KR20210021165A

KR20210021165A - 지방줄기세포 유래 스페로이드를 포함하는 조건 배지를 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20210021165A
Application number: KR1020190099362A
Authority: KR
Inventors: 박인수
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2019-08-14
Filing date: 2019-08-14
Publication date: 2021-02-25

Abstract

본 발명은 지방줄기세포 유래 스페로이드를 포함하는 무혈청 줄기세포 배양액의 용도에 관한 것으로, 상기 무혈청 줄기세포 배양액은 지방줄기세포를 3차원 세포법으로 배양하여 수득한 배지로서 이는 상처 치유용 조성물로서의 용도를 갖는다. 구체적으로, 본 발명에 따른 상처 치유용 조성물은 지방줄기세포에 LED 광원을 이용하여 적색 파장대의 조사함으로써, 상기 지방줄기세포로부터 3차원적 세포 스페로이드(cell spheroid)를 형성하고, 이렇게 형성된 스페로이드를 포함하는 무혈청 줄기세포 배양액에는 유용 성분(VEF, bFGF, HGF)이 다량 함유하고 있어 상처 치유에 효과적이다.

Description

지방줄기세포 유래 스페로이드를 포함하는 조건 배지를 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 약학 조성물{The pharmaceutical composition for wound healing comprising conditioned medium containing cell spheroid derived from adipose-derived stem cell}

본 발명은 지방줄기세포 유래 스페로이드 배양으로부터 얻어진 무혈청 줄기세포 배양액의 용도에 관한 것으로, 상기 무혈청 줄기세포 배양액은 지방줄기세포를 3차원 세포법으로 배양하여 수득한 배지로서 이는 상처 치유용 조성물로서의 용도를 갖는다. 구체적으로, 본 발명에 따른 상처 치유용 조성물은 지방줄기세포에 LED 광원을 이용하여 적색 파장대의 조사함으로써, 상기 지방줄기세포로부터 3차원적 세포 스페로이드(cell spheroid)를 형성하고, 이렇게 형성된 스페로이드 배양으로 부터 얻어진 무혈청 줄기세포 배양액에는 유용 성분(VEF, bFGF, HGF)이 다량 함유하고 있어 상처 치유에 효과적이다.

줄기세포 치료제를 포함한 세포치료제(cell therapy product)는 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위(최소한 이상의 조작: more-than-minimalmanipulation)를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용하는 의약품으로 정의된다. 줄기세포 치료제는 이중 특히 줄기세포를 사용하는 경우를 의미하며, 현재 대표적인 응용 분야는 신경질환, 심질환, 폐질환, 간질환, 암과 같이 손실된 세포의 회복과 재생이 필수적이면서도 자연스럽게는 잘 이루어지지 않는 경우에서 활발하게 개발이 진행되고 있다.

줄기세포는 다분화 잠재능을 가지고 있어서 손상된 조직에서 필요한 세포로의 분화를 유도할 수 있다는 점에서 세포치료에서 잠재력이 크지만, 현재 개발수준에서는 체내 이식 후 생존율이 높지 않아서 실제로 임상 적용에서 광범위하고 안정적으로 성공한 예를 찾기 어렵다.

이에 줄기세포에 대한 대안으로, 상기 줄기세포의 무혈청 줄기세포 배양액이 주목을 받고 있다. 줄기세포 배양액(conditioned media; CM)라 함은 세포를 배양한 후의 세포 자체를 포함하지 않는 배지로서, 세포 성장에 필수적인 여러 가지 성분들(예컨대, 사이토카인, 성장인자 등)이 포함되어 있는 것으로 예측되는 배지이다. 무혈청 줄기세포 배양액은 세포의 성장을 촉진시키기 위해 사용되거나, 특정 성분을 분리해내기 위해 사용되고 있으며, 이 밖에도 무혈청 줄기세포 배양액 자체로 여러가지 질환의 치료에 응용되고 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지를 이용하여 2차원 배양 접시에서 혈관내피전구세포를 배양한 후, 얻어진 무혈청 줄기세포 배양액을 랫트의 허혈 부위에 주사하여 허혈을 치료하거나(Stefano Di Santo et al., PLos One, Vol. 4, Issue 5, e5643, 2009), 세포 배양 배지를 이용하여 2차원 배양 접시에서 돼지 지방유래 줄기세포를 배양한 후, 얻은 무혈청 줄기세포 배양액을 돼지 피부에 생성된 창상 부위에 주사하여 치료하거나(Fu, Xiaobing, Fang et al., Wound Repair and Regeneration, vol. 15, No. 4, pp. 540-548, 2007), 세포 배양 배지를 이용하여 2차원 배양 접시에서 인간 지방 유래 줄기세포를 배양한 후, 얻은 무혈청 줄기세포 배양액을 피부 주름이 유발된 마우스 주름에 주사하여 치료한 결과가 보고된 바 있다(Won-Serk Kim et al., Journal of Dermatological Science, 48, 15-24, 2007). 하지만, 상기 연구들에 사용된 배지는 동물 유래 성분인 소 혈청과 안전성이 떨어지는 완충용액 및 지시약 성분들이 포함되어 있어 임상에 직접 적용하기 어려운 단점이 있다. 또한, 종래의 일반적인 세포배양법인 2차원 배양(배양 접시에서의 배양)의 경우 배지로 분비되는 성분들(예를 들어, 성장 인자 등)의 농도가 낮아 임상적용시 환부에 많은 부피의 무혈청 줄기세포 배양액을 사용하여야 하는 문제가 있다.

한편, 피부의 재건 및 손실, 위축 및 부상에 따른 교체는 종종 피부 이식편 대용물의 특정 양이 필요하다. 반면에, 세포 활성, 증식 및 분화를 조절할 수 있는 성장 인자의 사용은 피부 재생을 위한 새로운 방법으로 인식되기 시작했다. 최근 연구에 따르면 골형성단백질(bone morphogenetic proteins; BMPs), 인슐린유사성장인자-1(insulin-like growth factor-1; IGF-1) 및 인슐린유사성장인자-2(insulin-like growth factor-2; IGF-2), 형질전환성장인자-β1(transforming growth factor-β1; TGF-β1), 혈소판유도성장인자(platelet-derived growth factor; PDGF), 및 섬유아세포성장인자-2(fibroblast growth factor-2; FGF-2)는 세포를 자극하여 상처 치유를 위한 세포 능력을 향상시킬 수 있다고 밝힌 바가 있다[Med Hypotheses 72 (2009) 679-682, Cells Tissues Organs 187 (2008) 263-274].

아울러, 상피 세포의 이동은 상피 세포를 증식시키고 표피 세포를 분화시켜 상피층을 형성한다. 스페로이드(spheroid) 내 세포는 자연적으로 저산소 상태에 노출되기 때문에 세포 생존력과 파라크린 효과(paracrine effects)가 향상된다. 저산소증(Hypoxia)은 VEGF, FGF, HGF와 같은 성장 인자의 생산을 자극할 수 있다. 사이토카인을 함유한 무혈청 줄기세포 배양액은 현재 재생의학에서 새로운 치료 양식으로 사용될 수 있으며, 일부 질병에서 성공적인 결과를 보여주고 있다. 무혈청 줄기세포 배양액을 이용한 치료는 생산, 포장 및 유통의 용이함 때문에 줄기 세포 자체를 사용하는 것보다 더 유망하다.

이러한 배경 하에 본 발명자는 지방줄기세포에 LED 광원을 이용하여 적색 파장대의 조사함으로써, 지방줄기세포로부터 세포 스페로이드(cell spheroid)를 형성하고, 이렇게 형성된 스페로이드를 포함하는 무혈청 줄기세포 배양액에는 유용 성분(사이토카인, 성장인자, 케모카인 등)이 다량 함유하고 있어 특히 상처 치유에 효과적임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-1719870호(2017.03.27. 공고)

본 발명자는 광조사(Photobiomodulation irradiation; PBM)한 지방줄기세포로부터 유래된 스페로이드(spheroid)를 포함하는 무혈청 줄기세포 배양액(PBMAS-CM)가 피부 창상 동물 모델에서 피부 조직의 기능 회복을 향상시키기 위해 혈관 신생 및 조직 재생을 자극할 수 있는지 여부를 조사하였다. 조사 결과, 광조사한 무혈청 줄기세포 배양액의 경우(PBMAS-CM) 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor; VEF), 염기성섬유모세포성장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF) 및 간세포성장인자(hepatocyte growth factor; HGF)의 생성이 향상됨을 확인하였고, 광조사한 무혈청 줄기세포 배양액(PBMAS-CM)을 피부 창상 동물 모델의 상처 부위에 이식한 경우 혈관 신생, 상처 닫힘(Wound closure) 효과가 우수하였는바 상처 치유 효과가 탁월하다는 것을 확인하게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 지방줄기세포 유래 스페로이드를 포함하는 무혈청 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 상처치유용 조성물에 관한 것이다.

따라서 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 적색 파장대의 빛으로 광조사(photobiomodulation irradiation; PBM)하면서 지방줄기세포(adipose-derived stem cell)를 3차원적 스페로이드(spheroid) 형태로 배양하여 수거한 무혈청 줄기세포 배양액(conditioned media)을 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 다양한 혈관생성 및 피부재생인자(FGF, VEGF, HGF 등)의 농도가 높아 상처 크기를 감소시키는 효과와 신생혈관 생성 효과가 우수하고, 진피 및 상피의 재생 효과가 우수하여, 상처 치유 효과가 향상된 약학으로 사용될 수 있다.

도 1(A)는 LED(660nm)을 사용하여 지방줄기세포로부터 스페로이드를 형성하는 모습을 나타낸 그림이고, 도 1(B)는 각각의 처리 조건별(CM, PBM-CM, AS-CM, PBMAS-CM)로 HIF1-α의 웨스턴 블롯 결과이다(*p < 0.01, L-스페로이드 그룹 대비).
도 2(A)는 CM 처리군과 PBMAS-CM 처리군의 혈관 신생 관련 단백질 분석 결과이고(* p < 0.05, CM 군 대비, t-test, n = 3), 도 2(B)는 CM 군과 PBMAS-CM 군의 ELISA 측정 결과이다(* p < 0.05, 스페로이드 6J/cm²그룹 대비, t-test, n = 3).
도 3(A)는 각각의 처리 조건별(PBS, CM, PBM-CM, AS-CM, PBMAS-CM) anti-bFGF 및 anti-VEGF 또는 anti-HGF 항체(적색으로 염색됨) 면역염색(Immunostaining)을 수행한 결과이고(Scale bar: 100μm), 도 3(B)는 14일 경과 시점에서 bFGF, VEGF 및 HGF의 발현을 측정한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 4(A)는 각각의 처리 조건별(PBS, CM, PBM-CM, AS-CM, PBMAS-CM) 14일 경과 시점에서 이식한 것을 제거하고, anti CD31 및 αSMA antibodies로 염색한 결과이고, 도 4(B)는 14일 경과 시점에서 혈관내피세포 마커인 CD31 및 혈관외피세포의 마커인αSMA의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯 결과이다.
도 5는 14일 경과 시점에서 시토케라틴(cytokeratin)-양성 상피 세포(적색)를 보여주는 면역 형광(Immunofluorescence) 염색 사진이다.
도 6(A)는 피부 창상 마우스 모델에서 각각의 처리 조건별(PBS, CM, PBM-CM, AS-CM, PBMAS-CM) 상처 치유 모습을 나타낸 사진이고, 도 6(B)는 1 일, 7 일 및 14 일 경과 시점에서 상처 면적의 백분율을 그래프로 나타낸 결과이고(*p < 0.05 ㅍversus PBMAS), 도 6(C)는 각각의 처리 조건별(PBS, CM, PBM-CM, AS-CM, PBMAS-CM) 상처 부위의 조직학적 분석 결과이고(상처는 H & E와 Masson trichrome으로 14 일 동안 염색하였으며, 상처의 가장자리는 화살촉으로 표시되었고, 닫힌 화살표는 피부 부속기관(skin appendages)으로 모낭을 나타냄, Scale bar:500μm), 도 6(D)는 상처 부위마다 피부 부속기관의 수를 세어 피부 부속기관의 재생성을 조사한 결과이고, 도 6(E)는 조직학적 점수를 산출한 결과이다(* p <0.05 versus PBMAS).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서의 "지방줄기세포(adipose-derived stem cells; ASCs)"란, 지방조직(adipose tissue)에 존재하는 자가 재생능력이 뛰어나고, 간, 골, 연골, 지방, 혈관, 심장, 신경계 등과 같은 다양한 세포로 분화될 수 있는 미분화된 성체줄기세포를 의미한다. 상기 지방줄기세포는 중간엽 줄기세포와 비교하여 지방조직을 대량으로 추출할 수 있다는 점에서 취득과정이 용이하고 안전하며, 조직수급상의 제한이 없는 장점과 체외배양이 용이하여 조직 접근성, 안정성, 유효성, 그리고 경제적 측면에서 장점이 있다.

본 발명에서의 "무혈청 줄기세포 배양액(conditioned media, 조건 배지라고도 함)"은 세포를 배양하여 얻은 세포 자체를 포함하지 않는 배지로서, 세포 성장에 필수적인 여러 가지 성분들(예컨대, 성장 인자, 사이토카인 등)이 포함되어 있는 것으로 예측되는 배지이다. 배양하는 세포 및 배양 방식에 따라 무혈청 줄기세포 배양액의 구성은 달라질 수 있으며, 본 발명에 사용한 무혈청 줄기세포 배양액은 성체 줄기세포, 바람직하게는 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포를 배양하기에 적합한 배지이다. 상기 무혈청 줄기세포 배양액은 지방줄기세포를 배양 배지에서 배양한 후, 원심분리나 여과, 투석, 필터링, 농축 등의 방법을 통해 얻어질 수 있다.

본 발명에서의 "2차 배양"은 줄기세포 배양에 통상적으로 사용되던 방식으로서 배양 접시(페트리 디쉬) 상에서 줄기세포를 배양하는 것으로서 단일층(monolayer culture)으로도 불린다. 반면, "3차 배양"은 배양 접시가 아닌 배양 배지가 담긴 플라스크에서 적절한 교반 하에 배양하는 것으로서, 스피너 배양(spinner culture)으로도 불린다.

본 발명에서의 "상처"는 조직 구조의 연속성 또는 완전성의 물리적인 파열을 의미하며, "상처 치유"란 조직 완전성의 복원을 의미하는 것으로, 조직 완전성의 부분적 또는 완전 복원을 포함할 수 있으며, 치료(treat)와 혼용될 수 있다. 상기 치유(cure 또는 heal)는 자연 치유에 비하여 단축된 시간에 상처가 치유되는 것일 수 있다. 상기 치유는 혈관신생, 피부재생, 상처의 개선 및/또는 완화를 포함할 수 있다. 상처의 개선은 상처의 정도를 낮추는 것을 의미한다. 또한, 상기 치유는 상처 및/또는 상처와 관련된 질환의 치유를 모두 포함할 수 있다. 상기 치유는 상처로부터 유발되는 손상된 조직의 치유 및/또는 재생을 의미할 수 있다. 상기 치유는 피부 재생의 의미를 포함할 수 있다. 또한, 상기 치유는 손상된 조직의 원래 조성을 유지하는 것일 수 있다. 또한, 상기 치유는 상처와 관련된 질환의 합병증 및/또는 흉터를 최소화하면서 상기 손상된 조직을 치료 및/또는 재생을 촉진하는 것일 수 있다. 따라서 상처 치유란 상처 치료 과정에 관여하는 하나 이상의 단계 또는 과정의 촉진, 개선, 진행, 가속 또는 진전을 의미한다.

또한, 상처는, 예를 들면 타박상 또는 내부 궤양화와 같이 피부의 외부 구조적 완전성이 유지되는 임의의 내부 상처 이거나 외부 상처, 특히 피부 상처일 수 있으며, 따라서 조직은 내부 또는 외부의 신체 조직일 수 있다. 일예로서, 조직은 피부(예컨대, 인간 피부)이며, 상처는 진피 또는 표피 상처와 같은 피부 상처일 수 있다.

본 발명은 지방줄기세포 유래 스페로이드를 포함하는 무혈청 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 상처치유용 조성물을 제공한다. 구체적으로, 적색 파장대의 빛을 조사하면서 지방줄기세포(adipose-derived stem cell)를 3차원적 스페로이드(spheroid) 형태로 배양하여 수거한 무혈청 줄기세포 배양액(conditioned media; CM)를 유효성분으로 포함하는, 상처 치유용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 3차원 스페로이드의 배양의 경우, 시험관 내 세포 생존율을 크게 증가시킬 수 있으며, 세포당 혈관생성 인자의 분비량을 향상시킬 수 있다.

본 발명에 따른 무혈청 줄기세포 배양액은 저산소인자(HIF-1α), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF), 혈관내피인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 및 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor; FGF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 다량으로 포함한다.

혈관내피인자(vascular endothelial growth factor; VEGF)는 혈관 신생을 조절하는 가장 효과적이고 특이적인 성장 인자이다. 섬유아세포성장인자(2fibroblast growth factor 2; FGF2)는 섬유아세포의 이동과 증식, 혈관 신생, 기질 침착에 영향을 주기 때문에 상처 치료에서 중요한 성장 인자이다. 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF)는 이동과 증식을 유도하고 세포 사멸 세포 사멸을 억제할 수 있는 또 다른 강력한 전혈관생성 인자(proangiogenic factor)이다. 이러한 유용 성분들은 혈관재생을 촉진하고 상처 치유 회복 능력을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 무혈청 줄기세포 배양액은 600 내지 700nm 파장의 적색 파장대 빛으로 광조사(photobiomodulation irradiation; PBM)하여 지방줄기세포에서 3차원 스페로이드의 형성을 유도한다.

본 발명에서의 광조사(photobiomodulation irradiation; PBM)는 빛을 이용하여 살아있는 조직에 변화를 야기하는 것으로, 적색파장대의 빛은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 LED(light emitting diode) 또는 저출력 레이저 (low level laser light therapy)로부터 발생된 빛을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 LED로부터 발생되어 600 내지 700nm의 파장 및 0 내지 20mW/㎠의 전력의 전력를 나타내는 빛을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 LED로부터 발생되어 660nm의 파장 및 10mW/㎠의 전력을 나타내는 빛을 사용할 수 있다.

아울러, 상기 빛의 조사 조건 역시 지방줄기세포로부터 스페이드 형성을 촉진시키는 효과를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 배지로부터 1 내지 5cm의 간격을 두고 위치한 LED 광원을 이용하여 5 내지 20분 동안 조사하는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 지방줄기세포는 스페로이드(spheroid) 또는 3차원 세포집합체(3D cell mass; 3DCM)라고 알려진 세포괴를 형성할 수 있는데, 상기 스페로이드는 특별히 제한되지 않는다. 상기 지방줄기세포의 배양시 정지배양, 진탕배양 등의 방법을 제한없이 사용할 수 있으며, 저산소 환경에서 배양시 더 효과적이다. 통상적으로 상기 스페로이드는 배양시간의 경과에 따라 그의 직경이 지속적으로 증가한다. 상기 스페로이드의 직경이 적어도 500㎛ 이상일 때 스페로이드 내부가 저산소 환경이 만들어지고 저산소 환경일 때 발현하는 HIF-1a 단백질이 발현된다. HIF-1a 시그널에 의해 혈관생성 및 피부재생인자(FGF, VEGF, HGF 등)의 발현 및 분비가 촉진되어지는데 저산소 환경에서 배양 시 더 효과적일 수 있다.

본 발명의 스페로이드는 평균 직경은 0.5 내지 2.0mm 범위 내인 것이 바람하고, 더욱 바람직하게는 1.2 내지 1.5mm 이나, 상처 치유 효과가 있다면 상기 범위에 반드시 제한되지 않는다.

한편, 본 발명의 적색 파장대의 빛을 이용하여 스페로이드를 형성한 무혈청 줄기세포 배양액을 포함하는 약학 조성물은 살아있는 스페로이드를 유효성분으로 포함하므로, 세포치료제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위하여는, 바이오 폴리머 등의 유기물, 히드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 폴리머 또는 코폴리머, 폴리에틸렌글리콜 폴리머 또는 코폴리머 및 그의 화학적 유도체, 펩타이드 단백질, 생체외 기질 단백질(ECM), 겔(gel) 등과 조합시켜서 제형화 할 수도 있다. 상기 스페로이드를 유지하기 위한 기제로는 생리식염수, PBS(phosphate buffered saline) 등을 사용할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 또한, 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.

또한 상기 약학적 조성물은 피부에 도포하기 위한 피부외용제에 적용될 수 있다. 상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 및 약물 함유 붕대로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종 생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류도 적절하게 배합할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 스페로이드의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 10 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 20 내지 40 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.

상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다. 본 발명의 약학조성물의 투여량은 예를 들어, 상처 부위 주변에 1개소 또는 복수 개소(예를 들면 2 ~ 50개소)에 투여할 수 있으며, 투여량은 바람직하게는 1.0 × 10⁵ 내지 1.0 × 10⁸ 세포수/kg(체중), 보다 바람직하게는 1.0 × 10⁶ 내지 1.0 × 10⁷ 세포수/kg(체중)이 될 수 있다.

또한, 본 발명은 적색 파장대의 빛으로 광조사(photobiomodulation irradiation; PBM)하면서 지방줄기세포(adipose-derived stem cell)를 3차원적 스페로이드(spheroid) 형태로 배양하여 수거한 무혈청 줄기세포 배양액(conditioned media)을 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서의“화장료 조성물”은 인체를 청결, 미화하여 매력을 더하고 용모를 밝게 변화시키거나 피부, 모발의 건강을 유지 또는 증진하기 위하여 인체에 사용되는 물품을 의미한다.

상기 화장료 조성물은 토너, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 앰플, 로션, 에센스, 영양 크림, 아이 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 포밍 워시, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 젤, 워시오프 팩, 필오프 팩, 시트상 마스크 팩, 하이드로젤 마스크 팩, 리포젤 마스크팩, 클레이 마스크 팩, 비누, 스프레이, 선 크림, 선 로션, 선 밤, 선 미스트, 비비 크림, 메이컵 베이스, 파운데이션, 및 프라이머 제품 중에서 선택된 제형으로 제조될 수 있으며, 반드시 이에 제한되지는 않는다.

상기 화장료 조성물은 보습제, 에몰리언트제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제를 더 포함할 수 있다. 상기 보습제 등의 추가 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.01 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 무혈청 줄기세포 배양액(conditioned media)을 포함할 수 있다.

이처럼 적색 파장대의 빛을 이용하여 지방줄기세포로부터 스페로이드를 형성하여 얻은 무혈청 줄기세포 배양액이 상처 치유 약학 조성물의 유효성분으로 사용하는 기술은 지금까지 전혀 알려지지 않았으며, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 스페로이드를 유효성분으로 포함하는 무혈청 줄기세포 배양액은 혈관생성 및 피부재생인자(FGF, VEGF, HGF 등) 등의 유용 성분이 다량 포함되어 있어, 생체 내에 이식된 후 혈관재생 및 피부세포 분화를 촉진하여 최종적으로 상처를 치유하고 피부재생을 촉진시킬 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험 방법>

1) 지방줄기세포 배양(Culture of ASCs)

지방줄기세포(ASCs)는 CEFO(서울, 대한민국) Cell Engineering로부터 공급받았다. ASCs 세포를 인간-지방 조직으로부터 분리하고, 분리한 ASCs 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS, Welgene), 100units/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신을 첨가한 low-glucose Dulbecco's modified Eagle's medium F-12(DMEM / F-12, Welgene, Daegu, Korea)를 이용하여 37.0℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다(표 1 참조).

2) 키토산 코팅된 배양 플레이트의 제조(Preparation of chitosan-coated culture plates)

이전 연구[Cell Mol Med 17(11) (2013) 1355-1362]에서 기술된 방법을 이용하여 키토산을 조직 배양 플레이트에 코팅하였다. 0.67% (w/v) 아세트산에 용해된 0.5 mL 1% (w/w) 키토산 용액(C-3646, Sigma, St. Louis, MO)을 24-웰 조직 배양 플레이트(TCPS, Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany)에 각각 넣고 60℃의 오븐에서 24시간 동안 건조시켜 박막을 형성시킨 후 0.5N NaOH 수용액(Sigma)으로 2시간 중화시켰다. 다음으로, 플레이트를 밤새 자외선에 노출시키기 전에 증류수로 철저히 씻어 내었다.

3) 스페로이드 형성(Spheroid formation)

ASCs 세포를 분할(split)하고 키토산 코팅된 24-웰 플레이트에 7.5×10⁴ 세포/cm²의 밀도로 접종하고, 37℃에서 접착시켰다. 배양 3일 이내에, ASCs 세포는 저출력 광선 조사(Low-Level light irradiation)에 의해 스페로이드(Spheroid)를 형성하였다(L-spheroids). 사용된 광원은 세포 배양을 위해 표준 멀티 웰 판(12.5×8.5cm)에 맞도록 설계된 LED(발광 다이오드; WON Technology Co., Ltd., Korea)를 사용하였다. LED는 660nm 피크를 갖는 방출 파장이었다. 세포 단일층 표면에서의 조사는 Power meter(Orion, Ophir Optronics Ltd., UT)로 측정하였다. 0 내지 12J/cm²의 에너지 선량(energy dose)을 얻기 위해, LED 어레이의 노출 시간은 0 내지 20mW/cm²(1milliwatt × second = 0.001joules)의 전력 밀도에서 10분 동안 수행하였다(표 1 참조). L-스페로이드(L-Spheroid)의 크기는 이미지 분석에 의해 개별 세포 클러스터의 면적을 계산하여 측정하였다. L-스페로이드의 직경은 중앙값±표준편차(n=8)로 나타내었다.

[표 1]

4) PBM-ASC 무혈청 줄기세포 배양액 분획물의 제조(Preparation of conditioned medium fractions derived from PBM-ASCs)

ASCs 세포를 혈청 함유 완전 배지(serum-containing complete medium)에서 정상 산소 조건하에서 배양하였다. ASCs 세포를 100mm 조직 배양 접시에 도말하고 80%의 Confluency에 도달시켰다. 이어서, 배지를 지시된 대로 serum-free a-MEM(5 ml) 또는 다른 배지로 교환하고, 세포를 PBM 조건 하에 다시 48 시간 동안 배양하였다. 다음으로, 무혈청 줄기세포 배양액 분획을 PBM-ASC로부터 수집하여 CM 및 hypo-CM을 산출하거나, 각각 43,000℃에서 10분 동안 13,000g에서 원심 분리하고, 효소면역분석법(ELISA), 시험관 내 세포 증식(in vitro cell proliferation) 및 이동 분석(migration assays), 또는 생체 내 상처 치유 분석(in vivo wound-healing assays)에 사용하기 전에 저장하였다. 생체 내 상처 치유 분석(in vivo wound-healing assays)을 위해, 무혈청 줄기세포 배양액 분획물을 추가 원심 분리 및 원심 분리 필터 유닛(Millipore, Billerica, MA, USA)을 통한 여과에 의해 농축시켰다.

5) 인간 혈관신생 단백질 분석(Human angiogenic protein analysis)

혈관 신생 관련 단백질의 발현 프로파일(expression profiles of angiogenesis-related proteins)을 분석하기 위해, Human Angiogenesis Array Kit (R & D Systems, Ltd., Abingdon, UK)를 사용하였다. 세포 샘플(5 × 10⁶ cells)을 수확하고 150μg의 단백질을 15μl의 이차항체(biotinylated detection antibodies)와 혼합하였다. 전처리 후 칵테일(cocktail)을 4℃에서 밤새 배양하였다. 결합되지 않은 물질을 제거하기 위해 세척한 후, streptavidin- horseradish 및 화학 발광 검출 시약(chemiluminescent detection reagents)을 순차적으로 첨가하였다. 멤브레인 필름상의 신호는 이미지 판독기 LAS-3000(Kodak, Rochester, NY)를 사용하고 MultiGauge 4.0 소프트웨어(Kodak)를 사용하여 정량화하였다. 현상된 필름에서 보이는 양의 신호(positive signals)는 어레이 이미지(array image)에 투명도 오버레이를 배치하고 각 어레이의 구석에 있는 두 쌍의 양성 대조군 스팟(spot)에 정렬시킴으로써 확인하였다.

6) 혈관신생성장인자 생산을 위한 ELISA 분석(ELISA assay for angiogenic growth factor production)

스페로이드 내의 혈관신생성장인자 생산은 제조사의 프로토콜에 따라 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트(R&D Systems)를 이용하여 분석하였다. 농도는 주어진 시간에 10⁴ cells 당 혈관신생성장인자의 양으로 표현하였다.

7) 면역 형광 염색(Immunofluorescence staining)

간접 면역 형광 염색(Indirect immunofluorescence staining)은 표준 절차를 사용하여 수행되었다. 간단히 말하면, 세포를 4% 파라포름알데히드( paraformaldehyde)로 고정시키고, 5% BSA/PBS(1시간, 24℃)로 블록킹(blocking) 시켰으며, PBS로 2회 세척하고, 0.1% Triton X-100/PBS로 1분간 처리하고, PBS로 씻어 내었다. M.O.M. Kit(Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 사용하면서 섹션(sections)을 특이적인 1차 항체 및 형광 결합된 2차 항체로 염색하였다(표 2 참조).

세포를 DAPI(4,6-디아미노-2-페닐인돌디하이드로클로라이드; Vector Laboratories)로 대비 염색하였다. mouse IgG(Dako, Carpinteria, CA) 및 rabbit IgG (Dako) 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 염색된 섹션(sections)을 모델 DXM1200F 형광 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. 처리된 이미지를 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 형광 강도에 대해 분석하였다.

[표 2]

8) 웨스턴 블롯(Western blot)

샘플을 용해 완충액[20mM Tris-HCl, pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% sodium dodecyl sulfate(SDS), 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1μg/ml leupeptin, 2μg/ml aprotinin]으로 4℃에서 1시간 동안 처리하였다. 그 후 용해물을 4℃에서 30분 동안 15,000g에서 원심분리하여 정제하고, 2% SDS 및 5%(v/v) 2-mercaptoethanol을 함유한 램나이 샘플 버퍼(Laemmli sample buffer)로 희석하였고, 90℃에서 5분간 가열하였다. 단백질은 10% 또는 15% 분해겔(resolving gels)을 사용하여 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 분리한 후 니트로셀룰로오스 멤브레인(Bio-Rad, Hercules, CA)으로 옮겼다. 다음으로 HGF(Santa cruz), VEGF(Abcam) 및 FGF2 (Abcam)에 대한 항체로 실온에서 1시간 동안 탐침시켰다(표 2 참조). 퍼옥시다아제 결합된 anti-mouse IgG 또는 anti-rabbit IgG 및 화학 발광(enhanced chemiluminescence, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)을 설명서에 기재된 대로 사용하였다. 멤브레인을 스캔하여 화학 발광 이미지(chemiluminescent images)를 만들고, 이미지 분석기(Kodak, Rochester, NY)로 정량화하였다.

9) 실험 동물 모델의 제조(Preparation of the experimental animal model)

동물 연구는 단국대학교 동물 관리위원회의 승인을 받아 진행하였다. 5주된 수컷 BALB/c 누드 마우스(체중 20g, Narabio, Seoul, Korea)를 케타민(100mg/kg)으로 마취시켰다. 무균 수술 부위를 준비한 후, 8mm 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 등 부분(dorsal part)에 2개의 전체 두께의 피부 상처를 만들었다. 상처 수축을 억제하기 위해, 이전에 설명한 바와 같이 두께 0.5mm의 실리콘 부목을 사용했다(Biofabrication 4 (2012) 025004). 부목은 순간접착제와 나일론 6-0(Nylon 6-0)으로 상처 주위에 6개의 단절봉합사로 고정되었다. 상처를 무작위로 5가지 그룹으로 분류했다: 인산 완충 식염수(PBS 처리군, n = 9), 무혈청 줄기세포 배양액(CM 처리군, n = 9), 광조사한 무혈청 줄기세포 배양액(PBM-CM 처리군, n = 9), LED를 조사하면서 2차원 배양된 지방유래줄기세포(monolayer ASC)를 포함하는 무혈청 줄기세포 배양액(AS-CM 처리군, n = 9), 및 LED를 조사하면서 지방줄기세포로부터 스페로이드(spheroid)를 형성한 무혈청 줄기세포 배양액(PBMAS-CM 처리군, n = 9)을 상처 부위와 정상 피부 사이의 경계에 4 개의 주입 부위(injection sites)에 피내 이식(implant)하였다. 상처의 생리학적 상태는 치료 후 2주 동안 추적 관찰하였다. 데가덤(Tegaderm; 3M Health Care, MN, USA)을 상처 보호에 사용하였고, 동등한 부피의 무혈청 줄기세포 배양액을 사용하였다.

10) 조직학적 염색(Histological staining)

상기 배지를 각각 처리한 후 14일이 되는 시점에 각 샘플을 수집하였다. 수집한 샘플은 10% (v/v) 완충된 포름알데히드에 고정시키고, 등급이 매겨진 에탄올 시리즈에서 탈수시키고, 파라핀에 내장시켰다. 시험편을 4μm 두께의 절편으로 썰고 hematoxylin과 eosin(H & E)로 염색하여 근육 퇴화 및 조직 염증을 검사했다. Masson의 삼색 콜라겐 염색은 조직 섬유아세포 허혈 부위를 평가하기 위해 수행되었다. 상처 치유의 조직학적(histological) 점수에 사용되는 기준은 이전 보고서[Stem Cells 25 (2007) 2648-2659]에 근거하여 수정하였으며, 그 기준을 하기 표 3에 나타내었다. 고려되는 조직학적(histological) 매개 변수는 재상피화(reepithelialization), 피부 재생(dermal regeneration), 육아 조직 형성(granulation tissue formation) 및 혈관신생(angiogenesis)이였다. 피부 부속기관(skin appendages)의 재생은 상처 부위에서 모낭(hair follicles)이나 피지샘(sebaceous glands)의 수를 세어 평가하였다(표 3 참조).

[표 3]

11) 상처 부위의 그로스 평가(Gross evaluation of the wound area)

상처는 수술 후 3 일, 7 일, 14 일이 경과한 시점에 디지털 카메라를 사용하여 촬영하고 상처를 추적한 다음 Image J 이미지 분석 프로그램(NIH, MD, USA)을 사용하여 상처 면적을 측정하였다. 상처 부위는 원래의 상처 부위에 대한 현재 상처의 백분율을 계산하여 분석하였다. 상처 부위가 완전히 0 일 때 상처는 완전히 닫힌 것으로 간주되었다.

12) 통계분석(Statistical analyses)

모든 정량 결과는 삼중 샘플(triplicate samples)로부터 얻어졌으며, 데이터는 평균 ± 표준 편차(mean ± SD)로 나타내었다. 통계 분석은 두 그룹의 샘플을 비교하기 위한 two-sample t 검정과 3 그룹에 대한 일원 분산 분석 (One-way Analysis of Variance, ANOVA)을 사용하여 수행되었다. p <0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

<실시예 1> PBMAS에 의한 혈관신생성장인자 생산(Production of Angiogenic Factors by PBMAS)

지방줄기세포(ASCs)는 fetal bovine serum(FBS)의 존재 하에 비조직 배양(non-tissue culture) 처리된 24-웰 플레이트에서 배양되었고, 접종(seeding) 후 3일되는 시점에 PBM을 조사한 후 부동의(floating) 스페로이드(spheroid)를 형성하였다(도 1(A)). 대부분의 스페로이드(Spheroid)의 지름은 1.2 내지 1.5mm 범위였다. 3차원 배양에 의한 스페로이드(Spheroid)는 2차원 배양에 의한 단일층(monolayer) 배양 세포와 비교하여 HIF-1α(hypoxia-inducible factor-1α)와 같은 저산소증 생존 인자(hypoxia-induced survival factors)의 발현이 유의하게 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 1(B)). HIF-1α는 혈관신생성장인자의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다[Biofabrication 4 (2012) 025004, Biotechnol Bioeng 86(6) (2004) 672-680].

L-spheroid ASCs(3차원 배양)에는 혈관신생성장인자(angiogenic growth factors)로서, 간세포성장인자(hepatocyte growth factor; HGF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF) 및 섬유아세포성장인자 2(fibroblast growth factor 2; FGF2)의 상당한 발현이 있었음을 확인할 수 있었다(도 2(A)). PBMAS(9 J/cm²의 에너지 선량)에서의 혈관신생성장인자의 발현은 단일층 배양(2차원 배양)에서 배양된 ASC에서의 혈관신생성장인자의 발현보다 훨씬 컸음을 알 수 있었다(도 2(B)).

<실시예 2> 상처 부위(wound bed)에 이식된 무혈청 줄기세포 배양액에 의한 성장 인자의 분비 증가(Enhanced secretion of growth factors from implanted CM in wound bed)

이식된 무혈청 줄기세포 배양액(CM)은 혈관신생성장인자인 bFGF, VEGF 및 HGF의 면역형광 염색(Immunofluorescent staining)을 통해 이들의 존재를 확인할 수 있었다(도 3). CM 이식군에 비해 PBMAS 이식군에서 더 많은 성장 인자가 관찰되었다(도 4(A)). 웨스턴 블롯 분석 결과, PBMAS-CM 이식군에서 CM 이식군(대조군)보다 VEGF, bFGF, HGF의 농도가 유의하게 높았다. 즉 CM 이식군에 비해 PBMAS-CM 이식군에서 더 많은 성장인자가 관찰되었다(도 4(B)). 그러나 CM 이식군, PBM-CM 이식군, 및 AS-CM 이식군에서 성장 인자의 발현은 유의적인 차이가 없었다.

<실시예 3> 상처 부위에서의 혈관신생 효율(Angiogenic efficacy in the wound bed)

PBMAS-CM 처리군에서 많은 CD31+ 세포가 smooth muscle actin(SMA)에 이중으로 염색되었음을 확인하였다. 주입된 인간 세포로부터 분화된 ECs 및 혈관 주위 세포는 각각 αSMA 및 CD31 항체를 통해 검출되었다(도 4(A)). 녹색은 혈관외피세포의 마커인 αSMA을 나타내고, 적색은 혈관내피세포 마커인 CD31을 나타낸다. 웨스턴 블롯 분석 결과, L-spheroid 및 PBMAS-CM 처리군에서 대조군에 비해 CD31 의 발현이 유의하게 높았다. 또한, PBMAS-CM 처리군에서 ASC 처리군보다 더 많은 성장 인자를 보였다(도 4(A)). 그러나 PBS 처리군, CM 처리군, PBM-CM 처리군 및 AS-CM 처리군에서는 유의한 차이가 없었다. 이러한 결과는 상처 부위에서 혈관신생을 함에 있어서 PBMAS-CM 치료 효과가 더 높음을 시사한다.

<실시예 4> 상피 세포(Epithelial cells)

PBMAS-CM 처리가 표피 구조에 기여할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 판-시토케라틴(pan-cytokeratin)에 대한 면역조직화학(mmunohistochemistry) 수행을 14 일이 되는 시점에 수행하였다. 일부 시토케라틴-양성 세포는 PBMAS-CM의 표피(epidermis) 또는 피지선(sebaceous glands)에서 발견되었다(도 5).

<실시예 5> 상처 닫힘과 피부 반응(Wound closure and dermal reaction)

절개된 상처를 갖는 부목 고정 마우스 모델을 준비하였다. 실리콘 부목은 실험 기간 동안 피부에 밀착되어 남아 있었고 상처 수축은 제한적이었다(도 6(A)). 수술 후 7 일이 경과한 시점에, PBMAS-CM 처리군은 다른 군에 비해 유의하게 작은 상처 면적을 보였다. 7 일이 경과한 시점에, PBMAS-CM 처리군은 PBS 처리군, CM 처리군, PBM-CM 처리군 또는 AS-CM 처리군보다 유의하게 작은 상처 면적을 보였다. PBS 처리군 간에 상처 부위의 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 6(B)).

PBS 처리군, CM 처리군, PBM-CM 처리군 또는 AS-CM 처리군의 모든 상처가 완전히 닫히지 않은 것으로 관찰되었다. 조직학적 관찰에 따르면, PBMAS-CM 처리군은 대조군에 비해 피부 재생이 훨씬 더 컸다.

또한, PBMAS-CM 처리군이 수술 후 14일이 경과한 시점에 상피화(re-epithelialization) 및 과립화(granulation)를 촉진한다는 것을 보여주었다(도 6(C)). 아울러, PBMAS-CM 처리군은 피부 부속기(skin appendages) 의 수가 증가한 것으로 나타났다(도 6(D)). 또한, PBMAS-CM 군은 수술 후 14일이 경과한 시점에 모낭과 피지샘 수가 유의하게 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 6(E)).

상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 PBMAS-CM은 재상피화(re-epithelialization), 혈관 신생(neovascularization) 및 피부 부속기의 재생(regeneration of skin appendages)을 증가시켜 상처 봉합을 가속화 시켰음을 확인할 수 있었다. 이것은 파라크린(paracrine) 분비에 의한 증가로 인한 것으로 예측할 수 있다(도 3 및 도 4).

따라서, 본 발명에 따른 PBMAS-CM는 피부 조직의 재생을 촉진하는 능력을 가지고 있음을 나타내며, 이는 ASCs 세포 자체보다 PBMAS-CM가 상처 치유에 더 유용하고 실용적일 수 있다는 점에서 본 발명은 우수한 발명이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

적색 파장대의 빛으로 광조사(photobiomodulation irradiation; PBM)하면서 지방줄기세포(adipose-derived stem cell)를 3차원적 스페로이드(spheroid) 형태로 배양하여 수거한 무혈청 줄기세포 배양액(conditioned media)을 유효성분으로 포함하는, 상처 치유용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 적색 파장대의 빛은 600 내지 700 nm의 파장을 갖는 것을 특징으로 하는, 상처 치유용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 스페로이드(spheroid)는 평균 직경이 0.5 내지 2.0mm 범위 내인 것을 특징으로 하는, 상처 치유용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 무혈청 줄기세포 배양액은 저산소인자(HIF-1α), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor; HGF), 혈관내피인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 및 섬유아세포성장인자 2(fibroblast growth factor 2; FGF2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상처 치유용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 약학 조성물은 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 및 약물 함유 붕대로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 피부외용제의 조성물로 사용되는 것을 특징으로 하는, 상처 치유용 약학 조성물.
적색 파장대의 빛으로 광조사(photobiomodulation irradiation; PBM)하면서 지방줄기세포(adipose-derived stem cell)를 3차원적 스페로이드(spheroid) 형태로 배양하여 수거한 무혈청 줄기세포 배양액(conditioned media)을 유효성분으로 포함하는, 상처 치유용 화장료 조성물.
제 6 항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 토너, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 앰플, 로션, 에센스, 영양 크림, 아이 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 포밍 워시, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 젤, 워시오프 팩, 필오프 팩, 시트상 마스크 팩, 하이드로젤 마스크 팩, 리포젤 마스크팩, 클레이 마스크 팩, 비누, 스프레이, 선 크림, 선 로션, 선 밤, 선 미스트, 비비 크림, 메이컵 베이스, 파운데이션, 및 프라이머 제품 중에서 선택되는 제형으로 제조된, 상처 치유용 화장료 조성물.