KR20190003399A - 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부 섬유증 개선 용도 - Google Patents
줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부 섬유증 개선 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 피부 섬유증과 관련한 사이토카인의 발현량과 α-SMA의 발현량을 감소시키고 섬유화되어 두꺼워진 피부 두께를 감소시켜 피부 섬유증을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부 섬유증 개선 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 있어서 임상적 적용이 가능한 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 줄기세포 유래의 엑소좀을 대량으로 수득할 수 있고, 이와 같이 수득된 기능적 활성이 우수한 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 조성물을 저가로 대량으로 제공할 수 있는 임상 및 상업적으로 뛰어난 기술에 관한 것이다.
피부 섬유증은 피부의 과도한 흉터로, 병리학적 상처 치유 반응의 결과이다. 피부 섬유증은 상처 치유 과정의 일환이지만, 섬유증을 수반하는 반흔 및 흉터는 미용적 관점에서 좋지 않고 피부의 뻣뻣함을 유발하여 다른 신체 증상이나 질환을 유발할 수 있다.
피부 섬유증이 전신으로 나타날 경우 중요한 건강상의 문제를 야기한다. 부분적인 피부 섬유증은 얼굴 및 발 등의 피부에 국한되는 반면, 넓은 범위의 피부섬유증은 피부의 많은 부분을 침범하여 내장 기관까지 진행될 수 있다. 피부 섬유증은 화학적 요인, 물리적 요인(기계적 외상, 화상), 섬유성 피부 질환 등이 원인으로 알려져 있다. 피부 섬유증은 면역, 자가면역 및 염증 기전에 의해 촉발될 수 있는데, 콜라겐 생성 및 섬유아세포에 의한 분해의 균형이 피부 섬유화 과정에서 중요한 역할을 한다. 또한, 사이토카인들 중 TGF-β 및 IL-4는 상처 치유 및 섬유화를 촉진하는 반면, IFN-γ는 항섬유성(antifibrotic) 물질로 알려져 있다(대한민국 공개특허공보 제10-2016-0040452호 참조). 정상적인 피부의 섬유아세포는 휴지 상태에 있어 제어된 양의 결합조직 단백질을 합성하고 증식 활성이 낮다. 피부에 상처가 생기면 섬유화와 관련된 사이토카인 분비가 증가되면서 피부의 섬유아세포가 증식하고, 피부의 섬유아세포에서는 α-평활근 액틴(α-SMA)을 발현하여 대량의 결합조직 단백질을 합성한다. 이러한 과정을 통해 피부 섬유화가 발생되는 것으로 생각되고 있다.
피부 섬유증을 치료하기 위한 가장 대중적인 방법은 두꺼워진 피부 부위에 스테로이드 연고를 도포하거나 2차적으로 감염이 되면 항생제 연고를 도포하는 방식으로 치료를 하는 것이다. 또한, 피부 섬유증의 주요 원인이 자가면역에 의한 피부 조직 손상과 이로 인한 피부 조직 섬유화인 점을 감안하여 면역억제제를 사용하기도 한다. 면역억제 치료에 의해 피부 섬유화의 억제 내지 완화가 관찰된 바 있으나, 약물의 안전성에 대한 우려와 함께 결정적인 임상 데이터의 부족 및 입증 가능한 효능의 문제가 여전히 남아 있다. 따라서, 피부 섬유증, 섬유성 피부 질환 및 피부의 병리적 흉터를 치료하기 위한 새로운 치료 수단의 개발이 요구되고 있다.
한편, 줄기세포를 이용하여 피부 상태나 질환을 개선 또는 치료하고자 하는 방법이 제안되고 있다. 배아줄기세포 또는 태아조직 유래 줄기세포는 분화능력 및 재생치료능력이 우수하고 거부반응이 적지만, 윤리적 문제로 임상에 적용될 수 없고 종양을 형성할 수 있는 위험성이 존재한다. 이에 대한 대안으로서 성체줄기세포를 이용하여 피부 상태나 질환을 개선 또는 치료하고자 하는 방법이 제안되었다. 그러나, 환자 자신의 성체줄기세포가 이닌 타인의 성체줄기세포를 사용한 경우 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)을 일으킬 위험이 있고, 자가 성체줄기세포를 이용하여 치료를 하기 위해서는 환자로부터 성체줄기세포를 채취한 후 이를 배양하는 과정이 필요하여 복잡하고 비용이 많이 드는 문제가 있다.
최근에는 전술한 바와 같은 줄기세포의 문제점을 감안하여 성체줄기세포를 배양하여 얻은 배양액을 이용하여 피부 상태나 질환을 개선 또는 치료하고자 하는 시도가 있다. 그러나, 성체줄기세포 배양액에는 성체줄기세포가 분비하는 다양한 단백질, 사이토카인, 성장인자 등이 함유되어 있는 반면, 세포가 성장하면서 분비한 노폐물, 오염방지를 위해 첨가된 항생제, 동물유래 혈청 등의 성분도 포함되어 있기 때문에 피부에 사용할 경우 각종 위험에 노출될 가능성이 높다.
최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
그러나, 엑소좀을 이용한 일부 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 보다 면밀한 임상 및 비임상 연구가 필요하며, 특히 엑소좀이 작용하는 다양한 표적을 과학적으로 규명하여 엑소좀을 다양한 질환 치료에 응용할 수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명자들은 피부 섬유증과 관련하여 종래 알려진 치료제에 비하여 효과가 뛰어나고 안전한 피부 섬유증의 완화 내지는 개선용 조성물을 개발하고자 노력하였다. 이에 본 발명자들은 줄기세포로부터 유래된 엑소좀의 새로운 용도에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀이 전술한 바와 같은 줄기세포 자체나 줄기세포 배양액의 안전성 문제를 해결할 수 있고, 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
Pin Li et al., Progress in Exosome Isolation Techniques, Theranostics, 2017, 7(3): 789-804 (2017.01.26)
Coumans et al., Methodological Guidelinesto Study Extracellular Vesicles, Circulation Research, 2017, 120:1632-1648 (2017.05.12)
본 발명의 목적은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부 섬유증 개선 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 줄기세포 유래의 엑소좀을 대량으로 수득할 수 있고, 이와 같이 수득된 기능적 활성이 우수한 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 있어서 임상적 적용이 가능한 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 줄기세포 유래의 엑소좀을 대량으로 수득할 수 있고, 이와 같이 수득된 기능적 활성이 우수한 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 저가로 대량으로 제공할 수 있는 임상 및 상업적으로 뛰어난 신규한 기술을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 줄기세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
본 명세서에서 용어, "피부 섬유증"은 상피 세포 또는 섬유성 결합 조직(fibrous connective tissue)의 과도한 증식으로 인한 흉터 내지는 섬유성 조직의 발달의 초래를 의미한다. 상처가 발생되면 지혈(hemostasis), 염증(inflammation), 증식(proliferation) 및 리모델링(remodeling)의 프로세스를 거쳐 치유된다. 그러나 피부 상처가 심하거나 반복될 경우 상처 치료 프로세스에 조절장애가 발생되고, 이는 손상된 피부 조직 주위로 과도한 섬유성 결합 조직(fibrous connective tissue)을 형성하여 피부 섬유증을 유발한다. 본 발명에 있어서, 피부 섬유증은 임의의 피부 조직 및 상피 세포의 섬유증, 흉터, 피부 및 두피의 상피 세포의 섬유증 등을 포괄하는 개념이다.
본 명세서에서 용어, "이온토포레시스(iontophoresis)"는 유효물질이 적용된 피부에 미세전류를 흐르게 하여 전위차를 주어 피부의 전기적 환경을 변화시킴으로써 이온화된 유효성분을 전기적 반발력으로 피부를 투과하게 하는 방법을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 사용되는 이온토포레시스(iontophoresis)는 피부 위의 전극 패치에 외부전원으로부터의 전류가 흘러들어가 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 전극 패치 자체에 배터리가 장착되어 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 고농도 전해질 용액 및 저농도 전해질 용액 간의 이온 농도 차이를 통해 전류를 발생시키는 역전기투석(Reversed Electrodialysis) 수단이 장착된 패치를 통해 피부에 미세전류가 도입되는 방식 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며, 다양한 방식의 이온토포레시스가 사용될 수 있음은 물론이다.
한편, 줄기세포 유래의 엑소좀을 이용한, 제한적인 주름개선 및 피부재생 효과가 보고된 바가 있다. 그러나 상기 종래기술에 있어서의 엑조좀을 이용한 피부재생은 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 관한 것이 아니고, 피부조직의 재생을 통해 주름을 개선하거나 피부 탄력을 회복시키는 것에 관한 것이었다. 그리고 줄기세포, 줄기세포 배양액 등을 이용하여 피부 중 진피층을 재생하여 창상을 치료하고, 피부조직을 재생하여 피부 탄력을 개선하고자 한 시도는 있으나, 줄기세포 배양액으로부터 분리 정제된 엑소좀을 사용할 때 전술한 바와 같이 정의된 "피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료" 효과가 있다는 것에 대해서는 공지된 바가 없었다.
현재까지 대량 배양이 가능한 줄기세포를 배양한 후, 줄기세포 배양액으로부터 대량으로 경제적으로 분리 정제된 엑소좀을 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 임상적으로 적용가능하게 구현한 치료제는 개발된 바가 없다. 예를 들어, 지방에서 유래한 지방줄기세포(adipose-derived stem cells)는 지방 흡입술과 같은 간단한 시술에 의해 대량으로 입수가 가능하고 골수, 제대 또는 제대혈 등에 비해 약 40배 정도의 줄기세포가 있어 상업적으로는 가장 원가가 저렴하고 생산량이 많지만, 지방 내에 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대입자와 같은 불순물이 많아 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 경제적으로 대량으로 분리하는 것이 어렵다. 따라서, 경제성 측면에서 줄기세포 배양액으로부터 고순도의 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 대량으로 분리하는 것에는 기술적 장벽이 있다고 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학 조성물, 피부외용제 또는 화장료 조성물로 적용될 때, 유효성분으로 함유된 줄기세포 유래의 엑소좀이 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 유의적인 효과를 나타내며, 줄기세포 자체나 줄기세포 배양액의 안전성 문제를 해결할 수 있다. 따라서, 본 발명의 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 조성물에 포함된 줄기세포 유래의 엑소좀은 종래에 알려진 제한적인 주름개선 및 피부재생과는 전혀 다른 메카니즘으로 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하며 이러한 효능은 종래기술로부터 전혀 예측할 수 없는 것임을 명백히 밝혀 둔다.
본 발명의 일 구체예의 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 조성물은, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 하기의 단계들을 수행하여 수득될 수 있다: (a) 줄기세포 배양액에 트레할로오스를 첨가하는 단계, (b) 상기 트레할로오스가 첨가된 줄기세포 배양액을 여과하는 단계, (c) 상기 여과된 줄기세포 배양액으로부터, TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 엑소좀을 분리하는 단계, 및 (d) 탈염과 버퍼교환(diafiltration)에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하고, 상기 트레할로오스가 첨가된 완충용액을 이용한 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여, 상기 분리된 엑소좀에 대한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하는 단계.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 (d) 단계에서 탈염과 버퍼교환(diafiltration)에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하면, 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 효과적으로 수득할 수 있다(도 6 참조).
한편, 본 발명에 있어서 트레할로오스는 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대 입자와 같은 불순물에 대해 엑소좀을 효율적으로 분별할 수 있는 기능을 부여한다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행할 수 있다. 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, TFF를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 ㎛ TFF 필터를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 (c) 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 여과된 줄기세포 배양액은 TFF 전에 초음파처리(sonication)될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 피부조직 또는 피부세포에서 IL-4 및 α-SMA의 발현량을 감소시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에서 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물은 앞서 열거된 바와 같은 다양한 원인에 기인한 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물은 약학 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 조성물이 약학 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 과립제, 엘릭시르제(elixirs), 에어로졸 등의 경구투여용 제제, 외용제, 좌제, 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학 조성물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여로는 경피 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 직장 내 투여 등을 거론할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 활성 물질이 표적 조직 또는 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 유효량은 질환 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 또는 좌제일 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 주사제로도 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 수성 주사제, 비수성 주사제, 수성 현탁 주사제, 비수성 현탁 주사제, 또는 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형 주사제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 그 종류에 따라 주사용 증류수, 식물유(예를 들어, 낙화생유, 참기름, 동백기름 등), 모노글리세리드, 디글리세리드, 프로필렌글리콜, 캄퍼, 벤조산에스트라디올, 차살리실산비스무트, 아르세노벤졸나트륨, 또는 황산스트렙토마이신 중 적어도 1종을 포함할 수 있고, 선택적으로 안정제나 방부제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약학 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 질환 종류, 질환의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
한편, 본 발명의 일 구체예의 조성물이 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장품이나 피부외용제에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 피부외용제는 줄기세포 유래의 엑소좀 이외에, 그 작용(피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 피부 섬유증 치료제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 엑소좀은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 피부외용제에서, 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제가 화장료 조성물로 제조되는 경우, 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화 또는 개선시킬 목적으로 사용되며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 피부외용제 및/또는 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 피부외용제 및/또는 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 화장료 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공한다. 본 발명의 미용방법에 있어서, 피부의 상태 조절이란 피부의 상태를 개선시키고/시키거나 피부의 상태를 예방적으로 조절하는 것을 의미하고, 피부의 상태 개선이란 피부 조직의 외관 및 느낌의 시각적 및/또는 촉각적으로 지각할 수 있는 긍정적인 변화를 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법은, (a) 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법은, 상기 화장료 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흐르게 하여 이온토포레시스(iontophoresis)를 수행하는 것을 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 미용방법은, 이온토포레시스 장치를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착시키는 것을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법에 있어서, 상기 이온토포레시스 장치는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하거나, 상기 적어도 1종의 전지가 장착된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 상기 약학 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.
본 발명의 조성물은 피부 섬유증과 관련한 사이토카인의 발현량과 α-SMA의 발현량을 감소시키고 섬유화되어 두꺼워진 피부 두께를 감소시켜 피부 섬유증을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 줄기세포 유래의 엑소좀을 저가로 대량으로 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명은 기능적 활성이 우수한 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 저가로 대량으로 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 스케일-업(scale-up)이 가능하고 GMP(Good Manufacturing Practice)에도 적합하다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 제조하는 방법에 있어서 엑소좀을 분리 및 정제하는 과정을 설명하는 플로우챠트이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 제조하는 단계(step)별로 용액 내에 포함되어 있는 단백질의 총량 비율(Relative amount of protein)을 측정한 결과를 나타낸다. 각 단계별 단백질 총량의 비율은 줄기세포 배양액 전체에 대한 단백질 총량의 상대적 비율로 나타내었다. 실험 결과는 2개의 서로 다른 배치에서 얻어진 결과를 각각 도시하였다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 생산성(productivity)과 순도(purity)를 측정한 결과를 도시한 것이다. 엑소좀의 생산성은 "줄기세포 배양액(CM)단위 mL 당 얻어진 엑소좀의 입자수"로 계산하였고, 엑소좀의 순도는 "최종 분획물에 포함되어 있는 단백질 단위 ㎍ 당 엑소좀의 입자수"로 계산하였다. 실험 결과는 5개의 서로 다른 배치(batch)에서 얻어진 결과를 도시하였다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 5는 트레할로오스 첨가에 따라 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀이 수득되는 것을 보여주는 입자 크기 분포에 관한 NTA 분석 결과를 도시한다. 첨가된 트레할로오스의 양이 증가함에 따라 단일한 피크를 갖는 입자 크기 분포 결과를 얻을 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀의 제조과정에서 트레할로오스 첨가 여부에 따른 입자 크기 분포를 나타내는 NTA 분석 결과를 도시한다. "A"는 제조 과정 전과정에서 트레할로오스를 첨가한 경우, B는 세포 배양액을 동결 보관하였다가 해동한 후 트레할로오스를 첨가한 경우, "C"는 트레할로오스를 첨가하지 않고 제조한 결과를 나타낸다. "D"에는 A 내지 C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 상대적인 생산성(Relative productivity)과 상대 농도(Relative concentration)를 비교한 결과를 도시하였다. "E"에는 A 내지 C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 평균 입자크기(Mean size)를 도시하였다.
도 7은 피부 섬유증을 수반하는 아토피가 유발된 마우스에서 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 귀 피부 조직의 두께가 용량 의존적으로 감소된 결과를 도시한다.
도 8은 피부 섬유증을 수반하는 아토피가 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 후 피부손상 영역 샘플에서 피부 섬유증 원인이 되는 IL-4 mRNA의 변화량을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 9는 HDF 세포주에 대해 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, TGF-β1에 의해 피부 섬유아세포에서 생성이 촉진되는 피부 섬유화와 관련된 α-SMA 단백질의 발현량이 감소한 결과를 도시한다.
도 10은 PKH67로 염색된 엑소좀을 확인한 형광강도 측정 결과를 도시한다.
도 11은 돼지 피부조직 내부로, 형광염색된 엑소좀이 전달된 정도를 확인한 형광현미경 이미지이다.
도 12는 생쥐 피부조직 내부로, 형광염색된 엑소좀이 전달된 정도를 확인한 공초점형광현미경 이미지이다.
도 13은 도 12의 각 이미지 상의 형광강도를 측정하여 얻은 총 형광강도를 비교하여 도시한 그래프이다.
도 14는 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 15는 피부 섬유증의 진행단계를 나타내는 모식도이다(출처 https://link.springer.com/article/10.1186/ar2186).
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라 줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 제조하는 단계(step)별로 용액 내에 포함되어 있는 단백질의 총량 비율(Relative amount of protein)을 측정한 결과를 나타낸다. 각 단계별 단백질 총량의 비율은 줄기세포 배양액 전체에 대한 단백질 총량의 상대적 비율로 나타내었다. 실험 결과는 2개의 서로 다른 배치에서 얻어진 결과를 각각 도시하였다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 생산성(productivity)과 순도(purity)를 측정한 결과를 도시한 것이다. 엑소좀의 생산성은 "줄기세포 배양액(CM)단위 mL 당 얻어진 엑소좀의 입자수"로 계산하였고, 엑소좀의 순도는 "최종 분획물에 포함되어 있는 단백질 단위 ㎍ 당 엑소좀의 입자수"로 계산하였다. 실험 결과는 5개의 서로 다른 배치(batch)에서 얻어진 결과를 도시하였다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 5는 트레할로오스 첨가에 따라 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀이 수득되는 것을 보여주는 입자 크기 분포에 관한 NTA 분석 결과를 도시한다. 첨가된 트레할로오스의 양이 증가함에 따라 단일한 피크를 갖는 입자 크기 분포 결과를 얻을 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀의 제조과정에서 트레할로오스 첨가 여부에 따른 입자 크기 분포를 나타내는 NTA 분석 결과를 도시한다. "A"는 제조 과정 전과정에서 트레할로오스를 첨가한 경우, B는 세포 배양액을 동결 보관하였다가 해동한 후 트레할로오스를 첨가한 경우, "C"는 트레할로오스를 첨가하지 않고 제조한 결과를 나타낸다. "D"에는 A 내지 C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 상대적인 생산성(Relative productivity)과 상대 농도(Relative concentration)를 비교한 결과를 도시하였다. "E"에는 A 내지 C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 평균 입자크기(Mean size)를 도시하였다.
도 7은 피부 섬유증을 수반하는 아토피가 유발된 마우스에서 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 귀 피부 조직의 두께가 용량 의존적으로 감소된 결과를 도시한다.
도 8은 피부 섬유증을 수반하는 아토피가 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 후 피부손상 영역 샘플에서 피부 섬유증 원인이 되는 IL-4 mRNA의 변화량을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 9는 HDF 세포주에 대해 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, TGF-β1에 의해 피부 섬유아세포에서 생성이 촉진되는 피부 섬유화와 관련된 α-SMA 단백질의 발현량이 감소한 결과를 도시한다.
도 10은 PKH67로 염색된 엑소좀을 확인한 형광강도 측정 결과를 도시한다.
도 11은 돼지 피부조직 내부로, 형광염색된 엑소좀이 전달된 정도를 확인한 형광현미경 이미지이다.
도 12는 생쥐 피부조직 내부로, 형광염색된 엑소좀이 전달된 정도를 확인한 공초점형광현미경 이미지이다.
도 13은 도 12의 각 이미지 상의 형광강도를 측정하여 얻은 총 형광강도를 비교하여 도시한 그래프이다.
도 14는 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 15는 피부 섬유증의 진행단계를 나타내는 모식도이다(출처 https://link.springer.com/article/10.1186/ar2186).
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다. 또한, HDF(Human dermal fibroblast) 세포 및 배지는 (주)세포바이오 (대한민국 서울특별시 소재)에서 구입하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.
엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제
실시예 1에서 0.22 ㎛ 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 이용하여 엑소좀을 분리, 농축하기 전 배양액을 초음파처리(sonication)하여 잠재적인 엑소좀의 덩어리를 풀어주었다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff;MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다. 트레할로오스 처리에 따라 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 수득할 수 있는 효과를 확인한 결과는 도 6에 도시하였다.
실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석
분리된 엑소좀, 배양액, 및 TFF 분리과정의 분획물에서 단백질의 양은 BCA 발색법(ThermoFisher Scientific에서 구입) 또는 플루오로프로파일(FluoroProfile) 형광법(Sigma에서 구입)을 이용하여 측정하였다. 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀이 분리, 농축되고 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등이 제거되는 정도는 단백질 정량법에 의하여 모니터링하여 그 결과를 도 2에 도시하였다. 그 결과 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 효과적으로 배양액에 존재하는 단백질이 제거됨을 알 수 있었다.
본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀을 분리하는 경우 생산성과 순도를 독립적인 다섯 배치에서 비교한 결과를 도 3에 도시하였다. 독립적인 다섯 배치로부터 얻어진 결과를 분석한 결과, 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 안정적으로 엑소좀을 분리할 수 있음을 확인하였다.
분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis: NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing:TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 도 4에 도시하였다.
TFF 방법으로 엑소좀을 분리한 후, 트레할로오스의 첨가 여부에 따른 엑소좀의 크기 분포를 NTA 분석한 결과를 도 5에 도시하였다. 트레할로오스 농도를 0 중량%, 1 중량% 및 2 중량%로 증가시켰고(도 5의 위에서부터 아래), 3회 반복하여 실험하였다. 트레할로오스가 존재하지 않은 경우 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 확인되는 반면, 트레할로오스의 첨가량을 늘려주면 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 줄어들고 엑소좀의 크기 분포가 균일해지는 것을 확인하였다.
TFF 방법으로 엑소좀을 분리하는 과정에 트레할로오스의 첨가에 따른 효과를 추가로 조사하였다. 도 6에서 보는 바와 같이 TFF 전과정에 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가한 경우, 균일한 크기 분포를 갖는 엑소좀을 얻을 수 있었다(도 6A). 반면 트레할로오스를 첨가하지 않고 동결 보관하였던 배양액을 사용하되, 탈염과 버퍼교환 과정에서만 트레할로오스를 첨가하여 TFF 과정을 진행한 경우나, 트레할로오스를 전혀 첨가하지 않고 TFF 과정을 진행한 경우, 크기가 큰 입자가 많이 포함된 불균일한 엑소좀을 얻었다(도 6B 및 도 6C).
분리된 엑소좀의 상대적인 생산성과 농도를 비교한 결과, TFF 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 매우 높은 생산성으로 엑소좀을 얻을 수 있었으며, 얻어진 엑소좀의 농도도 5배 이상 높았다(도 6D). NTA 분석 결과에서 나타난 바와 같이, 분리된 엑소좀의 평균 크기도 TFF 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 200 nm로 균일하게 확인되었다(도 6E).
도 4D는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD9 (Abcam에서 구입), 항-CD63 (System Biosciences에서 구입), 항-CD81 (System Biosciences에서 구입), 및 항-TSG101 (Abcam에서 구입)을 사용하였다.
도 4E는 본 발명의 일 구체예의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD63에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD63 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
상기 결과들을 종합하면, 본 발명의 일 구체예의 분리방법은 접선흐름여과를 이용한 분리 및/또는 정제 과정에서 트레할로오스를 첨가하여 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 분리 및 정제할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 분리방법의 공정들은 스케일-업이 가능하고 GMP에도 적합함을 알 수 있었다.
실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정
인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 세포를 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.
비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 본 발명의 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 14).
실시예 5: 동물모델 1
수컷 NC/Nga 생쥐 (16-18g, 5주령; 중앙실험동물에서 구입)를 구매하여 7일 동안의 적응기를 통해 본 실험에 사용하였다. 적응기를 거친 생쥐는 피부 섬유증을 수반하는 피부염 유발 후 아래와 같이 각각 5군으로 분류하였다.
(1) Normal: 정상 대조군
(2) Vehicle (피부염 유발군): 집먼지 진드기 추출물로 피부 섬유증을 수반하는 피부염을 유발한 음성 대조군
(3) IV: 집먼지 진드기 추출물로 피부 섬유증을 수반하는 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 개체 당 2.8 ㎍의 용량으로 주 3회씩 2주간 혈관 내 투여(IV: intravenous injection)한 실험군
(4) SC: 집먼지 진드기 추출물로 피부 섬유증을 수반하는 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 개체 당 2.8 ㎍의 용량으로 주 3회씩 2주간 피하 투여(SC: subcutaneous injection)한 실험군
(5) Pred: 집먼지 진드기 추출물로 피부 섬유증을 수반하는 피부염 유발 후 프레드니솔론(prednisolone)을 매일 경구투여한 실험군
NC/Nga 마우스(중앙실험동물에서 구입)의 귓바퀴부분을 면도기로 제모한 후, 제모제를 적량 도포하여 제모하였다. 제모제를 닦아낸 후 AD 유발시약(집먼지 진드기 추출물; BioStir Inc.에서 구입)을 마이크로 파이펫 팁(micro pipet tip)을 이용하여 귓바퀴 부분에 균일하게 도포하였다. 필요에 따라 면도기로 제모한 후, 4% SDS 수용액 150 μL를 마이크로 파이펫 팁(micro pipet tip)을 이용하여 귓바퀴부분에 균일하게 도포하였다. 드라이어를 이용하여 냉풍으로 건조시킨 후, 약 2-3 시간 동안 자연건조시킨 다음, AD 유발시약을 마이크로 파이펫 팁(micro pipet tip)을 이용하여 귓바퀴 부분에 균일하게 도포하였다. 모든 전 처리는 1주간 2회, 총 3주간 6회 처리로 진행하였다.
실시예 2에서 준비된 엑소좀 투여개시 전 피부 임상지수 평가를 실시하여 순위화한 점수에 따라 각 군의 평균 점수가 최대한 균일하게 분포하도록 무작위법으로 분배하여 군을 분리하였다.
실시예 6: 동물모델 2
엑소좀의 용량 의존적인 효과를 확인하기 위하여 실시예 5에서와 같이 피부 섬유증을 수반하는 피부염을 유발한 후 아래와 같이 9군으로 분류하였다.
(1) Normal: 정상 대조군 (도 7에서 "N"으로 표기)
(2) Control (피부염 유발군): 집먼지 진드기 추출물로 피부 섬유증을 수반하는 피부염을 유발한 음성 대조군 (도 7에서 "C"로 표기)
(3) IV, L (exosome, low): 집먼지 진드기 추출물로 피부 섬유증을 수반하는 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 개체 당 0.14 ㎍의 용량으로 주 3회씩 4주간 혈관 내 투여(IV: intravenous injection)한 실험군
(4) IV, M (exosome, medium): 집먼지 진드기 추출물로 피부 섬유증을 수반하는 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 개체 당 1.4 ㎍의 용량으로 주 3회씩 4주간 혈관 내 투여(IV: intravenous injection)한 실험군
(5) IV, H (exosome, high): 집먼지 진드기 추출물로 피부 섬유증을 수반하는 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 개체 당 10 ㎍의 용량으로 주 3회씩 4주간 혈관 내 투여(IV: intravenous injection)한 실험군
(6) SC, L (exosome, low): 집먼지 진드기 추출물로 피부 섬유증을 수반하는 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 개체 당 0.14 ㎍의 용량으로 주 3회씩 4주간 피하 투여(SC: subcutaneous injection)한 실험군
(7) SC, M (exosome, medium): 집먼지 진드기 추출물로 피부 섬유증을 수반하는 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 개체 당 1.4 ㎍의 용량으로 주 3회씩 4주간 피하 투여(SC: subcutaneous injection)한 실험군
(8) SC, H (exosome, high): 집먼지 진드기 추출물로 피부 섬유증을 수반하는 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 개체 당 10 ㎍의 용량으로 주 3회씩 4주간 피하 투여(SC: subcutaneous injection)한 실험군
(9) Pred: 집먼지 진드기 추출물로 피부 섬유증을 수반하는 피부염 유발 후 프레드니솔론(prednisolone)을 매일 경구투여한 실험군 (도 7에서 "P"로 표기)
피부 섬유증을 수반하는 피부염 유발은 실시예 5에서와 같이 진행하였으며, AD 유발시약을 과량으로 도포하여 엑소좀을 투여하는 시점에서 평균 피부 임상지수가 9가 되도록 하였다. 실시예 2에서 준비된 엑소좀 투여개시 전 피부 임상지수 평가를 실시하여 순위화한 점수에 따라 각 군의 평균 점수가 최대한 균일하게 분포하도록 무작위법으로 분배하여 군을 분리하였다. 도 7A의 상단 및 중단은 아토피가 유발된 마우스 사진(Day 0)과 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 처리에 의해 용량 의존적으로 아토피 증상이 완화된 것(Day 28)을 보여주는 사진들이다.
도 7A의 하단은 귀 피부 조직의 절편(section)을 H&E로 염색한 결과이다. 희생시킨 생쥐의 귀 피부 조직을 H&E로 염색한 후 귀 피부 조직의 두께를 측정하였다. 도 7B는 (2)~(9)의 각 실험군에서 측정된 귀 피부 조직의 두께를 (1)의 정상군과 비교하여 도시한 그래프로서, 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 군(IV 및 SC)에서 귀 피부 조직의 두께가 용량 의존적으로 감소한 것을 확인하였다.
상기 실험을 통하여 본 발명의 엑소좀이 처리된 군(IV 및 SC)에서 섬유화되어 두꺼워진 피부 조직의 두께가 용량 의존적으로 감소되어 피부 섬유증을 효과적으로 개선할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7: 사이토카인 mRNA 발현량 측정
본 발명의 엑소좀이 피부 섬유증을 억제 및 완화시키는 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여 IL-4 mRNA 발현 수준을 분석하였다. IL-4는 상처 치유 및 섬유화를 촉진하여 피부 섬유증을 유발하는 것으로 알려져 있다(대한민국 공개특허공보 제10-2016-0040452호 참조). 따라서, 후보물질 처리 후 피부 조직이나 혈액 내의 IL-4의 생성량이나 발현량을 분석하면 피부 섬유증의 억제 및 완화에 대한 효능을 평가할 수 있다.
우선, 실시예 5의 동물모델 1 및 실시예 6의 동물모델 2를 희생시키고 피부 섬유증 부위의 조직을 적출하였다. 그리고 나서, 동물모델 1로부터 적출된 조직으로부터 얻은 총 RNA로부터 cDNA를 제조하고 리얼타임 PCR 방법을 이용하여 피부 섬유증의 주요 원인이 되는 IL-4의 mRNA 변화량을 측정하였다. 또한, 동물모델 2로부터 적출된 조직으로부터 얻은 총 RNA로부터 cDNA를 제조하고 리얼타임 PCR 방법을 이용하여 피부 섬유증의 주요 원인이 되는 IL-4의 mRNA 변화량을 측정하였다. IL-4 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로서 GAPDH 유전자를 사용하였다. 리얼타임 PCR에 사용한 프라이머의 종류와 서열은 하기 표 1과 같다.
| 유전자 | 서열 | |
| 정방향 프라이머 (5' → 3') | 역방향 프라이머 (5' → 3') | |
| IL-4 | ACA GGA GAA GGG ACG CCA T (서열번호 1) | GAA GCC CTA CAG ACG AGC TCA (서열번호 2) |
| GAPDH | CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA (서열번호 3) | CCT GCT TCA CCA CCT TCT TGA T (서열번호 4) |
상기 동물모델 1에 대한 실험을 통하여 본 발명의 엑소좀이 처리된 군(IV 및 SC)에서 피부 섬유증의 원인이 되는 IL-4의 발현량이 감소하는 것을 확인하였고(도 8A), 상기 동물모델 2에 대한 실험을 통하여 본 발명의 엑소좀이 처리된 군(IV 및 SC)에서 피부 섬유증의 원인이 되는 IL-4의 발현량이 용량 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 8B). 따라서, 본 발명의 엑소좀은 피부 섬유증을 일으키는 주요 표적인 IL-4에 대해 작용하여 피부 섬유증을 억제 및 완화시킬 수 있을 것으로 기대된다.
실시예 8: HDF 세포주를 이용한 α-SMA 단백질의 발현량 측정
HDF 세포를 10% FBS를 포함한 배지 ((주)세포바이오에서 구입)에 현탁시킨 후 6웰 플레이트 (6-well plate)의 각 웰에 1.5×105의 밀도로 분주하였다. 24시간 배양 후 부착된 HDF 세포를 PBS로 2회 세척하였고, 도 9에 도시된 실험군 분류에 따라 무혈청 배지에서 TGF-β1 (R&D systems에서 구입) 및 본 발명의 엑소좀(실시예 2에서 준비된 엑소좀)을 처리하여 72시간 배양하였다. 각 실험군에서의 α-SMA 단백질의 발현량을 α-SMA 항체(Abcam, Cambridge, MA)를 이용한 웨스턴 블랏을 통해 측정하였다. 단백질의 양은 표준 물질인 BSA(bovine serum albumin)를 사용한 BCA 방법으로 정량하였다. 각 실험군에서의 α-SMA의 발현 수준은 GAPDH 발현 수준으로 정규화(normalization)하여 보정하였다.
그 결과, 본 발명의 엑소좀은 TGF-β1에 의해 매개되는 피부 섬유화와 관련된 α-SMA 단백질의 발현량을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 엑소좀은 TGF-β1 매개 피부 섬유화를 억제 및 완화시킬 수 있다.
실시예 9: 엑소좀의 피부 투과 능력 시험
형광염색된 엑소좀을 제조하기 위하여 PKH67 염료(Sigma에서 구입)를 사용하였다. 1 mM의 PKH67을 Diluent C (Sigma에서 구입)에 희석하여 10 μM의 PKH67 용액을 제조한 후, 적정 농도의 엑소좀 용액과 혼합하여 상온에서 빛을 차단한 상태로 10분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, PKH67로 염색된 엑소좀(이하, "PKH-엑소좀"으로 약칭)으로부터 잔여 PKH67 염료를 제거하기 위하여 MW3000 스핀 컬럼(ThermoFisher Scientific에서 구입)을 사용하였다. 형광측정기(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 확인한 결과 엑소좀과 반응하지 않은 PKH67을 제거한 후, PKH-엑소좀에서 충분한 강도의 형광이 검출됨을 확인하였다(도 10).
PKH-엑소좀을 적정 농도, 예를 들어 1×105 입자/mL 내지 1×109 입자/mL 농도로 인산완충용액(PBS)에 분산시킨 후, 돼지 피부조직의 피부 바깥면에 도포하였다. 도포된 PKH-엑소좀의 건조를 막기 위하여 부직포를 덮어 준 후 적정 시간, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 반응시켜 PKH-엑소좀이 피하 조직에 전달되도록 하였다. 또한, PKH-엑소좀을 돼지 피부 바깥면에 도포하고 부직포를 덮어 준 후, 일정 시간, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 미세 전류를 흘려주었다. 반응이 종료된 후, 돼지 피부조직을 3.7% 포름알데히드 용액에 담궈 하룻밤 동안 반응시키고, 인산완충용액으로 5분씩 3회 세척하였다. 세척된 돼지 피부조직을 30% 수크로오스 용액에 담가 처리한 후, OCT 화합물을 처리하였다. 다시 인산완충용액으로 5분씩 3회 세척한 후, 마이크로톰을 이용하여 종단면으로 절편을 제작하여 슬라이드글라스 위에 조직 절편을 위치시켰다. 한편 조직 절편의 제작은 포름알데히드 용액으로 조직을 고정하기 전에 진행할 수도 있다. 조직 절편에서 PKH-엑소좀으로부터 검출되는 형광은 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 이상의 방법으로 돼지 피부조직의 표피를 투과하여 피하 조직으로 전달된 PKH-엑소좀을 확인하였다(도 11). 도 11에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 엑소좀은 피부장벽을 효과적으로 통과하여 피부조직 내부로 깊숙이 전달될 수 있고, 피부에 대해 효과적으로 흡수될 수 있다.
따라서, 상기 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 또는 화장료 조성물은 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료 등에 있어서, 효과적으로 작용할 것으로 기대된다.
다음으로, 헤어리스 마우스의 피부조직을 적출하여 프란츠 확산셀(Franz Diffusion Cell)의 챔버 위쪽에 위치시켰다. 이때, 확산셀의 내부는 인산완충용액으로 채워주었다. PKH-엑소좀을 적정 농도, 예를 들어 1×105 입자/mL 내지 1×109 입자/mL 농도로 인산완충용액(PBS)에 분산시킨 후, 생쥐의 피부조직 바깥쪽에 도포하였다. 이때, PKH-엑소좀의 건조를 막기 위하여 부직포를 생쥐 피부조직 바깥쪽에 미리 위치시키고, 부직포와 피부조직 사이에 PKH-엑소좀을 주입하였다. 그 후 30분 내지 1시간 동안 반응시켰다. 또한, PKH-엑소좀을 부직포와 피부조직 사이에 주입한 후, 일정 시간, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 미세 전류를 흘려주었다. 반응이 끝난 후, 즉시 공초점형광현미경(Leica, SP8X)을 이용하여 피부조직 내부로 전달된 PKH-엑소좀을 확인하거나, 1시간 내지 6시간 동안 피부조직과 PKH-엑소좀 용액을 추가로 반응시킨 후, 공초점형광현미경으로 PKH-엑소좀을 확인하였다. 이상의 방법으로 확인한 결과, 본 발명의 엑소좀은 피부장벽을 효과적으로 통과하여 피부조직 내부로 깊숙이 전달될 수 있고, 피부에 대해 효과적으로 흡수될 수 있다(도 12 및 도 13).
따라서, 상기 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 또는 화장료 조성물은 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료 등에 있어서, 효과적으로 작용할 것으로 기대된다.
실시예 10: 본 발명의 엑소좀을 포함하는 화장료 조성물의 제조
상기 실시예 2에서 준비된 1704 μg/mL 농도의 엑소좀을 하기 표 2에 기재된 성분들과 혼합하여 현탁한 후 화장료 조성물(로션)을 제조하였다. 각 성분의 함량은 하기 표 2와 같다.
| 성분 | 함량 (중량%) |
| 실시예 2에서 준비된 엑소좀 | 1 |
| 글리세린 | 7.375 |
| 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 | 6 |
| 세틸 에틸헥사노에이트 | 5 |
| 프로판디올 | 5 |
| 페닐 트리메티콘 | 3.5 |
| 스테아르산 | 3 |
| 1,2-헥산디올 | 2 |
| 판테놀 | 2 |
| 세테아릴 올리베이트 | 1.8 |
| 소르비탄 올리베이트 | 1.2 |
| 디이소스테아릴 말레이트 | 1 |
| 프룩탄 | 1 |
| 암모늄 아크릴로일디메틸타우레이트/VP 코폴리머 | 0.3 |
| 아라키딜 알코올 | 0.25 |
| 베헤닐 알코올 | 0.15 |
| 아라키딜 글루코사이드 | 0.1 |
| 하이드로제네이티드 레시틴 | 0.1 |
| 시어버터 | 0.09 |
| 잔탄검 | 0.05 |
| 라벤더 오일 | 0.02 |
| 베르가모트 오일 | 0.02 |
| 세라마이드 NP | 0.02 |
| 오렌지껍질 오일 | 0.02 |
| 피토스핑고신 | 0.015 |
| 팔미토일 테트라펩타이드-7 | 0.01 |
| 팔미토일 트리펩타이드-1 | 0.01 |
| 정제수 | 잔량 |
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
<110> ExoCoBio Inc.
<120> A composition comprising an exosome derived from stem cell as an
active ingredient and its application for improving skin fibrosis
<130> P18-0042KR
<150> KR 10-2017-0083507
<151> 2017-06-30
<150> KR 10-2018-0063745
<151> 2018-06-01
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-4 forward primer
<400> 1
acaggagaag ggacgccat 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-4 reverse primer
<400> 2
gaagccctac agacgagctc a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH forward primer
<400> 3
catggccttc cgtgttccta 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH reverse primer
<400> 4
cctgcttcac caccttcttg at 22
Claims (21)
- 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 엑소좀은 하기의 단계들을 수행하여 수득되는, 약학 조성물:
(a) 줄기세포 배양액에 트레할로오스를 첨가하는 단계, (b) 상기 트레할로오스가 첨가된 줄기세포 배양액을 여과하는 단계, (c) 상기 여과된 줄기세포 배양액으로부터, TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 엑소좀을 분리하는 단계, 및 (d) 탈염과 버퍼교환(diafiltration)에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하고, 상기 트레할로오스가 첨가된 완충용액을 이용한 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여, 상기 분리된 엑소좀에 대한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하는 단계. - 제2항에 있어서,
상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물. - 제2항에 있어서,
시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물. - 제2항에 있어서,
TFF(Tangential Flow Filtration)를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da, 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 ㎛ TFF 필터를 사용하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 (c) 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함하는, 약학 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 여과된 줄기세포 배양액은 TFF 전에 초음파처리(sonication)되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 엑소좀은 피부조직 또는 피부세포에서 IL-4 및 α-SMA의 발현량을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물. - 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 피부외용제.
- 제9항에 있어서,
상기 엑소좀은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합되어 있는, 피부외용제. - 제10항에 있어서,
상기 하이드로겔은 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔인 것을 특징으로 하는, 피부외용제. - 제11항에 있어서,
상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종이고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인 것을 특징으로 하는, 피부외용제. - 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화 또는 개선용 화장료 조성물.
- 제13항에 있어서,
패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더 및 기름 종이로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 형태에 적용하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물. - 제14항에 있어서,
패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물. - (a) 제13항에 기재된 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함하는, 치료용을 제외한 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법.
- 제16항에 있어서,
(c) 상기 화장료 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흐르게 하여 이온토포레시스(iontophoresis)를 수행하는 것을 더 포함하는, 미용방법. - 제17항에 있어서,
이온토포레시스 장치를 상기 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착시키는 것을 더 포함하는, 미용방법. - 제18항에 있어서,
상기 이온토포레시스 장치는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하거나, 상기 적어도 1종의 전지가 장착된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포함하는, 미용방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 약학 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
- 제20항에 있어서,
상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지인, 피부 섬유증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021096089A1 (ko) * | 2019-11-15 | 2021-05-20 | 주식회사 엑소코바이오 | 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 새로운 조성물 |
| KR20210059599A (ko) * | 2019-11-15 | 2021-05-25 | 주식회사 엑소코바이오 | 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 새로운 조성물 |
| WO2021114164A1 (zh) * | 2019-12-12 | 2021-06-17 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种外泌体及其制备方法及应用 |
| CN113462632A (zh) * | 2021-08-13 | 2021-10-01 | 徐州医科大学 | 一种苦瓜外泌体、提取方法及在制备治疗烧烫伤皮肤药物中的应用 |
| KR20240016207A (ko) | 2022-07-28 | 2024-02-06 | 주식회사 셀투인 | 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀 및 이의 용도 |
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2018
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| KR20210065925A (ko) * | 2019-11-15 | 2021-06-04 | 주식회사 엑소코바이오 | 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 새로운 조성물 |
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| CN113462632B (zh) * | 2021-08-13 | 2023-08-29 | 徐州医科大学 | 一种苦瓜外泌体、提取方法及在制备治疗烧烫伤皮肤药物中的应用 |
| KR20240016207A (ko) | 2022-07-28 | 2024-02-06 | 주식회사 셀투인 | 클로렐라 배양액 유래의 엑소좀 및 이의 용도 |
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