KR101719870B1 - 적색 파장대의 빛을 이용한 중간엽 줄기세포의 분화유도 방법 - Google Patents

적색 파장대의 빛을 이용한 중간엽 줄기세포의 분화유도 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지방유래 중간엽 줄기세포에 LED 광원을 이용하여 적색 파장대의 빛을 조사함으로써, 상기 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 스페로이드를 형성하고, 상기 형성된 스페로이드를 혈관내피세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면 분화유도물질을 사용하지 않고서도, 줄기세포를 혈관내피세포로 분화유도할 수 있으므로, 보다 경제적인 혈관질환 치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

적색 파장대의 빛을 이용한 중간엽 줄기세포의 분화유도 방법{Mehtod for inducing differentiation of mesenchymal stromal cells using light with red wavelength}
본 발명은 적색 파장대의 빛을 이용한 중간엽 줄기세포의 분화유도 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 중간엽 줄기세포에 LED 광원을 이용하여 적색 파장대의 빛을 조사함으로써, 상기 중간엽 줄기세포로부터 스페로이드를 형성하고, 상기 형성된 스페로이드를 혈관내피세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 분화란 초기 단계의 세포가 각 조직으로서의 특성을 갖게 되는 과정을 말하는데, 그 대표적인 예는 동물의 발생 과정에서 볼 수 있다. 즉, 정자와 난자가 결합하여 만들어진 수정란이라는 하나의 세포가 뼈, 심장, 피부 등의 다양한 조직 세포로 만들어지기 위해서는 '분화'가 일어나야 하는 것이다. 이러한 분화능력을 가지고 있는 줄기세포(stem cell)는 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능하며 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성을 가진 세포를 의미한다.
최근에, 인간 지방조직(adipose tissue)에 자가 재생능력이 뛰어나고, 간, 골, 연골, 지방, 혈관, 심장, 신경계 등과 같은 다양한 세포로 분화될 수 있는 미분화 세포군이 포함되어 있음이 보고되었다(B. Cousin 등, BBRC 301: 1016, 2003; Miranville 등, Circulation 110: 349, 2004; S. Gronthos 등, J. Cell Physiol. 189: 54, 2001; M.J. Seo 등, BBRC 328: 258, 2005). 이러한 지방조직 유래 다분화능 줄기세포로서 지방줄기세포(adipose-derived stem cells; ASCs)는 중간엽계 줄기세포와 비교하여 지방조직을 대량으로 추출할 수 있다는 점에서 취득과정이 용이하고 안전하며, 조직수급상의 제한이 없는 장점과 체외배양이 용이하여 조직 접근성, 안정성, 유효성, 그리고 경제적 측면에서 이점을 가지고 있어 다분화능 줄기세포의 새로운 공급원으로서 주목받고 있다.
지금까지 알려진 지방줄기세포로는 상피세포로 분화 가능한 인간 지방줄기세포(Martin Brzoska 등, BBRC 330: 142, 2005), 골 형성 및 지방세포로 분화 가능한 인간 지방줄기세포(Ying Cao 등, BBRC 332: 370, 2005), 신경세포로 분화 가능한 인간 지방줄기세포(Kristine M. Safford 등, BBRC 294: 371, 2005), 지방세포로 분화 가능한 쥐 지방줄기세포(Rei Ogawa 등, BBRC 319: 511, 2004), 골 형성 및 연골 형성 세포로 분화 가능한 쥐 지방줄기세포(Rei Ogawa 등, BBRC 313: 871, 2004), 연골세포로 분화 가능한 인간 지방줄기세포(Hani A. Awad 등, Biomaterials 25: 3211, 2004), 신경세포로 분화 가능한 쥐 지방줄기세포(Juri Fujimura 등, BBRC 333: 116, 2005), 및 골세포, 연골세포, 신경세포 또는 근육세포로 분화가능한 지방줄기세포(미국특허 제6,777,231호) 등이 있다.
아울러, 상기 지방줄기세포가 생체 내 및 시험관 내에서 혈관내피세포로 분화가 유도될 수 있음이 보고되었다. 예를 들어, 지방줄기세포를 육종마우스로부터 분리된 특수한 세포외 기질 성분인 마트리겔(matrigel)이 코팅된 배양용기에서 다양한 성장인자가 첨가된 배지를 이용하여 배양하면 혈관내피세포로 분화될 수 있고(Cao Y, 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 332: 370-379, 2005), 무혈청 배지에서 지방줄기세포를 배양하여 스페로이드(구상체, spheroid)를 형성한 후 이를 조혈모세포 배양배지에서 일주일간 배양하여 Flk-1을 다량 발현하는 혈관내피세포를 획득할 수 있음이 보고되었다(Martinez-Estrada O.M., 등, Cardiovasc. Res. 65(2): 328-333, 2005). 그러나 상기 방법들은 분화에 3주 이상의 시간이 소요되어 장기간의 세포 배양으로 오염이 발생할 수 있고 특정 세포로의 분화를 위해 성장인자와 같은 특수 배지 성분을 사용해야 하기 때문에 배지 제조비용이 상승하여 산업적으로 이용하기에 어렵다는 단점이 있다. 또한, 종래에는 중간엽 줄기세포를 혈관 세포로 유도하기 위해 혈관세포 유도성분이 함유된 배지 또는 배양 메트릭스에서 배양하였을 뿐 혈관세포의 분화를 촉진시키는 장비가 없어 분화시간이 길어지는 문제점이 있었다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 보다 효과적으로 지방유래 중간엽 줄기세포를 혈관내피세포로 분화시킬 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 지방유래 중간엽 줄기세포를 스페로이드 형태로 배양하면서 적색 파장대의 빛을 조사할 경우, 상기 줄기세포를 효과적으로 혈관내피세포로 분화시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 지방유래 중간엽 줄기세포의 스페로이드에 적색 파장대의 빛을 조사하면서 배양하는 단계를 포함하는, 지방유래 중간엽 줄기세포를 혈관내피세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 보다 효과적으로 지방줄기세포를 혈관내피세포로 분화시킬 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, LED 광원을 이용하여 빛을 조사하는 방법에 주목하게 되었다. 즉, 줄기세포를 배양하면서 LED 광원을 이용하여 적색 파장대의 빛을 조사하면, 줄기세포의 증식 및 이동성이 향상되어 스페로이드의 형성이 촉진되고, 상기 형성된 스페로이드에 지속적으로 적색 파장대의 빛을 조사하면, 혈관내피세포로의 분화를 촉진할 수 있는 다양한 성장인자(FGF, VEGF, HGF 등)의 발현 및 분비가 상기 스페로이드를 형성하는 줄기세포 자체에서 촉진되어, 외부에서 혈관생성 관련인자의 첨가 또는 유전자 조작 없이도 상기 스페로이드가 혈관내피세포로 분화되는 것이 촉진될 수 있다.
한편, 상기 적색 파장대의 빛을 조사하여 지방줄기세포를 혈관내피세포로 분화시키는 분화효율을 향상시키기 위한 조건을 연구한 결과, 600 내지 700nm의 파장 및 5 내지 30 mW/㎠의 전력을 나타내는 빛(에너지량 3 내지 18 J/㎠)을 조사하고, 지방유래 중간엽 줄기세포의 배양용기로는 세포 배양용기에 소수성을 부여하는 고분자로 표면 처리되거나 또는 소수성을 갖는 세포 배양용기(non-tissue culture-treated well plate)를 사용하며, 상기 배양용기에 지방줄기세포를 24웰 플레이트의 각 웰에 1 × 105 세포 이상의 지방줄기세포를 접종함이 바람직함을 확인하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 지방줄기세포에 적색 파장대의 빛을 조사하여 지방줄기세포를 혈관내피세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 지방줄기세포를 혈관내피세포로 분화시키는 방법은 지방줄기세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 접종하고 배양하면서, 5 내지 15 mW/㎠의 전력 및 600 내지 700nm의 빛을 상기 지방줄기세포에 조사하는 단계를 포함한다.
본 발명의 용어 "중간엽 줄기세포(mesenchymal stromal cells; MSCs)"란, 자가 재생능력이 뛰어나고, 간, 골, 연골, 지방, 혈관, 심장, 신경계 등과 같은 다양한 세포로 분화될 수 있는 미분화된 성체줄기세포를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포로서 지방유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived stem cells; ASCs)를 사용하였다. 상기 지방유래 중간엽 줄기세포는 다른 종류의 중간엽 줄기세포와 비교하여 대량으로 추출할 수 있는 지방조직으로부터 수득할 수 있다는 점에서 취득과정이 용이하고 안전하며, 조직수급상의 제한이 없는 장점과 체외배양이 용이하여 조직 접근성, 안정성, 유효성, 그리고 경제적 측면에서 장점이 있다.
본 발명에서 제공하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 혈관내피세포로 분화시키는 방법은 상기 지방유래 중간엽 줄기세포에 적색 파장대의 빛을 조사하는 단계를 필수적으로 포함하는데, 상기 지방세포에 조사된 빛은 줄기세포의 증식 및 이동을 촉진시켜서, 스페로이드(spheroid) 또는 3차원 세포집합체(3D cell mass, 3DCM)라고 알려진 세포괴의 형성을 촉진시킬 수 있고, 상기 스페로이드에 상기 빛을 지속적으로 조사하면, 상기 스페로이드를 형성하는 줄기세포로부터 혈관내피세포로의 분화를 촉진할 수 있는 다양한 성장인자(FGF, VEGF, HGF 등)의 발현 및 분비가 촉진되어, 스페로이드의 내부에 축적되거나 또는 스페로이드의 외부로 분비되고, 상기 성장인자는 줄기세포 분화에 관여하는 분화 신호전달을 활성화시켜서, 혈관내피세포로의 상기 스페로이드의 분화를 촉진시킬 수 있다.
이때, 상기 빛은 지방유래 중간엽 줄기세포를 혈관내피세포로 분화시키는 것을 촉진시키는 효과를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 LED(light emitting diode)로부터 발생된 빛을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 LED로부터 발생되어 600 내지 700nm의 파장 및 5 내지 30 mW/㎠의 전력을 나타내는 빛을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 LED로부터 발생되어 660nm의 파장 및 10 mW/㎠의 전력을 나타내는 빛을 사용할 수 있다.
아울러, 상기 빛의 조사조건 역시 지방유래 중간엽 줄기세포를 혈관내피세포로 분화시키는 것을 촉진시키는 효과를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 1 내지 5cm의 간격을 두고 위치한 LED 광원을 이용하여 1일 10 내지 15분 동안 조사하는 방법을 사용할 수 있다.
또한, 상기 지방줄기세포를 배양하는 배양용액 또는 배양 메트릭스에 혈관내피세포로 줄기세포의 분화를 유도하는 물질을 처리하거나 유전자 변형을 하지 않고, 적색 파장대의 빛을 조사하여 스페로이드 형성 및 혈관생성인자 발현을 유도하는 것만으로도 줄기세포를 혈관내피세포로 분화시킬 수 있다. 이때, 사용되는 배양용액은 지방줄기세포의 배양 및/또는 분화에 통상적으로 사용되는 배지라면 제한되지 않고 사용할 수 있고, 바람직하게는 DMEM (Dulbeco's modified eagle medium), Ham's F12 등에 혈청이 포함된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에서는 DMEM과 Ham's F12가 1:1 비율로 혼합된 DMEM/F12 배지에 우 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 첨가된 배지를 사용하였다. 하지만, 혈청을 포함하지 않는 배지를 사용하여도 본 발명의 방법을 수행하는 것이 가능하다.
아울러, 상기 지방유래 중간엽 줄기세포의 분화를 촉진시키기 위하여, 상기 지방유래 중간엽 줄기세포를 소수성을 부여하는 고분자로 표면 처리된 배양용기 또는 상기 고분자로 제조된 배양용기에 접종하여 배양할 수 있다. 상기 소수성을 부여하는 고분자는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리비닐클로라이트(PVC), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 지방족 폴리에스테르계 고분자로서, 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(D,L-락트산）(PDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리다이옥산온(PDS), 폴리트라이메틸렌카보네이트, 이들의 유도체 또는 공중합체 (폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA), 폴리(L-락트산-co-카프로락톤)(PLCL), 폴리(글리콜산-co-카프로락톤)(PGCL) 등)등을 사용할 수 있다.
끝으로, 상기 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 스페로이드를 용이하게 형성하기 위하여는, 상기 지방유래 중간엽 줄기세포를 1 × 105 내지 2 × 106 세포/㎠의 밀도로 접종함이 바람직하다. 1 × 105 세포/㎠ 미만의 밀도로 접종할 경우에는 스페로이드의 크기가 작고, 편차가 심하다는 문제점이 있고, 2 × 106 세포/㎠ 이상의 밀도로 접종할 경우에는 과다한 세포증식에 의한 세포사가 유발될 수 있다. 그러나, 1 × 105 내지 2 × 106 세포/㎠ 이상의 밀도로 접종할 경우에는, 육안으로 검출가능한 약 1 ㎜의 직경을 갖는 스페로이드를 형성할 수 있다.
상기 방법에 의해 분화된 혈관내피세포는 다양한 혈관 질환 또는 창상의 치료에 사용될 수 있는데, 상기 혈관질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 심혈관 질환, 뇌혈관 질환, 허혈성 질환 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 동맥경화증, 안정형 및 불안정형 협심증, 말초 심혈관 질환, 고혈압, 심부전증, 말초 순환장애, 심근경색증, 뇌졸중, 일과성 및 허혈성 발작, 지주막하 출혈 등의 질환이 될 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하면 분화유도물질을 사용하지 않고서도, 줄기세포를 혈관내피세포로 분화유도할 수 있으므로, 보다 경제적인 혈관질환 치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 인간의 지방조직으로부터 분리한 줄기세포를 검증한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 2는 LED 조사장치를 나타내는 사진이다.
도 3은 LED 조사에 의한 지방유래 중간엽 줄기세퐁의 성장율 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 배양용기에 코팅된 ECM 단백질의 존재여부에 따른, 지방유래 중간엽 줄기세포를 배양한 결과를 나타내는 사진이다.
도 4b는 지방유래 중간엽 줄기세포를 NTCP에 접종하고, LED 광원으로부터 빛을 조사하면서 배양시간의 경과에 따른 지방유래 중간엽 줄기세포의 형태변화를 나타내는 사진이다.
도 5는 LED의 조사여부 및 스페로이드의 형성여부에 따른 혈관신생 관련 단백질의 발현수준 변화를 측정한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 6의 좌측사진은 LED가 조사된 지방조직 유래 중간엽 줄기세포에 대한 면역형광염색 결과를 나타내는 사진이다.
도 6의 우측사진은 LED의 조사여부 및 스페로이드의 형성여부에 따른 CD31의 발현여부를 웨스턴 블럿 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 7는 LED가 조사된 2차원 배양된 줄기세포와 스페로이드가 형성된 줄기세포에 대한 FACS 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 하지허혈 마우스 동물모델에 대한 LED를 조사하여 스페로이드가 형성된 줄기세포의 치료효과를 비교한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, A는 주입후 1, 7, 14 및 21일이 경과한 시점에서 촬영한 마우스 동물모델의 하지부위를 나타내는 사진이고, B는 21일이 경과한 후, 전체 마우스 중에서 하지의 손상정도가 차지하는 비율을 나타내는 그래프이며, C는 주입후 1, 7, 14 및 21일이 경과한 시점에서 촬영한 피부혈류를 나타내는 사진이고, D는 21일이 경과한 후, 전체 마우스 중에서 하지허혈이 치료된 마우스의 비율을 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인간의 지방유래 중간엽 줄기세포의 분리
인간 피하 지방조직으로부터 다분화능 줄기세포를 분리하고, 이를 그대로 위상차 현미경(Nikon)으로 관찰하거나, DAPI 염색을 수행하여 관찰하거나 또는 유세포분석을 수행하였다. 유세포분석 시에는 중간엽 줄기세포의 확인을 위한 표면항원으로 CD29, CD90 및 CD105를 사용하였고, 줄기세포의 분리, 배양 중 다른 세포의 혼입 여부를 관찰하기 위한 표면항원으로 CD34, CD31, KDR(Flk1) 및α-SMA를 사용하여, 이들의 발현양상을 유세포 분석기(flow cytometry)를 사용하여 분석하였다(도 1).
도 1은 인간의 지방조직으로부터 분리한 줄기세포를 검증한 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 1에서 보듯이, 인간 피하지방 조직에서 분리한 세포가 중간엽 줄기세포의 표현형을 가지는 지방유래 중간엽 줄기세포임을 확인하였다.
실시예 2: LED 조사에 의한 지방유래 중간엽 줄기세포의 성장율 변화
지방유래 중간엽 줄기세포의 성장율 변화를 관찰하기 위해서 WST(Water-soluble Tetrazolium Salts) assay(Dojindo laboratories)를 실시하였다. 대략적으로, 96웰 플레이트에 2 x 103 세포수의 줄기세포를 접종하고, 660nm의 빛을 조사할 수 있는 LED 조사장치를 이용하여 0 내지 6 J/㎠의 빛을 조사하였다. 일정한 시간이 경과한 후, 배양액을 제거하고, 20㎕의 WST 용액과 180㎕의 새로운 배양액을 가하고 37℃에서 4시간동안 반응시킨 다음, OD450에서 흡광도를 측정하였다(도 2 및 3).
도 2는 LED 조사장치를 나타내는 사진이고, 도 3은 LED 조사에 의한 지방유래 중간엽 줄기세퐁의 성장율 변화를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 빛의 조사시간이 증가할 수록 줄기세포의 증식이 가속화되었고, 조사되는 빛에 포함된 에너지양이 증가할 수록 줄기세포의 증식수준이 증가하는 양상을 나타내었다.
특히, 0.5 J/㎠ 이상의 빛을 조사할 경우에 줄기세포의 증식이 촉진되었고, 3 J/㎠의 빛을 조사할 때까지는 빛에 포함된 에너지양에 따라 줄기세포의 증식수준이 비례하는 양상을 나타내었으나, 6 J/㎠의 빛을 조사할 경우에는 줄기세포의 증식수준이 오히려 감소함을 확인하였다.
따라서, 줄기세포의 증식을 촉진시키기 위하여는 0.5 내지 3 J/㎠의 빛을 조사함이 바람직함을 알 수 있었다.
실시예 3: 중간엽 줄기세포의 구상체 ( spheroid : 3 DCM , 3D cell mass ) 형성
배양용기 표면에 대한 지방유래 중간엽 줄기세포의 접착활성과 스페로이드 형성의 상관관계를 조사하기 위하여, ECM 단백질로서 피브로넥틴이 코팅되거나 또는 코팅되지 않은 비-조직세포 배양용 24-웰 플레이트(NTCP, 폴리스티렌)에 웰당 4 × 104 세포/㎠의 지방유래 중간엽 줄기세포를 접종한 후 10% FBS 함유 DMEM/F12 배지에서 3일간 배양하였다. 배양이 종료된 후, 각 세포접착 표면에서 지방유래 중간엽 줄기세포의 스페로이드 형성 여부를 관찰하였다(도 4a).
도 4a는 배양용기에 코팅된 ECM 단백질의 존재여부에 따른, 지방유래 중간엽 줄기세포를 배양한 결과를 나타내는 사진이다. 도 4에서 보듯이, 표면이 소수성을 띠어 세포접착이 약하게 유도되는 NTCP에서 육안으로 검출가능한 크기로 지방유래 중간엽 줄기세포의 스페로이드가 형성되었는데, 상기 스페로이드는 약 1 mm 이상의 직경을 갖는 것으로 확인되었다. 이에 반하여, 세포접착이 강하게 유도되는 파이브로넥틴이 코팅된 NTCP에서는 지방유래 중간엽 줄기세포가 2차원적으로 플레이트 표면에 넓게 접착된 상태로 단층 배양되어 세포집합체가 형성되지 않음을 확인하였다.
상기 결과로부터 사용되는 배양용기의 표면에 대한 접착활성에 따라 지방유래 중간엽 줄기세포의 스페로이드 형성이 영향을 받으며, 육안으로 검출가능한 크기의 스페로이드를 형성하기 위해서는 초기에는 세포접착이 약하게 유도되다가 시간이 경과함에 따라 세포 밀도가 증가하면서 세포들이 탈착되어 부유된 상태로 증식하게 되는 폴리스티렌 재질의 NTCP와 같이 표면이 소수성을 띠는 배양용기를 사용하는 것이 바람직함을 확인하였다.
또한, NTCP에서 육안으로 검출가능한 크기의 스페로이드를 형성하는데 요구되는 지방유래 중간엽 줄기세포의 배양시간을 알아보기 위하여, 상기 실시예 1에서 수득된 지방유래 중간엽 줄기세포를 5% FBS 함유 DMEM/F12 배지가 담겨진 NTCP의 각 웰에 0.5 × 104 내지 1× 105 세포/㎠의 농도로 접종하고 매일 10분씩 LED 광원으로부터 빛을 조사하면서 3일동안 배양하였다(도 4b).
도 4b는 지방유래 중간엽 줄기세포를 NTCP에 접종하고, LED 광원으로부터 빛을 조사하면서 배양시간의 경과에 따른 지방유래 중간엽 줄기세포의 형태변화를 나타내는 사진이다. 도 4b에서 보듯이, 3일이 경과된 시점에서 육안으로 검출가능한 크기의 스페로이드가 형성됨을 확인하였다
실시예 4: LED 조사에 의한 지방유래 줄기세포의 혈관분화 성장인자 생산량 변화
2차원 배양된 줄기세포 그룹(control), 2차원 배양된 줄기세포에 LED를 조사한 그룹(low level light therapy, LLLT), LED 조사없이 스페로이드가 형성된 줄기세포 그룹(spheroid) 및 LED를 조사하여 스페로이드가 형성된 줄기세포 그룹(L-spheroid)으로부터 얻어진 각 줄기세포를 대상으로 혈관신생 관련 단백질의 발현수준 변화를 비교하기 위하여, Human Angiogenesis Array Kit (R&D Systems, Ltd., Abingdon, UK)를 사용하여 상기 각 줄기세포로부터 혈관신생 관련 단백질의 발현수준을 측정하였다(도 5). 이때, 상기 각 줄기세포로부터 얻어진 단백질 50mg을 15㎕의 바이오틴이 결합된 검출용 항체와 혼합하여 반응시켰고, 검출신호는 image reader LAS-3000(Kodak, Rochester, NY)을 사용하여 측정한 다음, MultiGauge 4.0 software (Kodak)를 사용하여 분석하였다.
도 5는 LED의 조사여부 및 스페로이드의 형성여부에 따른 혈관신생 관련 단백질의 발현수준 변화를 측정한 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다. 도 5에서 보듯이, 2차원 배양된 줄기세포 보다는 스페로이드가 형성된 줄기세포에서 혈관신생 관련 단백질의 발현수준이 증가하였고, 상기 스페로이드가 형성된 줄기세포 중에서도, LED 조사없이 스페로이드가 형성된 줄기세포보다는 LED를 조사하여 스페로이드가 형성된 줄기세포에서 혈관신생 관련 단백질의 발현수준이 증가함을 확인하였다.
실시예 5: 스페로이드의 면역염색학적 분석
상기 실시예 1에서 분리한 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 1 × 105 세포/웰의 농도로 24-웰 NTCP(Non-Treated cell culture plate)에 접종하고, LED를 조사하면서 배양하여 스페로이드를 형성시켰다. 상기 형성된 스페로이드를 회수하고, OCT 화합물을 이용하여 -70℃에서 고정한 후 마이크로톰을 이용해 4 ㎛ 두께로 자른 후 그 절편을 슬라이드 글라스에 고정시키고 면역학적 염색을 수행하였다.
또 다른 방법으로서, 상기 회수된 스페로이드를 주사기를 이용해 물리적으로 와해시킨 후, 이를 슬라이드 글라스 위에 놓고 4시간 동안 부착시키고, 상기 슬라이드 글라스를 PBS로 수회 세척하였으며, 이를 4% 파라포름알데하이드 용액에 침지하여 30분간 실온에서 고정시킨 다음, 다시 PBS로 세척하고 면역학적 염색을 수행하였다.
상기 면역학적 염색은 상기에서 준비된 슬라이드 글라스를 다양한 분화마커(CD29, CD34, KDR(Flk1) 및 CD31)에 대한 일차항체를 함유한 PBS에 침지하여, 하룻밤 동안 반응시키고, PBS로 3회 세척한 다음, 다시 상기 일차항체에 결합할 수 있는 이차항체를 처리하고, 암실에서 1시간 동안 반응시켜서 수행하였다. 반응이 종결된 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3회 세척하고 봉입(mounting)한 후 형광현미경으로 분석하였다(도 6의 좌측사진).
도 6의 좌측사진은 LED가 조사된 지방조직 유래 중간엽 줄기세포에 대한 면역형광염색 결과를 나타내는 사진이다. 도 6의 좌측사진에서 보듯이, LED 조사에 의하여 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 형성된 스페로이드는 CD29, CD34, Flk1 및 CD31에 대해서는 양성반응을 나타내었다. CD29는 중간엽줄기세포 및 상피세포에서 특이적으로 발현되는 표면항원이고, CD34, KDR(Flk1) 및 CD31은 혈관내피세포에서 특이적으로 발현되는 표면항원이다.
따라서, 지방유래 중간엽 줄기세포를 적색 파장대의 광을 조사, 표면이 소수성을 띠는 배양용기에서 배양하여 형성된 spheroid가 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포로 구성되어 있음을 알 수 있었다.
한편, 2차원 배양된 줄기세포 그룹(control), 2차원 배양된 줄기세포에 LED를 조사한 그룹(LLLT), LED 조사없이 스페로이드가 형성된 줄기세포 그룹(spheroid) 및 LED를 조사하여 스페로이드가 형성된 줄기세포 그룹(spheroid+LLLT)으로부터 얻어진 각 줄기세포를 대상으로 CD31의 발현여부를 확인하기 위하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다(도 6의 우측사진).
도 6의 우측사진은 LED의 조사여부 및 스페로이드의 형성여부에 따른 CD31의 발현여부를 웨스턴 블럿 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 도 6의 우측사진에서 보듯이, 스페로이드가 형성된 줄기세포에서만 CD31이 발현되었고, 상기 스페로이드가 형성된 줄기세포 중에서도, LED 조사없이 스페로이드가 형성된 줄기세포보다는 LED를 조사하여 스페로이드가 형성된 줄기세포에서 CD31이 더 많이 발현됨을 확인하였다.
실시예 6: LED 조사에 의한 지방유래 줄기세포의 혈관분화 FACS
2차원 배양된 줄기세포에 LED를 조사한 그룹(ASC+LLLT) 및 LED를 조사하여 스페로이드가 형성된 줄기세포 그룹(L-spheroid)으로부터 얻어진 각 줄기세포를 대상으로 CD31, Cd34 및 KDR에 대한 FACS 분석을 수행하였다.
상기 각 그룹의 줄기세포를 회수하여, 주사기를 이용해 물리적으로 와해시킨 후, 이를 슬라이드 글라스 위에 놓고 4시간 동안 부착시킨 다음, 상기 슬라이드 글라스를 PBS로 수회 세척하였으며, 이를 4% 파라포름알데하이드 용액에 침지하여 30분간 실온에서 고정시키고, 다시 PBS로 세척하였으며, 혈관내피세포에서 특이적으로 발현되는 표면항원인 CD31, Cd34 및 KDR에 대한 면역학적 염색을 수행하였다.
상기 면역학적 염색은 상기에서 준비된 슬라이드 글라스를 다양한 분화마커(CD29, CD34, KDR(Flk1) 및 CD31)에 대한 일차항체를 함유한 PBS에 침지하여, 하룻밤 동안 반응시키고, PBS로 3회 세척한 다음, 다시 상기 일차항체에 결합할 수 있는 이차항체를 처리하고, 암실에서 1시간 동안 반응시켜서 수행하였다. 반응이 종결된 후, 슬라이드 글라스를 PBS로 3회 세척하고 봉입(mounting)한 후 FACS 으로 분석하였다(도 7).
도 7는 LED가 조사된 2차원 배양된 줄기세포와 스페로이드가 형성된 줄기세포에 대한 FACS 분석결과를 나타내는 그래프이다. 도 7에서 보듯이, LED 조사에 의하여 형성된 스페로이드는 혈관내피세포에서 특이적으로 발현되는 표면항원인 CD29, CD34, KDR (Flk1) 및 CD31에 대하여 양성반응을 나타냄을 확인하였다.
따라서, LED가 조사된 스페로이드는 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 혈관내피세포의 특징을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 7: 하지허혈 마우스 동물모델에 스페로이드 이식 후 치료효과 확인
먼저, 5주령의 BALB/c 누드마우스(20 g body weight; Narabio, Seoul, Korea)의 대퇴부 대동맥을 5-0 silk suture을 사용하여 결찰함으로써, 하지허혈 마우스 동물모델을 제작하였다.
상기 제작된 하지허혈 마우스 동물모델의 결찰부위에, PBS를 주입하거나(control), 1.5 × 106 세포수의 2차원 배양된 줄기세포를 주입하거나(ASC), LED를 조사하거나(LLLT) 또는 1.5 × 106 세포수의 LED를 조사하여 스페로이드가 형성된 줄기세포를 주입하고(L-spheroid) 21일 동안 사육한 다음, 외관, 하지의 손상정도(하지손실, 발괴사 및 회복) 및 피부혈류(cutaneous blood flow)를 촬영 또는 측정하였다(도 8). 이때, 피부혈류 사진은 마우스를 37℃ 열판에 위치시키고, 스캔하여 레이저 도트 칼라 이미지를 촬영하는 방식으로 수득하였다.
도 8은 하지허혈 마우스 동물모델에 대한 LED를 조사하여 스페로이드가 형성된 줄기세포의 치료효과를 비교한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, A는 주입후 1, 7, 14 및 21일이 경과한 시점에서 촬영한 마우스 동물모델의 하지부위를 나타내는 사진이고, B는 21일이 경과한 후, 전체 마우스 중에서 하지의 손상정도가 차지하는 비율을 나타내는 그래프이며, C는 주입후 1, 7, 14 및 21일이 경과한 시점에서 촬영한 피부혈류를 나타내는 사진이고, D는 21일이 경과한 후, 전체 마우스 중에서 하지허혈이 치료된 마우스의 비율을 나타내는 그래프이다. 상기 도 8에서 보듯이, LED를 조사하여 스페로이드가 형성된 줄기세포를 사용하면, 하지허혈 마우스에서 발생된 혈관손상을 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (6)

  1. 지방유래 중간엽 줄기세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 접종하고 배양하면서, 5 내지 30 mW/㎠ 및 600 내지 700nm 파장의 빛을 상기 지방유래 중간엽 줄기세포 또는 스페로이드를 형성한 상태의 지방유래 중간엽 줄기세포에 조사하는 단계를 포함하는 지방유래 중간엽 줄기세포를 혈관내피세포로 분화시키는 방법으로서,
    상기 방법은 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 스페로이드를 형성하고, 형성된 스페로이드를 혈관내피세포로 분화시키는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 소수성을 띠는 배양용기는 소수성을 부여하는 고분자로 표면 처리된 배양용기 또는 상기 고분자로 제조된 배양용기인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 소수성을 부여하는 고분자는 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리비닐클로라이트(PVC), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 지방족 폴리에스테르계 고분자로서, 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(D,L-락트산）(PDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리다이옥산온(PDS), 폴리트라이메틸렌카보네이트, 이들의 유도체 및 이들의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    지방유래 중간엽 줄기세포의 접종밀도는 1 × 105 내지 2 × 106 세포/㎠인 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 빛은 지방유래 중간엽 줄기세포로부터 1 내지 5cm의 간격을 두고 위치한 LED 광원을 이용하여 1일 10 내지 15분 동안 조사하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 지방유래 중간엽 줄기세포는 LED 조사에 의하여 스페로이드를 형성한 다음, 혈관내피세포로 분화되는 것인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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