CN113462632B - 一种苦瓜外泌体、提取方法及在制备治疗烧烫伤皮肤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种苦瓜外泌体、提取方法及在制备治疗烧烫伤皮肤药物中的应用，提取步骤如下：S1、取新鲜云南山野苦瓜，摘除根茎，水洗，待水分干后，切开去籽，榨汁；S2、将榨出的苦瓜汁连续离心；离心后取上清，弃沉淀，将上清液继续进行超速离心，离心后弃上清，得沉淀悬液；S3、在离心管中依梯度加好蔗糖溶液，在最上层加入所得沉淀悬液，然后超速离心；S4、离心结束后分别收集分层置入清洗后的离心管中，加入冰PBS溶液后混合均匀，离心，用1‑3ml PBS溶液重悬沉淀后用滤膜过滤，取滤液分装。本发明的提取方法利用蔗糖梯度纯化，能够大大提高纯度和得率；提取的苦瓜外泌体能用于制备治疗烧烫伤皮肤药物，对皮肤深Ⅱ度烫伤有明显修复作用，修复后无疤痕。

Description

一种苦瓜外泌体、提取方法及在制备治疗烧烫伤皮肤药物中 的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种苦瓜外泌体、提取方法及在制备治疗烧烫伤皮肤药物中的应用。

背景技术

烧烫伤是指因皮肤接触火焰、蒸气及高热金属而导致的热效应性损伤，也是人们生活和工作中最常见的意外伤害之一，烧烫伤引起的皮肤损伤，不仅会破坏皮肤的天然屏障作用，还会导致内环境紊乱、代谢失常等不良后果，危重症者全身多个脏器系统都有不同程度的损害，危及生命。烫伤创面的愈合及治疗过程比较复杂、时间较长，烫伤创面愈合后可留有疤痕挛缩和功能障碍等后遗症，是一种复杂和严重的外伤性疾病。因此，在烫伤早期早期阶段采取恰当的药物进行治疗对于伤口的愈合康复、避免感染等显得尤为重要。

根据烫伤后皮肤创面受损的范围和深度，可将烫伤分为Ⅰ度烫伤、浅Ⅱ度烫伤、深Ⅱ度烫伤、Ⅲ度烫伤四种类型。其中，深Ⅱ度烫伤模型是科研过程中最常建立、最常研究的模型。正常皮肤构造主要包含两大重要成分：表皮和真皮。表皮中有丰富的角质细胞，真皮较厚，富含维持皮肤机械强度的细胞外基质蛋白，如胶原I和弹性蛋白。深Ⅱ度烫伤皮肤的损伤包括整个表皮的损伤并伤及到乳头层以下真皮层，但仍残留有部分真皮。深Ⅱ度烫伤的创面修复是涉及多个生物学的、比较复杂的一系列过程，包括炎症反应期、肉芽组织形成期、组织重塑期这主要的三大时期。其愈合的过程依赖于残存上皮细胞的迁移和增殖，以及成纤维细胞、炎症细胞、细胞外基质成分的共同参与。

外泌体是指包含了复杂微小RNA（miRNA）和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。许多植物中发现含蛋白质和miRNA的外泌体样纳米粒子，这些植物外泌体由于缺乏毒性，有大规模生产的可能性，其内在特性具有携带药物或miRNA分子等其他化合物的可能性。植物外泌体的直径约40～150 nm，具有磷脂双分子层结构，呈茶托状或杯状，由大量脂质、包括mi RNA和蛋白质组成。植物外泌体含有较为丰富的miRNA，该RNA是高效的基因表达调控因子，其不仅在原始系统内执行生物学功能，还可进行跨界基因表达调控，在生物体中发挥重要的作用。研究表明，植物外泌体具有抗炎、抗病毒、抗纤维化、抗肿瘤等作用，还能参与病原体侵袭的防御反应。然而，目前还未见有利用植物外泌体，尤其是苦瓜外泌体来治疗、修复烫伤皮肤的报道。

发明内容

针对现有技术中的不足之处，本发明提供一种苦瓜外泌体、提取方法及在制备治疗烧烫伤皮肤药物中的应用。

为了达到上述目的，本发明技术方案如下：一种苦瓜外泌体的提取方法，包括以下步骤：

S1、取适量克数的新鲜云南山野苦瓜，摘除根茎，用自来水洗三遍后再用蒸馏水洗三遍，每遍约2-3min，待水分干后，切开去籽，榨汁；

S2、将榨出的苦瓜汁连续离心，于4℃，1000 g，10 min；3000 g，20 min；10000 g，40 min；离心后取上清，弃沉淀，将上清液继续进行超速离心，于超速冰冻离心机4℃，150000 g，离心90 min，离心后弃上清，得沉淀悬液；

S3、在离心管中依梯度加好蔗糖溶液，在最上层加入步骤S2所得沉淀悬液，然后于150000g下超速离心120min；

S4、离心结束后分别收集分层置入清洗后的离心管中，加入冰PBS溶液后混合均匀，于超速冷冻离心机中，150000 g，离心90 min，用1-3ml PBS溶液重悬沉淀后用滤膜过滤，取滤液分装。

优选地，步骤S3中浓度梯度为：8%、30%、45%、60%。

优选地，步骤S4中采用0.22um的滤膜进行过滤。

本发明还提供由上述方法提取到的苦瓜外泌体。

本发明还提供由上述方法提取到的苦瓜外泌体在制备治疗烧烫伤皮肤药物中的应用。

本发明还提供由上述方法提取到的苦瓜外泌体在制备治疗皮肤深Ⅱ度烫伤药物中的应用。

将提取到的苦瓜外泌体涂抹烫伤处作为治疗深Ⅱ度烫伤的实验组药物，以美宝湿润烧伤膏作为阳性对照组和生理盐水作为模型阴性对照组组，观察苦瓜外泌体对大鼠烫伤创面愈合的疗效，实验显示苦瓜外泌体对皮肤深Ⅱ度烫伤有明显修复作用，主要体现在：

1、能有效缓解皮肤皱缩现象，从14天起，实验组创面皱缩现象较模型组及阳性对照组显著改善，皮肤平整，不易形成凸起性疤痕。

2、烧(烫)伤创面愈合面积百分比是评价创面愈合的综合性指标，实验中苦瓜外泌体可明显提高创面愈合面积百分比，缩短创面愈合时间，加速创面愈合。

3、 实验组皮肤组织的表皮角质细胞标志蛋白CK19表达前期多于其他对照组，表明初期烫伤创面组织恢复早，缓解后期皮肤组织的肉芽组织增生情况，避免增生性疤痕，促进愈合。

4、实验组皮肤组织的新生血管标记物CD31表达前期与其余组基本相似，但后期表达量多于其他组，表明后期皮肤内新生血管的生长，各组织的修复，与HE结果相同。

有益效果：（1）本发明的提取方法利用蔗糖梯度纯化，能够大大提高纯度和得率；（2）所得的苦瓜外泌体能有效缓解皮肤皱缩现象；可明显提高创面愈合面积百分比，缩短创面愈合时间，加速创面愈合；有利于后期皮肤内新生血管的生长；有利于初期的烫伤创面组织恢复，缓解后期皮肤组织的肉芽组织增生情况，避免增生性疤痕，促进愈合；（3）创面愈合后无疤痕。

附图说明

图1为本发明实施例1的苦瓜外泌体提取流程图；

图2为实施例2中各组大鼠创面不同时期愈合过程外观对比分析图；

图3为实施例2中各组大鼠皮肤深Ⅱ度烫伤模型HE染色图；

图4为实施例2中各组大鼠不同时期病理切片HE染色图；

图5为实施例2中各组大鼠不同时期组织免疫荧光染色分析图（CK19）；

图6为实施例2中各组大鼠不同时期组织免疫荧光染色分析图（CD31）。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：如图1所示，一种苦瓜外泌体的提取方法，包括以下步骤：

S1、取适量克数的新鲜云南山野苦瓜，摘除根茎，用自来水洗三遍后再用蒸馏水洗三遍，每遍约2-3min，待水分干后，切开去籽，榨汁；

S2、将榨出的苦瓜汁连续离心，于4℃，1000 g，10 min；3000 g，20 min；10000 g，40 min；离心后取上清，弃沉淀，将上清液继续进行超速离心，于超速冰冻离心机4℃，150000 g，离心90 min，离心后弃上清，得沉淀悬液；

S3、在离心管中依梯度加好蔗糖溶液，浓度梯度为：8%、30%、45%、60%，在最上层加入步骤S2所得沉淀悬液，然后于150000g下超速离心120min；

S4、离心结束后分别收集分层置入清洗后的离心管中，加入冰PBS溶液后混合均匀，于超速冷冻离心机中，150000 g，离心90 min，用1-3ml PBS溶液重悬沉淀后用0.22um的滤膜进行过滤，取滤液分装。

实施例2：苦瓜外泌体在治疗大鼠深Ⅱ度烫伤及皮肤组织修复中的作用

2.1材料

2.1.1 实验动物

健康成年徐州本地大鼠72只，体重（200±20g），全部来自徐州医科大学实验动物中心。动物领回后均养于徐州医科大学医学技术学院大鼠房，恒温（22±4℃）饲养，实验前适应性饲养一周。

2.1.2 实验仪器

（1）ABS动物气体麻醉机：上海玉研

（2）电磁锅：Midea型号 C21-simple103

（3）微量移液器：Gilson

（4）超速冰冻离心机：型号 Optima XPN-100*100

（5）冰冻切片机：型号 Leica CM1950

（6）多功能微孔板（酶标仪）：型号 Synergy2

（7）研究级正置荧光显微镜：型号 Olympus BX43

（8）倒置荧光显微镜：型号 Olympus IX73

（9）微量振荡器：型号 QL-901

（10）超低温冰箱：Thermo

（11）JA2003N 电子天平：上海精密科学仪器

（12）pH酸度计:上海雷磁

（13）脱色摇床：上海西巴斯

2.1.3 实验药品

（1）百多邦莫匹罗星软膏

（2）美宝湿润烧伤膏（MEBO）

（3）苦瓜外泌体（自提）

2.1.4 实验试剂

（1）6%硫化钠溶液：自配

（2）1：5000高锰酸钾溶液：自配

（3）0.9%生理盐水：自配

（4）4%多聚甲醛溶液：自配

（5）PBS：自配

（6）95%乙醇溶液

（7）15%、30%蔗糖溶液：自配

（8）1%盐酸-乙醇液：自配

（9）伊红染液：购买于上海生工生物

（10）苏木素染液：购买于上海生工生物

（11）封闭液

（12）BCA 蛋白检测试剂盒：Beyotime公司

（13）DAPI染色试剂盒：上海臻诺生物

2.1.5 主要试剂配制方法

（1）6%硫化钠溶液

取6g无水硫化钠，溶解后定容至100ml。现配现用。

（2）PBS

取9.6g PBS干粉，用蒸馏水定容至1000ml。保存于4℃冰箱待用。

（3）4%多聚甲醛溶液

0.1 M PB：28.7 g Na2HPO4·12H2O，3 g NaH2PO4·2H2O，定容至1000ml。

40g多聚甲醛用0.1 M PB溶解后，定容至1000 ml，保存于4℃冰箱待用。

（4）1%盐酸-乙醇液

取70%酒精溶液 99 ml，1ml浓盐酸，配制成100 mL浓度为1%的盐酸-乙醇溶液，保存于4℃冰箱待用。

2.2 方法

2.2.1 苦瓜来源的外泌体提取

同实施例1。

2.2.2 大鼠深Ⅱ度烫伤模型的建立

（1）脱毛

大鼠领回适应性饲养一周后，用动物麻醉机麻醉后固定于操作台上，先用推毛剪去除大鼠背部大部分毛发，随后用棉签浸湿6%硫化钠擦拭剪毛区域，直至毛发完全脱落。而后立即用棉球蘸取0.9%的生理盐水擦拭脱毛处皮肤，擦去多余的硫化钠溶液，防止对皮肤产生灼伤。擦拭完后用洁净棉球擦干脱毛处皮肤。

（2）烫伤模型的建立

大鼠脱毛24h后，使用动物麻醉机麻醉后固定于操作台上，依次用1:5000的高锰酸钾溶液和0.9%的生理盐水擦拭脱毛处皮肤。将直径1.5cm大小的砝码置于电热锅中，加水持续煮沸，用镊子夹取砝码迅速用纱布擦干，一端紧贴大鼠背部皮肤持续8s左右，每只大鼠背部造成4个创面。烫伤30分钟后将老鼠分笼饲养，分为3组：模型组、阳性对照组、给药组，分别在创面涂抹相应的药物（模型组：1：5000高锰酸钾溶液清洗创面+0.9%生理盐水冲洗+百多邦；阳性对照组：1：5000高锰酸钾溶液清洗创面+0.9%生理盐水冲洗+百多邦+美宝湿润烫伤膏；给药组：1：5000高锰酸钾溶液清洗创面+0.9%生理盐水冲洗+百多邦+苦瓜来源的外泌体），涂抹完毕后用纱布包扎好伤口放回笼中。每日换药一次，连续给药28天，观察各组大鼠第1、3、7、14、21、28天创面恢复愈合情况（记录创伤面积变化、体重变化、毛发生长情况、疤痕增长程度）。

2.2.3 病理切片及HE染色

在烫伤模型建立1、3、7、14、21、28d天，每组分别取4只大鼠，麻醉后固定在操作台上，剪取各组大鼠烫伤处皮肤组织，用生理盐水冲洗后，分别放入盛有4%多聚甲醛溶液的EP管中固定，放置于4℃冰箱中保存。

皮肤组织经4%多聚甲醛固定24h后，用镊子夹取依次放置于15%、30%的蔗糖溶液中沉糖脱水24h，放置于4℃冰箱中保存待用。

（1）冰冻切片的制作

夹取沉糖后的皮肤组织，修剪成适当的大小，竖立于载物板上，滴加包埋剂将皮肤组织包埋，冰冻后固定于冰冻切片机上。调整切片厚度为20um。蘸取少量PBS涂抹于载玻片上，部分切片组织直接贴片，编号，干后待用；剩余放置于甘油和PBS各50%的混合溶液中，于-20℃保存，方便后续贴片。

（2）HE染色

HE皮肤组织染色步骤详细如下：

① 苏木素染色5-10min；

② 蒸馏水冲洗；

③ PBS 冲洗 30s；

④ 1%盐酸-乙醇分化 30s；

⑤ 弱碱水冲洗 1min 返蓝；

⑥ 95%酒精 20s；

⑦ 蒸馏水冲洗 ；

⑧ 伊红染色30-45s；

⑨ 蒸馏水冲洗；

⑩待载玻片干后，滴取适量的中性树脂，盖上盖玻片，封片。

⑪置于光学显微镜下观察，拍照记录镜下结构。

2.2.4 组织免疫荧光染色

皮肤组织免疫荧光染色步骤详细如下：

（1）取出待用贴片，放置于暗盒中，用免疫组织笔在组织周围画圈。

（2）用PBS冲洗贴片3遍，5min/遍，而后滴加封闭液于贴片上，封闭1h。

（3）封闭后的贴片冲洗3遍，5min/遍，滴加一抗（CK19、CD31均是1:500稀释），4℃孵育过夜。

（4）孵育过夜后取出，复温20min，PBS洗三遍，5min/遍。

以下操作均避光进行：

（5）滴加荧光二抗（CK19、CD31均是1:500稀释），孵育1h。

（6）PBS洗三遍，5min/遍。

（7）DAPI核染色15min。

（8）PBS洗三遍，5min/遍。

（9）倒置荧光显微镜下观察，拍照记录观察结果。

实验结果：

3.1 各组大鼠创面愈合过程外观观察（见图2）

（1）1-3天内各组烫伤创面均发白，给药组和阳性对照组创面有抓痕，且有抓破的伤口，模型组抓伤情况不明显，创面较完好。

（2）3-7天内各组大鼠创面陆续出现一定程度的细菌感染，给药组和阳性对照组结束较早，模型组持续时间较长。各组创伤表面趋于干燥，有较薄的痂层出现，阳性对照组痂层相对给药组和模型组薄。给药组痂皮边缘有皮肤稍皱起，可见创口表面及皮下组织存在收缩趋势。

（3）7-14天内各组结痂明显。模型组相对阳性对照组和给药组痂皮更厚更硬。各组均陆续掉痂，速度模型组快于阳性对照组快于给药组。给药组的创面收缩程度较模型组及阳性对照组小；阳性对照组痂皮脱落组织颜色较红润，触之较软，创面收缩程度较给药组明显；模型组创面周围痂皮脱落暴露组织，红润，有小出血点，创面收缩请况较给药组明显。

（4）14-21天内各组创面再次结痂，给药组痂层最为轻薄。二次结痂时，给药组痂下创面组织收缩程度更为明显，创面面积比第 14 天大幅减小。掉痂后，阳性对照组和模型组有部分痂层脱落不完全，用手触及创面，给药组最为平坦，阳性对照组有些许小突起，模型组最为粗糙。

（5）21-28天内给药组大部分创面组织有微量绒毛生长，阳性对照组有少量老鼠创面组织有毛，模型组基本无。各组创面的皮肤颜色趋于正常周围皮肤颜色，给药组色泽更贴近。

3.2 各组大鼠不同时间点愈合面积

烫伤后第3d给药组的创面愈合率显著高于阳性组和模型组，前14d给药组伤口愈合较快，14-28d期间，模型组和阳性对照组愈合率较高，给药组较为平缓。从总体愈合面积程度来看，给药组创面愈合最好（见表1）。

表1：各组大鼠不同时间点愈合面积统计

组别/天数

N

3d%

7d%

14d%

21d%

28d%

模型组

4

8.28±1.69

33.74±4.01

50.59±8.05

81.75±0.91

87.31±0.37

阳性对照组

4

9.94±4.14

28.71±1.28

51.04±4.72

79.42±2.55

87.03±0.84

给药组

4

18.60±2.48

37.94±1.83

64.38±6.69

85.75±2.75

91.68±1.49

3.3 HE染色检测创面皮肤组织病理学变化

（1）大鼠皮肤深Ⅱ度烫伤模型建立验证

正常的皮肤组织切片HE染色可看到明显的毛囊结构，皮下各层组织结构排列整齐、层次清晰，细胞完整。

见图3，在烫伤24h后取未经任何处理的大鼠烫伤处皮肤，切片，HE染色结果显示：烫伤模型组皮肤表皮破损严重，表层毛囊消失，皮肤附属结构不完整；真皮层大部分组织细胞已经坏死，碎裂的细胞核较多；同时有大量的炎性细胞浸润，只有贴近皮下组织的真皮细胞和皮肤附属结构有少量有核皮肤细胞存在。符合皮肤深Ⅱ度烫伤的病理特征。

（2）各组大鼠不同时期病理切片HE染色结果（见图4）

第3天：各组大鼠皮肤的表皮结构均出现破损，模型组表皮损伤较严重，给药组表皮组织结构相对平整；模型组及阳性对照组的表皮厚度较给药组稍厚，说明两组大鼠皮肤炎症反应导致组织水肿现象较给药组稍严重；各组皮下可见炎性细胞浸润，大部分毛囊、附属腺体消失。

第7天：各组大鼠表皮结构断裂仍较为严重，模型组和阳性对照组炎性细胞浸润依旧较多，给药组相对较少；各组皮肤均不平整出现皱缩现象，给药组痂皮与皮下组织分离较为严重，阳性对照组次之，有掉痂趋势。

第14天：各组掉痂基本结束，新生表皮开始增长；有肉芽组织生长，组织增厚，模型组仍有少量炎性细胞浸润，给药组和阳性对照组基本不见；给药组组织增厚较其他两组明显，可见成纤维细胞及结缔组织，可见毛囊组织有生长趋势。

第21天：给药组表皮较第 14 天平整，过渡较阳性对照组平缓，内部各组织排队趋于整齐；阳性对照组肉芽组织生长明显，组织增厚，表皮可见乳突状小凸起，生长较慢；模型组真皮层较其他两组排列紧凑。

第28天：给药组和阳性对照组皮肤组织结构更趋于完整，均有毛囊生长，但给药组增长趋势更好且表皮更为平整，阳性对照组表皮有些许破损；模型组仍未见有毛囊生长趋势。

3.4各组大鼠不同时期组织免疫荧光染色结果

血管再生和表皮细胞的增长在损伤组织再生中有重要作用，本研究观察了苦瓜外泌体和阳性对照药对损伤组织血管及表皮角质细胞生成的影响。

CK19为分子量44kD的表皮角质细胞标志蛋白，是构成细胞骨架的一类中间丝状物，对于干细胞向表皮细胞分化有重要作用。对皮肤组织表达角蛋白19（CK19）荧光染色后检测发现，苦瓜外泌体对表皮角质细胞生长的促进作用要好于阳性对照组，CK19表达阳性的表皮角质细胞的数量较其它对照组呈上调趋势，2-3周左右其治疗的损伤皮肤组织表皮有大量的角质细胞覆盖，新生皮肤生长情况好于其余组，见图5。提示表皮干细胞在分化为上皮角质细胞的同时可能还进行自我的复制。

血小板-内皮细胞黏附分子1(PECAM-1）又称CD31，主要存在于血管内皮组织，参与维持血管壁屏障的完整性，且是血管内皮分化的标志，CD31在创面修复过程中能客观、直接地反映创面血管生成及愈合程度。对新生血管标记 CD31 的表达检测发现，苦瓜外泌体对于促进损伤组织新生血管生长，前期与阳性对照药相似，无明显的促进生长效果；在后期，效果比较显著，血管生长情况好于阳性对照组及模型组，见图6。

结论：经实验证实苦瓜外泌体对皮肤深Ⅱ度烫伤有明显修复作用，主要体现在：

1、能有效缓解皮肤皱缩现象，从14天起，实验组创面皱缩现象较模型组及阳性对照组显著改善，皮肤平整，不形成凸起性疤痕。

2、烧(烫)伤创面愈合面积百分比是评价创面愈合的综合性指标。在本实验中苦瓜外泌体可明显提高创面愈合面积百分比，缩短创面愈合时间，加速创面愈合。

3、 实验组皮肤组织的CK19表达前期多于其他对照组，有利于初期的烫伤创面组织恢复，缓解后期皮肤组织的肉芽组织增生情况，避免增生性疤痕，促进愈合。

4、实验组皮肤组织的CD31表达前期与其余组基本相似，但后期表达量多于其他组，有利于后期皮肤内新生血管的生长，各组织的修复，与HE结果相同。

Claims (2)

1.苦瓜外泌体在制备治疗皮肤深Ⅱ度烫伤药物中的应用，其特征在于，所述苦瓜外泌体通过以下步骤提取：

S1、取适量克数的新鲜云南山野苦瓜，摘除根茎，用自来水洗三遍后再用蒸馏水洗三遍，每遍2-3min，待水分干后，切开去籽，榨汁；

S2、将榨出的苦瓜汁连续离心，于4℃，1000g，10 min；3000 g，20 min；10000 g，40min；离心后取上清，弃沉淀，将上清液继续进行超速离心，于超速冰冻离心机4℃，150000g，离心90 min，离心后弃上清，得沉淀悬液；

S3、在离心管中依梯度加好蔗糖溶液，在最上层加入步骤S2所得沉淀悬液，然后于150000g下超速离心120min；

S4、离心结束后分别收集分层置入清洗后的离心管中，加入冰PBS溶液后混合均匀，于超速冷冻离心机中，150000 g，离心90 min，用1-3mL PBS溶液重悬沉淀后用滤膜过滤，取滤液分装。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤S3中蔗糖浓度梯度为：8%、30%、45%、60%。