RU2717088C1 - Способ получения ацеллюлярного дермального матрикса - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано в реконструктивной хирургии для создания технологии получения и использования в практических целях биоинженерного матрикса в качестве трансплантата. Для этого осуществляют забор свиной дермы толщиной 3 мм после предварительного снятия эпидермиса дерматомом, далее образцы замораживают до температуры -80°С, после разморозки образцы заливают раствором Трипсин-Версена и помещают в шейкер-инкубатор в режиме 100 об/мин при 37°С на 18 часов; на втором этапе образцы помещают на вращающуюся платформу в режиме 170 об/мин и подвергают последовательному циклическому воздействию растворов детергентов: 1% раствора Тритона X100 в течение 2 часов и 4% раствора дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002 М Na2-ЭДТА в течение 2 часов, общее число циклов обработки равняется 5. После каждого детергента образцы промывают в деионизированной воде в течение 10 минут. На третьем этапе следует обработка образцов раствором свиной панкреатической ДНКазы I (2000 ЕД растворяли в 200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием) в шейкер-инкубаторе в режиме 100 об/мин при 37°С в течение 4 часов. Завершают децеллюляризацию воздействием 10% раствора хлоргексидина биглюконата в фосфатном буфере в течение 24 часов со сменой раствора каждые 6 часов. После этого подтверждают качество децеллюляризации методами гистологического исследования, молекулярно-биологического анализа и культуральными методами. Способ позволяет сократить время экспозиции воздействия децеллюляризирующих растворов, снизить уровень остаточной ДНК в ткани до 60 нг/мг ткани во влажном образце.

Description

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине и может быть использовано в клеточной биологии, молекулярной биологии, реконструктивной хирургии для создания технологии получения и использования в практических целях биоинженерного матрикса в качестве трансплантата.

Кожа является самым большим органом в организме, и выполняет ряд важных функций, прежде всего, барьерную, иммунную, сенсорную, обладает способностью к саморегуляции и рядом других особенностей [Suhail S. et al., 2019]. Потеря целостности кожных покровов из-за травм или болезней может привести к острому физиологическому дисбалансу и, в конечном итоге, к значительной инвалидности или даже смерти [Воусе ST. al., 2018].

Повреждения кожных покровов разнообразны и могут возникать из-за ожогов, травм, или быть обусловлены трофическими нарушениями вследствие венозной гипертензии, артериальной недостаточности, сахарным диабетом и другими причинами, приводящими к изъязвлениям кожи. Ряд наследственных заболеваний, связанных с нарушением структурных белков эпидермиса или дермы, также могут вызывать развитие обширных кожных ран и хронических эрозий [Petrof G. al., 2014].

Как правило, при повреждении кожи происходит ряд сложных биохимических процессов, направленных на заживление раны. В поверхностных ранах, где дефекты ограничены эпидермисом или верхним дермальным слоем, необходима регенерация только эпидермиса, что приводит к быстрому заживлению и минимальному риску образования рубцов. Тем не менее, в ранах, проникающих глубже дермального слоя, с отслоением кожи или подкожно-жировой клетчатки, осложнения, такие как инфекция, развиваются чаще, и рубцы, как правило, остаются даже после полного заживления раны. Длительность процесса заживления ран в действительности имеет тенденцию варьировать у разных людей и зависит от различной степени тяжести повреждения [You HJ. et al., 2014].

Терапевтические вмешательства по восстановлению кожных покровов и функций кожи являются важным долгосрочным направлением как традиционной, так и трансляционной медицины, в которой в последние годы было отмечено ряд ключевых достижений и клинических преимуществ [Petrof G. al., 2014]. Выбор подходящей стратегии заживления ран имеет решающее значение для успешного их закрытия. От данного выбора зависит скорость заживления раневой поверхности, вероятность наступления осложнений и образования рубцов. В настоящее время используются различные методы для закрытия раневых дефектов. В качестве покрытий раневых поверхностей применяют трупные аллотрансплантаты, ксенотрансплантаты, синтетические материалы. Золотым стандартом лечения большинства кожных ран остается аутодермопластика.

Благодаря интеграции инженерных дисциплин с биологическими науками в настоящее время активно развивается регенеративная медицина [Wu SC. al., 2010]. Рассматриваются возможности применения клеточных технологий, дополнительных биологических факторов, которые направлены на стимуляцию регенерации ткани. Проводятся экспериментальные работы по созданию тканеинженерной полноценной кожи [Chua AWC al., 2010]. Такие разработки интересны и, несомненно, могут оказаться полезными особенно в тех случаях, когда имеется значительный дефицит кожных покровов и невозможно выполнить аутодермопластику.

Тканеинженерный подход к созданию искусственных органов включает в себя использование матриксов, стволовых клеток и биологически активных веществ. Одним из методов получения матриксов является децеллюляризация нативной ткани или органа. Выбор оптимального способа получения матрикса является одной из главных задач в тканевой инженерии. С учетом высокой встречаемости ожоговых повреждений кожи, весьма актуальной является разработка способа подготовки материала для создания биоинженерной конструкции кожи.

Известен способ получения дермального матрикса из кожи человека и животных толщиной до 0,38 мм. На первом этапе проводят децеллюляризацию кожного лоскута путем замораживания-оттаивания. Затем кожу погружают в гипертонический раствор натрия хлорида (1М) и перемешивают. Этим достигается деэпителизация кожного лоскута. Второй этап представляет собой децеллюляризацию собственно дермы при помощи детергента додецилсульфата натрия (0,2%). После многократной отмывки физиологическим раствором полученный биоматериал упаковывают, хранят при -80°С в течение 1 года [Хватов В.Б. и соавт. Патент РФ на изобретение №2524619 С2 от 02.04.2013 г. «Способ изготовления дермального матрикса»].

Недостатками данного способа является источник исходного сырья -кожа человека, что требует проведения тщательных исследований с целью исключения потенциальных инфекций у доноров. Такой источник сырья ограничивает возможность получения больших по площади лоскутов. Также недостатком является использование в качестве детергента раствора додецилсульфата натрия, который оказывает повреждающее действие на структуры внеклеточного матрикса дермы.

За ближайший аналог принят способ проведения децеллюляризации кожи свиньи [Сарбаева Н.Н. и соавт. Патент РФ на изобретение RU 2694543 от 09.11.2018 «Способ получения дермального матрикса»], заключающийся в деэпителизации путем многократного замораживания, оттаивания лоскута кожи и обработки его гипертоническим раствором натрия хлорида с последующим помещением в разбавленный 1:9 фосфатный буфер Серенсена. На втором этапе децеллюляризацию продолжали с использованием 2% раствора дезоксихолата натрия в течение 48 часов со сменой раствора каждые 12 часов и обработкой 2% раствором дезоксихолата натрия в комбинации с панкреатической липазой в течение 9 часов со сменой раствора каждые 3 часа. Далее элиминировали из образцов ДНК при помощи раствора ДНК-азы 0,1 мг/мл, приготовленного с использованием трис-HCl буфера рН 6,8 с добавлением 10 мМ магния (II) сульфата и 1,9 мМ кальция (II) хлорида и инкубировали их в емкости без перемешивания при температуре 37°С в течение 9 часов с трехкратной сменой раствора, добиваясь содержания ДНК в контрольных образцах не выше 200 нг/мг. Качество образцов оценивали дополнительно с помощью морфологического исследования путем изготовления гистологических препаратов, окрашенных пикросириусом красным; препараты исследовали, применяя поляризационную микроскопию, и оценивали матрикс на предмет целостности коллагеновых волокон и сохранения их пространственной ориентации; качественный состав дермального матрикса исследовали с применением времяпролетной масспектрометрии с ионизацией электроспреем; достигаемым целевым параметром являлось удаление основного пула клеточных белков (тубулин, аннексии, виментин, кавеолин и т.д.) и идентификация в составе матрикса преимущественно матрисомных белков (декорин, дерматопонтин). При достижении целевых параметров дермальные матриксы подлежали химической стерилизации, упаковке и криоконсервации.

Основными недостатками данного способа является длительность проведения децеллюляризации и многократные циклы заморозки и разморозки, создающие угрозу бактериальной контаминации каркаса, а также высокие целевые количественные значения остаточной ДНК, превышающие принятые критерии в 4 раза.

Сущностью предложенного изобретения является то, что забор дермы свиней толщиной 3 мм для проведения децелюляризации осуществляют после предварительного снятия эпидермиса дерматомом, далее производят замораживание образцов в низкотемпературном морозильнике до температуры -80°С, после разморозки образцы заливают раствором Трипсин-Версена и помещают в шейкер-инкубатор в режиме 100 об/мин при 37°С на 18 часов; на втором этапе образцы помещают на вращающуюся платформу в режиме 170 об/мин и подвергают последовательному циклическому воздействию растворов детергентов: 1% раствора Тритона X100 в течение 2 часов и 4% раствора дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002 М Na2-ЭДТА в течение 2 часов, общее число циклов обработки равняется 5, после воздействия каждого детергента следует промывка образцов в деионизированной воде в течение 10 минут; на третьем этапе следует обработка образцов раствором свиной панкреатической ДНКазы I (2000 ЕД растворяли в 200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием) в шейкер-инкубаторе в режиме 100 об/мин при 37°С в течение 4 часов, завершают децеллюляризацию воздействием 10% раствора хлоргексидина биглюконата в фосфатном буфере в течение 24 часов со сменой раствора каждые 6 часов, причем качество децеллюляризации подтверждают путем гистологического окрашивания, определения количественного содержания ДНК, определения жизнеспособности клеток на полученном каркасе по наличию дифференциального окрашивания живых и мертвых клеток, по способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде.

Техническим результатом способа является сокращение времени экспозиции перфузионных растворов. Ранее использовавшиеся протоколы повреждали матрикс дермы и несли высокий риск развития бактериальной контаминации, что крайне неблагоприятно сказывалось на качестве полученного каркаса и возможности последующего создания тканеинженерной конструкции. Применение тритона Х100 совместно с дезоксихолатом натрия, снижение времени воздействия децеллюляризирующих растворов полностью нивелирует негативные эффекты известных способов того же назначения. Также предложенный способ позволяет снизить уровень остаточной ДНК в ткани до 60 нг/мг ткани во влажном образце. Кроме того, способ предусматривает оценку биосовместимости и жизнеспособности клеток, засеянных на каркас, по наличию дифференциального окрашивания живых и мертвых клеток, по способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде (МТТ-тест).

Способ получения свиного ацеллюлярного дермального матрикса осуществляют следующим образом: в условиях операционной под наркозом в положении животного на боку после стандартной обработки операционного поля электродерматомом производится деэпителизация, после чего следует забор фрагмента дермы толщиной 3 мм. Полученные образцы замораживают в низкотемпературном морозильнике до температуры -80°С. Размороженные образцы заливают раствором Трипсина-Версена и помещают в шейкер-инкубатор в режиме 100 об/мин при 37°С на 18 часов. Далее образцы помещают на вращающуюся платформу и децеллюляризируют путем последовательного воздействия растворами детергентов: 1% раствора Тритона XI00 в течение 2 часов и 4% раствора дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002 М Na2-ЭДТА в течение 2 часов, общее число циклов обработки равняется 5, после воздействия каждого детергента следует промывка образцов в деионизированной воде в течение 10 минут. Удаление остаточной ДНК осуществляют путем обработки образцов раствором свиной панкреатической ДНКазой I (2000 ЕД растворяют в 200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием) в шейкер-инкубаторе в режиме 100 об/мин при 37°С в течение 4 часов, затем завершают децеллюляризацию отмывкой от децеллюляризирующих растворов и дезинфекцией матрикса в 10% растворе хлоргексидина биглюконата в фосфатном буфере в течение 24 часов со сменой раствора каждые 6 часов.

Контроль качества полученного биоинженерного каркаса осуществляют методами гистологического исследования (окрашивание гематоксилином и эозином, флуорофором DAPI), молекулярно-биологического анализа (анализ количественного содержания остаточной ДНК во влажной ткани), культуральными методами (определение жизнеспособности клеток на полученном каркасе по наличию дифференциального окрашивания живых и мертвых клеток, по способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде - МТТ-тест).

Способ апробирован в течение 2 лет на биологическом материале (дерма) экспериментальных животных (свиньи). Результаты полностью подтвердили решаемые задачи. Получен естественный матрикс дермы с сохранной гистологической структурой и отсутствием неповрежденных клеточных элементов и не являющийся цитотоксичным в условиях in vitro.

Claims (1)

1. Способ получения ацеллюлярного дермального матрикса, включающий забор дермального лоскута толщиной 3 мм, отличающийся тем, что перед забором образца снимают эпидермис дерматомом, далее выполняют 1 цикл заморозки при температуре -80°С, далее образец размораживают, заливают раствором Трипсин-Версена и помещают в шейкер-инкубатор в режиме 100 об/мин при 37°С на 18 часов, затем образцы помещают на вращающуюся платформу в режиме 170 об/мин и подвергают последовательному циклическому воздействию растворов детергентов: 1% раствора Тритона XI00 в течение 2 часов и 4% раствора дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002 М Na2-ЭДТА в течение 2 часов, общее число циклов обработки равняется 5, после воздействия каждого детергента следует промывка образцов в деионизированной воде в течение 10 минут, далее следует обработка образцов раствором свиной панкреатической ДНКазы I 2000 ЕД /200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием в шейкер-инкубаторе в режиме 100 об/мин при 37°С в течение 4 часов, завершают децеллюляризацию воздействием 10% раствора хлоргексидина биглюконата в фосфатном буфере в течение 24 часов со сменой раствора каждые 6 часов, причем качество децеллюляризации подтверждают путем гистологического окрашивания, определения количественного содержания ДНК, определения жизнеспособности клеток на полученном каркасе по наличию дифференциального окрашивания живых и мертвых клеток, по способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде.