BR112016014116B1 - Método para preparar células-tronco mesenquimais (mscs) de mamíferos - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA PREPARAR CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DE MAMÍFEROS; POPULAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS; COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA OU VETERINÁRIA; CÉLULAS ADIPÓCITAS, OSTEÓCITAS, CONDRÓCITAS, MIOGÊNICAS DIFERENCIADAS, CÉLULAS HEMA TOPOÉTICAS, CÉLULAS ENDOTELIAIS, CÉLULAS NERVOSAS, CÉLULAS CARDÍACAS OU HEPATÓCITOS; E; MÉTODO PARA TRATAR UM OU MAIS DOS SEGUINTES DISTÚRBIOS: DESMITE, OSTEOCONDROSE, ARTRITE, OSTEOPOROSE, TENDINITE, LAMINITE, INFLAMAÇÃO DOS TENDÕES E LIGAMENTOS, FRATURA E DIFICULDADE DE REGENERAÇÃO EM UM MAMÍFERO A presente invenção fornece um novo método para obter células-tronco mesenquimais derivadas de músculos de microbiópsias de origem mamífera. A invenção fornece uma metodologia minimamente invasiva que produz grandes quantidades de MSCs que podem ser diferenciar em diferentes linhagens celulares.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção se refere à produção de células- tronco de mamíferos derivadas de tecido muscular e a usos de tais células-tronco no tratamento de tecido lesionado. Mais particularmente, a invenção fornece a produção de células- tronco mesenquimais (MSCs) derivadas de tecido muscular de mamífero e o uso veterinário de tais células-tronco no tratamento de tecido lesionado.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O uso de células-tronco em medicina veterinária, como medicina equina abre caminhos para uma ampla variedade de oportunidades terapêuticas, promovendo uma regeneração ideal do tecido lesionado. De fato, a tendinite e a osteoartrite são patologias muito frequentes na medicina equina e, infelizmente, tem um prognóstico insatisfatório. De fato, as lesões músculo-esqueléticas representam a fonte mais comum de lesões para cavalos de competição. Embora seja bem conhecido que tecidos (quase) adultos têm algumas células progenitoras tecido-específicas, essas não são, com frequência, suficientes para um reparo eficaz. Desse modo, a medicina regenerativa eficaz exige uma entrada exógena de células em números maiores do que aqueles que estão presentes normalmente no tecido. Ambas essas células devem ser capazes de reparar a lesão, bem como de coordenar o processo de cicatrização.

[003] Na prática veterinária equina atual, as células-tronco mais comumente usadas são células-tronco mesenquimais (MSCs) derivadas de tecido adiposo e derivadas de medula óssea adulta, bem como MSCs da geleia de Wharton (Schnabel et al., 2013, lacono et al., 2012). O aspirado da medula óssea é tipicamente colhido do esterno (espaços medulares 3 a 5) ou do ílio (Adams et al., 2012) e o tecido adiposo é colhido, em geral, da região da base da cauda (Gutierrez-Nibeyro, 2011). A geleia de Wharton é isolada do cordão umbilical (lacono et al., 2012). Esses métodos de amostragem são bastante invasivos, frequentemente não são bem aceitos pelos proprietários dos cavalos de competição e podem provocar algumas infecções.

[004] Uma segunda desvantagem para a pesquisa veterinária é a falta de anticorpos específicos comercialmente disponíveis. Para tanto, anticorpos humanos precisam ser usados e sua reatividade cruzada em animais, como cavalos, precisa ser testada. Como exemplo, apenas 4 % de anticorpos humanos reagem com proteínas equinas equivalentes. Uma imunofenotipagem válida precisa adicionalmente do uso adequado de isótipos de controle para excluir reações de anticorpo não específicas e de células de controle positivas para confirmar a reatividade cruzada em, por exemplo, cavalos. No entanto, não há nenhuma especificação ou marcador padrão para garantir a qualidade das células-tronco animais ou equinas comercialmente disponíveis. Entretanto, alguns grupos de pesquisa tentaram caracterizar de modo eficaz as células-tronco mesenquimais (MSCs) de diversas origens animais, como: medula óssea, tecido adiposo, cordão umbilical, sangue do cordão umbilical, geleia de Wharton, sangue periférico e, muito recentemente, músculo e tecido periosteal (Radtke et al., 2013). Radtke e colaboradores relataram, nesse sentido, um processo para a geração de células-tronco mesenquimais (MSCs) derivadas de músculo equino, em que grandes biópsias musculares (peso de 6 g) são coletadas de cadáveres de cavalo. Esse método é, portanto, altamente invasivo e não é útil para cavalos vivos e cavalos de competição. Em segundo lugar, as células-tronco obtidas são isoladas das biópsias por meio de técnicas de digestão enzimática, o que limita as possibilidades. Em terceiro lugar, as células obtidas pelo processo de Radtke e colaboradores são positivas para CD90 e CD44, porém, são negativas para CD45, CD34, CD146 e CD105. Essa negatividade para CD105 foi relatada como sendo comum em células-tronco mesenquimais (MSCs) de equinos por Radtke et al., 2013.

[005] A partir do que foi dito acima, torna-se evidente que novos métodos são necessários para produzir células-tronco mesenquimais (MSCs) de mamíferos, como cavalos, que envolvem um esforço invasivo mínimo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] Resumindo, as células-tronco usadas em medicina regenerativa devem estar presentes em grande quantidade, ser capazes de serem coletadas e colhidas por um procedimento minimamente invasivo, ser capazes de diferenciação ao longo de múltiplos percursos de linhagem celular de uma maneira reproduzível, ser transplantadas segura e eficazmente de modo autólogo, alogênico ou xenógeno. De fato, esses critérios não são satisfeitos na medicina veterinária regenerativa atual.

[007] A presente invenção fornece, portanto, um novo processo para a geração de células-tronco mesenquimais (MSCs) pluripotentes derivadas de mamíferos a partir de uma microbiópsia. Uma microbiópsia muscular não invasiva (10 a 20 mg) é coletada de um animal vivo, por exemplo, do tecido muscular de um cavalo, cultivada e usada como explante para iniciar a cultura. As células que saíram do explante foram centrifugadas em um gradiente (descontínuo) de densidade para selecionar a parte da população celular cultivada com as maiores porcentagens de células pluripotentes. A imunofenotipagem e a diferenciação de tripla linhagem indicaram, de modo inesperado, que as populações celulares selecionadas por centrifugação de gradiente de densidade eram células-tronco mesenquimais (MSCs) capazes de se diferenciar em adipócitas, osteócitas e condrócitas quando cultivadas no meio de diferenciação adequado.

[008] As células-tronco mesenquimais (MSCs) da presente invenção são positivas para CD44, CD90 e CD 105 e negativas para CD45, MHCII e CD29. Isso se dá em contraste com as células-tronco obtidas por Radtke et al., 2013, as quais foram relatadas como negativas para CD105. Considerando-se as recomendações do ISCT para células-tronco (Dominici et al., 2006), as populações de MSC obtidas no presente documento podem ser classificadas de modo eficaz como células-tronco pluripotentes, já que são altamente positivas para CD90, CD105 e CD44, negativas para CD45, MHCII e, de modo inesperado, para CD29.

[009] As MSCs da presente invenção são, ainda, positivas para miR-128, miR-133B e imiR-802, levemente positivas para miR-218 e negativas para miR-656. Isso se dá em contraste com outras MSCs na técnica, como MSCs da geleia de Wharton ou MSCs da medula óssea. As MSCs da geleia de Wharton são negativas para miR-128, miR-133B, miR-218 e miR- 802 e positivas para miR-656. As MSCs da medula óssea são positivas para miR-218 e miR-802 e negativas para miR-128, miR-133B e miR-656 (consultar a seção de Exemplos). Portanto, existem diferenças particulares nas propriedades das MSCs da presente invenção e as MSCs apresentadas na técnica.

[010] Além disso, essas células suportam uma pluralidade de ciclos de gelo/degelo sem perder sua pluripotência.

[011] A presente invenção oferece, desse modo, uma alternativa mais eficaz e promissora para os métodos já descritos na literatura e, pela primeira vez, fornece a possibilidade de que sejam realizados em animais vivos, como cavalos, devido a seu caráter minimamente invasivo.

[012] Além disso, a cultura celular é iniciada com um método mais simples do que a técnica de digestão enzimática anteriormente usada (Radtke et al., 2013). Para tanto, as microbiópsias musculares são usadas como explantes e células progenitoras aparecem de modo espontâneo no tempo devido. Ao fazê-lo, o número de manipulações é reduzido, impedindo fontes potenciais de contaminação. Nenhum fator de crescimento externo precisou ser adicionado, já que os fatores de crescimento que são naturalmente secretados pela microbiópsia muscular (o explante) são suficientes.

[013] As Células derivadas de músculos são uma mistura de subpopulações de diferentes linhagens e diferentes estágios de desenvolvimento. Com base em sua densidade, relacionada à sua expressão de marcadores moleculares específicos, e devido a um gradiente (descontínuo) de densidade, o método da invenção é capaz de selecionar três subpopulações substancialmente puras de células-tronco pluripotentes mesenquimais dentre os explantes musculares.

[014] Todas as três subpopulações compreendem >90 % de células que são CD44-positivas. Para CD90, a taxa de expressão é de 36 % para fração de 25 a 35 %, 48 % para fração de <15 % e 73 % para fração de 15 a 25 %. Para CD105, a taxa de expressão varia entre 85 e 95 % nas três populações. As três populações também mostram CFU-F e propriedades proliferativas diferentes (consultar a seção de Exemplos).

[015] Além disso, mostrou-se que as ditas células-tronco mesenquimais (MSCs) podem formar colônias similares a fibroblastos em cultura. Além disso, ao contrário do que é normalmente observado em outras fontes de células- tronco mesenquimais, as ditas células também podem se diferenciar em adipócitas, condrócitas e osteócitas e suportar uma pluralidade de ciclos de gelo/degelo sem perder sua pluripotência.

[016] Em uma tentativa de fornecer um processo menos invasivo para a geração de células-tronco mesenquimais (MSCs) animais derivadas de músculos, os inventores constataram que combinar microbiópsia muscular, cultivo do explante e enriquecimento adicional das células que emergem do explante por centrifugação de gradiente (descontínuo) de densidade de modo inesperado gera células MSCs. Foi totalmente inesperado que células recém-geradas provenientes do explante espontaneamente durante o cultivo e enriquecidas adicionalmente por centrifugação de gradiente eram células- tronco mesenquimais (MSCs).

[017] O processo da invenção permite a geração de uma grande quantidade de células-tronco mesenquimais (MSCs) a partir de uma biópsia muito pequena (microbiópsia), sem uma etapa de digestão enzimática. Tal etapa de digestão enzimática seria, em qualquer caso, impossível de se aplicar a uma microbiópsia, como confirmado em Freshney, R.I. et al., 2005 (Culture of animal cells: A manual of basic technique. 5a Edição, Wiley, New York) que apresenta que a quantidade exigida de tecido para o cultivo após uma digestão enzimática é de cerca de 1 a 5 g.

[018] As MSCs obtidas pelo método, de acordo com a presente invenção, expressam CD105, o qual é um componente do complexo TGF-beta 1, que têm diferentes funções biológicas importantes, como angiogênese e indução de crescimento no nível junta-articular. Para uma revisão geral de sinalização de TGF-beta em cartilagem, consultar Finnson KW et al., 2012 (Front Biosci (Schol Ed). 1 de janeiro;4:251 a 268). O TGF-beta 1 estimula a divisão de condrócito, bem como a síntese de matriz de cartilagem. É encontrado, ainda, em derivados de plaquetas, como plasma rico em plaqueta, isto é, plasma sanguíneo que foi enriquecido com plaquetas (PRP) (Lubkowska A et al., 2012, J Biol Regul Homeost Agents. Abril-junho;26(2 Suppl 1):3S a 22S). Como uma fonte concentrada de plaquetas autólogas, o PRP contém (e libera através de degranulação) diversos diferentes fatores de crescimento e outras citocinas que estimulam a regeneração do osso e do tecido mole. Além disso, o TGF-beta 1 diminui a liberação de PGE2 por fibroblastos sinoviais de articulações osteoartríticas e, desse modo, diminui a degradação de matriz estimulada por PGE2 em osteoartrite (Fernandes J.C. et al., 2002, Biorheology, 39, 237 a 46). A expressão de CD105 nas MSCs da invenção parecem, desse modo, conferir excelentes características de regeneração de tecido às células-tronco obtidas.

A INVENÇÃO FORNECE, ENTÃO, OS SEGUINTES ASPECTOS

[019] Aspecto 1. Um método para preparar células-tronco mesenquimais (MSCs) de mamíferos que compreende as etapas de: a) coletar uma microbiópsia do dito mamífero, b) após a coleta, posicionar a dita microbiópsia em um meio de cultura adequado, c) coletar as células que emergem da dita microbiópsia durante o cultivo, d) cultivar as células obtidas na etapa c) até se aproximar da confluência, e) dissociar as células da etapa d), f) separar células-tronco mesenquimais (MSCs) das outras células por fracionamento de gradiente de densidade, obtendo, desse modo, células-tronco mesenquimais (MSCs). As ditas células podem ser opcionalmente purificadas mais uma vez por uma ou mais etapas de subcultivo ou passagem.

[020] Aspecto 2. O método, de acordo com o aspecto 1, em que a dita microbiópsia é obtida a partir de tecido muscular esquelético, como de músculos do pescoço, ombro, peito, costas, cauda, membros, membro posterior, membro anterior, quadris, patas traseiras, etc., de preferência, de tecido do músculo triceps brachii, mais preferencialmente, é obtida da cabeça longa do triceps brachii.

[021] Aspecto 3. O método, de acordo com o aspecto 2, em que a dita microbiópsia é coletada a uma profundidade de cerca de 5 cm na cabeça longa da cabeça longa do triceps brachii.

[022] Aspecto 4. O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 3, em que a dita microbiópsia contém cerca de 15 a cerca 20 mg de tecido.

[023] Aspecto 5. O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 4, em que o dito meio de cultura compreende DMEM/F12 com cerca 20 % de soro bovino fetal, cerca de 5 ml de penicilina (1000 U/ml)-estreptomicina (10000 μg/ml), cerca de 2,5 ml de anfotericina B (250 μg/ml) e cerca de 5 ml de HEPES.

[024] Aspecto 6. O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 5, em que, na etapa d), as células da fração de densidade abaixo de 35 % são obtidas.

[025] Aspecto 7. O método, de acordo com o aspecto 6, em que, na etapa d), as células com frações de densidade <15 %, 15 a 25 % e/ou 25 a 35 % são obtidas.

[026] Aspecto 8. O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 7, em que o dito mamífero é selecionado do grupo que compreende: animais domésticos e de criação, animais de jardim zoológico, animais de competições esportivas, animais de estimação, animais de companhia e animais de laboratório, como, por exemplo, camundongos, ratos, hamsters, coelhos, cachorros, gatos, porquinhos-da- índia, gado, vacas, ovelhas, cavalos, porcos e primatas, por exemplo, macacos e símios.

[027] Aspecto 9. Uma população de células- tronco mesenquimais obtida através do método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 8.

[028] Aspecto 10. Uma população de células- tronco mesenquimais, ou a população de células-tronco mesenquimais, de acordo com o aspecto 9, caracterizada por as ditas células expressarem CD105, de preferência, em que as ditas células expressam CD105 em combinação com CD44 e/ou CD90.

[029] Aspecto 11. A população de células-tronco mesenquimais, de acordo com o aspecto 9 ou 10, caracterizada por as ditas células não expressarem os seguintes marcadores: CD45, MHC II e CD29.

[030] Aspecto 12. A população de células-tronco mesenquimais, de acordo com qualquer um dos aspectos 9 a 11, caracterizada por as ditas células expressarem pelo menos um microRNA selecionado do grupo que compreende: miR-128 e miR- 133B.

[031] Aspecto 13. A população de células-tronco mesenquimais, de acordo com qualquer um dos aspectos 9 a 12, caracterizada por as ditas células não expressarem o seguinte microRNA: miR-656.

[032] Aspecto 14. Uma composição farmacêutica ou veterinária que compreende as células-tronco mesenquimais obtidas de acordo com o método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 8, ou que compreende uma população de células- tronco mesenquimais, de acordo com qualquer um dos aspectos 9 a 13.

[033] Aspecto 15. A população de células-tronco mesenquimais, de acordo com qualquer um dos aspectos 9 a 13, ou a composição farmacêutica ou veterinária, de acordo com o aspecto 14, para uso como um medicamento ou como um agente farmacêutico ou veterinário.

[034] Aspecto 16. A população de células-tronco mesenquimais, de acordo com qualquer um dos aspectos 9 a 13, ou a composição farmacêutica ou veterinária, de acordo com o aspecto 14, para uso no tratamento de um ou mais dos seguintes distúrbios: desmite, osteocondrose, artrite, osteoporose, tendinite, laminite, inflamação dos tendões e ligamentos, fratura e dificuldade de regeneração em um mamífero.

[035] Aspecto 17. A população de células-tronco mesenquimais for uso, de acordo com os aspectos 15 ou 16, em que células-tronco mesenquimais (MSCs) autólogas, alogênicas ou xenogênicas são usadas.

[036] Aspecto 18. O método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 8, que compreende adicionalmente a etapa de diferenciação das células em adipócitas, osteócitas, condrócitas, células miogênicas, células hematopoéticas, células endoteliais, células nervosas, células cardíacas ou hepatócitos cultivando-se as MSCs em um meio de diferenciação adipogênica, osteogênica, condrogênica, miogênica, hematopoética, endotelial, neuronal, cardíaca ou hepatocítica adequado, respectivamente. De preferência, o método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 8, compreende a etapa de diferenciação das células em adipócitas, osteócitas ou condrócitas, cultivando-se as MSCs em um meio de diferenciação adipogênica, osteogênica ou condrogênica adequado, respectivamente.

[037] Aspecto 19. Células adipócitas, osteócitas ou condrócitas, miogênicas diferenciadas, células hematopoéticas, células endoteliais, células nervosas, células cardíacas ou hepatócitos obtidos pelo método, de acordo com o aspecto 18.

[038] Aspecto 20. Uma composição farmacêutica ou veterinária que compreende as células adipócitas, osteócitas ou condrócitas diferenciadas, de acordo com o aspecto 19.

[039] Aspecto 21. As células adipócitas, osteócitas ou condrócitas diferenciadas, de acordo com o aspecto 19, ou a composição farmacêutica ou veterinária, de acordo com o aspecto 20, para uso no tratamento de um ou mais dos seguintes distúrbios: desmite, osteocondrose, artrite, osteoporose, tendinite, laminite, inflamação dos tendões e ligamentos, fratura e dificuldade de regeneração em um mamífero.

[040] Aspecto 22. Um método para tratar um ou mais dos seguintes distúrbios: desmite, osteocondrose, artrite, osteoporose, tendinite, laminite, inflamação dos tendões e ligamentos, fratura e dificuldade de regeneração em um mamífero que compreende a etapa de administrar ao dito mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de MSCs obtidas através do método, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 a 8, ou da composição farmacêutica ou veterinária, de acordo com o aspecto 14, tratando, desse modo, os ditos um ou mais distúrbios no dito mamífero.

[041] Aspecto 23. Um método para tratar um ou mais dos seguintes distúrbios: desmite, osteocondrose, artrite, osteoporose, tendinite, laminite, inflamação dos tendões e ligamentos, fratura e dificuldade de regeneração em um mamífero que compreende a etapa de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de células adipócitas, osteócitas ou condrócitas, miogênicas diferenciadas, células hematopoéticas, células endoteliais, células nervosas, células cardíacas ou hepatócitos obtidos através do método, de acordo com o aspecto 18, ou da composição farmacêutica ou veterinária, de acordo com o aspecto 20, tratando, desse modo, os ditos um ou mais distúrbios no dito mamífero.

[042] Aspecto 24. Os métodos, de acordo com o aspecto 22 ou 23, em que as ditas células administradas são autólogas, alogênicas ou xenogênicas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[043] A presente invenção é ilustrada pelas seguintes figuras que devem ser consideradas para propósitos ilustrativos apenas e que não limitam de modo algum a invenção às modalidades apresentadas nessas:

[044] Figura 1: Fotografia microscópica representativa de aspecto morfológico de unidades formadoras de colônia similar a fibroblastos obtidas com células de cada fração de Percoll semeadas a uma baixa densidade (500000 células/frasco) e cultivadas por 10 dias (manchamento com May-Grunwald Giemsa; magnificação de A: 100 x; B: 400 x).

[045] Figura 2: Imagens de FACS de controle que mostram a reatividade cruzada dos anticorpos escolhidos em células mononucleadas de medula óssea equina.

[046] Figura 3: Histogramas representativos de citometria de fluxo de células de fração de Percoll de 15 a 25 %.

[047] (Cavalo 2). Essas células são altamente positivas para CD105, CD90 e CD44, porém, negativas para CD45.

[048] Figura 4: Fotografias microscópicas representativas da diferenciação adipocítica obtida para o cavalo 2 após 7 dias em meio de diferenciação (manchamento com solução de Oil Red O, magnificação de 400 x). <15 %, 15 a 25 %, 25 a 35 % representam as células das 3 frações de Percoll, Controle representa as células para as quais nenhuma diferenciação foi induzida.

[049] Figura 5: Fotografias representativas de manchamento de cortes finos com Azul Alciano, da condrosfera obtida após 3 semanas de cultura no meio de diferenciação condrogênico (A) ou do pélete de controle (B; células não cultivadas com meio de diferenciação condrogênico).

[050] Figura 6: Fotografias microscópicas representativas da diferenciação osteogênica obtida para o cavalo 2 após 7 dias em meio de diferenciação (manchamento com solução de Vermelho de Alizarina, magnificação de 400 x). <15 %, 15 a 25 %, 25 a 35 % representam as células das 3 frações de Percoll, Controle representa as células para as quais nenhuma diferenciação foi induzida.

[051] Figura 7: Representa o nível diferenciado de expressão (número de cópias detectado) de 5 miRNAs em 3 fontes de células-tronco mesenquimais (MSCs) de cavalo, isto é, MSCs de geleia de Wharton, MSCs de medula óssea e MSCs derivadas de músculo, de acordo com a presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[052] Como usado no presente documento, as formas singulares "um", "uma", “o” e "a" incluem ambas as formas singular e plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Com propósitos exemplificativos, "uma célula" se refere a uma ou mais de uma célula.

[053] Os termos "que compreende", "compreende" e "composto por”, como usado no presente documento, são sinônimos de "que inclui", "inclui" ou "que contém", "contém", e são inclusivos ou abertos e não excluem membros, elementos ou etapas de método não citados adicionais.

[054] A citação de faixas numéricas com pontos finais inclui todos os números e frações integrados às faixas respectivas, bem como os pontos finais citados.

[055] O termo "cerca", como usado no presente documento, quando se refere a um valor mensurável como um parâmetro, uma quantidade, uma duração de tempo e similares, pretende abranger variações de +/-10 % ou menos, de preferência, +/-5 % ou menos, mais preferencialmente +/-1 % ou menos e, ainda mais preferencialmente, +/-0,1 % ou menos de e a partir do valor especificado, desde que tais variações sejam adequadas para desempenho na invenção apresentada. Deve-se compreender que o valor ao qual o modificador "cerca" se refere também é, por si só, especificamente e, de preferência, apresentado.

[056] Todas as referências citadas no presente relatório descritivo são incorporadas no presente documento a título de referência em sua totalidade. Em particular, os ensinamentos de todas as referências do presente documento especificamente citadas estão incorporados a título de referência.

[057] A menos que seja definido de outro modo, todos os termos usados para revelar a invenção, incluindo termos técnicos e científicos, têm o significado que é comumente compreendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica a qual esta invenção pertence. A fim de obter melhores diretrizes, definições de termos são incluídas para que o conhecimento da presente invenção seja mais bem compreendido.

[058] Para métodos gerais referentes à invenção, é feita referência a livros bem conhecidos, incluindo, por exemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed." (Sambrook et al., 1989), Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987), a series Methods in Enzymology (Academic Press), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3a Ed." (F. M. Ausubel et al., eds., 1987 & 1995); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu ed., Academic Press 1995), incorporados a título de referência no presente documento.

[059] Para uma elaboração adicional de técnicas gerais úteis na prática desta invenção, o técnico pode se referir a livros e análises padrão em biologia celular, cultura de tecido e embriologia. Estão incluídos "Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach" (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987); "Guide to Techniques in Mouse Development" (P. M. Wasserman et al. eds., Academic Press 1993); "Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro" (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); "Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy" (P. D. Rathjen et al., al.,1993). A diferenciação de células- tronco é analisada, por exemplo, em Robertson. 1997. Meth Cell Biol 75: 173; e Pedersen. 1998. Reprod Fertil Dev 10: 31, e Lisas et al., 2011, incorporados a título de referência no presente documento.

[060] As técnicas gerais de cultura celular e coleta de meio são definidas em Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al. 1997. Curr Opin Biotechnol 8: 148); Serum- free Media (K. Kitano. 1991. Biotechnology 17: 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr Opin Biotechnol 2: 375, 1991), incorporado a título de referência no presente documento.

[061] O termo "célula-tronco" se refere, em geral, a uma célula competente em proliferação não especializada ou relativamente menos especializada, a qual é capaz de autorrenovação, isto é, pode se proliferar sem diferenciação, e a qual ou cuja progênie pode resultar pelo menos em um tipo de célula relativamente mais especializado. O termo abrange células-tronco capazes de autorrenovação substancialmente ilimitada, isto é, em que a progênie de uma célula-tronco ou pelo menos parte dessa retém substancialmente o fenótipo não especializado ou relativamente menos especializado, o potencial de diferenciação e a capacidade de proliferação as célula-tronco de origem, bem como células-tronco que exibem uma autorrenovação limitada, isto é, em que a capacidade da progênie ou parte dessa para proliferação e/ou diferenciação adicional é comprovadamente reduzida em comparação à célula de origem. Com propósitos exemplificativos e não de limitação, uma célula-tronco pode resultar em descendentes que podem ser diferenciar ao longo de uma ou mais linhagens para produzir células cada vez mais relativamente mais especializadas, em que tais descendentes e/ou células cada vez mais relativamente mais especializadas podem ser, por si sós, células-tronco, como definido no presente documento, ou até mesmo para produzir células terminalmente diferenciadas, isto é, células totalmente especializadas, as quais podem ser pós-mitóticas.

[062] O termo "célula-tronco mesequimal" ou "MSC", como usado no presente documento, se refere a uma célula-tronco derivada do mesoderma de um mamífero adulto que é capaz de gerar células de linhagens mesenquimais, tipicamente células de duas, de preferência, de três ou mais linhagens mesenquimais, por exemplo, linhagem osteocítica (osso), condrocítica (cartilagem), miocítica (músculo), tendonocítica (tendão), fibroblástica (tecido conjuntivo), adipocítica (gordura) e estromogênica (estroma da medula óssea). Comumente, porém, sem limitação, uma célula pode ser considerada MSC se for capaz de formar células de cada uma das linhagens adipocíticas, condrocíticas e osteocíticas, usando condições padrão de diferenciação aceitas na técnica e método de avaliação de fenótipo celular, por exemplo, como descrito em Pittenger et al. 1999 (Science 284: 143-7) ou Barberi et al.,2005 (PLoS Med 2: e161), e Lisas et al., 2011.

[063] O termo MSC também abrange a progênie de MSC, por exemplo, a progênie obtida por propagação in vitro ou ex vivo da MSC obtida de uma amostra biológica de um indivíduo.

[064] O termo "isolar" com referência a um componente particular se refere a separar aquele componente de pelo menos um outro componente de uma composição da qual o componente anterior está, desse modo, "isolado". O termo "isolado" usado em relação a qualquer célula, grupo de células ou uma população celular também implica que tal célula, grupo de células ou população celular não faz parte de um corpo animal.

[065] O ISCT determinou precisamente as qualidades que as células devem possuir para serem definidas como células-tronco mesenquimais (MSCs) como a seguir: as células devem ser plástico-aderentes, positivas para os marcadores CD73, CD90 e CD105, negativas para os marcadores CD14 (ou CD11b), CD34, CD45, CD79a (ou CD19) e MHC-II, e devem exibir a habilidade de se diferenciar em células de origem mesodérmica, como osteoblastos, condroblastos e adipócitos (Dominici et al., 2006). O uso de outros marcadores de MSC, como CD29 ou CD44, também foi relatado (Pittenger et al., 1999). Os critérios do ISCT foram estendidos para a invenção no presente documento. As células MSC de mamíferos da presente invenção são, portanto, definidas por expressarem ou coexpressarem (isto é, são positivas para) pelo menos o marcador mesenquimal CD105 e, de preferência, também um ou mais dos seguintes marcadores: CD44 e CD90. As células MSC de mamíferos da presente invenção também são definidas por expressarem ou coexpressarem (isto é, são positivas para) um ou mais dos seguintes microRNAs: miR-128, miR-133B, miR-218 ou miR-802. As células MSC de mamíferos da presente invenção também são definidas por não expressarem miR-656.

[066] Ao longo deste relatório descritivo, "coexpressar" pretende abranger o significado de "que compreende coexpressão de" de tal modo que as células possam expressar outros marcadores ou microRNAs além dos marcadores ou microRNAs particulares citados que caracterizam as células.

[067] Os termos microRNA, miRNA, miR ou eca-miR são usados no presente documento de modo alternável e se referem a RNAs não codificantes maduros com 19 a 25 nucleotídeos ou precursores desses, ou fragmentos desses, derivados de genes endógenos de organismos vivos, como animais. Os microRNAs maduros são processados a partir de precursores similares a grampo de cabelo (hairpin) mais longos denominados pré-microRNAs (pré-miRs) que tem um comprimento de aproximadamente 75 nucleotídeos.

[068] Quando se diz que a célula é positiva para um marcador ou microRNA particular, isso significa que uma pessoa versada na técnica irá identificar a presença ou evidência de um sinal distinto, por exemplo, detectável por anticorpo ou detecção por reação em cadeia da polimerase da transcrição reversa, para aquele marcador ou microRNA ao realizar a medição adequada, em comparação a controles adequados. Quando o método permite uma avaliação quantitativa do marcador ou microRNA, as células positivas geram um sinal que é significativamente diferente e maior ou mais forte do que o controle, por exemplo, porém, sem limitação, pelo menos 1,5 vezes maior do que tal sinal gerado por células de controle, por exemplo, pelo menos 2 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes maior ou ainda maior.

[069] A expressão de marcadores célula- específicos pode ser detectada com o uso de qualquer técnica imunológica adequada conhecida na técnica, como imunocitoquímica ou absorção por afinidade, análise Western blot, FACS, ELISA, etc., ou por qualquer ensaio bioquímico adequado de atividade enzimática, ou por qualquer técnica adequada de medição da quantidade do mRNA marcador, por exemplo, Northern blot, RT-PCR semiquantitativa ou quantitativa, etc.

[070] A expressão de microRNAs pode ser determinada, por exemplo, com um ensaio para expressão de gene global (por exemplo, com o uso de um ensaio de microarranjo para análise de expressão de perfil de microRNAs, uma placa de microRNA qPCR pronta para uso ou sequenciamento de RNA) ou por ensaios de detecção específicos, por exemplo, porém, sem limitação, PCR quantitativa, PCR (qRT-PCR) (tempo real) da transcrição reversa quantitativa, PCR em tempo real de ácido nucleico bloqueado (LNA) ou northern blotting. Em particular, a medição da expressão de um microRNA pode ser realizada com uma sonda de oligonucleotídeo específica para a detecção do dito microRNA. A dita sonda de oligonucleotídeo pode se ligar direta e especificamente ao microRNA, ou pode especificamente submeter o dito microRNA à transcrição reversa. De modo alternativo, a dita sonda de oligonucleotídeo pode se ligar a um cDNA obtido do dito microRNA. A dita sonda de oligonucleotídeo também pode ampliar um cDNA obtido do dito microRNA.

[071] Dados da sequência de aminoácido e ácido nucleico para proteínas marcadoras listadas nesta revelação são, em geral, conhecidos e podem ser obtidos em bancos de dados públicos, como, entre outros, do banco de dados de "Protein Reviews on the Web" do NIH (http://mpr.nci.nih.gov/prow/), do banco de dados de "Entrez Gene" do NIH (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene) ou do banco de dados Uniprot/Swissprot (http://www.expasy.org/). Reagentes e métodos de detecção adequados para os ditos marcadores podem ser designados com base em tais informações de sequência ou, mais comumente, estão disponíveis comercialmente (por exemplo, reagentes de anticorpo monoclonal marcados).

[072] O termo "CD105" abrange o antígeno conhecido como CD105, ou seus sinônimos, como endoglina. CD105 é uma glicoproteína de membrana localizada em superfícies celulares e é um marcador conhecido de célula- tronco mesequimal. Como exemplo, a sequência de aminoácido parcial do antígeno CD105 equino pode ser encontrada no banco de dados Genbank sob o número de acesso AGW 16345.1.

[073] O termo "CD90" abrange o antígeno CD90, ou seus sinônimos, como a glicoproteína de membrana Thy-1. Como exemplo, a sequência de aminoácido do antígeno CD90 equino pode ser encontrada no banco de dados Genbank sob o número de acesso ACG61223.1.

[074] O termo "CD44" abrange o antígeno geralmente conhecido como CD44, ou seus sinônimos, como receptor III de matriz extracelular, receptor de endereçamento/adesão de linfócito GP90, HUTCH-I, antígeno Hermes, receptor de Hialuronato, ou Glicoproteína fagocítica 1. Como exemplo, a sequência de aminoácido do antígeno CD44 equino pode ser encontrado no banco de dados Genbank sob o número de acesso CAA47331.1.

[075] Os reagentes de anticorpo comercialmente disponíveis exemplificativos para detecção dos ditos marcadores de MSC incluem, entre outros, anticorpos monoclonais anti-CD105-RPE (ABD Serotec), anti-CD44-APC (BD Pharmigen) e anti-CD90 (VMDR). Anticorpos alternativos que são especificamente ligados a CD105, CD44 ou CD90 podem ser identificados pela pessoa versada na técnica.

[076] Em uma modalidade, as MSCs expressam pelo menos um marcador mesenquimal escolhido a partir de: CD105, CD90 e CD44. De preferência, as MSCs expressam pelo menos o marcador mesenquimal CD105. A invenção contempla as células MSC, as quais coexpressam CD105 e CD90, células que coexpressam CD90 e CD44, bem como células que coexpressam CD105 e CD44. Também são abrangidas células, em particular, células MSC, as quais coexpressam CD105, CD90 e CD44. Como mostrado nos exemplos, células MSC do perfil de marcador acima também podem coexpressar outros marcadores.

[077] Em outra modalidade, as MSCs expressam pelo menos um microRNA selecionado do grupo que compreende: miR-128 e miR-133B. A invenção contempla MSCs que expressam pelo menos miR-128 ou MSCs que expressam pelo menos miR-133B. Também são abrangidas MSCs que coexpressam miR-128 e miR- 133B. Em uma modalidade adicional, as MSCs não expressam o seguinte microRNA: miR-656.

[078] Os microRNAs listados nesta revelação são geralmente conhecidos e podem ser obtidas em bancos de dados públicos como, entre outros, o banco de dados miRBase (http://www.mirbase.org).

[079] O termo "miR-128" abrange o microRNA conhecido como miR-128 ou seu precursor. Como exemplo, a sequência de nucleotídeo do miR-128 equino pode ser encontrada no banco de dados miRBase sob o número de acesso MI0012821.

[080] O termo "miR-133B" abrange o microRNA conhecido como miR-133B ou seu precursor. Como exemplo, a sequência de nucleotídeo do miR-133B equino pode ser encontrada no banco de dados miRBase sob o número de acesso MI0012844.

[081] O termo "miR-656" abrange o microRNA conhecido como miR-656 ou seu precursor. Como exemplo, a sequência de nucleotídeo do miR-656 equino pode ser encontrada no banco de dados miRBase sob o número de acesso MI0012915.

[082] A pessoa versada na técnica está ciente de que os microRNAs podem ser designados com diferentes nomes ou sinônimos.

[083] As células MSC podem exibir, ainda, certas características morfológicas, como qualquer um ou mais dentre adesão ao plástico da cultura de tecido; crescimento em monocamadas; e formato ovoide, estrelado ou redondo mononuclear com núcleos redondos a ovais que têm nucleóleos proeminentes.

[084] O termo "população celular" geralmente se refere a um agrupamento de células. Uma população celular pode consistir em ou pode compreender pelo menos uma fração de células de um tipo comum ou que tem características em comum. Tais características podem incluir, sem limitação, características morfológicas, potencial para diferenciação (por exemplo, pluripotente, multipotente, unipotente, etc.; por exemplo, se multipotente ou unipotente, habilidade para se diferenciar em tipos específicos de célula), ou a presença e/ou nível de um, dois, três ou mais marcadores associados à célula, por exemplo, antígenos de superfície. Tais características podem definir, então, uma população celular ou uma fração dessa. De preferência, tal população celular é uma população de células-tronco mesenquimais, mais preferencialmente, uma população substancialmente homogênea de células-tronco mesenquimais.

[085] O termo "população substancialmente homogênea" ou "população substancialmente pura" de células- tronco mesenquimais se refere a uma população celular que compreende uma fração de MSCs, como definido acima, em que a dita fração na dita população celular é de pelo menos 50 %, por exemplo, pelo menos 55 %, de preferência, pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, mais preferencialmente, pelo menos 70 %, por exemplo, pelo menos 75 %, ainda mais preferencialmente, pelo menos 80 %, por exemplo, pelo menos 85 %, com máxima preferência, pelo menos 90 %, por exemplo, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou até mesmo próximo ou igual a 100 %.

[086] A expressão "centrifugação de gradiente de densidade" abrange todos os tipos de técnicas de separação de célula ou produtos que abrangem a separação baseada em densidade de células. Exemplos não limitantes podem ser representados por centrifugação de gradiente de densidade em um gradiente de polímero sacarídico, ou sílica coloidal. Exemplos não limitantes de gradientes comercialmente disponíveis são: percoll (sílica coloidal revestida com polivinilpirrolidona ou silano), ficoll (polímeros sacarídicos de alto peso molecular), Ficoll-Paque (Ficoll mais diatrizoato de sódio e edetato dissódico de cálcio), solução de densidade flutuante (BDS, que compreende sílica coloidal), lymphoprep (diatrizoato de sódio e polissacarídeo), etc. fica evidente que a pessoa versada na técnica será capaz de selecionar gradientes adequados para separar as células-tronco obtidas com o método de acordo com a presente invenção. Com o uso de métodos da presente invenção, as células-tronco mesenquimais (MSCs) são tipicamente encontradas nas interfaces de densidade de Percoll de <15 %, 15 a 25 % ou 25 a 35 %, após centrifugação a 1250 x g (25 °C, 20 min). As células-tronco mesenquimais que coexpressam as proteínas marcadoras desejadas podem ser, então, selecionadas, enriquecidas ou isoladas da população geral de células isoladas e opcionalmente expandidas por métodos conhecidos por si, como, por exemplo, com o uso de separação de células ativadas por fluorescência (FACS), separação de células ativadas magnéticas (MACS), tecnologias baseadas em afinidade, entre outros, cromatografia por afinidade, ou a técnica de pré-placa e combinações desses. Os métodos exemplificativos são relatados em Wu et al., 2010 (consultar Cell Tissue Research, Jun;340(3):549 a 567).

[087] Permite-se que células vivas que têm um perfil de expressão desejado se liguem a reagentes (mais comumente, reagentes imunológicos, como, por exemplo, anticorpos monoclonais) específicos para os respectivos marcadores, em que os ditos reagentes são, por sua vez, modificados (por exemplo, por um fluoróforo, ou por imobilização em partículas magnéticas ou outro tipo de fase estacionária), como para facilitar a seleção ou captura de células ligadas pelos ditos reagentes de células não ligadas. Para orientação geral sobre esses métodos, consultar, entre outros, Flow Cytometry and Cell Sorting, 2a ed., por Andreas Radbruch (ed.), Springer 1999 (ISBN 3540656308); In Living Color: Protocols in Flow Cytometry and Cell Sorting, 1a ed., por RA Diamond e S Demaggio (eds.), Springer 2000 (ISBN 3540651497); Flow Cytometry Protocols (Methods in Molecular Biology), 2a ed., por TS Hawley e RG Hawley (eds.), Human Press 2004 (ISBN 1588292355); Affinity Separations: A Practical Approach, P Matejtschuk (ed.), Oxford University Press, 1997 (ISBN 0199635501); e Dainiak et al. 2007. Adv Biochem Eng Biotechnol 106: 1 a 18.

[088] A expressão "meio de cultura adequado" abrange todos os meios de cultura celular que suportam a sobrevivência e/ou crescimento das células células-tronco mesenquimais (MSCs) ou populações de célula-tronco mesequimal. Exemplos não limitantes são: DF20, F12 de DMEM- Ham, DMEM, Alpha-MEM etc., tipicamente suplementados com pelo menos antibióticos e soro bovino fetal (FBS) e, opcionalmente, com agentes fungicidas e tampões.

[089] Como exemplo apenas, o seguinte meio de cultura foi usado nos exemplos: meio DF20 que compreende: DMEM/F12 com cerca 20 % de soro bovino fetal, cerca 5 ml de penicilina (1000 U/ml)-estreptomicina (10000 μg/ml), cerca 2,5 ml de anfotericina B (250 μg/ml) e cerca 5 ml de HEPES.

[090] Para diferenciação em, por exemplo, adipócitas, osteócitas e condrócitas, as MSCs ou populações de célula-tronco mesequimal da invenção foram cultivadas em um "meio de diferenciação" adequado. O dito meio de diferenciação pode ser, por exemplo: para diferenciação adipogênica: meio NH AdipoDiff (Miltenyi Biotec); para diferenciação condrogênica: meio de diferenciação condrócito (Meio NH ChondroDiff; Miltenyi Biotec); para diferenciação osteogênica: meio osteogênico (Meio NH OsteoDiff; Miltenyi Biotec). Os meios listados no presente documento são meramente mostrados como meios exemplificativos, porém, a pessoa versada na técnica será capaz de usar qualquer outro meio de diferenciação comercial ou especificamente desenvolvido. Outros exemplos de meios de diferenciação adequados para outras células, como células miogênicas, células hematopoéticas, células endoteliais, células nervosas, células cardíacas, ou hepatócitos podem ser oferecidos cultivando-se as MSCs em um meio adequado de diferenciação miogênica, hematopoética, endotelial, neuronal, cardíaca ou hepatocítica respectivamente, cujos exemplos podem ser, por exemplo, encontrados em Usas et al., 2011.

[091] Modos adequados de "destacar", "dispersar", "dissociar" ou "separar" células são geralmente conhecidos na técnica e podem ser usados na presente invenção. Esses envolvem, por exemplo, tratamento com enzimas proteolíticas, quelação de íons bivalentes, desintegração mecânica, ou combinações de qualquer um acima. De preferência, a dita dissociação celular pode envolver digestão enzimática, uso favorável de tripsina (por exemplo, como descrito acima), opcionalmente, em combinação com quelação de íons bivalentes, uso favorável de EDTA (por exemplo, como descrito acima), e/ou dissociação mecânica das células então tratadas. Esses podem envolver, por exemplo, passar repetidamente as células através de uma pipeta com orifícios pequenos (por exemplo, uma ponta de micropipeta de 1000 μl) e/ou pipetar uma corrente de uma suspensão que contém as células contra uma superfície sólida (por exemplo, contra a parede do vaso de cultura). Desse modo, uma suspensão celular que compreende MSCs da invenção pode ser obtida.

[092] O termo "microbiópsia" abrange todos os métodos de coleta subcutâneos livres de sutura preferenciais e minimamente invasivos de uma amostra de tecido. O tamanho da amostra de uma microbiópsia é, como o termo define, muito pequeno e compreende tipicamente cerca 15 a cerca 20 mg de tecido. Qualquer técnica ou dispositivo possível adequado para coletar microbiópsias pode ser usado. Exemplos não limitantes são agulhas de microbiópsia, conchotomias ou sistemas de microbiopsia com ação de mola conhecidos na técnica. Como exemplo apenas, uma agulha de microbiópsia com calibre 14 e uma pistola de microbiópsia podem ser usadas.

[093] A fonte da microbiópsia usada no método da presente invenção para isolar células-tronco mesenquimais (MSCs) é, de preferência, tecido muscular esquelético de mamíferos. Exemplos de tecidos musculares esqueléticos são músculos do pescoço, ombro, peito, costas, cauda, membros, membro posterior, membro anterior, quadris, patas traseiras, etc. o tecido muscular exemplificativo usado nos exemplos é o músculo triceps brachii do cavalo, mais preferencialmente, obtido da cabeça longa do triceps brachii, com máxima preferência, obtido de uma profundidade de cerca 5 cm na cabeça longa da cabeça longa do triceps brachii. A coleta do tecido muscular é preferencial para, por exemplo, a medula óssea ou o tecido periosteal, devido à quantidade, porém, também devido à facilidade de acesso do tecido muscular e à baixa morbididade nesse sítio de doador. O tecido embrionário é explicitamente excluído como uma fonte de microbiópsia. Um estudo realizado por Votion et al., 2010 demonstrou que a microbiópsia realizada por veterinários em prática clínica é concebível. Além disso, a ausência de efeitos colaterais permite a consideração desse método de coleta de amostra para uso em cavalos de alto desempenho, até mesmo durante competições (Votion et al., 2010) e já é usado para iniciar de modo bem sucedido, por método de explante, uma cultura primária de mioblastos esqueléticos de equino (Ceusters et al., 2012).

[094] A expressão "mamífero" se refere a todos os mamíferos, incluindo, porém, sem limitação, animais domésticos e de criação, animais de jardim zoológico, animais de competições esportivas, animais de estimação, animais de companhia e animais de laboratório, como, por exemplo, camundongos, ratos, hamsters, coelhos, cachorros, gatos, porquinhos-da-índia, gado, vacas, ovelhas, cavalos, porcos e primatas, por exemplo, macacos e símios. Os mamíferos preferenciais são cavalos, cachorros ou gatos.

[095] Como explicado no presente documento, as células-tronco mesenquimais obtidas das ditas microbiópsias são células que emergem espontaneamente ao redor da microbiópsia quando cultivadas de acordo com o método, como reivindicado. O termo "emergir" abrange a ocorrência espontânea de células, isto é, sem a necessidade de manipulação da biópsia, ou sem a necessidade de adicionar fatores ou agentes adicionais de crescimento, diferenciação ou outros fatores. A etapa de cultivo da microbiópsia, também denominada explante nesse estágio, gera de modo inesperado e espontâneo células-tronco mesenquimais que podem ser adicionalmente subcultivadas, purificadas e preservadas por, por exemplo, criopreservação, como definido no presente documento. Os meios adequados para o dito cultivo da dita microbiópsia são DF20, F12 de DMEM-Ham, DMEM, Alpha-MEM etc. os ditos meios contém tipicamente ou são suplementados com pelo menos antibióticos e soro bovino fetal (FBS) e, opcionalmente, com agentes fungicidas e tampões.

[096] A presente invenção também fornece métodos de tratamento administrando-se as MSCs diferenciadas ou não diferenciadas ou populações de célula-tronco mesequimal diferenciadas ou não diferenciadas, como definido no presente documento, particularmente a indivíduos que necessitam dessas, sendo que estão incluídos indivíduos que se beneficiariam do tratamento de uma dada afecção, como distúrbios mioartroesquelético. Tais indivíduos podem incluir, sem limitação, aqueles que foram diagnosticados com a dita afecção, aqueles suscetíveis a desenvolver a dita afecção e/ou aqueles nos quais a dita afecção deve ser prevenida.

[097] O termo "indivíduo" abrange todos os mamíferos, incluindo, porém, sem limitação, animais domésticos e de criação, animais de jardim zoológico, animais de competições esportivas, animais de estimação, animais de companhia e animais de laboratório, como, por exemplo, camundongos, ratos, hamsters, coelhos, cachorros, gatos, porquinhos-da-índia, gado, vacas, ovelhas, cavalos, porcos e primatas, por exemplo, macacos e símios. Os indivíduos preferenciais são cavalos, cachorros ou gatos.

[098] Os termos "tratar" ou "tratamento" abrangem tanto o tratamento terapêutico de um distúrbio já desenvolvido, como a terapia de um distúrbio mioartroesquelético já desenvolvido, quanto medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é prevenir ou diminuir as chances de incidência de um sofrimento indesejado, como para prevenir as chances de contração e progressão de um distúrbio mioartroesquelético, como, porém, sem limitação: desmite, osteocondrose, artrite, osteoporose, tendinite, inflamação dos tendões e ligamentos, fratura e dificuldade de regeneração. Os resultados clínicos benéficos ou desejados de tal tratamento podem incluir, sem limitação, amenização de um ou mais sintomas ou um ou mais marcadores biológicos, diminuição da extensão da doença, estabilizar (isto é, não piorar) o estado da doença, retardamento ou desaceleração da progressão da doença, melhora ou paliação do estado da doença, e similares. "Tratamento" também pode significar prolongar a sobrevivência como em comparação à sobrevivência esperada, se não estivesse recebendo tratamento.

[099] O termo "quantidade profilaticamente eficaz" se refere a uma quantidade da composição farmacêutica ou veterinária, de acordo com a invenção que inibe ou retarda, em um indivíduo, o início de um distúrbio sendo investigado por um pesquisador ou veterinário. O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", como usado no presente documento, se refere a uma quantidade da composição farmacêutica ou veterinária, de acordo com a invenção, que obtém a resposta biológica ou medicinal em um indivíduo que está sendo investigada por um pesquisador ou veterinário, a qual pode incluir, entre outros, a amenização dos sintomas da doença ou distúrbio sendo tratado. Os métodos são conhecidos na técnica por determinar terapêutica e profilaticamente as doses eficazes.

[0100] O tratamento pode empregar células MSCs autólogas (isto é, células derivadas do indivíduo a ser tratado), alogênicas (isto é, células derivadas de indivíduo(s) diferente(s) do indivíduo a ser tratado, porém, que faz parte da mesma espécie) ou xenogênicas (isto é, células derivadas de indivíduo(s) que pertencem a uma espécie diferente do indivíduo a ser tratado), MSCs diferenciadas ou suas respectivas populações celulares, como definido no presente documento.

[0101] As composições farmacêuticas ou veterinárias irão compreender tipicamente as células-tronco mesenquimais, células-tronco mesenquimais diferenciadas ou as respectivas populações de célula-tronco mesequimal (diferenciadas) da invenção como o ingrediente ativo, e um ou mais carreador/excipiente farmaceuticamente aceitável. Como usado no presente documento, "carreador" ou "excipiente" inclui qualquer e todos os solventes, diluentes, tampões (como, por exemplo, solução salina neutra tamponada ou solução salina fosfatada tamponada), solubilizantes, coloides, meio de dispersão, veículos, cargas, agentes quelantes (como, por exemplo, EDTA ou glutationa), aminoácidos (como, por exemplo, glicina), proteínas, disintegrantes, ligantes, lubrificantes, agentes umectantes, emulsificantes, adoçantes, corantes, flavorizantes, aromatizantes, espessantes, agentes para alcançar um efeito de depósito, revestimentos, agentes fungicidas, conservantes, estabilizantes, antioxidantes, agentes de controle de tonicidade, agentes de retardamento de absorção, e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias ativas veterinárias ou farmacêuticas é bem conhecido na técnica. Tais materiais devem ser não tóxicos e não devem interferir na atividade das células. Para uso veterinário, as células também podem ser formuladas em, ou administradas como, um suplemento de alimentação.

[0102] A natureza precisa do carreador ou excipiente ou outro material irá depender da via de administração. Por exemplo, a composição pode estar na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável. Para princípios gerais em formulação medicinal, o leitor deve consultar Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, por G. Morstyn & W. Sheridan eds., Cambridge University Press, 1996; e Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000.

[0103] Tais composições farmacêuticas ou veterinárias podem conter componentes adicionais que garantam a viabilidade das células-tronco mesenquimais (diferenciadas) ou populações celulares nas mesmas. Por exemplo, as composições podem compreender um sistema de tampão adequado (por exemplo, sistema de tampão fosfato ou carbonato) para alcançar o pH desejável, mais usualmente próximo ao pH neutro, e podem compreender sal suficiente para garantir condições isosmóticas para as MSCs a fim de evitar estresse osmótico. Por exemplo, a solução adequada para esses propósitos podem ser solução salina fosfatada tamponada (PBS), solução de cloreto de sódio, Injeção de Ringer ou Injeção de Ringer com Lactato, como conhecido na técnica. Além disso, a composição pode compreender uma proteína carreadora, por exemplo, albumina, a qual pode aumentar a viabilidade das MSCs.

[0104] As composições farmacêuticas ou veterinárias podem compreender componentes adicionais úteis na recuperação de defeitos e lesões ósseas. Por exemplo, tais componentes podem incluir, sem limitação, proteínas morfogenéticas ósseas, matriz óssea (por exemplo, matriz óssea produzida in vitro por células da invenção ou por outros métodos), partículas de fosfato de hidroxiapatita/tricálcio (HA/TCP), gelatina, ácido poli- láctico, ácido poli-láctico glicólico, ácido hialurônico, quitosano, poli-L-lisina e colágeno. Por exemplo, as células osteoblásticas podem ser combinadas com matriz óssea desmineralizada (DBM) ou outras matrizes para tornar o compósito osteogênico (osso que se forma à direita) bem como osteoindutivo. Os métodos similares que usam células autólogas de medula óssea com DBM alogênica produziram bons resultados.

[0105] A composição farmacêutica ou veterinária pode incluir, ainda, ou podem ser coadministradas com um fator complementar bioativo, como uma proteína morfogênica óssea, como BMP-2, BMP-7 ou BMP-4, ou qualquer outro fator de crescimento. Outros componentes associados potenciais incluem fontes inorgânicas de cálcio ou fosfato adequadas para auxiliar na regeneração óssea (WO 00/07639). Se for desejado, a preparação celular pode ser administrada em um material ou matriz carreadora para fornecer regeneração melhorada de tecido. Por exemplo, o material pode ser uma cerâmica granular, ou um biopolímero, como gelatina, colágeno, osteonectina, fibrinogênio, ou osteocalcina. Matrizes porosas podem ser sintetizadas de acordo com técnicas padrão (por exemplo, Mikos et al., Biomaterials 14: 323, 1993).

[0106] A composição farmacêutica ou veterinária pode incluir, ainda, ou ser coadministrada com um agente desinfetante complementar, asséptico ou exterminador de micro-organismo, como um agente bactericida, antibacteriano, antibiótico ou antifúngico e/ou um agente anti-inflamatório a fim de evitar complicações devido à infecção e/ou inflamação no local da introdução ou administração das MSCs.

[0107] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a uma disposição que compreende um instrumento cirúrgico para administração da composição que compreende MSC a um indivíduo, como, por exemplo, sistemicamente, topicamente ou em um local de uma lesão, e que compreende, ainda, as MSCs ou populações celulares da invenção, ou uma composição farmacêutica ou veterinária que compreende as ditas MSCs ou populações celulares, sendo que a disposição é adaptada para administração da composição farmacêutica ou veterinária, por exemplo, sistemicamente, topicamente ou no local da lesão óssea. Por exemplo, um instrumento cirúrgico adequado pode ser capaz de injetar uma composição líquida que compreende MSCs ou populações celulares da presente invenção, como sistemicamente ou no local da lesão óssea.

[0108] As MSCs ou populações celulares podem ser administradas de maneira a permitir que essas sejam enxertadas ou migrem para o local de tecido pretendido e reconstituir ou regenerar a área funcionalmente deficiente. A administração da composição irá depender do local mioartroesquelético sendo recuperado. Por exemplo, as MSCs ou populações celulares podem ser administradas diretamente nas lesões (como, por exemplo, em tendão ou ligamento), ou nas articulações sinoviais (como, por exemplo, as sinoviais tendinosas ou articulares).

[0109] Por exemplo, a osteogênese pode ser facilitada de acordo com um procedimento cirúrgico para remodelar o tecido ou inserir uma divisão, ou um dispositivo prostético. Em outras circunstâncias, uma cirurgia invasiva não será necessária, e a composição pode ser administrada por injeção, como injeção guiada por ultrassom, ou com o uso de um endoscópio orientável.

[0110] Em outra modalidade, as MSCs ou populações de célula-tronco mesequimal diferenciadas ou não diferenciadas da invenção podem ser transferidas e/ou cultivadas em substratos adequados para fornecer implantes. O substrato no qual as células podem ser aplicadas e cultivadas pode ser um metal, como titânio, liga de cobalto/cromo ou aço inoxidável, uma superfície bioativa, como um fosfato de cálcio, superfícies poliméricas, como polietileno, e similares. Embora menos preferencial, o material silicioso, como cerâmicas vítreas, também pode ser usado como um substrato. São mais preferenciais os metais, como titânio, e fosfatos de cálcio, muito embora o fosfato de cálcio não seja um componente indispensável do substrato. O substrato pode ser poroso não poroso. O substrato pode ser biodegradável ou bioabsorvível.

[0111] Por exemplo, as MSCs da invenção que se proliferaram ou que estão sendo diferenciadas em placas de cultura podem ser transferidas em suportes sólidos tridimensionais a fim de fazer com que se multipliquem e/ou continuem o processo de diferenciação incubando-se o suporte sólido em um meio de nutriente líquido da invenção, caso seja necessário. As células podem ser transferidas para um suporte sólido tridimensional, por exemplo, impregnando-se o dito suporte com uma suspensão líquida que contém as ditas células. Os suportes impregnados obtidos desse modo podem ser implantados em um indivíduo. Tais suportes impregnados também podem ser recultivados imergindo-os em um meio de cultura líquido, antes de ser finalmente implantado.

[0112] O suporte sólido tridimensional precisa ser biocompatível de modo a permitir que esse seja implantado em um indivíduo. Pode ser de qualquer formato adequado, como um cilindro, uma esfera, uma placa ou uma parte de formato arbitrário. Dos materiais adequados para o suporte sólido tridimensional biocompatível, é feita menção particular a carbonato de cálcio e, em particular, aragonita, especificamente na forma de esqueleto de coral, cerâmica porosa à base de alumina, de zircônia, de fosfato de tricálcio, e/ou hidroxiapatita, esqueleto de coral de imitação obtido por troca hidrotérmica que permite que o carbonato de cálcio seja transformado em hidroxiapatita ou, ainda, vitrocerâmicas de apatita-wollastonita, vitrocerâmica bioativa, como vidros Bioglass(TM).

[0113] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos, os quais não limitam o escopo da invenção de modo algum.

EXEMPLOS MATERIAIS E MÉTODOS 1. O MÉTODO DE AMOSTRAGEM: MICROBIÓPSIA MUSCULAR

[0114] Os procedimentos de microbiópsia foram realizados em cavalos conscientes, de pé. Os espécimes da microbiópsia foram obtidos dos músculos triceps brachii (cabeça longa, na interseção de uma linha vertical que se estende a partir da crista tricipital e uma linha entre as articulações de escápulo-umeral e rádio-umeral) de cada cavalo (n=3).

[0115] Os espécimes de microbiópsia foram coletados com uma agulha de microbiópsia com calibre 14 e uma pistola de microbiópsia. Brevemente, o local da amostragem foi depilado (um cm2) e assepticamente preparado. Cada amostra (aproximadamente 15 a 20 mg de tecido) foi coletada a uma profundidade de 5 cm na cabeça longa do músculo triceps brachii, através de uma incisão na pele feita com a ponta de uma lâmina de bisturi no 11. O fechamento da incisão na pele não foi necessário e todo o procedimento de microbiópsia foi concluído em 15 minutos. Imediatamente após a coleta, cada amostra foi posicionada em 6 ml de meio de cultura composto por DMEM/F12 com 20 % de soro bovino fetal, 5 ml de penicilina (1000 U/ml)-estreptomicina (10000 Mg/ml), 2,5 ml de anfotericina B (250μg/ml) e 5 ml de HEPES [DF20]. Os espécimes de microbiópsia foram mantidos em meio de crescimento a 4 °C até o uso.

2. INICIAÇÃO DAS CULTURAS CELULARES COM O USO DE ESPÉCIMES DE MICROBIÓPSIA COMO EXPLANTES

[0116] A preparação da cultura foi realizada com o uso de equipamento estéril, sob uma capela de fluxo melhorada. Os espécimes de microbiópsia foram lavados duas vezes em 5 ml de DF20 pré-aquecido a 37 °C. Cada espécime de microbiópsia foi cuidadosamente dissecado (tentando manter apenas tecido muscular tanto quanto possível) em solução de PBS 10 mM (pH, 7,4) contendo NaCl 137 mM e KCl 2,7 mM, então, cortado e, pequenos fragmentos (tamanho da ponta da lâmina de bisturi). Então, cada fragmento foi posicionado individualmente nas 16 cavidades centrais da placa com 24 múltiplas cavidades, 100 μl de DF20 foram adicionados a cada cavidade, e as placas de cultura foram incubadas a 37 °C sob atmosfera controlada (5 % de CO2 e 21 % de O2). As paredes externas foram preenchidas com PBS (1 ml/cavidade) para impedir a secagem da cavidade que contém explantes. As cavidades que contêm explantes foram monitoradas a cada dia e alimentadas por adição simples de novo DF20, quando necessário (mantendo fatores de crescimento nas cavidades).

[0117] Quando um halo de células estava visível ao redor do tecido (cerca 10 dias), os fragmentos de músculo foram individualmente transferidos para outra placa com 24 múltiplas cavidades (16 cavidades centrais para fragmentos de músculo e as cavidades externas preenchidas com PBS); as células que se separaram da microbiópsia foram cultivadas a 80 % de confluência (cerca 20 dias).

3. TRIPSINIZAÇÃO DAS CÉLULAS E ISOLAMENTO DE CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES: CENTRIFUGAÇÃO DE GRADIENTE DESCONTÍNUO DE DENSIDADE DE PERCOLL

[0118] Células quase confluentes obtidas nos explantes foram destacadas com o uso de tripsina-EDTA, centrifugadas (200 x g, 10 min, 37 °C) e o pélete foi ressuspenso em 1 ml de HBSS. A suspensão celular foi, então, posicionada em um gradiente descontínuo de densidade de Percoll preparado como a seguir: Soluções de cloreto de sódio com 15 %, 25 % e 35 % de Percoll foram preparadas. Então, 2 ml de cada solução de Percoll foram adicionados a um tubo de cultura de 15 ml para formar o gradiente descontínuo de densidade de Percoll acima do qual 1 ml da suspensão celular foi posicionada. As frações de célula com diferentes densidades apareceram nas interfaces entre cada fração de Percoll após centrifugação a 1250 x g (25 °C, 20 min). Cada fração (<15 %, 15 a 25 %, 25 a 35 %) foi individualmente coletada, lavada uma vez com HBSS (1 ml/fração) e centrifugada a 200 x g, 10 min a 37 °C. os sobrenadantes foram descartados e os péletes foram ressuspensos em 1 ml de DF20/fração. Cada fração foi, então, cultivada separadamente em Frasco T-25 cm2 até alcançar 80 % de confluência e, por fim, células de cada fração foram dissociadas com o uso de tripsina-EDTA, em Frasco T-175-cm2. Uma vez que se tenha alcançado 80 % de confluência (cerca 40 dias), as células de frações de <15 %, 15 a 25 % e 25 a 35 % puderam ser congelada em nitrogênio líquido ou adicionalmente passadas para caracterização.

4. CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS

[0119] As células de frações de <15 %, 15 a 25 % e 25 a 35 % foram caracterizadas em número (consultar Seção 4.1.), para suas capacidades clonogênicas (consultar Seção 4.2.), para suas capacidades de se diferenciar em adipócitas, condrócitas e osteócitas quando posicionadas em meios de diferenciação adequados (consultar Seção 4.4.) e para sua expressão de CD29, CD105, CD44, CD90, CD45 e MHC II com citometria de fluxo (consultar Seção 4.3.). Todos esses testes foram realizados antes e após o congelamento das células em nitrogênio líquido. As células de frações de 15 a 25 % e 25 a 35 % também foram testadas para suas capacidades imunomodulatórias (consultar Seção 5). As células também foram comparadas às MCSs da geleia de Wharton e da medula óssea para sua expressão de miRNAs através de método de sequenciamento de RNA (consultar Seções 6 a 8).

4.1. NÚMERO DE CÉLULAS

[0120] Uma vez que estivessem confluentes, o número de células contido em um Frasco T-175 cm2 foi avaliado para cada fração de célula.

4.2. CAPACIDADE CLONOGÊNICA

[0121] As capacidades clonogênicas das células foram avaliadas com um ensaio de "unidades formadoras de colônia de fibroblastos" (CFU-F). As células de cada fração, em primocultura ou após uma passagem, foram semeadas a uma baixa densidade (500000 células/frasco) e cultivadas por 10 dias. O manchamento com May-Grunwald Giemsa foi usado para visualizar as unidades formadoras de colônia macroscopicamente e o número total de colônias/frasco foi contado.

4.3. IMUNOFENOTIPAGEM

[0122] As células colhidas foram analisadas por citometria de fluxo. De modo breve, as células (105) foram lavadas com PBS e incubadas com os seguintes anticorpos monoclonais: CD29-FITC (Immunostep) CD105-RPE (ABD Serotec) CD44-APC (BD Pharmigen) MCH II (ABD Serotec) CD45-Alexa Fluor 488 (ABD Serotec) CD90 (VMDR)

[0123] Após a lavagem com Tampão Contínuo MACSQuant (Miltenyi Biotec), as células foram fixadas com 4 % de solução de formaldeído. Os dados foram obtidos com o uso do Analisador MACSQuant e avaliados com o uso do Software FCS Express 4 Flow Cytometry (De Novo Software, Los Angeles, CA, EUA).

4.4. MULTIPOTENCIAL DE DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS

[0124] O potencial de diferenciação de células isoladas foi examinado com o uso de células colhidas em P1 a P3. Diferenciações adipogênicas, osteogênicas e condrogênicas foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante em meios adaptados (meios NH, Miltenyi Biotec). - DIFERENCIAÇÃO ADIPOGÊNICA

[0125] Para a diferenciação adipogênica, 5000 células/cavidade foram plaqueadas em uma placa de 24 cavidades em Meio NH AdipoDiff (Miltenyi Biotec). Após 7, 14 e 21 dias, as células foram coloridas com o uso de Oil Red O. De modo breve, as células foram lavadas com PBS e fixadas com 8 % de formaldeído antes do manchamento com solução de Oil Red O (Sigma). - DIFERENCIAÇÃO CONDROGÊNICA

[0126] Para induzir condrogênese, as células foram transferidas no fundo de tubos cônicos de 15 ml e diferenciadas em condrócitos em cultura de pélete (250000 células/pélete) em meio de diferenciação condrócito específico de 1 ml (Meio NH ChondroDiff; Miltenyi Biotec). Os tubos foram incubados por 21 dias a 37 °C em uma incubadora com 5 % de CO2, e o meio foi substituído a cada semana. De modo breve, após 21 dias, as micromassas foram fixadas com metanol e todas foram manchadas com Azul Alciano. O Azul Alciano foi extraído com cloridrato de guanidina a 6 mol/l e absorbância foi lida a 620 nm. - DIFERENCIAÇÃO OSTEOGÊNICA

[0127] Para a diferenciação osteogênica, as células foram plaqueadas em DMEM em uma placa de 24 cavidades a uma densidade de 5000 células/cavidade. Após 24 a 48 h, o meio osteogênico (Meio NH OsteoDiff; Miltenyi Biotec) foi adicionado às células aderentes. A cada semana, as células foram alimentadas com substituição completa do meio. Nos dias 7, 14 e 21, a mineralização de cálcio foi avaliada por coloração com Vermelho de Alizarina (Sigma), como descrito por Meloan et al. com ligeiras modificações.

[0128] As células foram lavadas em PBS e fixadas em 70 % de etanol à temperatura ambiente por 5 min a que se sucederam diversas lavagens em H2O. As células foram manchadas em Vermelho de Alizarina 40 mM (Sigma), pH 4,2 por 15 min à temperatura ambiente, enxaguadas em H2O e, então, secas por ar. O manchamento vermelho foi examinado por microscopia de luz.

[0129] O acúmulo de cálcio também foi medido (determinação quantitativa). Para avaliar a deposição de cálcio, a matriz foi desmineralizada por adição de 200 μl de HCl 0,6 N e incubação de um dia para o outro a 37 °C. As soluções foram, então, coletadas e centrifugadas a 2000 g por 5 min. A concentração de cálcio no sobrenadante foi determinada por colorimetria (Kit de Ensaio de Cálcio QuantiChrom; BioAssay Systems) como descrito pelo fabricante. De modo breve, 5 ml de amostras foram combinados com 200 ml de reagente de cálcio e incubados por 5 min à temperatura ambiente. A absorbância foi medida imediatamente após a incubação a 610 nm com o uso de um leitor de placas (Organon Teknika Cappel Products).

5. . AVALIAÇÃO DE CAPACIDADES IMUNOMODULATÓRIAS DE MSCS DERIVADAS DE MÚSCULO

[0130] Os linfócitos T (TL) CD2 foram purificados de sangue de cavalos coletado em tubos de EDTA com o uso de microesferas magnéticas. A população de TL CD2 obtida mostrou um grau de pureza de 99 % (não mostrado). Os TL CD2 foram, então, marcados como fluorescentes com carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE), estimulados com fito-hemaglutinina (PHA) e posicionados ou não com as frações de 15 a 25 % ou 25 a 35 % das MSCs preparadas pelo método, de acordo com a presente invenção, a diferentes razões de MSCs/TL CD2: 4/1, 2/1 , 1/1, ^, % e - A inibição da proliferação de TL CD2 (%) provocada pelas MSCs foi avaliada pela alteração em fluorescência observada e representa as capacidades imunomodulatórias das MSCs.

6. ISOLAMENTO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DA GELEIA DE WHARTON

[0131] Segmentos de cordão umbilical de cavalo (5 a 10 cm) foram cortados longitudinalmente para expor a geleia de Wharton. Algumas incisões foram feitas na matriz com um bisturi estéril para expor uma área mais ampla de tecido para que entrasse em contato com a superfície plástica. Os cortes do cordão foram, então, transferidos para uma placa de Petri de 10 cm2 e plaqueados por 5 dias em meio Eagle modificado por Dulbecco com 1,0 g/l de glicose, sem L- glutamina (DMEM; Lonza) suplementado com 15 % de soro bovino fetal (Sigma), L-Glutamina 2 mM (Lonza), e 0,5 % de solução antimicótica-antibiótica (Lonza). As culturas foram mantidas em uma atmosfera umidificada com 5 % de CO2 a 37 °C. Após 5 dias, os cortes do cordão foram descartados e o meio foi renovado. As células foram, então, expandidas até que alcançassem subconfluência (80 a 90 %) com alteração do meio a cada semana. Em subconfluência, as células foram colhidas após destacamento por 10 min de incubação com solução de TrypLE Select (Lonza). Para passagens, 5x104 células foram replaqueadas em frasco de 75 cm2 (Falcon) nas mesmas condições de cultura até a subconfluência. As células foram passadas até P4.

7. ISOLAMENTO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DERIVADAS DA MEDULA ÓSSEA

[0132] De modo breve, as células mononucleadas (MNC) (de amostras de medula óssea de um cavalo) foram isoladas por centrifugação de gradiente de densidade (LinfoSep; Biomedics, Madrid, Espanha) e lavadas em meio HBSS (Bio-Whittaker, Walkersville, MD). Foram semeadas 0,5x106 células/ml em meio essencial mínimo alfa (α-MEM; BioWhittaker) suplementado com 15 % de FBS (Biochrom, Berlim, Alemanha), L-glutamina 2 mM (GIBCO BRL, Grand Island, NY), 0,5 % de solução antibiótica/antimicótica (GIBCO BRL). Esse é o meio α-MEM completo. As MSCs, quando selecionadas por adesão plástica, exigem a eliminação de células não aderentes substituindo-se o meio 48 horas após a semeadura da célula. Quando as culturas alcançaram 80 % de confluência, as células foram destacadas com solução de tripsina-EDTA (GIBCO BRL) e subcultivadas a 1x104 células/ml.

8. ANÁLISE TRANSCRIPTÔMICA MÉTODO

[0133] O método de sequenciamento de RNA (RNA- seq) foi usado. O RNA total foi extraído de 20 milhões de MSCs preparadas de acordo com o método da presente invenção (da fração de 15 a 25 %) de 2 diferentes cavalos, 20 milhões de células-tronco da geleia de Wharton de 1 cavalo e 20 milhões de células-tronco derivadas da medula óssea de 1 cavalo com o uso do minikit RNAeasy (Qiagen). As células foram lisadas em tampão RLT que contém beta-mercaptoetanol, então, o RNA foi purificado em coluna seguindo as recomendações do fabricante.

[0134] A integridade do RNA foi verificada em Bioanalyser 2100 com Nanochips RNA 6000, as pontuações de RIN eram >8 para todas as amostras.

[0135] O kit de Preparação de Amostra de filamento de mRNA Illumina Truseq foi usado para preparar bibliotecas de 1 micrograma de RNA total. RNAs Poli-A foram purificados com microesferas magnéticas revestidas com poli-T e quimicamente fragmentados em cerca de 200 nucleotídeos. São usados como modelo para primeira síntese de filamento na presença de hexâmeros aleatórios e segunda síntese de filamento posterior. Em seguida, extremidades de cDNAs de filamento duplo foram adeniladas em extremidades 3'OH antes da ligação a adaptadores que contêm os índices. Por fim, os fragmentos de biblioteca ligados por adaptadores foram enriquecidos por PCR seguindo o protocolo de Illumina e purificados com microesferas magnéticas Ampure XP. As bibliotecas foram validadas em chip de Bioanalyser DNA 1000 e quantificadas por qPCR com o kit de quantificação de biblioteca KAPA. O sequenciamento foi realizado em Illumina NextSeq500 em protocolo de base 2x75 de extremidade pareada.

ANÁLISE DE DADOS

[0136] Os arquivos de Fastq foram cortados para sequências de adaptador. As leituras foram alinhadas com Tophat 2.0.9 para o genoma do cavalo (Equus caballus (Cavalo) EquCab2 de UCSC). O pacote Cufflinks 2.2.0 foi usado para gerar valores de FPKM e CuffDiff foi usado para identificar genes expressos de modo significativamente diferente. RESULTADOS 1. MÉTODO DE AMOSTRAGEM

[0137] A técnica de microbiópsia permitiu a aquisição de uma quantidade suficiente de tecido muscular de cavalo para iniciar facilmente uma cultura. Nenhuma contaminação foi observada, durante a amostragem ou o tratamento no laboratório, validando, desse modo, as condições de trabalho. Já que cada microbiópsia foi cortada em dois fragmentos, foi possível iniciar duas culturas separadas com 15 a 20 mg de tecido.

2. CULTURA POR EXPLANTES

[0138] Após três ou quatro dias em cultura, as primeiras células começaram a aparecer ao redor do músculo amostrado. Após cerca de nove ou dez dias, o número de células era suficiente para transplantar os explantes e deixar as células cultivadas (denominadas 1as células). O transplante de explantes permitiu a obtenção de um segundo agrupamento de células (denominado 2as células) que também foi cultivado até a confluência. Um terceiro agrupamento de células também pode ser obtida. Além disso, as 2as células começaram a aparecer ao redor do fragmento de músculo mais rapidamente do que as 1as células.

3. ISOLAMENTO DE CÉLULA-TRONCO PLURIPOTENTE

[0139] Para cada 3 cavalos e em cada fração de Percoll (isto é <15 %, 15 a 25 %, 25 a 35 %), obteve-se sucesso ao cultivar e congelar uma quantidade importante de células.

[0140] Cerca 20 dias após a iniciação da cultura, o número de células foi suficiente para tripsinizar e iniciar o processo de isolamento. Antes desse processo, obteve-se 1020000 e 1340000 das 1as células para o cavalo 2 e o cavalo 3, respectivamente. As 2as células eram 333333 e 750000 respectivamente para o cavalo 2 e o cavalo 3. 4. CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS CULTIVADAS 4.1. NÚMERO DE CÉLULAS

4.2. CAPACIDADE CLONOGÊNICA

[0141] O aspecto morfológico das CFUs observadas foi diferente daqueles habitualmente observados nas células- tronco pluripotentes isoladas da medula óssea ou Geleia de Wharton (Figura 1).

[0142] Nas seções 4.1 e 4.2 acima, P significa "passagem"; P1 é "passagem 1" e P2 é "passagem 2". O termo passagem se refere à "transferência ou subcultura de células de um vaso de cultura para outro; usualmente, porém, não necessariamente, envolve a subdivisão de uma população celular em proliferação, permitindo a propagação de uma linhagem celular ou cepa celular.

[0143] O número de passagem é o número de vezes que uma cultura foi subcultivada.

5. IMUNOFENOTIPAGEM

[0144] As células obtidas eram positivas para CD44, CD90 e CD105 e negativas para CD45, MHC II e CD29. A reatividade cruzada de todos esses anticorpos com o cavalo foi verificada em células mononucleadas de medulas ósseas equinas, exceto para CD29 (Figura 2 e 3).

[0145] Para cada uma das três frações de Percoll, 85 a 95 % das células expressaram CD105 e > 90 % dessas expressaram CD44 e CD90 (Figura 3). 6. MULTIPOTENCIAL DE DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS As células obtidas de cada uma das três frações de Percoll eram capazes de se diferenciar em adipócitas (Figura 4), condrócitos (Figura 5) e osteócitas (Figura 6) quando cultivadas com os respectivos meios de diferenciação.

[0146] 7. USO CLÍNICO DE CÉLULAS

[0147] As MSCs do cavalo obtidas pelo método, de acordo com a presente invenção, são capazes de reduzir claudicação e para promover a cura de cavalos afetados por patologias graves do sistema locomotor, como desmite, tendinite e osteoartrite. As MSCs podem ser administradas diretamente nas lesões (tendão, ligamento) ou nas articulações sinoviais tendinosas ou articulares.

[0148] 1/ Injeção intratendinosa de MSCs

[0149] - Um cavalo de corrida (égua, 9 anos de idade, puro-sangue) desenvolveu uma tendinite severa do tendão flexor digital superficial após uma corrida. Ela obteve repouso, porém, nenhum outro tratamento. Três meses após a lesão, ela demonstrou um grau III de claudicação do membro anterior esquerdo, o qual era positivo para o membro inferior e as articulações intercarpais. O exame de imagiologia diagnóstica mostrou uma tendinopatia do tendão flexor digital superficial (SDFT) pós-fase aguda em cicatrização com forte vascularização e lesão nuclear. O método, de acordo com a presente invenção, foi usado para obter MSCs autólogas de uma microbiópsia muscular da égua. Um controle foi produzido seis semanas depois. Não houve nenhuma melhora significante da claudicação, porém, o exame ultrassonográfico mostrou uma evolução moderada favorável da suavização e da cicatrização do SDFT anterior esquerdo da lesão nuclear. A égua recebeu uma injeção orientada por ultrassom de 107 MSCs autólogas na lesão nuclear do SDFT. Ela também recebeu repouso em box com 20 minutos de caminhada/dia. Seis semanas depois, a égua mostrou uma melhora significante da claudicação do membro anterior esquerdo. O exame ultrassonográfico se mostrou significativamente melhor, com uma ecogenicidade melhorada (consultar tabela 1 abaixo). O programa de reabilitação é praticado.

[0150] - Um cavalo de salto (7 anos de idade, Zangersheide, garanhão) desenvolveu uma tendinite do SDFT do membro anterior direito. Ele respondeu bem a repouso e NSAIs (anti-inflamatório não esteroidal). Retornou ao nível anterior de desempenho 4 meses após, porém, desenvolveu outro intumescimento palmar do membro anterior direito após 3 semanas. Ele mostrou um grau III de claudicação associada ao intumescimento. O exame ultrassonográfico mostrou uma grande área hipoecóica de Doppler negativo com 5*1 *0,7 cm, com septo hiperecoico no aspecto lateral do SDFT no terço distal do 3° metacarpo. Ele recebeu corte corretivo, ferrageamento ortopédico e injeção PrP intralesional orientada por ultrassom. Um programa de reabilitação foi sugerido. Uma microbiópsia muscular foi realizada para a preparação de MSCs de acordo com o método da presente invenção. O primeiro controle ocorreu 8 semanas depois. O intumescimento foi totalmente reabsorvido e uma melhora de 2 estágios da claudicação foi observada. O exame ultrassonográfico também mostrou uma melhora: a lesão estava menos hipoecoica, reduzida em 2 (2,5*0,5*0,7 cm) com um melhor aspecto fibrilar. O cavalo recebeu injeção orientada por ultrassom de 107 MSCs autólogas na lesão do SDFT. O programa de reabilitação foi praticado. No segundo controle (2 meses depois), o cavalo não mostrou nenhuma claudicação e a ultrassonografia mostrou uma pequena área hipoecoica mal definida (consultar tabela 1 abaixo). O cavalo recebeu corte, o ferrageamento ortopédico foi mantido e o programa de reabilitação foi praticado. No último controle (2 meses após o segundo controle), não houve mudança significante nas imagens ultrassonográficas. O programa de reabilitação foi finalizado e o ferrageamento ortopédico mantido.

[0151] 2/ Injeção intratendinosa e intrasinovial de MSCs

[0152] - Um cavalo de lazer (castrado, 16 anos de idade, cruzado) mostrou um grau III de claudicação do membro anterior esquerdo localizado abaixo do boleto. O exame por imagens mostrou tendinopatia anterior bilateral do lobo médio do tendão flexor digital profundo (DDFT) e doença articular degenerativa leve a moderada da articulação interfalangeana distal esquerda. Ferraduras ortopédicas e intra-articulares convencionais foram aplicadas sem nenhuma melhora significante após 6 semanas. O método, de acordo com a presente invenção, foi usado para obter MSCs autólogas de uma microbiópsia muscular do cavalo castrado. Quatro semanas depois, o cavalo recebeu uma injeção orientada por ultrassom de 107 MSCs autólogas no lobo médio do tendão flexor digital profundo anterior esquerdo e na bainha digital correspondente. O cavalo mostrou local intumescimento moderado no local da injeção por 2 dias após a administração das células-tronco. Seis semanas depois, um controle foi realizado, mostrando uma melhora moderada da claudicação e uma melhora leve das imagens ultrassonográficas. O programa de reabilitação foi iniciado e, no segundo controle, o cavalo estava claramente melhor (consultar tabela 1 abaixo). Uma intensificação progressiva da atividade física foi proposta.

[0153] 3/ Injeção intraligamentar e intraarticular de MSCs

[0154] - Um pônei de lazer (castrado, 5 anos de idade) que sofre de uma desmite severa do ligamento colateral lateral da articulação tarsocrural direita de 6 meses e sinais moderados de doença articular degenerativa. Claudicação III/V, articulação intumescida, articulação dolorida com alcance limitado. Tratamentos convencionais aplicados desde o acidente não melhoraram significativamente a claudicação. O método, de acordo com a presente invenção, foi usado para obter MSCs autólogas de uma microbiópsia muscular do pônei. Um mês depois, uma dose de 107 MSCs foi injetada no ligamento e 107 MSCs na bolsa sinovial da articulação tarsocrural. Seis semanas depois, uma melhora clínica da claudicação foi observada (grau I/V) com uma clara diminuição do intumescimento articulatório e uma articulação normal (consultar tabela 1 abaixo). Um programa de reabilitação foi prescrito e o pônei recuperou as atividades físicas.

[0155] Tabela 1: Efeito da injeção em locais específicos de MSCs autólogas de cavalo preparadas de acordo com o método da presente invenção (107/local da injeção) na pontuação de claudicação [de 0: ausência de Claudicação a V: impossibilidade de o cavalo usar o membro afetado] de 4 cavalos com diferentes doenças osteoarticulares.

8. CAPACIDADES IMUNOMODULATÓRIAS DE CÉLULAS

[0156] Uma inibição da proliferação (%) dos Linfócitos T (TL) CD2 do cavalo foi observada. Para as MSCs da fração de 15 a 25 %, a maior inibição foi observada com a razão de MSCs/TL CD2 de 1/8. Para as células da fração de 25 a 35 %, a razão ideal de MSCs/TL CD2 era de ^ (consultar tabela 2 abaixo).

[0157] Tabela 2: Inibição da proliferação (%) dos TL CD2 de 2 cavalos quando incubados com MSCs das frações de 15 a 25 % ou de 25 a 35 % a diferentes razões de MSCs/TL CD2 (isto é, 4/1, 2/1, 1/1, ^, %, 1/8) . Razão de MSCs a 15 a 25 %/TL CD2

9. ANÁLISE TRANSCRIPTÔMICA - EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE 5 MIRNAS ENTRE MSCS DE CAVALO PREPARADAS DE ACORDO COM O MÉTODO DA PRESENTE INVENÇÃO (ABREVIADAS COMO MSCS DERIVADAS DE MÚSCULO) , MSCS DE GELEIA DE WHARTON DE CAVALO E MSCS DE MEDULA ÓSSEA DE CAVALO

[0158] Observou-se uma expressão diferencial significante para 56 genes entre as 3 fontes de células- tronco. Escolheu-se focar em microRNAs (miRNA). 5 miRNAs, a saber, miR-128, miR-133B, miR-218, miR-656 e miR-802, mostraram uma expressão diferencial significante entre as 3 fontes de células-tronco. Provavelmente devido à técnica usada, os miRNAs observados são os precursores do miRNA correspondente. A partir desse experimento, observou-se que o miR-128 e o miR-133B estavam significativamente superexpressos em MSCs derivadas de músculo em comparação a MSCs de geleia de Wharton e MSCs de medula óssea. O miR-218 e o miR-802 também foram expressos por MSCs derivadas de músculo, porém, o miR-218 foi significativamente mais expresso em MSCs de medula óssea em comparação a MSCs de geleia de Wharton e MSCs derivadas de músculo, enquanto o miR-802 foi significativamente superexpresso nas MSCs de medula óssea e MSCs derivadas de músculo em comparação às MSCs de geleia de Wharton. O miR-656 foi significativamente superexpresso nas MSCs de geleia de Wharton em comparação às MSCs de medula óssea e MSCs derivadas de músculo (Figura 7).

ABREVIAÇÕES

[0159] DF20: Meio de cultura de crescimento composto por DMEM/F12 com 20 % de soro bovino fetal, 5 ml de penicilina (1000 U/ml)-estreptomicina (10000 μg/ml), 2,5 ml de anfotericina B (250 μg/ml) e 5 ml de HEPES.

[0160] HBSS: Solução salina balanceada de Hank REFERÊNCIAS

[0161] Adams, M.K., Goodrich, L.R., Rao, S., Olea-Popelka, F., Phillips, N., Kisiday, J.D., Mcllwraith, C.W. Equine bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BMDMSCs) from the ilium and sternum: Are there differences? Equine Veterinary Journal, 2012, 45, 372 a 375.

[0162] Ceusters J., Mouithys-Mickalad A., De La Rebiere De Pouyade G., Franck T., Votion D., Deby-Dupont G., Serteyn D. Assessment of reactive oxygen species production in cultured equine skeletal myoblasts in response to conditions of anoxia followed by reoxygenation with or without exposure to peroxidases. American Journal of Veterinary Research, 2012, 73, 426 a 434.

[0163] Dominici, M., Le Blanc, K., Mueller, I., Slaper-Cortenbach, I., Marini, F., Krause, D., Deans, R., Keating, A., Prockop, D.J., Horwitz, E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 2006, 8(4), 315 a 317.

[0164] Gutierrez-Nibeyro, S.D. Commercial cellbased therapies for musculoskeletal injuries in horses. Veterinary Clinics of North America: Equine Practice, 2011, 27, 363 a 371.

[0165] lacono, E, Brunori, L, Pirrone, A, Pagliaro, P, Ricci, F, Tazzari, PL, Merlo, B. Isolation, characterization and differentiation of mesenchymal stem cells from amniotic fluid, umbilical cord blood and Wharton's jelly in the horse. Reproduction, 2012, 143, 455 a 468.

[0166] Meloan, S.N., Puchtler, H., Valentine, L.S. Alkaline and acid alizarin red S stains for alkali- soluble and alkali-insoluble calcium deposits. Archives of Pathology, 1972,93(3), 190 a 197.

[0167] Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, S.C., Jaiswal, R.K., Douglas, R., Mosca, J.D., Moorman, M.A., Simonetti, D.W., Craig, S., Marshak, D.R. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells (MSCs). Science, 1999, 284 (5411), 143 a 147.

[0168] Radtke, C.L., Nino-Fong, R., Esparza Gonzalez, B.P., Stryhn, H., McDuffee, L.A. Characterization and osteogenic potential of equine muscle tissue- and periosteal tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) in comparison with bone marrow- and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs). American Journal of Veterinary Research, 2013,74(5), 790 a 800.

[0169] Schnabel L.V., Fortier L.A., Wayne Mcllwraith C, Nobert K.M. Therapeutic use of stem cells in horses: Which type, how, and when? The Veterinary Journal, 2013, 197(3), 570 a 577.

[0170] Usas, A., Maciulaitis, J., Maciulaitis, R., Jakuboniene, N., Milasius, A., Huard, J. Skeletal muscle- derived stem cells: implications for cell-mediated therapies. Medicina (Kaunas), 2011, 47(9), 469 a 479.

[0171] Votion D.M., Fraipont A., Goachet A.G., Robert C, Van Erck E., Amory H., Ceusters J., De La Rebiere De Pouyade G., Franck T., Mouithys-Mickalad A., Niesten A., Serteyn D. Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing. Equine Veterinary Journal, 2010, 42(suppl 38), 268 a 274.

Claims (4)

1. MÉTODO PARA PREPARAR CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS (MSCs) DE MAMÍFEROS, caracterizado por compreender as etapas de: a) colocar uma microbiópsia de tecido de músculo esquelético de mamífero em meio de cultura adequado, b) coletar células que emergem da dita microbiópsia durante o cultivo, c) cultivar as células obtidas na etapa b) até de aproximar da confluência, d) dissociar as células da etapa c), e) separar as células-tronco mesenquimais (MSCs) das outras células por fracionamento de gradiente de densidade, obtendo, desse modo, células-tronco mesenquimais (MSCs).

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito mamífero ser selecionado do grupo que compreende: animais domésticos e de criação, animais de jardim zoológico, animais de competições esportivas, animais de estimação, animais de companhia e animais de laboratório, como, por exemplo, camundongos, ratos, hamsters, coelhos, cachorros, gatos, porquinhos-da-índia, gado, vacas, ovelhas, cavalos, porcos e primatas, por exemplo, macacos e símios.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por compreender, ainda, a etapa de diferenciação das células em células adipócitas, osteócitas, condrócitas, miogênicas, células endoteliais, células nervosas, células cardíacas ou hepatócitos cultivando- se as MSCs em um meio de diferenciação adipogênica, osteogênica, condrogênica, miogênica, endotelial, neuronal, cardíaca ou hepatocítica adequado, respectivamente.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender, ainda, a etapa de preparação de uma composição farmacêutica ou veterinária compreendendo a obtenção de adipócitos, osteócitos, condrócitos, células miogênicas diferenciados, células endoteliais, células neurais, células cardíacas ou hepatócitos.

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