JP6713412B2 - 哺乳類筋肉由来の幹細胞 - Google Patents
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Description
態様1
哺乳類の間充織幹細胞(MSC)を調製する方法であって、
a)前記哺乳類からマイクロバイオプシーを収集する工程と、
b)収集後、前記マイクロバイオプシーを適切な培地にセットする工程と、
c)培養中、前記マイクロバイオプシーから出現する細胞を収集する工程と、
d)工程c)で得られた細胞をコンフルエンシー近くまで成長させる工程と、
e)工程d)から前記細胞を解離する工程と、
f)密度勾配分画により他の細胞から間充織幹細胞(MSC)を分離させ、間充織幹細胞(MSC)を取得する工程と、
を備える方法。前記細胞は、1以上の継代培養又は継代工程により任意でさらに精製できる。
態様1に記載の方法であって、
前記マイクロバイオプシーは、首、肩、胸、背、尾、手足、後肢、前肢、後四半部、後脚等の筋肉から等の、好ましくは上腕三頭筋組織から、より好ましくは上腕三頭筋の長頭から取得される、骨格筋組織から得られる方法。
態様2に記載の方法であって、
前記マイクロバイオプシーは、上腕三頭筋の長頭の長頭において、約5cmの深さで採取される方法。
態様1乃至3のいずれかに記載の方法であって、
前記マイクロバイオプシーは、約15〜約20mgの組織を含む方法。
態様1乃至4のいずれかに記載の方法であって、
前記培地は、約20%のウシ胎児血清、約5mlのペニシリン(1000U/ml)−ストレプトマイシン(10000μg/ml)、約2.5mlのアンフォテリシンB(250μg/ml)、及び約5mlのHEPESを含むDMEM/F12を備える方法。
態様1乃至5のいずれかに記載の方法であって、
工程d)において、35%未満の密度分画からの細胞が得られる方法。
態様6に記載の方法であって、
工程d)において、<15%、15−25%、及び/又は25−35%の密度分画からの細胞が得られる方法。
態様1乃至7のいずれかに記載の方法であって、
前記哺乳類は、たとえばネズミ、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、畜牛、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、及び、たとえばサルや類人猿等の霊長類のような、家畜、動物園の動物、スポーツ用の動物、ペット、コンパニオン・アニマル、及び実験動物を含むグループから選択される方法。
態様1乃至8のいずれかに記載の方法により得られる間充織幹細胞集団。
間充織幹細胞集団、又は態様9に記載の間充織幹細胞集団であって、
前記細胞がCD105を発現させ、好ましくは前記細胞がCD44及び/又はCD90と共にCD105を発現させることを特徴とする間充織幹細胞集団。
態様9又は10に記載の間充織幹細胞集団であって、
前記細胞は以下のマーカー、CD45、MHCII及びCD29を発現させないことを特徴とする間充織幹細胞集団。
態様9乃至11のいずれかに記載の間充織幹細胞集団であって、
前記細胞がmiR−128及びmiR−133Bを備えるグループから選択された少なくとも1つのマイクロRNAを発現させることを特徴とする間充織幹細胞集団。
態様9乃至12のいずれかに記載の間充織幹細胞集団であって、
前記細胞が以下のマイクロRNA、miR−656を発現させないことを特徴とする間充織幹細胞集団。
医薬又は獣医学組成物であって、
態様1乃至8のいずれかに記載の方法に従って得られた間充織幹細胞を備える、又は態様9乃至13のいずれかに記載の間充織幹細胞集団を備える組成物。
態様9乃至13のいずれかに記載の間充織幹細胞集団、又は態様14の医薬又は獣医学組成物であって、
薬剤として若しくは医薬品又は獣医薬品として利用する間充織幹細胞集団又は組成物。
態様9乃至13のいずれかに記載の間充織幹細胞集団、又は態様14の医薬又は獣医学組成物であって、
哺乳類の対象における以下の疾患、靱帯炎、骨軟骨症、関節炎、骨粗鬆症、腱炎、蹄葉炎、腱及び靱帯の炎症、骨折、及び治癒不可の1以上の治療において利用する間充織幹細胞集団又は組成物。
態様15又は16に記載の使用のための間充織幹細胞集団であって、
自己、同種異系、又は異種の間充織幹細胞(MSC)が利用される間充織幹細胞集団。
態様1乃至8のいずれかに記載の方法であって、さらに、
前記MSCをそれぞれ適切な脂質生成、骨形成、軟骨形成、筋原性、造血、内皮、ニューロン、心臓、又は肝細胞分化培地において培養することにより、前記細胞を脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋原細胞、造血細胞、内皮細胞、神経細胞、心臓細胞、又は肝細胞に分化させる工程を備える方法。好ましくは、態様1乃至8のいずれかに記載の方法であって、
前記MSCをそれぞれ適切な脂質生成、骨形成、又は軟骨形成分化培地において培養することにより、前記細胞を脂肪細胞、骨細胞、又は軟骨細胞に分化させる工程を備える方法。
態様18に記載の方法により得られる分化した脂肪細胞、骨細胞又は軟骨細胞、筋原細胞、造血細胞、内皮細胞、神経細胞、心臓細胞、又は肝細胞。
医薬又は獣医学組成物であって、
態様19に記載の分化した脂肪細胞、骨細胞、又は軟骨細胞を備える組成物。
態様19に記載の分化した脂肪細胞、骨細胞、又は軟骨細胞、又は態様20に記載の医薬又は獣医学組成物であって、
哺乳類の対象における以下の疾患、靱帯炎、骨軟骨症、関節炎、骨粗鬆症、腱炎、蹄葉炎、腱及び靱帯の炎症、骨折、及び治癒不可の1以上の治療において利用する細胞又は組成物。
哺乳類の対象における以下の疾患、靱帯炎、骨軟骨症、関節炎、骨粗鬆症、腱炎、蹄葉炎、腱及び靱帯の炎症、骨折、及び治癒不可の1以上を治療する方法であって、
前記対象に治療効果のある量の態様1乃至8のいずれかの方法で得られたMSC、又は態様14に記載の獣医学又は医薬組成物を投与し、前記哺乳類の対象における前記1以上の疾患を治療する工程を備える方法。
哺乳類の対象における以下の疾患、靱帯炎、骨軟骨症、関節炎、骨粗鬆症、腱炎、蹄葉炎、腱及び靱帯の炎症、骨折、及び治癒不可の1以上を治療する方法であって、
治療効果のある量の態様18の方法で得られた分化した脂肪細胞、骨細胞又は軟骨細胞、筋原細胞、造血細胞、内皮細胞、神経細胞、心臓細胞、又は肝細胞、若しくは態様20に記載の獣医学又は医薬組成物を投与し、前記哺乳類の対象における前記1以上の疾患を治療する工程を備える方法。
態様22又は23に記載の方法であって、
前記投与された細胞は自己、同種異系、又は異種である方法。
[例]
物質及び方法
1.抽出法:筋肉マイクロバイオプシー
2.マイクロバイオプシーの検査サンプルを外植片として使用する細胞培養の開始
3.細胞のトリプシン処理及び多能性幹細胞分離:不連続のパーコール密度勾配遠心分離
4.細胞のキャラクタリゼーション
4.1.細胞の数
4.2.クローン原性
4.3.免疫表現型検査
CD29−FITC(Immunostep)
CD105−RPE(ABD Serotec)
CD44−APC(BD Pharmigen)
MCH II(ABD Serotec)
CD45−Alexa Fluor 488(ABD Serotec)
CD90(VMDR)
4.4.細胞の多分化能
−脂質生成分化
−軟骨形成分化
−骨形成分化
5.筋肉由来MSCの免疫調節能力の評価
6.ホウォートンゼリーからの間充織幹細胞の分離
7.骨髄由来間充織幹細胞の分離
8.トランスクリプトーム解析
方法
データ解析
[結果]
1.抽出法
2.外植片による培養
3.多能性幹細胞分離
4.培養された細胞のキャラクタリゼーション
4.1.細胞の数
4.2.クローン原性
5.免疫表現型検査
6.細胞の多分化能
7.細胞の臨床用途
1/MSCの腱内注入
2/MSCの腱内及び滑膜内注入
3/MSCの靭帯内及び関節内注射
表1:異なる骨関節の病気の4頭のウマの跛行スコア[0:跛行がないこと〜V:ウマは影響を受けた肢の使用不可]における本発明の方法に従って調製されたウマの自己MSCの特定の部位での注入(107/注入部位)効果
8.細胞の免疫調節能力
表2:異なる比率のMSC/CD2 TL(すなわち、4/1、2/1、1/1、1/2、1/4、1/8)における15−25%又は25−35%分画からのMSCで培養された場合の2頭のウマのCD2 TLの増殖抑制(%)
9.トランスクリプトーム解析−本発明の方法に従って調製されたウマMSC(筋肉由来MSCと略)、ウマのホウォートンゼリーMSC及びウマの骨髄MSC間の5つのmiRNAの差次的発現
[略語]
DF20:20%のウシ胎児血清、5mlのペニシリン(1000U/ml)−ストレプトマイシン(10000μg/ml)、2.5mlのアンフォテリシンB(250μg/ml)、及び5mlのHEPESを備えるDMEM/F12で構成される成長培地。
HBSS:Hankの平衡塩溶液
[参照]
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Claims (4)
- 哺乳類の間充織幹細胞(MSC)を調製する方法であって、
a)前記哺乳類の骨格筋組織からマイクロバイオプシーを収集する工程と、
b)収集後、前記マイクロバイオプシーを適切な培地にセットする工程と、
c)培養中、前記マイクロバイオプシーから出現する細胞を収集する工程と、
d)工程c)で得られた前記細胞をコンフルエンシー近くまで成長させる工程と、
e)工程d)から前記細胞を解離する工程と、
f)密度勾配分画により他の細胞から間充織幹細胞(MSC)を分離し、間充織幹細胞
(MSC)を取得する工程と、
を備える方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
前記培地は、約20%のウシ胎児血清、約5mlのペニシリン(1000U/ml)−
ストレプトマイシン(10000μg/ml)、約2.5mlのアンフォテリシンB(2
50μg/ml)、及び約5mlのHEPESを含むDMEM/F12を備える方法。 - 請求項1又は2に記載の方法であって、
前記哺乳類は、たとえばネズミ、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモッ
ト、畜牛、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、及び、たとえばサルや類人猿等の霊長類のような
、家畜、動物園の動物、スポーツ用の動物、ペット、コンパニオン・アニマル、及び実験
動物を含むグループから選択される方法。 - 請求項1乃至3のいずれか1項に記載に記載の方法であって、さらに、
前記MSCをそれぞれ適切な脂質生成、骨形成、軟骨形成、筋原性、造血、内皮、ニュ
ーロン、心臓、又は肝細胞の分化培地において培養することにより、前記細胞を脂肪細胞
、骨細胞、軟骨細胞、筋原細胞、造血細胞、内皮細胞、神経細胞、心臓細胞、又は肝細胞
に分化させる工程を備える方法。
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