 보다 상세하게는 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과, 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 혼합되어 유지되는 사포게닌과 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 포함하는 히알루론산 기반의 필러 조성물 및 이의 응용을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 고유 분리방법에 의해 분리 정제된 고순도이면서 균일한 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 준비한 후 이를 사포게닌과 함께 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 혼합하여 제조된 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물 및 이의 응용을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물을 이용하여, 흉터 제거 또는 피부조직 개선, 연부조직의 결함 보정, 주름 제거 또는 개선, 윤곽교정, 조직확대, 유방 확대, 성기 확대 등을 위한 미용방법, 및 상처 치료, 흉터 치료, 관절염 등의 개선 또는 치료 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물을 신체의 각부에 국소적으로 적용하여 피부의 일반적 증상 개선, 즉 지질 부족을 나타내는 신체의 각부를 개선하거나 아름답게 하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물을 함유하는, 상처 치료, 흉터 치료, 관절염의 개선 또는 치료 등을 위한 약학 조성물을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과, 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 혼합되어 유지되는 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체와 사포게닌을 포함하는 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 히알루론산 기반의 필러 조성물을 이용하여, 흉터 제거 또는 피부조직 개선, 연부조직의 결함 보정, 주름 제거 또는 개선, 윤곽교정, 조직확대, 유방 확대, 성기 확대 등을 위한 미용방법, 및 상처 치료, 흉터 치료, 관절염의 개선 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 히알루론산 기반의 필러 조성물은 신체의 각부에 국소적으로 적용되어 피부의 일반적 증상 개선, 즉 지질 부족을 나타내는 신체의 각부(各部)를 개선하거나 아름답게 하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)"는 세포막 유래 소포체(membrane vesicles), 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 또는 이의 등가물을 포괄하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미하며(단, 분리 대상이 되는 줄기세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3), 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, mRNA, miRNA, DNA 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 거동을 조절한다고 알려져 있다. 본 발명에서 사용되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용하여 줄기세포 배양액으로부터 분리할 수 있고, 본 발명자들이 개발한 고유 분리방법에 따라 분리할 수도 있다(대한민국 공개특허공보 제10-2016-0116802호; Pin Li et al., Progress in Exosome Isolation Techniques, Theranostics, 2017, 7(3): 789-804; Coumans et al., Methodological Guidelines to Study Extracellular Vesicles, Circulation Research, 2017, 120:1632-1648 등 참조).
본 발명의 명세서에서 사용된 용어, "지질 부족을 나타내는 신체의 각부(各部)"는 피하지방이 결여된 신체의 각부를 의미하고 이들 부분은 예를 들면 움푹 들어간 뺨, 주름, 패인 눈, 및 피부의 처짐이라고 하는 결과를 초래한다. 또한, 본 발명의 명세서에서 사용된 용어, "지질 부족을 나타내는 신체의 각부(各部)를 개선하거나 아름답게 하는 것"이란 지방 부족을 나타내는 영역에서 지방 세포의 도입 및 성장을 자극하는 것을 의미한다. 이러한 지방 세포의 도입 및 성장은 피부의 두께를 단계적이면서 큰 폭으로 증가시킴으로써 풍만함, 볼륨업(volume-up) 및 피부팽만 효과를 만들어 내고, 피부를 탄력 있게 만들며 주름을 제거 또는 개선할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 히알루론산 기반의 필러 조성물은, 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과, 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 혼합되어 유지되는, 사포게닌과 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 포함한다.
본 발명의 일 양태의 히알루론산 기반의 필러 조성물은, 사포게닌과 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 각각 별개로 준비한 후 이들을 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 혼합하여 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 양태의 히알루론산 기반의 필러 조성물은, 사포게닌과 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 혼합하여 반응시킨 후 얻은 반응액을 그대로 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 혼합하여 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태의 히알루론산 기반의 필러 조성물은, 사포게닌과 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 혼합하여 반응시킨 후 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 침투하지 않은 사포게닌을 제거하여 얻은 반응액을 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 혼합하여 제조될 수 있다. 이때, 상기 사포게닌은 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 침투되거나 적어도 결합(association)되어 담지될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 히알루론산 기반의 필러 조성물은, 가교되지 않은 히알루론산 겔 및/또는 가교된 히알루론산 겔을 더 포함할 수 있다. 상기 가교된 히알루론산 겔은 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르 (BDDE), 1,4-비스(2,3-에폭시프로폭시)부탄, 1,4-비스글리시딜옥시부탄, 1,2-비스(2,3-에폭시프로폭시)에틸렌 및 1-(2,3-에폭시프로필)-2,3-에폭시사이클로헥산 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 가교결합제로 가교결합된 히알루론산 겔일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 히알루론산 기반의 필러 조성물에 있어서, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는, 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 초미세여과법(ultrafiltration), 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 적어도 1종의 분리방법에 의해 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 히알루론산 기반의 필러 조성물에 있어서, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는, 줄기세포 배양액에 부형제(excipient)를 첨가하고 상기 부형제가 첨가된 줄기세포 배양액을 여과한 후, 상기 여과된 줄기세포 배양액으로부터 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 분리된, 고순도의 입자크기 분포가 균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체일 수 있다. 그러나 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 이에 제한되는 것이 아니며, 전술한 바와 같은 다양한 분리 방법에 의해 수득된 것을 본 발명의 히알루론산 기반의 필러 조성물에 사용할 수 있음은 물론이다. 이하, 본 명세서에서 설명되는 고유 분리방법은 히알루론산 기반의 필러 조성물에 사용될 수 있는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 대한 분리방법의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
한편, "부형제(excipient)"는 통상, 약제에 적당한 굳기나 형상을 주거나, 주제(主劑)의 양이 적은 경우에 일정한 중량을 주어 취급하기 쉬운 크기로 할 목적으로 첨가되는 물질을 의미하나, 본 발명에서는 당업계에 알려진 "부형제(excipient)(또는 첨가제로 불리기도 함)"가 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대 입자와 같은 불순물에 대해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 효율적으로 분별할 수 있는 기능을 부여한다. 본 발명을 제한하지 않는 예시로서, 부형제는 자당(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 유당(lactose), 락툴로오스, 말토오스, 셀로비오스, 이소말토오스, 투라노오스, 포도당(dextrose), 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 탈로오스, 만노오스, 타가토오스, 프시코오스, 에리트로오스, 에리트룰로오스, 트레오스, 에리스리톨(erythritol), 아라비노오스, 자일로오스, 릭소오스, 리보오스, 리불로오스, 자일룰로스, 알도헵토오스, 헵툴로오스, 옥툴로오스, 겐티아노스, 움벨리페로스, 플란테오스, 이소리크노오스, 라피노오스, 리크노오스, 스타키오스, 베르바스코오스(verbascose), 만니톨(manitol), 말티톨, 락티톨, 말토트리오스, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 자일리톨, 소르비톨(sorbitol), 전분 분해당, 전분 분해당 환원 알콜, 비이온성 계면활성제 (예를 들어, Tween-20, Triton X-100, Pluonic F-68 등), 글리신(glycine), 히스티딘(histidine), 글리세롤(glycerol) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 히알루론산 기반의 필러 조성물에 있어서, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 1차 분리 후에 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 더 수행하여 수득된 것일 수 있다. 상기 탈염과 버퍼교환에 사용되는 완충용액에는 부형제를 첨가할 수 있다. 상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행할 수 있다. 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 히알루론산 기반의 필러 조성물에 있어서, TFF를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 μm TFF 필터를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 히알루론산 기반의 필러 조성물에 있어서, 상기 분리 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 히알루론산 기반의 필러 조성물에 있어서, 상기 여과된 줄기세포 배양액은 TFF 전에 초음파처리(sonication)될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 히알루론산 기반의 필러 조성물에 있어서, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 혼합하기 전에 멸균 필터를 사용하여 제균하는 과정을 더 포함하여 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 히알루론산 기반의 필러 조성물에 있어서, 상기 사포게닌의 종류는 제한되지 않으나, 예를 들어 디오스게닌(diosgenin), 헤코게닌(hecogenin), 스밀라게닌(smilagenin), 에피스밀라게닌(epismilagenin), 사르사사포게닌(sarsasapogenin), 이소사르사사포게닌(isosarsasapogenin), 에피사르사사포게닌(episarsasapogenin), 파리게닌(parigenin), 티고게닌(tigogenin), 에피티고게닌(epitigogenin), 네오티고게닌(neotigogenin), 파릴린(parillin), 티모사포닌(timosaponin), 키시링사포닌(xilingsaponin), 피리페린(filiferin), 야모게닌(yamogenin) 및 유카게닌(yuccagenin)으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 히알루론산 기반의 필러 조성물에서 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포, 보다 더 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 히알루론산 기반의 필러 조성물은 바람직하게는 주사 투여 방식으로 적용된다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다.
본 발명의 일 구체예의 히알루론산 기반의 필러 조성물은 상처 치료, 흉터 치료, 관절염의 개선 또는 치료 등을 위한 약학 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 히알루론산 기반의 필러 조성물을 이용하여, 흉터 제거 또는 피부조직 개선, 연부조직의 결함 보정, 주름 제거 또는 개선, 윤곽교정, 조직확대, 유방 확대, 또는 성기 확대를 위한 미용방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 상기 히알루론산 기반의 필러 조성물을 신체의 각부에 국소적으로 적용하여 피부의 일반적 증상 개선, 즉 지질 부족을 나타내는 신체의 각부를 개선하거나 아름답게 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 상기 히알루론산 기반의 필러 조성물을 이용하여, 상처 치료, 흉터 치료, 관절염의 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물은 흉터 제거 또는 피부조직 개선, 연부조직의 결함 보정, 주름 제거 또는 개선, 윤곽교정, 조직확대, 유방 확대, 성기 확대 등의 미용 효과에 있어서 우수한 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물은 상처 치료, 흉터 치료, 관절염의 개선 또는 치료 등의 치료 효과에 있어서도 우수한 효과를 나타낸다.
특히, 본 발명의 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물은 주사가 용이하면서도 히알루론산이 분해되는 과정 또는 분해 후 주사 부위 주변으로 방출되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체와 사포게닌에 의해 히알루론산 필러로부터 얻고자 하는 미용 또는 치료적 효과를 오래 지속할 수 있다. 따라서, 본 발명의 히알루론산 기반의 필러 조성물은 미용적 또는 치료적 효과가 오래 지속되면서 주사가 편리하고 환자에게 고통을 덜 주는 히알루론산 기반의 필러의 구현에 적합하게 응용될 수 있다.
추가로, 본 발명의 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물은 신체의 각부에 국소적으로 적용되어 피부의 일반적 증상 개선, 즉 지질 부족을 나타내는 신체의 각부를 개선하거나 아름답게 하는데 사용될 수 있다.
아울러, 본 발명은 고유 분리방법에 의해 분리 정제된 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 저농도로 히알루론산 기반의 필러에 혼합 제조가 가능하고 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 입자수를 많이 필요로 하는 경우 보다 균질한 혼합이 용이하다. 이로써, 본 발명은 미용이나 치료적 효과를 위해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 혼합하는 경우 발생할 수 있는 히알루론산 기반의 필러 조성물의 전체 볼륨이 증가하는 문제를 방지할 수 있다.
또한, 본 발명의 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물은 스케일-업(scale-up)이 가능하고 GMP(Good Manufacturing Practice)에도 적합하다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 생물학적 용액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 포함하는 분획물을 제조하는 방법에 있어서 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리 및 정제하는 과정을 설명하는 플로우챠트이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라 생물학적 용액, 예를 들어 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 포함하는 분획물을 제조하는 단계(step)별로 용액 내에 포함되어 있는 단백질의 총량 비율(Relative amount of protein)을 측정한 결과를 나타낸다. 각 단계별 단백질 총량의 비율은 줄기세포 배양액 전체에 대한 단백질 총량의 상대적 비율로 나타내었다. 실험 결과는 2개의 서로 다른 배치에서 얻어진 결과를 각각 도시하였다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀 함유 배양액 분획물에 포함되어 있는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성(productivity)과 순도(purity)를 측정한 결과를 도시한 것이다. 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성은 "줄기세포 배양액(CM)단위 mL 당 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 입자수"로 계산하였고, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 순도는 "최종 분획물에 포함되어 있는 단백질 단위 μg 당 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 입자수"로 계산하였다. 실험 결과는 5개의 서로 다른 배치(batch)에서 얻어진 결과를 도시하였다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따라 제조된 분획물 내에 포함된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "D"는 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다.
도 5는 부형제 첨가에 따라 균일하고 순도가 높은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 수득되는 것을 보여주는 입자 크기 분포(균일한 분포)에 관한 NTA 분석 결과를 도시한다. 첨가된 부형제의 양이 증가함에 따라 단일한 피크를 갖는 입자 크기 분포 결과를 얻을 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 포함하는 분획물의 제조 과정에서 부형제 첨가 여부에 따른 입자 크기 분포를 나타내는 NTA 분석 결과를 도시한다. "A"는 제조 과정 전과정에서 부형제를 첨가한 경우, B는 세포 배양액을 동결 보관하였다가 해동한 후 부형제를 첨가한 경우, "C"는 부형제를 첨가하지 않고 줄기세포 배양액 분획물을 제조한 결과를 나타낸다. "D"에는 A 내지 C 방법에 의하여 분리한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 상대적인 생산성(Relative productivity)과 상대 농도(Relative concentration)를 비교한 결과를 도시하였다. "E"에는 A 내지 C 방법에 의하여 분리한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 평균 입자크기(Mean size)를 도시하였다.
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따라 사포게닌이 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 침투되어 담지된 복합체를 도식적으로 설명하는 도면이다.
도 8은 본 발명의 히알루론산 기반의 가교되지 않은 필러 조성물(NC)과 가교된 필러 조성물(C)을 마우스 피하에 주사한 후 6일 동안 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.
도 9는 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 히알루론산 필러에 섞은 후 NTA 장비를 이용하여 촬영한 사진으로서, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 히알루론산 기반의 필러 조성물 내에 잘 혼합되어 있고 냉동 보관 후에도 혼합 상태가 양호하게 유지되고 있음을 나타내고 있다. 도 9의 오른쪽 마지막 사진은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 없는 음성대조군 사진으로서, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 혼합되어 있지 않은 필러에는 거의 입자가 존재하지 않은 것을 확인시켜 주고 있다.
도 10은 지방유래 줄기세포에 사포게닌(SSP), 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(EV), 사포게닌과 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 혼합물(SSP+EV), 사포게닌과 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 결합물(SSP/EV)를 처리한 후 세포 내에 형성된 지방을 염색한 세포 현미경 사진이다.
도 11은 도 10에서 염색된 지방을 용출한 후 흡광도를 측정하여 상대적 지방 증가량을 도시한 그래프이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 지방 유래 줄기세포는 5% CO2, 37℃ 조건에서 우태아 혈청, 항생제-항진균제가 포함된 성장 배지를 이용하여 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline; PBS,Thermo Scientific에서 구입)으로 3회 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.
엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 분리 과정에서 균일하고 순도가 높은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 수득하기 위하여 배양액에 부형제를 첨가하였다. 부형제로서는 자당(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 유당(lactose), 락툴로오스, 말토오스, 셀로비오스, 이소말토오스, 투라노오스, 포도당(dextrose), 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 탈로오스, 만노오스, 타가토오스, 프시코오스, 에리트로오스, 에리트룰로오스, 트레오스, 에리스리톨(erythritol), 아라비노오스, 자일로오스, 릭소오스, 리보오스, 리불로오스, 자일룰로스, 알도헵토오스, 헵툴로오스, 옥툴로오스, 겐티아노스, 움벨리페로스, 플란테오스, 이소리크노오스, 라피노오스, 리크노오스, 스타키오스, 베르바스코오스(verbascose), 만니톨(manitol), 말티톨, 락티톨, 말토트리오스, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 자일리톨, 소르비톨(sorbitol), 전분 분해당, 전분 분해당 환원 알콜, 비이온성 계면활성제 (예를 들어, Tween-20, Triton X-100, Pluonic F-68 등), 글리신(glycine), 히스티딘(histidine), 글리세롤(glycerol) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종을 0.01 내지 30 중량% 첨가하였다. 부형제를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 1일 이내로 보관한 후 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 적어도 분리 과정 수행 1일 전 배양액을 냉장고로 이동 보관하여 서서히 해동시킨 후 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하였다.
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 분리 및 정제
실시예 1에서 0.22 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 이용하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리, 농축하기 전 배양액을 초음파처리(sonication)하여 잠재적인 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 덩어리를 풀어주었다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare 또는 Spectrum Labs에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 μm 크기의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/25 내지 1/100 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 균일하고 순도가 높은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 수득하기 위하여 부형제를 첨가하였다. 부형제 처리에 따라 고순도이면서 균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 높은 수율로 수득할 수 있는 효과를 확인한 결과는 도 6에 도시하였다.
한편, 본 발명의 히알루론산 기반의 필러 조성물에 사용되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 전술한 바와 같은 분리방법 외에도 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용하여 줄기세포 배양액으로부터 분리할 수 있다(대한민국 공개특허공보 제10-2016-0116802호; Pin Li et al., Progress in Exosome Isolation Techniques, Theranostics, 2017, 7(3): 789-804; Coumans et al., Methodological Guidelines to Study Extracellular Vesicles, Circulation Research, 2017, 120:1632-1648 참조). 예를 들어, 본 발명의 히알루론산 기반의 필러 조성물에 사용되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는, 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 초미세여과법(ultrafiltration), 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 중 적어도 1종의 분리방법에 의해 분리될 수 있다.
그러나 본 발명의 히알루론산 기반의 필러 조성물에 사용되는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 전술한 바와 같은 방법들에 의해 분리된 것에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 분리 방법에 의해 수득된 것을 본 발명의 히알루론산 기반의 필러 조성물에 사용할 수 있음은 물론이다. 상기와 같은 분리방법들은 히알루론산 기반의 필러 조성물에 사용될 수 있는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 대한 분리방법의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
실시예 3: 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 특성 분석
분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 배양액, TFF 분리과정의 분획물에서 단백질의 양은 BCA 발색법(Thermo Fisher에서 구입) 또는 플루오로프로파일(FluoroProfile) 형광법(Sigma에서 구입)을 이용하여 측정하였다. TFF 방법에 의해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 분리, 농축되고 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등이 제거되는 정도는 단백질 정량법에 의하여 모니터링하여 그 결과를 도 2에 도시하였다. 그 결과 TFF 방법에 의하여 매우 효과적으로 배양액에 존재하는 단백질이 제거됨을 알 수 있었다.
TFF 방법에 의해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하는 경우 생산성과 순도를 독립적인 다섯 배치에서 비교한 결과를 도 3에 도시하였다. 독립적인 다섯 배치로부터 얻어진 결과를 분석한 결과, TFF 방법에 의하여 매우 안정적으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리할 수 있음을 확인하였다.
분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing: TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 도 4에 도시하였다.
TFF 방법으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리한 후, 부형제의 첨가 여부에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 크기 분포를 NTA 분석한 결과를 도 5에 도시하였다. 부형제가 존재하지 않는 상태에서 TFF 방법으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리한 경우, 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 확인되는 반면, 부형제의 첨가양을 늘려주면 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 줄어들고 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 크기 분포가 균일해지는 것을 확인하였다.
TFF 방법으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하는 과정에 부형제의 첨가 여부를 추가로 조사하였다. 도 6에서 보는 바와 같이 TFF 전과정에 부형제를 첨가한 경우, 균일한 크기 분포를 갖는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 얻을 수 있었다(도 6A). 반면 부형제를 첨가하지 않고 동결 보관하였던 배양액을 사용한 경우나 부형제를 전혀 첨가하지 않고 TFF 과정을 진행한 경우, 크기가 큰 입자가 많이 포함된 불균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 얻었다(도 6B 및 도 6C).
분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 상대적인 생산성과 농도를 비교한 결과, TFF 전과정에 부형제를 첨가한 경우 매우 높은 생산성으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 얻을 수 있었으며, 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 농도도 5배 이상 높았다(도 6D). NTA 분석 결과에서 나타난 바와 같이, 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 평균 크기도 TFF 전과정에 부형제를 첨가한 경우 200 nm로 균일하게 확인되었다(도 6E).
도 4D는 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다.
따라서, 본 발명은 접선흐름여과를 이용한 분리 및/또는 정제 과정에서 기존에 부형제(excipient)로 알려진 물질을 첨가하여 고순도이면서 균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 분리 및 정제할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 분리방법의 공정들은 스케일-업이 가능하고 GMP에도 적합함을 알 수 있었다.
실시예 4: 사포게닌을 포함하는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 제조
사포게닌과 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 혼합하여 상온에서 반응시킨 후 반응액을 그대로 사용(사포게닌-엑소좀 혼합액으로 명칭)하거나 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 결합하지 않은 사포게닌을 제거한 후 사용(사포게닌-엑소좀으로 명칭)하였다(도 7). 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 결합(association)되지 않은 사포게닌을 제거하기 위하여 크기분별컬럼 예를들어 MW3000 스핀 칼럼(spin column)(ThermoFisher에서 구입)을 사용하였다.
실시예 5: 히알루론산 기반의 필러 조성물의 준비 및 필러 효능 검증
실시예 4에서 준비된 사포게닌-엑소좀 혼합액 또는 사포게닌-엑소좀을 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 혼합하여 히알루론산 기반의 필러 조성물을 제조하였다. 또한, 사포게닌과 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 각각 별개로 준비한 후 이들을 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 혼합하여 히알루론산 기반의 필러 조성물을 제조하였다.
히알루론산 염을 사용하는 경우에는 히알루론산 나트륨을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에서 사용되는 다양한 히알루론산 염이 사용될 수 있다. 또한, 히알루론산 겔은 가교되지 않은 히알루론산 또는 가교된 히알루론산 겔을 사용할 수 있는데, 가교된 겔로서는, 예를 들어 레스틸렌을 사용할 수 있다. 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 혼합된 히알루론산 기반의 필러 조성물을 가열 멸균 또는 멸균 필터를 이용하여 제균하였다. 멸균된 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 혼합된 히알루론산 기반의 필러 조성물에 사포게닌-엑소좀 혼합액 또는 사포게닌-엑소좀을 혼합하여 히알루론산 필러 조성물을 제조하였다. 이때, 사포게닌-엑소좀 혼합액 또는 사포게닌-엑소좀을 히알루론산 기반의 필러 조성물에 혼합하기 전 멸균 필터를 이용하여 추가로 멸균할 수 있다.
또한, 멸균된 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 혼합된 히알루론산 기반의 필러 조성물에 사포게닌과 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 개별적으로 혼합하여 히알루론산 필러 조성물을 제조하였다. 이때, 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 히알루론산 기반의 필러 조성물에 혼합하기 전 멸균 필터를 이용하여 추가로 멸균할 수 있다.
히알루론산 기반의 필러 조성물 내의 줄기세포 유래 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 농도는 예를 들어 대략 1×105 입자/mL 내지 1×1011 입자/mL (또는 단백질 농도로는 대략 0.001 내지 1000 μg/mL)로 제조될 수 있다.
가교되지 않은 히알루론산 필러(NC)와 가교된 히알루론산 필러(C)를 각각 마우스 피하에 주사한 후 6일 동안 관찰하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 가교되지 않은 히알루론산 필러는 6일 후에 분해되어 마우스 피하 조직 내에 유지되지 않고 있는 반면에, 가교된 히알루론산 필러는 마우스 피하 주사 후 6일째에도 피하 조직 내에서 잘 유지되는 것을 확인하였다.
한편, 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 1×108 입자/mL 농도로 히알루론산 필러에 섞은 후 즉시 NTA 장비를 이용하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 히알루론산 기반의 필러 조성물 내에 잘 혼합되었는지를 확인하였다(도 9). 또한, 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 혼합된 히알루론산 기반의 필러를 영하 20℃에 30일 간 보관한 후 다시 NTA 장비를 이용하여 촬영하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 히알루론산 기반의 필러 조성물 내에 양호하게 유지되고 있는지를 확인하였다(도 9). 그 결과, 도 9에 도시된 바와 같이, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 히알루론산 기반의 필러 조성물 내에 잘 혼합되어 있고 냉동 보관 후에도 혼합 상태가 양호하게 유지되고 있음을 촬영 이미지로부터 확인할 수 있었다.
실시예 6: 히알루론산 기반의 필러 조성물의 지방세포 증식율 증가 평가
미분화상태(pre-adipocyte)의 3T3-L1 세포주를 클론 확장(clonal expansion)하여 충분한 수의 세포를 확보한 후 사용하였다. 미분화상태의 세포주를 멀티웰 플레이트(multiwell plate)에 적정한 농도가 되도록 접종 한 후에 통상적인 분화 칵테일(conventional differentiation cocktail)을 첨가한 배지에서 실시예 5에서 준비한 히알루론산 기반의 필러 조성물을 포함하지 않거나(음성대조군), 히알루론산 기반의 필러 조성물을 포함한 조건, 또는 피오글리타존(Pioglitazone)(양성대조군)을 처리한 조건에서 배양하여 분화를 유도하였다. 3~20일간 분화 유도된 세포를 수거하여 세포수를 계수하여 세포 증식율을 정량하였다. 상기 방법을 통하여 히알루론산 기반의 필러 조성물이 함께 처리된 실험군이 분화 단계의 세포 증식을 증가시킴을 확인하였다.
실시예 7: 히알루론산 기반의 필러 조성물을 이용한 지방세포의 분화능 평가
미분화상태(pre-adipocyte)의 3T3-L1 세포주를 실시예 6과 동일한 방법으로 3~20일간 분화유도하였다. 분화유도된 세포의 배지를 일반 배양 배지로 교체하고 분화유도 과정과 동일하게 실시예 5에서 준비된 히알루론산 기반의 필러 조성물, 또는 피오글리타존(Pioglitazone)을 처리하여 3~20일간 배양하였다. 세포를 수거하여 G3PDH(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase) 활성을 정량하여 히알루론산 기반의 필러 조성물이 함께 처리된 실험군의 분화능이 증가함을 확인하였다.
실시예 8: 히알루론산 기반의 필러 조성물을 이용한 지방세포의 지질 축적 평가
미분화상태의 지방 유래 줄기세포를 멀티웰 플레이트(multiwell plate)에 80-90% 농도가 되도록 배양한 후에 통상적인 분화 칵테일(conventional differentiation cocktail)을 첨가한 배지와 실시예 5에서 준비한 히알루론산 기반의 필러 조성물을 포함하지 않거나(음성대조군), 히알루론산 기반의 필러 조성물을 포함한 조건, 또는 피오글리타존(Pioglitazone)(양성대조군)을 처리한 조건에서 5일간 배양하여 분화를 유도하였다. 분화 유도된 세포는 세척(washing) 및 고정(fixing) 과정을 거친 후 오일 레드 오(Oil Red O)로 염색하였으며, 이미지 분석 및 추출된 오일의 흡광도를 분석하여 세포내 지질 축척을 정량하였다. 도 10 및 도 11에 도시한 바와 같이 지방 유래 줄기세포는 통상적인 분화 칵테일을 첨가하여 배양하면 오일 드롭(oil drop)을 세포 내에 축적하였다. 17.5 μM의 사포게닌이 첨가된 조성물을 함께 처리한 경우(도 10 및 도 11의 SSP) 세포 내 지질 축적의 양이 미약하게 증가하였으며, 3×108 입자/mL (단백질 양으로 약 4.5 μg/mL)의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 포함한 조성물을 함께 처리한 경우(도 10 및 도 11의 EV) 세포 내 지질 축적의 양이 증가함을 확인하였다. 사포게닌과 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 혼합물을 포함하는 조성물을 함께 처리한 경우(도 10 및 도 11의 SSP+EV)와 사포게닌과 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 결합물을 포함하는 조성물을 함께 처리한 경우(도 10 및 도 11의 SSP/EV) 세포 내 지방 축적이 상승적으로 증가함을 확인하였다.
미분화상태(pre-adipocyte)의 3T3-L1 세포주를 실시예 6과 동일한 방법으로 3~20일간 분화유도하였다. 분화 유도 후 분화 칵테일(differentiation cocktail)은 성숙 칵테일(maturation cocktail)을 포함한 배지로 교체하였으며, 분화유도 과정과 동일한 조건으로 실시예 5에서 준비된 히알루론산 기반의 필러 조성물, 또는 피오글리타존(Pioglitazone)을 처리하여 3~20일간 성숙(maturation)을 유도하였다. 성숙된 세포는 세척(washing) 및 고정(fixing) 과정을 거친 후 레드 오일(Red Oil)로 염색하였으며, 이미지 분석을 통해 세포내 지질 축척을 정량하였다. 상기 방법을 통하여 히알루론산 기반의 필러 조성물이 함께 처리된 실험군의 지질 축적이 증가함을 확인하였다.
실시예 9: 히알루론산 기반의 필러 조성물을 이용한 지방세포의 세포 부피 평가
피브로넥틴(Fibronectin)이 코팅된 유리 슬라이드 위에 접종한 미분화상태의 3T3-L1 세포주를 3~20일간 분화유도하였고(실시예 6 참조), 실시예 5에서 준비된 히알루론산 기반의 필러 조성물을 포함하지 않거나(음성대조군), 히알루론산 기반의 필러 조성물을 포함한 조건, 또는 피오글리타존(Pioglitazone)(양성대조군)에서 6일간 배양하였다. 이후 지질 (적색, red oil), 세포 핵(청, HOECHST), 및 세포질 (녹색, BODIPY)의 삼중염색을 실시한 후, 매 600 nm 마다 이미지를 얻은 후 이를 재구성 및 분석하여 지방세포의 총 부피를 확인하였다. 상기 방법을 통하여 히알루론산 기반의 필러 조성물이 함께 처리된 실험군의 세포부피가 증가함을 확인하였다.
상기와 같은 결과들로부터 본 발명의 히알루론산 기반의 필러 조성물은 미용적 또는 치료적 효과가 오래 지속되면서 주사가 편리하고 환자에게 고통을 덜 주는 히알루론산 기반의 필러의 구현에 적합하게 응용될 수 있음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물은 흉터 제거 또는 피부조직 개선, 연부조직의 결함 보정, 주름 제거 또는 개선, 윤곽교정, 조직확대, 유방 확대, 성기 확대 등의 미용 효과, 및 상처 치료, 흉터 치료, 관절염의 개선 또는 치료 등의 치료 효과에 있어서 우수한 효과를 나타낼 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 신규한 히알루론산 기반의 필러 조성물은 신체의 각부에 국소적으로 적용되어 피부의 일반적 증상 개선, 즉 지질 부족을 나타내는 신체의 각부를 개선하거나 아름답게 하는데 사용될 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (24)

  1. 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과,
    상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 혼합되어 유지되는, 사포게닌과 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 포함하는, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 사포게닌과 상기 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 각각 별개로 준비한 후 이들을 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 혼합하여 수득된 것인, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 사포게닌과 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 혼합하여 반응시킨 후 얻은 반응액을 그대로 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 혼합하여 수득된 것인, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 사포게닌과 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 혼합하여 반응시킨 후 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 침투하지 않은 사포게닌을 제거하여 얻은 반응액을 상기 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종과 혼합하여 수득된 것인, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 사포게닌은 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 침투되거나 적어도 결합(association)되어 담지된 것인, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    가교되지 않은 히알루론산 겔, 또는 가교된 히알루론산 겔 중 적어도 1종을 더 포함하는, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 가교된 히알루론산 겔은 1,4-부탄다이올 다이글리시딜 에테르 (BDDE), 1,4-비스(2,3-에폭시프로폭시)부탄, 1,4-비스글리시딜옥시부탄, 1,2-비스(2,3-에폭시프로폭시)에틸렌 및 1-(2,3-에폭시프로필)-2,3-에폭시사이클로헥산 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 가교결합제로 가교결합된 히알루론산 겔인, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    지질 부족을 나타내는 신체의 각부(各部)를 개선하거나 아름답게 하는 효능을 나타내는, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 사포게닌은 디오스게닌(diosgenin), 헤코게닌(hecogenin), 스밀라게닌(smilagenin), 에피스밀라게닌(epismilagenin), 사르사사포게닌(sarsasapogenin), 이소사르사사포게닌(isosarsasapogenin), 에피사르사사포게닌(episarsasapogenin), 파리게닌(parigenin), 티고게닌(tigogenin), 에피티고게닌(epitigogenin), 네오티고게닌(neotigogenin), 파릴린(parillin), 티모사포닌(timosaponin), 키시링사포닌(xilingsaponin), 피리페린(filiferin), 야모게닌(yamogenin) 및 유카게닌(yuccagenin)으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종인 것을 특징으로 하는, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는, 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 초미세여과법(ultrafiltration), 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 중 적어도 1종의 분리방법에 의해 분리된, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 줄기세포 배양액에 부형제(excipient)를 첨가하고 상기 부형제가 첨가된 줄기세포 배양액을 여과한 후, 상기 여과된 줄기세포 배양액으로부터 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 분리된, 고순도의 입자크기 분포가 균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체인, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 1차 분리 후에 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 더 수행하여 수득되는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 탈염과 버퍼교환에 사용되는 완충용액에는 부형제를 첨가하는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행하는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    TFF(Tangential Flow Filtration)를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da, 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 μm TFF 필터를 사용하는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  17. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분리 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함하는, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  18. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 여과된 줄기세포 배양액은 TFF 전에 초음파처리(sonication)되는 것을 특징으로 하는, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  19. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 부형제는 자당(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 유당(lactose), 락툴로오스, 말토오스, 셀로비오스, 이소말토오스, 투라노오스, 포도당(dextrose), 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 탈로오스, 만노오스, 타가토오스, 프시코오스, 에리트로오스, 에리트룰로오스, 트레오스, 에리스리톨(erythritol), 아라비노오스, 자일로오스, 릭소오스, 리보오스, 리불로오스, 자일룰로스, 알도헵토오스, 헵툴로오스, 옥툴로오스, 겐티아노스, 움벨리페로스, 플란테오스, 이소리크노오스, 라피노오스, 리크노오스, 스타키오스, 베르바스코오스(verbascose), 만니톨(manitol), 말티톨, 락티톨, 말토트리오스, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 자일리톨, 소르비톨(sorbitol), 전분 분해당, 전분 분해당 환원 알콜, 비이온성 계면활성제, 글리신(glycine), 히스티딘(histidine), 글리세롤(glycerol) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 히알루론산 기반의 필러 조성물.
  20. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 히알루론산 기반의 필러 조성물을 유효성분으로 포함하는 상처 또는 흉터 치료용 약학 조성물.
  21. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 히알루론산 기반의 필러 조성물을 유효성분으로 포함하는 관절염의 개선 또는 치료용 약학 조성물.
  22. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 히알루론산 기반의 필러 조성물 을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 흉터 제거 또는 피부조직 개선, 연부조직의 결함 보정, 주름 제거 또는 개선, 윤곽교정, 조직확대, 유방 확대, 또는 성기 확대를 위한 미용방법.
  23. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 히알루론산 기반의 필러 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 상처 또는 흉터 치료방법.
  24. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 히알루론산 기반의 필러 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 관절염의 개선 또는 치료 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102161850B1 (ko) * 2019-08-16 2020-10-05 주식회사 엑소코바이오 히알루론산과 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀의 조합을 유효성분으로 포함하는 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물
CN113230452A (zh) * 2021-05-28 2021-08-10 易生彬 一种面部填充剂及其配制方法
CN114099772A (zh) * 2021-11-29 2022-03-01 陕西科美致尚生物科技有限公司 一种用于面部塑形填充的材料及其制备方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6294157B1 (en) 1999-10-14 2001-09-25 L'oreal Composition containing sapogenin
KR20080109774A (ko) 2006-03-13 2008-12-17 키쎄라 바이오파마슈티컬즈 인코포레이티드 유체 조직 증대 조성물 및 방법
KR101062320B1 (ko) 2007-08-01 2011-09-05 포항공과대학교 산학협력단 가교결합성 히알루론산 유도체 제조방법 및 그 히알루론산유도체의 가교결합물
KR20120125293A (ko) 2010-01-13 2012-11-14 알러간 인더스트리 에스에이에스 첨가제를 포함하는 안정한 하이드로겔 조성물
KR20120128596A (ko) 2002-03-27 2012-11-27 파이토팜 피엘씨 사포게닌 및 그 유도체의 치료 방법 및 용도
KR101459070B1 (ko) 2013-12-09 2014-11-17 (주) 뉴메딕 지속성을 갖는 히알루론산 겔 조성물
KR101514831B1 (ko) 2008-11-07 2015-04-24 앙테이스 에스.아. 히알루론산 또는 그의 염 중 하나, 폴리올 및 리도카인의 가열 멸균된 주사용 조성물
KR20160116802A (ko) 2015-03-31 2016-10-10 포항공과대학교 산학협력단 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 분리방법

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6294157B1 (en) 1999-10-14 2001-09-25 L'oreal Composition containing sapogenin
KR20120128596A (ko) 2002-03-27 2012-11-27 파이토팜 피엘씨 사포게닌 및 그 유도체의 치료 방법 및 용도
KR20080109774A (ko) 2006-03-13 2008-12-17 키쎄라 바이오파마슈티컬즈 인코포레이티드 유체 조직 증대 조성물 및 방법
KR101062320B1 (ko) 2007-08-01 2011-09-05 포항공과대학교 산학협력단 가교결합성 히알루론산 유도체 제조방법 및 그 히알루론산유도체의 가교결합물
KR101514831B1 (ko) 2008-11-07 2015-04-24 앙테이스 에스.아. 히알루론산 또는 그의 염 중 하나, 폴리올 및 리도카인의 가열 멸균된 주사용 조성물
KR20120125293A (ko) 2010-01-13 2012-11-14 알러간 인더스트리 에스에이에스 첨가제를 포함하는 안정한 하이드로겔 조성물
KR101459070B1 (ko) 2013-12-09 2014-11-17 (주) 뉴메딕 지속성을 갖는 히알루론산 겔 조성물
KR20160116802A (ko) 2015-03-31 2016-10-10 포항공과대학교 산학협력단 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 분리방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Coumans et al., Methodological Guidelines to Study Extracellular Vesicles, Circulation Research, 2017, 120:1632-1648 (2017.05.12)
Pin Li et al., Progress in Exosome Isolation Techniques, Theranostics, 2017, 7(3): 789-804 (2017.01.26)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102161850B1 (ko) * 2019-08-16 2020-10-05 주식회사 엑소코바이오 히알루론산과 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀의 조합을 유효성분으로 포함하는 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물
WO2021033899A1 (ko) * 2019-08-16 2021-02-25 주식회사 엑소코바이오 히알루론산과 동결건조된 줄기세포 유래 엑소좀의 조합을 유효성분으로 포함하는 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 조성물
CN113230452A (zh) * 2021-05-28 2021-08-10 易生彬 一种面部填充剂及其配制方法
CN114099772A (zh) * 2021-11-29 2022-03-01 陕西科美致尚生物科技有限公司 一种用于面部塑形填充的材料及其制备方法

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