ES2846760T3 - Células madre derivadas de músculo de mamífero - Google Patents

Abstract

Un método para la preparación de células madre mesenquimáticas (MSC) de mamífero, que comprende las etapas de: a) colocar una microbiopsia de tejido muscular esquelético de mamífero en un medio de cultivo adecuado, b) recolectar células que aparecen a partir de dicha microbiopsia durante el cultivo, c) cultivar las células obtenidas en la etapa b) hasta casi la confluencia, d) disociar las células de la etapa c), e) separar las células madre mesenquimáticas (MSC) de las otras células por fraccionamiento en gradiente de densidad, obteniendo de esta manera células madre mesenquimáticas (MSC).

Description

DESCRIPCIÓN

Células madre derivadas de músculo de mamífero

Campo de la invención

La invención se refiere a la producción de células madre de mamífero derivadas del tejido muscular y a los usos de dichas células madre en el tratamiento del tejido lesionado. Más particularmente, la invención proporciona la producción de células madre mesenquimáticas (MSC) derivadas del tejido muscular de mamífero y el uso veterinario de dichas células madre en el tratamiento del tejido lesionado.

Antecedentes de la invención

El uso de células madre en medicina veterinaria tal como en medicina equina abre la vía a una amplia variedad de posibilidades terapéuticas que promueven una regeneración óptima del tejido lesionado. Además, la tendinitis y osteoartrosis son patologías muy frecuentes en medicina equina y desafortunadamente tienen un mal pronóstico. De hecho, las lesiones musculoesqueléticas son la fuente más común de lesiones en caballos de competición. Aunque es bien conocido que (casi todos) los tejidos adultos tienen algunas células progenitoras específicas del tejido, a menudo no son suficientes para una reparación eficaz. Por lo tanto, la medicina regenerativa eficaz necesita un aporte exógeno de células en una cantidad mayor que la que está presente normalmente en el tejido. Ambas células deberían ser capaces de reparar la lesión así como de coordinar el proceso de curación.

En la práctica veterinaria equina actual, las células madre que se utilizan más comúnmente son las derivadas de médula ósea de adulto y las células madre mesenquimáticas derivadas del tejido adiposo (MSC), así como las MSC de la gelatina de Wharton (Schnabel et al., 2013, lacono et al., 2012). El aspirado de médula ósea se recolecta normalmente del esternón (espacios medulares 3-5) o el ilion (Adams et al., 2012) y el tejido adiposo se recolecta generalmente de la región craneal de la cola (Gutierrez-Nibeyro, 2011). La gelatina de Wharton se aísla del cordón umbilical (lacono et al., 2012). Estos métodos de recolección de muestras son bastante invasivos, a menudo no les gusta a los propietarios de caballos de competición y pueden provocar algunas infecciones.

Una segunda limitación para la investigación veterinaria es la falta de anticuerpos específicos disponibles en el mercado. Por esto, es necesario utilizar anticuerpos humanos, y es necesario ensayar su reactividad cruzada en los animales tales como los caballos. Como ejemplo, solo el 4 % de los anticuerpos humanos reaccionan con proteínas equinas equivalentes. Un inmunofenotipificación válido necesita además el uso apropiado de los isotipos para evitar las reacciones de anticuerpo no específicas y las células de control positivo para confirmar la reactividad cruzada, por ejemplo, en caballos. Por lo tanto, no hay especificaciones convencionales o marcadores para asegurar la calidad de las células madre de animales o equinos disponibles en el mercado. Sin embargo, algunos grupos de investigación han intentado caracterizar eficazmente las células madre mesenquimáticas (MSC) de varios orígenes tales como: médula ósea, tejido adiposo, cordón umbilical, sangre del cordón umbilical, gelatina de Wharton, sangre periférica y muy recientemente del tejido perióstico y el músculo (Radtke et al., 2013). Radtke y sus colaboradores a este respecto informaron de un proceso para la generación de células madre mesenquimáticas (MSC) derivadas del músculo de equinos, en el que se recolectaban grandes biopsias musculares (de 6 g de peso) de cadáveres de caballos. Este método por lo tanto es altamente invasivo y no es útil para los caballos vivos y de competición. En segundo lugar, las células madre obtenidas se aíslan de las biopsias por medio de técnicas de digestión enzimática, lo que limita las posibilidades. En tercer lugar, las células que se obtienen por el proceso de Radtke y sus colaboradores son positivas para CD90 y CD44, pero negativas para CD45, CD34, CD146 y CD105. Se informó que esta negatividad para CD105 es común en las células madre mesenquimáticas (MSC) de equinos, por Radtke et al., 2013.

A partir de lo anterior, está claro que se necesitan nuevos métodos para producir células madre mesenquimáticas (MSC) de mamíferos tales como los caballos, que impliquen una maniobra mínimamente invasiva.

Sumario de la invención

En resumen, las células madre que se utilizan en medicina regenerativa deberían estar presentes en gran cantidad, ser capaces de recogerse y recolectarse con un procedimiento mínimamente invasivo, ser capaces de diferenciarse a lo largo de rutas de múltiples linajes de una manera reproducible, ser seguras y que se trasplanten eficazmente autólogamente, alogénicamente o xenogénicamente. Actualmente, estos criterios no se cumplen en la medicina regenerativa veterinaria actual.

La presente invención proporciona por lo tanto un nuevo proceso para la preparación de células madre mesenquimáticas de mamíferos según la reivindicación 1. Una microbiopsia muscular no invasiva (10-20 mg) se obtiene de un animal vivo, por ejemplo, del tejido muscular de un caballo, se cultiva y se utiliza como explante para iniciar el cultivo. Las células que provienen del explante se centrifugan en un gradiente de densidad (discontinuo) para seleccionar la parte de la población celular cultivada con los mayores porcentajes de células pluripotentes. El inmunofenotipaje y la diferenciación trilinaje inesperadamente indicaba que las poblaciones celulares seleccionadas por centrifugación en gradiente de densidad resultaban ser células madre mesenquimáticas (MSC), capaces de diferenciarse en adipocitos, osteocitos, y condrocitos cuando se incubaban en un medio adecuado de diferenciación. Las células madre mesenquimáticas (MSC) según la reivindicación 4 se obtienen mediante el proceso de la presente invención y son positivas a CD44, CD90 y CD105 y son negativas para CD45, MHC II y CD29. Esto es lo contrario que las células madre obtenidas por Radtke et al., 2013, de las que se informó que eran negativas a CD105. Teniendo en cuenta las recomendaciones del ISCT para las células madre (Dominici et al., 2006), las poblaciones de MSC del presente documento pueden clasificarse efectivamente como células madre pluripotentes ya que son altamente positivas para CD90, CD105 y CD44, negativas para CD45, MHC II e inesperadamente para CD29.

Las MSC de la presente invención son positivas además para miR-128, miR-133B, y miR-802, ligeramente positivas para miR-218 y negativas para miR-656. Esto es lo contrario que otras MSC de la técnica, tales como las MSC de la gelatina de Wharton o las MSC de la médula ósea. Las MSC de la gelatina de Wharton son negativas para miR-128, miR-133B, miR-218 y miR-802 y positivas para miR-656. Las MSC de médula ósea son positivas para miR-218 y miR-802 y negativas para miR-128, miR-133B y miR-656 (cf. sección de Ejemplos). Por lo tanto, existen diferencias distintivas en las propiedades de las MSC de la presente invención y las ^m S^c desveladas en la técnica.

Además, estas células soportan una pluralidad de ciclos de congelación-descongelación sin perder su pluripotencia. La presente invención ofrece por lo tanto una alternativa más eficaz y prometedora que los métodos que ya se han descrito en la bibliografía y, por primera vez, proporciona la posibilidad de llevarse a cabo en animales vivos, tales como los caballos, debido a su carácter mínimamente invasivo.

Además, el cultivo se inicia con un método más simple que la técnica de digestión enzimática utilizada previamente (Radtke et al., 2013). Por esto, las microbiopsias se utilizan como explantes y las células aparecen espontáneamente en el tiempo esperado. De esta manera, el número de manipulaciones se reduce, evitando las fuentes potenciales de contaminación. No es necesario añadir factores de crecimiento externos, ya que los factores de crecimiento que se secretan naturalmente por la microbiopsia de músculo (el explante) son suficientes.

Las células derivadas del músculo son una mezcla de subpoblaciones de diferentes linajes y diferentes estadios de desarrollo. Basándose en su densidad, relacionada con su expresión de marcadores moleculares específicos, y gracias a un gradiente de densidad (discontinuo), el método de la invención es capaz de seleccionar tres subpoblaciones sustancialmente puras de células madre mesenquimáticas pluripotentes a partir de los explantes musculares.

Las tres poblaciones comprenden > 90% de las células que son positivas a CD144. Para el CD90, la tasa de expresión es del 36 % para la fracción del 25-35 %, el 48 % para la fracción < 15 % y del 73 % para la fracción del 15-25%. Para el CD105, la tasa de expresión varía entre el 85 y el 95% en las tres poblaciones. Las tres poblaciones también muestran diferentes UFC-F y propiedades proliferativas (cf. sección de Ejemplos).

Además, se ha demostrado que dichas células madre mesenquimáticas (MSC) pueden formar colonias tipo fibroblastos en el cultivo. Además, a diferencia de lo que se observaba normalmente con otras fuentes de células madre mesenquimáticas, dichas células se pueden diferenciar en adipocitos, condrocitos y osteocitos, y soportan una pluralidad de ciclos de congelación-descongelación sin pérdida de su pluripotencia.

En un intento para proporcionar un proceso menos invasivo para la generación de células madre mesenquimáticas derivadas de músculo animal (MSC), los inventores descubrieron que combinando la microbiopsia muscular, cultivando el explante, enriqueciendo adicionalmente las células que aparecían del explante por un gradiente de densidad (discontinuo) se generaban inesperadamente células MSC. Era totalmente inesperado que las células recién generadas que provenían espontáneamente del explante durante el cultivo y que se enriquecían adicionalmente por centrifugación en gradiente fueran células madre mesenquimáticas (MSC).

El proceso de la invención permite la generación de grandes cantidades de células madre mesenquimáticas (MSC) a partir de una biopsia muy pequeña (microbiopsia), sin una etapa de digestión enzimática. Dicha etapa de digestión enzimática, en cualquier caso, sería imposible de aplicar a una microbiopsia, como se confirma en Freshney, R.l. et al., 2005 (Culture of animal cells: A manual of basic technique. 5a Edición, Wiley, New York) que desvela que la cantidad de tejido para el cultivo tras una digestión enzimática es aproximadamente de 1-5 g.

Las MSC que se obtienen pro el método de acuerdo con la presente invención expresan CD105, que es un componente del complejo TGF beta 1, tiene diferentes funciones biológicas importantes tales como la angiogénesis y la inducción del crecimiento a nivel de las articulaciones/articular. Para una revisión completa de la señalización del TGF beta en el cartílago, véase Finnson KW et al., 2012 (Front Biosci (Schol Ed). Jan 1; 4:251-68). El TGF beta 1 estimula la división de los condrocitos así como la síntesis de matriz cartilaginosa. Sobre todo se encuentra en derivados de plaquetas, como el plasma rico en plaquetas, es decir, plasma sanguíneo que se ha enriquecido en plaquetas (PRP) (Lubkowska A et al., 2012, J Biol Regul Homeost Agents. Abr-Jun; 26(2 Supl. 1):3S-22^s ). Como una fuente concentrada de plaquetas autólogas, el PRP contiene (y libera por medio de desgranulación) distintos factores de crecimiento y otras citosinas que estimulan la curación del hueso y el tejido blando. Además, el TGF beta 1 disminuye la liberación de PGE2 por los fibroblastos sinoviales osteoartríticos y por lo tanto disminuye la degradación de la matriz estimulada por la PGE2 (Fernandes J.C. et al., 2002, Biorheology, 39, 237-46). La expresión de CD105 en las MSC de la invención parece, por lo tanto, que aporta características excelentes de regeneración tisular a las células madre que se obtienen.

Breve descripción de las figuras

La presente invención se ilustra por las siguientes figuras que se tienen que considerar solo con fines ilustrativos y no de manera que limiten la invención respecto a las realizaciones desveladas en este documento:

Figura 1: Fotografía microscópica representativa del aspecto morfológico de unidades formadoras de colonias tipo fibroblastos que se obtienen con células de cada fracción Percoll sembradas a baja densidad (500000 células/matraz) y cultivadas durante 10 días (tinción May-Grünwald-Giemsa; A: 100 x; B: 400 x de magnificación).

Figura 2: Imágenes del control por FACS que muestran la reactividad cruzada de anticuerpos escogidos sobre las células mononucleadas de médula ósea equina.

Figura 3: Histogramas de citometría de flujo representativos de células de la fracción Percoll del 15-25% (Caballo 2). Estas células son altamente positivas para CD105, CD90 y CD44 pero negativas para CD45.

Figura 4: Fotografías microscópicas negativas de la diferenciación adipocítica que se obtiene para el caballo 2 tras 7 días en medio de diferenciación (tinción con solución de aceite Rojo O, 400 x de magnificación). < 15%, 15-25 %, 25-35 % representan las células de las 3 fracciones Percoll, Control representa las células para las que no se indujo diferenciación.

Figura 5: Fotografías representativas de cortes finos teñidos con Azul Alciano, de la condrosfera obtenida tras 3 semanas de cultivo en el medio de diferenciación condrogénico (A) o del aglomerado de control (B; células no cultivadas con el medio de diferenciación condrogénico).

Figura 6: Fotografías microscópicas representativas de la diferenciación osteogénica que se obtiene para el caballo 2 tras 7 días en el medio de diferenciación (tinción con solución Rojo de Alizarina, 400 x de magnificación). < 15 %, 15-25 %, 25-35 % representan las células de las 3 fracciones Percoll, Control representa las células para las que no se indujo la diferenciación.

Figura 7: Representa el nivel de expresión diferencial (número de copias detectadas) de 5 miARN en 3 fuentes de células madre mesenquimáticas (MSC) de caballo, es decir, MSC de gelatina de Wharton, MSC de médula ósea y MSC derivadas de músculo de acuerdo con la presente invención.

Descripción detallada de la invención

Como se utiliza en el presente documento, las formas en singular de “un”, “una”, y “el” incluyen tanto el referente singular como el plural a menos que el contexto claramente dicte otra cosa. A modo de ejemplo, “una célula” se refiere a una célula o más de una.

Las expresiones “que comprende”, “comprende” o “comprendido por” como se utiliza en el presente documento son sinónimos de “que incluye” o “que contiene”, “contiene”, y son incluyentes o de extremos abiertos y no excluyen miembros, elementos o etapas del método adicionales, no mencionados.

La mención de intervalos numéricos con extremos incluye todos los números y fracciones que se incluyen en los intervalos respectivos, así como los extremos mencionados.

El término “aproximadamente” como se utiliza en el presente documento en referencia a un valor medible tal como un parámetro, una cantidad, una duración temporal, y similares, significa que engloba variaciones de /- un 10 % o menos, preferentemente /- un 5 % o menos, más preferentemente /- un 1 % o menos, y más preferentemente /-un 0,1 % o menos de, y desde el valor especificado, siempre que dichas variaciones sean apropiadas para realizar la invención desvelada. Se entiende que el valor al que se refiere el modificador “aproximadamente” también se desvela específicamente en sí mismo, y preferentemente.

Todas las referencias que se citan en la presente memoria descriptiva se incorporan de esta manera por referencia en su totalidad. En particular, las enseñanzas de todas las referencias a las que se hace referencia en el presente documento específicamente se incorporan por referencia.

A menos de que se defina otra cosa, todos los términos utilizados para desvelar la invención, incluyendo los términos técnicos y científicos, tienen el significado que entiende comúnmente un experto habituado en la técnica a la que pertenece la presente invención. A modo de guía, las definiciones de los términos se incluyen para apreciar mejor la enseñanza de la presente invención.

En cuanto a los métodos generales relacionados con la invención, se hace referencia a los libros de texto bien conocidos, que incluyen, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed." (Sambrook et al., 1989), Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987), la serie Methods in Enzymology (Academic Press), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3a Ed." (F. M. Ausubel et al., eds., 1987 y 1995); Recombinant DNA Methodology II (R. Wu ed., Academic Press 1995), que se incorporan en el presente documento por referencia. Para la elaboración adicional de las técnicas generales útiles en la práctica de la presente invención, el facultativo puede dirigirse a los libros de texto y revisiones de biología celular, cultivo tisular, y embriología. Se incluyen "Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach" (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987); "Guide to Techniques in Mouse Development" (P. M. Wasserman et al. eds., Academic Press 1993); "Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro" (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); "Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy" (P. D. Rathjen et al., 1993). La diferenciación de las células madre se revisa por ejemplo, en Robertson. 1997. Meth Cell Biol 75: 173; y Pedersen.

1998. Reprod Fértil Dev 10: 31, y Usas et al., 2011, que se incorporan en el presente documento por referencia. Las técnicas generales de cultivo celular y recolección en medios se describen en general en Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al. 1997. Curr Opin Biotechnol 8: 148); Serum-free Media (K. Kitano. 1991. Biotechnology 17: 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr Opin Biotechnol 2: 375, 1991), que se incorporan en el presente documento por referencia.

La expresión “célula madre” se refiere en general a una célula no especializada o relativamente menos especializada y competente para proliferación, que es capaz de auto-renovarse, es decir, puede proliferar sin diferenciación, y las cuales o la progenie de las cuales pueden dar lugar a al menos un tipo celular más especializado. La expresión engloba células madre capaces de auto-renovación sustancialmente ilimitado, es decir, en las que la progenie de una célula madre o al menos parte de la misma mantiene sustancialmente el fenotipo no especializado o relativamente menos especializado, el potencial de diferenciación, y la capacidad de proliferación de la célula madre parental, así como las células madre que presentan una auto-renovación limitada, es decir, en las que la capacidad de la progenie o parte de la misma para proliferación adicional y/o diferenciación está reducida demostrablemente en comparación con la célula parental. A modo de ejemplo y sin limitación, una célula madre puede dar lugar a descendientes que se pueden diferenciar a lo largo de uno o más linajes para producir células cada vez más especializadas, en la que dichos descendientes y/o células cada vez más especializadas relativamente pueden ser en sí mismas células madre como se definen en el presente documento, o incluso producir células terminalmente especializadas, es decir, células completamente especializadas, que pueden ser postmitóticas.

La expresión “célula madre mesenquimática” o “MSC” como se utiliza en el presente documento se refiere a una célula madre derivada del mesodermo, de un mamífero adulto que es capaz de generar células de linajes mesenquimáticos, normalmente células de dos, preferentemente de tres o más linajes mesenquimáticos, por ejemplo, de linaje osteocítico (hueso), condrocítico (cartílago), miocítico (músculo), tendonocítico (tendón), fibroblástico (tejido conjuntivo), adipocítico (grasa) y estromogénico (estroma de médula). Comúnmente, pero sin limitación, una célula se puede considerar MSC si es capaz de formar células de cada uno de los linajes adipocítico, condrocítico y osteocítico, utilizando condiciones de diferenciación convencionales que se aceptan en la técnica y métodos de evaluación del fenotipo, por ejemplo, como se describe en Pittenger et al. 1999 (Science 284: 143-7) o Barberi et al., 2005 (PLoS Med 2: e161), y Usas et al., 2011.

El término MSC también engloba la progenie de MSC, por ejemplo, la progenie que se obtiene por la propagación in vitro o ex vivo de MSC que se obtiene de una muestra biológica de un sujeto.

El término “aislamiento” en referencia a un componente en particular denota la separación de ese componente de entre al menos otro componente de una composición de la que el primer componente se “aísla” de esta manera. El término “aislado” que se utiliza en relación con cualquier célula, grupo de células o una población de células también implica que dicha célula, grupo de células o población de células no forma parte del cuerpo de un animal.

El ISCT determina con precisión las cualidades que tienen que poseer las células para definirse como células madre mesenquimáticas (MSC), de la siguiente manera: las células tienen que ser adherentes en plástico, positivas a los marcadores CD73, CD90 y CD105, negativas a los marcadores CD14 (o CD11b), CD34, ^c D45, CD79a (o CD19) y MCH-II, y deben presentar la capacidad de diferenciarse en células de origen mesodérmico tales como los osteoblastos, condroblastos y adipocitos (Dominici et al., 2006). El uso de otros marcadores de MSC tales como CD29 o CD44 también se informaron (Pittenger et al., 1999). Los criterios del ISCT se extendieron a la invención del presente documento. Las células MSC de mamífero de la presente invención por lo tanto se definen por que expresan o co-expresan (es decir, son positivas para) al menos el marcador mesenquimático CD105, y preferentemente también uno o más de los siguientes marcadores: CD44 y CD90. Las células MSC de mamífero de la presente invención también expresan o co-expresan (es decir son positivas para) uno o más de los siguientes microARN: miR-128, miR-133B y potencialmente miR-218 o miR-802. Las células MSC de mamífero de la presente invención no expresan miR-656.

A lo largo de la memoria descriptiva “co-expresar” pretende cubrir el significado “que comprende la co-expresión de” de manera que las células pueden expresar otros marcadores o microARN además de los marcadores o microARN particulares enumerados que caracterizan las células.

Los términos microARN, miARN, miR o eca-miR se utilizan en el presente documento de manera intercambiable, y se refieren a ARN maduros no codificantes de 19-25 nucleótidos o precursores de los mismos, o fragmentos de los mismos, derivados de genes endógenos de organismos vivos tales como los animales. Los microARN maduros se procesan por precursores tipo horquilla más largos llamados pre-microARN (pre-miR) que tienen una longitud de aproximadamente 75 nucleótidos.

Cuando se dice que una célula es positiva a un marcador en particular o microARN, esto significa que un experto concluirá la presencia o evidencia de una señal distintiva, por ejemplo, detectable por anticuerpos o detección por reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa, para ese marcador o microARN cuando se lleva a cabo la medición apropiada, en comparación con los controles adecuados. Cuando el método permite la evaluación cuantitativa del marcador o microARN, las células positivas generan una señal que es significativamente diferente y mayor o más fuerte que el control, por ejemplo, pero sin limitación, al menos 1,5 veces mayor que dicha señal generada por las células de control, por ejemplo, al menos 2 veces, al menos 4 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces o incluso mayor.

La expresión de los marcadores específicos de la célula se puede detectar utilizando cualquier técnica inmunológica adecuada que se conozca en la técnica, tal como la inmuno-citoquímica o la adsorción por afinidad, el análisis de transferencia de Western, FACS, ELISA, etc., o por cualquier ensayo bioquímico adecuado de la actividad enzimática, o por cualquier técnica adecuada de medición de la cantidad del marcador, miARN, por ejemplo, transferencia de Northern, RT-PCR semicuantitativa o cuantitativa, etc.

La expresión de microARN se puede determinar, por ejemplo, con un ensayo para la expresión genética global (por ejemplo, utilizando un ensayo de micromatrices para el análisis del perfil de expresión de microARN, una placa de qPCR de microARN listo para su uso o secuenciación de ARN) o por ensayos de detección específica, por ejemplo, pero sin limitarse a, PCR cuantitativa, PCR (de tiempo real) de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR), PCR en tiempo real de ácido nucleico bloqueado (LNA), o transferencia de northern. En particular, la medición de la expresión de un microARN puede llevarse a cabo con una sonda de oligonucleótidos específicos para la detección de dicho microARN. Dicha sonda de oligonucleótidos puede unirse directa y específicamente al microARN, o puede específicamente transcribir inversamente dicho microARN. Dicha sonda de oligonucleótidos puede también amplificar un ADNc que se obtiene de dicho microARN.

Los datos de secuencia de ácido nucleico y aminoácidos para las proteínas marcadoras enumeradas en la presente divulgación se conocen en general y se pueden obtener de bases de datos públicas tales como, entre otras, de la base de datos del NIH "Protein Reviews on the Web" (http://mpr.nci.nih.gov/prow/), la base de datos del NIH "Entrez Gene" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene) o la base de datos Uniprot/Swissprot (http://www.expasy.org/). Los reactivos adecuados de detección y los métodos para dichos marcadores se pueden diseñar basándose en dicha información de secuencia o, más comúnmente, están disponibles en el mercado (por ejemplo, reactivos de anticuerpos monoclonales marcados).

El término “CD105” engloba el antígeno conocido como CD105, o sus sinónimos tales como endoglina. El CD105 es una glucoproteína de membrana localizada en las superficies celulares y es un marcador conocido de célula madre mesenquimática. Como ejemplo, la secuencia de aminoácidos parcial del antígeno CD105 equino se puede encontrar en la base de datos GenBank con el número de registro AGW 16345.1.

El término “CD90” engloba el antígeno CD90, o sus sinónimos tales como glucoproteína de membrana Thy-1. Como ejemplo, la secuencia de aminoácidos del antígeno CD90 equino se puede encontrar en la base de datos GenBank con el número de registro ACG61223.1.

El término “CD44” engloba el antígeno que se conoce en general como CD44, o sus sinónimos tales como receptor III de la matriz extracelular, receptor de migración/adhesión de linfocitos GP90, HUTCH-1, antígeno Hermes, receptor de hialuronato, o glucoproteína fagocítica 1. Como ejemplo, la secuencia de aminoácidos del antígeno CD44 equino se puede encontrar en la base de datos GenBank con el número de registro CAA47331.1.

Reactivos a modo de ejemplo disponibles en el mercado para la detección de dichos marcadores de MSC incluyen inter alia los anticuerpos monoclonales anti-CD105-RPE (ABD Serotec), anti-CD44-APC (BD Pharmigen), y anti-CD90 (VMDR). Los anticuerpos alternativos que se unen específicamente a CD105, CD44 o CD90 pueden ser identificados por el experto en la técnica.

Las MSC expresan al menos un microARN que se selecciona de entre el grupo que comprende: miR-128 y miR-133B, pero no expresan el siguiente microARN: miR-656.

Los microARN enumerados en la presente divulgación se conocen en general y se pueden obtener en bases de datos públicas tales como, entre otras, la base de datos miRBase (http://www.mirbase.org).

El término “miR-128” engloba el microARN conocido como miR-128 o su precursor. Como un ejemplo, la secuencia de nucleótidos del miR-128 equino se puede encontrar en la base de datos miRBase con el número de registro MI0012821.

El término “miR-133B” engloba el microARN conocido como miR-133B o su precursor. Como ejemplo, la secuencia de nucleótidos del miR-133B equino se puede encontrar en la base de datos miRBase con el número de registro MI0012844.

El término “miR-656” engloba el microARN conocido como miR-656 o su precursor. Como ejemplo, la secuencia de nucleótidos del miR-656 equino se puede encontrar en la base de datos miRBase con el número de registro MI0012915.

El experto en la técnica es consciente de que se puede hacer referencia a los microARN con diferentes nombres, o sinónimos.

Las células MSC pueden presentar además ciertas características morfológicas, tales como una cualquiera o más de entre: adherencia al plástico del cultivo tisular; crecimiento en monocapa; y son mononucleares de forma ovoide, estrellada o ahusada con núcleos ovales o redondeados que tienen nucléolos prominentes.

La expresión “población celular” generalmente se refiere a un agrupamiento de células. Una población de células puede consistir o puede comprender al menos una fracción de células de un tipo común, o que tengan características en común. Dichas características pueden incluir sin limitación, características morfológicas, potencial para la diferenciación (por ejemplo, pluripotentes, multipotentes, unipotentes, etc.; por ejemplo, si son multipotentes o unipotentes, la capacidad de diferenciarse en tipos celulares específicos), o la presencia y/o nivel de uno, dos, tres o más marcadores asociados con la célula, por ejemplo, antígenos de superficie. Dichas características pueden definir entonces una población celular o una fracción de la misma. Preferentemente, dicha población celular es una población de células madre mesenquimáticas, más preferentemente una población sustancialmente homogénea de células madre mesenquimáticas.

La expresión población “sustancialmente homogénea” o “sustancialmente pura” de células madre mesenquimáticas denota una población celular que comprende una fracción de MSC como se ha definido anteriormente, en la que dicha fracción de dicha población celular es al menos un 50 %, por ejemplo, al menos un 55 %, preferentemente al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 65 %, más preferentemente al menos un 70 %, por ejemplo, al menos un 75 %, incluso más preferentemente al menos un 80 %, por ejemplo, al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 %, por ejemplo, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o incluso cerca de o igual al 100 %.

La expresión “centrifugación en gradiente de densidad” engloba todos los tipos de técnicas de separación de células o productos que engloban la separación de células basada en la densidad. Ejemplos no limitantes pueden ser la centrifugación en gradiente de densidad en un gradiente de polímero de sacarosa, o sílice coloidal. Ejemplos no limitantes de gradientes disponibles en el mercado son: Percoll (sílice coloidal revestido con polivinilpirrolidona o silano), Ficoll (polímeros de sacarosa de alto peso molecular), Ficoll-Paque (Ficoll más diatrizoato sódico y edetato cálcico disódico), solución flotante de densidad (BDS, que comprende sílice coloidal), linfoprep (diatrizoato sódico y polisacáridos), etc. Está claro que el experto en la técnica será capaz de seleccionar gradientes adecuados para separar las células madre que se obtienen con el método de acuerdo con la presente invención. Utilizando los métodos de la presente invención las células madre mesenquimáticas (MSC) se encuentran normalmente en las superficies de contacto entre densidades < 15 %, 15-25 %, o 25-35 % de Percoll, tras la centrifugación a 1250 x g (25 °C, 20 min). Las células madre mesenquimáticas que co-expresan las proteínas marcadoras deseadas se pueden seleccionar entonces, enriquecerse o aislarse de la población general de células aisladas y opcionalmente expandirlas por los métodos conocidos per se, tales como, por ejemplo, utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), la clasificación celular activada magnética (MACS), tecnologías basadas en la afinidad, inter alia, cromatografía de afinidad, o la técnica preplaca y combinaciones de las mismas. Se informa de métodos a modo de ejemplo en Wu et al., 2010 (cf. Cell Tissue Research, Jun; 340(3):549-67).

Se permite que las células vivas que tienen un perfil de expresión deseado se unan con los reactivos (más comúnmente reactivos inmunológicos tales como, por ejemplo, anticuerpos monoclonales) específicos para los respectivos marcadores, en los que dichos reactivos a su vez están modificados (por ejemplo, por un fluoróforo, o por inmovilización sobre partículas magnéticas u otro tipo de fase fija), tal como para facilitar la selección o captura de las células unidas a dichos reactivos de entre las células que no están unidas. Como guía general para estos métodos, se hace referencia inter alia a Flow Cytometry and Cell Sorting, 2a ed., por Andreas Radbruch (ed.), Springer 1999 (ISBN 3540656308); coloración en vivo: Protocols in Flow Cytometry and Cell Sorting, ia ed., por ^rA Diamond y S Demaggio (eds.), Springer 2000 (ISBN 3540651497); Flow Cytometry Protocols (Methods in Molecular Biology), 2a ed., por TS Hawley y RG Hawley (eds.), Humana Press 2004 (ISBN 1588292355); separaciones por afinidad: A Practical Approach, P Matejtschuk (ed.), Oxford University Press, 1997 (ISBN 0199635501); y Dainiak et al. 2007. Adv Biochem Eng Biotechnol 106: 1-18.

La expresión “medio de cultivo adecuado” engloba todos los medios de cultivo celular que mantienen la supervivencia y crecimiento de las células madre mesenquimáticas (MSC) o las poblaciones de células madre mesenquimáticas. Ejemplos no limitantes son: DF20, DMEM F12 de Ham, DMEM, Alfa-MEM, etc., normalmente suplementados con al menos antibióticos y suero fetal bovino (FBS), y opcionalmente con agentes antifúngicos y tampones.

Solo como ejemplo, se ha utilizado el siguiente medio de cultivo en los ejemplos: medio DF20 que comprende el DMEM/F12 con aproximadamente un 20 % de suero fetal bovino, aproximadamente 5 ml de penicilina (1000 U/ml)-estreptomicina (10000 pg/ml), aproximadamente 2,5 ml de anfotericina B (250 pg/ml) y aproximadamente 5 ml de HEPES.

Para la diferenciación en, por ejemplo, adipocitos, osteocitos y condrocitos, las MSC o poblaciones de células madre mesenquimáticas de la invención se cultiva en un “medio de diferenciación” adecuado. Dicho medio de diferenciación puede ser por ejemplo: para la diferenciación adipogénica: Medio NH AdipoDiff (Miltenyi Biotec); para la diferenciación condrogénica: medio de diferenciación de condrocitos (Medio NH ChondroDiff; Miltenyi Biotec); para la diferenciación osteogénica: medio osteogénico (Medio NH OsteoDiff; Miltenyi Biotec). Los medios enumerados en el presente documento se muestran simplemente como medios a modo de ejemplo, pero el experto en la técnica será capaz de utilizar cualquier otro medio de diferenciación comercial o que se ha desarrollado específicamente. Otros ejemplos de medios de diferenciación adecuados para otras células tales como las células miogénicas, células endoteliales, células neurales, células cardíacas o hepatocitos se pueden hacer cultivando las MSC en un medio de diferenciación miogénico, endotelial, neuronal, cardíaco, o hepatocítico, respectivamente, ejemplos de los cuales se pueden encontrar, por ejemplo, en Usas et al., 2011.

Las maneras apropiadas para “despegado”, “dispersión”, “disociación” o “no disociación” de células se conocen en general en la técnica y se pueden utilizar en la presente invención. Estas implican, por ejemplo, el tratamiento con enzimas proteolíticas, la quelación de iones bivalentes, la desintegración mecánica o combinaciones de cualquiera de los anteriores. Preferentemente, dicha disociación celular puede implicar la digestión enzimática, favorablemente utilizando tripsina (por ejemplo, como se ha descrito anteriormente), opcionalmente en combinación con quelación de iones bivalentes, favorablemente utilizando EDTA (por ejemplo como se ha descrito anteriormente) y/o la disociación mecánica de las células tratadas de esta manera. Esta última puede implicar, por ejemplo, el paso repetido de las células a través de una pipeta de pequeño calibre (por ejemplo, una punta de micropipeta de 1000 pl) y/o pipeteándolas en una corriente de una suspensión que contiene las células contra una superficie sólida (por ejemplo contra la pared del matraz de cultivo). De esta manera se puede obtener una suspensión celular que comprende las MSC de la invención.

El término “microbiopsia” engloba todos los métodos de recolección subcutánea mínimamente invasivos y preferentemente sin sutura. El tamaño de una muestra de una microbiopsia es, como el término define, muy pequeña y normalmente comprende aproximadamente 15 a aproximadamente 20 mg de tejido. Se puede utilizar cualquier técnica posible o dispositivo adecuado para recolectar microbiopsias. Ejemplos no limitantes son agujas de microbiopsia, conchotomos o sistemas de microbiopsia cargados con un muelle que se conocen en la técnica. Solo como ejemplo, se puede utilizar una aguja de microbiopsia de calibre 14 y una pistola de microbiopsia.

La fuente de la microbiopsia que se utiliza en el método de la presente invención para aislar las células madre mesenquimáticas (MSC) es preferentemente el tejido relacionado con el músculo esquelético de mamíferos. Ejemplos de tejidos relacionados con músculo son los músculos del cuello, hombro, ancas, cola, extremidades, extremidad posterior, extremidad anterior, cuartos traseros, pata, etc. El tejido muscular a modo de ejemplo que se utiliza en los ejemplos es el músculo tríceps brachii del caballo, más preferentemente, que se toma de la cabeza larga del tríceps brachii, más preferentemente tomado a una profundidad de aproximadamente 5 cm en la cabeza larga de la cabeza larga del tríceps brachii. La recolección de tejido muscular se prefiere con respecto a, por ejemplo, la médula ósea o el tejido perióstico, debido a la cantidad, pero también a la facilidad del acceso al tejido muscular y la baja morbilidad en el sitio donante. El tejido embrionario se excluye explícitamente como fuente de microbiopsia. Un estudio llevado a cabo por Votion et al., 2010 demostraba que la microbiopsia llevada a cabo por veterinarios en la clínica práctica es fiable. Además, la ausencia de efectos adversos permite la consideración de este método de recolección de muestras para su uso en caballos de alto rendimiento, incluso durante las competiciones (Votion et al., 2010) y ya se ha utilizado para iniciar satisfactoriamente, por el método de explante, un cultivo primario de mioblastos esqueléticos equinos (Ceusters et al., 2012).

La expresión “mamífero” o “de mamífero” se refiere a todos los mamíferos incluyendo, pero sin limitación a, animales domésticos y de granja, animales de zoo, animales deportivos, animales mascotas, animales de compañía y animales de experimentación, tales como por ejemplo, ratones, ratas, hámsteres, conejos, perros, gatos, cobayas, ganado bovino, vacas, ovejas, caballos, cerdos y primates, por ejemplo, simios inferiores y simios superiores. Los mamíferos preferidos son caballos, perros, o gatos.

Como se explica en el presente documento, las células madre mesenquimáticas que se obtienen a partir de dichas microbiopsias son células que aparecen espontáneamente alrededor de la microbiopsia cuando se cultiva de acuerdo con el método que se reivindica. La expresión “que aparecen” engloba la existencia espontánea de células, es decir, sin necesidad de manipulación de la biopsia, o sin necesidad de añadir factores o agentes adicionales de crecimiento, diferenciación u otros. La etapa de cultivo de la microbiopsia, también llamada explante en este estadio, genera inesperadamente y espontáneamente células madre mesenquimáticas que se pueden subcultivar adicionalmente, purificar y conservar por ejemplo, por crioconservación como se ha definido en el presente documento. Los medios adecuados para dicho cultivo de dicha microbiopsia son DF20, DMEM F12 de Ham, DMEM, Alfa-MEM etc. Dichos medios contienen normalmente o están suplementados al menos con antibióticos y suero fetal bovino (FBS), y opcionalmente con agentes antifúngicos y tampones.

La presente invención también proporciona métodos de tratamiento administrando las MSC diferenciadas o no diferenciadas o las poblaciones de células madre mesenquimáticas diferenciadas o no diferenciadas como se define en el presente documento, particularmente para administrárselas a los sujetos que necesitan las mismas, cuya frase incluye sujetos que se beneficiarían de este tratamiento para una afección determinada, tal como trastornos mioartro-esqueléticos. Tales sujetos pueden incluir, sin limitación, los que se han diagnosticado de dicha afección, los que tienen tendencia a desarrollar dicha afección y/o aquellos en los que dicha afección se va a prevenir.

El término “sujeto” engloba todos los mamíferos, incluyendo, pero sin limitarse a, animales domésticos y de granja, animales de zoo, animales deportivos, animales mascotas, animales de compañía y animales de experimentación, tales como, por ejemplo, ratones, ratas, hámsteres, conejos, perros, gatos, ganado bovino, vacas, ovejas, caballos, cerdos y primates, por ejemplo, simios inferiores y simios superiores. Los sujetos preferidos son los caballos, perros y gatos.

El término “tratar” o “tratamiento” engloba tanto el tratamiento terapéutico de un trastorno ya desarrollado, tal como la terapia de un trastorno mio-artro-esquelético ya desarrollado, así como las medidas profilácticas o preventivas en las que el objetivo es prevenir o aminorar las oportunidades de incidencia de una afección no deseada, tal como para prevenir las oportunidades de contraer y la progresión de un trastorno mio-artro-esquelético tal como, pero sin limitarse a: desmitis, osteocondrosis, artritis, osteoporosis, tendinitis, inflamación de los tendones y ligamentos, fracturas, y fallo en la curación. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados de dicho tratamiento pueden incluir, sin limitación, el alivio de uno o más síntomas o uno o más marcadores biológicos, disminución de la extensión de la enfermedad, un estado estable de la enfermedad (léase, que no empeore), retraso o enlentecimiento de la progresión de la enfermedad, mejoría o paliación del estado de enfermedad, y similares. “Tratamiento” puede significar también prolongar la vida en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento.

La expresión “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad de composición veterinaria o farmacéutica de acuerdo con la invención que inhibe o retrasa en un sujeto la aparición de un trastorno como desea el investigador o el veterinario. La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” como se utiliza en el presente documento, se refiere a una cantidad de la composición veterinaria o farmacéutica de acuerdo con la invención que da lugar a la respuesta biológica o medicinal en un sujeto que desea el investigador, o veterinario, que puede incluir inter alia el alivio de los síntomas de la enfermedad o trastorno que se va a tratar. Se conocen métodos en la técnica para determinar las dosis terapéutica y profilácticamente eficaces.

El tratamiento puede emplear MSC, MSC diferenciadas o sus respectivas poblaciones celulares autólogas (léase, células derivadas del sujeto que se va a tratar), alogénicas (léase, células derivadas de sujetos distintos del sujeto que se va a tratar, pero que pertenecen a la misma especie) o xenogénicas (léase, células derivadas de sujetos que pertenecen a especies distintas del sujeto que se va a tratar), como se definen en el presente documento.

Las composiciones veterinarias o farmacéuticas comprenderán normalmente las células madre mesenquimáticas o las respectivas poblaciones de células madre mesenquimáticas de la invención como principio activo, y uno o más vehículos/excipientes farmacéuticamente aceptables. Como se utiliza en el presente documento, “vehículo” o “excipiente” incluye cada uno de los disolventes, diluyentes, tampones (tales como, por ejemplo, una solución salina tamponada neutra o una solución salina tamponada fosfato), solubilizantes, coloides, medios de dispersión, vehículos, cargas, agentes quelantes, (tales como, por ejemplo, EDTA o glutatión), aminoácidos (tales como, por ejemplo, glicina), proteínas, desintegrantes, aglutinantes, lubricantes, agentes humectantes, emulsionantes, edulcorantes, colorantes, saborizantes, aromatizantes, espesantes, agentes para conseguir un efecto depósito, revestimientos, agentes antifúngicos, conservantes, estabilizantes, antioxidantes, agentes que controlan la tonicidad, agentes que retrasan la absorción, y similares. El uso de dichos medios y agentes para las sustancias veterinaria o farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Dichos materiales deberían ser no tóxicos y no deberían interferir en la actividad de las células. Para su uso veterinario, las células se podrían formular también en, o administrarse como, un suplemento del pienso.

La naturaleza precisa del vehículo o excipiente u otro material dependerá de la vía de administración. Por ejemplo, la composición puede estar en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable. Para los principios generales de formulación medicinal, se remite al lector a Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, por G. Morstyn & W. Sheridan eds., Cambridge University Press, 1996; y Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000.

Dichas composiciones veterinarias o farmacéuticas pueden contener componentes adicionales para asegurar la viabilidad de las células madre mesenquimáticas o las poblaciones celulares del presente documento. Por ejemplo, las composiciones pueden comprender un sistema tampón adecuado (por ejemplo, un sistema tampón carbonato o fosfato) para conseguir un pH deseable, más habitualmente un pH cerca de la neutralidad, y puede comprender suficiente sal para asegurar las condiciones isoosmóticas para evitar la tensión osmótica en las MSC. Por ejemplo, una solución adecuada para estos fines puede ser la solución salina tamponada fosfato (PBS), solución de cloruro de sodio, inyección de Ringer o inyección de lactato de Ringer, como se conoce en la técnica. Además, la composición puede comprender una proteína portadora, por ejemplo, albúmina, que puede aumentar la viabilidad de las MSC.

Las composiciones veterinarias o farmacéuticas pueden comprender componentes adicionales útiles para reparar las heridas y defectos del hueso. Por ejemplo, dichos componentes pueden incluir sin limitación proteínas morfogénicas óseas, matriz ósea (por ejemplo, matriz ósea producida in vitro por las células de la invención o por otros métodos), partículas de hidroxiapatita/fosfato tricálcico (HA/TCP), gelatina, ácido poli-láctico, ácido glicólico poli-láctico, ácido hialurónico, quitosano, poli-L-lisina, y colágeno. Por ejemplo, las células osteoblásticas se pueden combinar con matriz ósea desmineralizada (DBM) u otras matrices para producir el compuesto osteogénico (hueso que se forma por sí mismo) así como osteo-inductivo. Métodos similares que utilizan células de médula ósea autólogas con DBM alogénica han dado buenos resultados.

La composición veterinaria o farmacéutica puede incluir además o se puede co-administrar con un factor bioactivo complementario tal como una proteína morfogénica ósea, tal como BMP-2, BMP-7 o BMP-4, o cualquier otro factor de crecimiento. Otros componentes acompañantes potenciales incluyen fuentes inorgánicas de calcio o fosfato adecuadas para ayudar a la regeneración ósea (documento WO 00/07639). Si se desea, la preparación celular se puede administrar sobre una matriz portadora o un material que proporcione una mejora en la regeneración tisular. Por ejemplo, el material puede ser una cerámica granular, o un biopolímero tal como gelatina, colágeno, osteonectina, fibrinógeno, u osteocalcina. Las matrices porosas se pueden sintetizar de acuerdo con técnicas convencionales (por ejemplo, Mikos et al., Biomaterials 14:323, 1993).

La composición veterinaria o farmacéutica puede incluir adicionalmente o se puede co-administrar con un agente complementario desinfectante, antiséptico, o destructor de microorganismos tales como un bactericida, antibacteriano, antibiótico o antifúngico y/o un agente antiinflamatorio con el fin de evitar complicaciones debidas a la infección o inflamación en el sitio de introducción o administración de las MSC.

A continuación se describe una disposición que comprende un instrumento quirúrgico para la administración de la composición que comprende MSC a un sujeto, tal como por ejemplo por vía sistémica, tópica o en el sitio de la lesión, y que además comprende las MSC o las poblaciones celulares de la invención, o una composición veterinaria o farmacéutica que comprende dichas MSC o poblaciones celulares, en el que la disposición se adapta a la administración de la composición veterinaria o farmacéutica por ejemplo por vía sistémica, tópica o en el sitio de la lesión ósea. Por ejemplo, un instrumento quirúrgico adecuado puede ser capaz de inyectar una composición líquida que comprende MSC o poblaciones celulares de la presente invención, tal como por vía sistémica o en el sitio de la lesión ósea.

Las MSC o poblaciones celulares pueden administrarse de manera que les permiten injertarse o migrar al sitio tisular que se pretende y reconstituir o regenerar el área funcionalmente deficiente. La administración de la composición dependerá del sitio mio-artro-esquelético que se va a reparar. Por ejemplo, las MSC o poblaciones celulares se pueden administrar directamente en las lesiones (tal como por ejemplo en un tendón o ligamento), o en las articulaciones sinoviales (tales como por ejemplo en las sinovias tendinosa o articular).

Por ejemplo, se puede facilitar la osteogénesis de acuerdo con un procedimiento quirúrgico para remodelar el tejido o insertar un catéter, o un dispositivo protésico. En otras circunstancias, no se necesitará cirugía invasiva, o la composición se puede administrar por inyección, tal como una inyección guiada por ultrasonidos, o utilizando un endoscopio guiable.

Las MSC diferenciadas o sin diferenciar o las poblaciones de células madre mesenquimáticas de la invención se pueden transferir y/o cultivar en sustratos adecuados para proporcionar los implantes. El sustrato sobre el cual se pueden aplicar y cultivar las células pueden ser de metal, tal como el titanio, aleación de cobalto/cromo o acero inoxidable, una superficie bioactiva tal como fosfato cálcico, superficies de polímero tales como polietileno, y similares. Aunque menos preferidos, también se pueden utilizar como sustrato, materiales silíceos tales como cristales cerámicos. Los más preferidos son los metales, tales como el titanio, y los fosfatos cálcicos, aunque el fosfato cálcico no es un componente indispensable del sustrato. El sustrato puede ser poroso o no poroso. El sustrato puede ser biodegradable o bio-absorbible.

Por ejemplo, las MSC de la invención que han proliferado, o que se van a diferenciar en placas de cultivo, se pueden transferir en soportes sólidos tridimensionales con el fin de producir que se multiplique y/o continúen el proceso de incubación incubando el soporte sólido en un medio nutritivo líquido de la invención, si fuera necesario. Las células se pueden transferir a un soporte sólido tridimensional, por ejemplo, impregnando dicho soporte con una suspensión líquida que contiene dichas células. Los soportes impregnados de esta manera se pueden implantar en un sujeto. Tales soportes impregnados se pueden re-cultivar sumergiéndolos en un medio de cultivo líquido, antes de ser implantados finalmente.

El soporte sólido tridimensional necesita ser biocompatible de manera que sea capaz de ser implantado en un sujeto. Puede tener cualquier forma adecuada tal como un cilindro, una esfera, una placa, o una parte de forma arbitraria. De los materiales adecuados para el soporte sólido tridimensional biocompatible, se puede hacer mención especial del carbonato cálcico, y en particular la aragonita, específicamente en forma de esqueleto de coral, la cerámica porosa basada en alúmina, en zirconio, o en fosfato tricálcico, y/o hidroxiapatita, imitación de esqueleto de coral por intercambio hidrotérmico que hace posible que el carbonato cálcico se transforme en hidroxiapatita, o incluso cristal cerámico de apatita-wolastonita, cristal cerámico bioactivo tal como cristales Bioglass™.

La presente invención se ilustra además por los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención de ninguna manera.

Ejemplos

Materiales y métodos

1. El método de recogida de muestras: microbiopsia muscular

Se llevaron a cabo los procedimientos de microbiopsia en caballos despiertos de pie. Los especímenes de microbiopsia se obtuvieron del músculo tríceps brachii (cabeza larga, en la intersección de una línea vertical que se extiende desde la cresta tricipital y una línea entre las articulaciones escápulo- y radio-humeral) de cada caballo (n = 3).

Los especímenes de microbiopsia se recolectaron con una aguja de microbiopsia de calibre 14 y una pistola de microbiopsia. En resumen, el sitio de biopsia se afeitó (un cm cuadrado) y se preparó asépticamente. Cada muestra (aproximadamente 15 a 20 mg de tejido) se recolectó a una profundidad de 5 cm en la cabeza larga del músculo tríceps brachii, por medio de una incisión cutánea realizada con la punta de una hoja de bisturí del n.° 11. La sutura de la incisión cutánea no era necesaria y todo el procedimiento de microbiopsia se completaba en 15 minutos. Inmediatamente tras la recolección, se colocó cada muestra en 6 ml de medio de cultivo compuesto por DMEM/F12 con un 20% de suero fetal bovino, 5 ml de penicilina (1000 U/ml)-estreptomicina (10000 pg/ml), 2,5 ml de anfotericina B (250 pg/ml) y 5 ml de HEPES [DF20]. Los especímenes de microbiopsia se mantuvieron en el medio de cultivo a 4 °C hasta su uso.

2. Inicio de los cultivos celulares utilizando los especímenes de microbiopsia como explantes

La preparación del cultivo se llevó a cabo con el uso de un equipo estéril, en una campana de flujo laminar. Los especímenes de microbiopsia se lavaron dos veces en 5 ml de DF20 precalentado a 37 °C. Cada espécimen de microbiopsia se diseccionó cuidadosamente (intentando mantener solo tejido muscular tanto como fuera posible) en solución de 10 mM de PBS (pH 7,4) que contenía 137 mM de NaCl y 2,7 mM de KCl, y luego se cortó en pequeñas piezas (del tamaño de la punta de la hoja de bisturí). Luego, cada pieza se colocó individualmente en los 16 pocillos centrales de una placa multipocillo de 24, se añadieron a cada pocillo 100 pl de DF20, y se incubaron los pocillos de cultivo a 37 °C en atmósfera controlada (un 5 % de CO2 y un 21 % de O2). Los pocillos exteriores se llenaron con PBS (1 ml/pocillo) para evitar el secado de los pocillos que contenían los explantes. Los pocillos que contenían explantes se controlaron cada día y se alimentaron con la simple adición de nuevo DF20 cuando era necesario (manteniendo los factores de crecimiento en los pocillos).

Cuando era visible un halo de células alrededor del tejido (aproximadamente a los 10 días), las piezas de músculo se transfirieron a otra placa multipocillo de 24 (los 16 pocillos centrales para las piezas de músculo y los pocillos exteriores se llenaron con PBS); las células que se separaron de la microbiopsia se cultivaron hasta el 80 % de confluencia (aproximadamente a los 20 días).

3. Tripsinización de las células y aislamiento de las células madre pluripotentes: centrifugación por gradiente de densidad de Percoll discontinuo

Las células cerca de la confluencia obtenidas de los explantes se despegaron utilizando tripsina-EDTA, se centrifugaron (200 x g, 10 min, 37 °C) y el aglomerado se resuspendió en 1 ml de HBSS. La suspensión celular se colocó entonces en un gradiente de densidad Percoll discontinuo preparado de la siguiente manera: se prepararon soluciones de cloruro sódico con un 15 %, 25 % y 35 % de Percoll. Luego, se añadieron 2 ml de cada solución de Percoll en un tubo de cultivo de 15 ml para formar el gradiente de densidad Percoll discontinuo por encima del cual se colocó 1 ml de suspensión celular. Las fracciones celulares con diferentes densidades aparecieron en las superficies de contacto de cada fracción Percoll tras la centrifugación a 1250 x g (25 °C, 20 min). Cada fracción (< 15 %, 15-25 %, 25-35 %) se recolectó individualmente, se lavó una vez con HBSS (1 ml/fracción) y se centrifugó a 200 x g, 10 min a 37 °C. Los sobrenadantes se desecharon y los aglomerados se resuspendieron en 1 ml de la DF20/fracción. Cada fracción se cultivó por separado en matraces T de 25 cm2 hasta el 80 % de confluencia y finalmente, las células de cada fracción se disociaron utilizando tripsina-EDTA, en matraces T de 175 cm2. Una vez alcanzado el 80 % de confluencia (aproximadamente a los 40 días), las células de las fracciones < 15 %, 15-25 % y 25-35 % se podían congelar en nitrógeno líquido o pasarse a la caracterización.

4. Caracterización de las células

Se caracterizaron las células de las fracciones < 15 %, 15-25 % y 25-35 % por su número (cf. Punto 4.1.), por sus capacidades clonogénicas (cf. Punto 4.2.), por su capacidad para diferenciarse en adipocitos, condrocitos y osteocitos cuando se colocan en medios de diferenciación adecuados (cf. Punto 4.4.) y por su expresión de CD29, CD105, CD44, CD90, CD45 y MHC II según la citometría de flujo (cf. Punto 4.3.). Todos estos ensayos se llevaron a cabo antes y después de congelar las células en nitrógeno líquido. Las células de las fracciones 15-25 % y 25-35 % también se ensayaron en cuanto a sus capacidades inmunoduladoras (cf. Punto 5). Las células se compararon también con MSC de la gelatina de Wharton y de médula ósea en cuanto a su expresión de miARN por el método de secuenciación de ARN (cf. Puntos 6 a 8).

4.1. Número de células

Una vez que eran confluentes, se evaluó el número de células contenidas en un matraz T-175cm2 para cada fracción.

4.2. Capacidad clonogénica

Las capacidades clonogénicas de las células se evaluaron con un ensayo de “unidades formadoras de colonias tipo fibroblastos” (UFC-F). Las células de cada fracción, en primocultivo o después de un pasaje, se sembraron a baja densidad (500000 células/matraz) y se cultivaron durante 10 días. Se utilizó la tinción de May-Grunwald Giemsa para visualizar las unidades formadoras de colonias macroscópicamente y se hizo el recuento del número total de colonias por matraz.

4.3. Inmunofenotipificación

Las células recolectadas se analizaron por citometría de flujo. En resumen, se lavaron las células (105) con PBS y se incubaron con los siguientes anticuerpos monoclonales:

CD29-FITC (Immunostep)

CD105-RPE (ABD Serotec)

CD44-APC (BD Pharmigen)

MCH II (ABD Serotec)

CD45-Alexa Flúor 488 (ABD Serotec)

CD90 (VMDR)

Tras el lavado con el tampón de ejecución MACSQuant (Miltenyi Biotec), las células se fijaron con una solución de formaldehído al 4 %. Los datos se adquirieron utilizando un analizador MACSQuant y se evaluó utilizando el software de citometría de flujo FCS Express 4 (De Novo Software, Los Angeles, CA, USA).

4.4. Potencial de multi-diferenciación de las células

El potencial de diferenciación de células aisladas se examinó utilizando las células recolectadas en P1 a P3. Se llevaron a cabo las diferenciaciones adipogénica, osteogénica, y condrogénica de acuerdo con las instrucciones del fabricante en medios adaptados (medios NH, Miltenyi Biotec).

- Diferenciación adipogénica

Para la diferenciación adipogénica, se colocaron en placas 5000 células/pocillo en una placa de 24 pocillos en medio in NH AdipoDiff (Miltenyi Biotec). A los 7, 14, y 21 días, se colorearon las células utilizando Oil Red O. En resumen, las células se lavaron en PBS y se fijaron con formaldehído al 8 % antes de teñirlas con solución Oil Red O (Sigma).

- Diferenciación condrogénica

Para inducir la condrogénesis, se transfirieron las células a tubos de fondo cónico de 15 ml y se diferenciaron en condrocitos en el cultivo del aglomerado (250.000 células/aglomerado) en 1 ml de medio de diferenciación específico de condrocitos (NH ChondroDiff Médium; Miltenyi Biotec). Los tubos se incubaron durante 21 días a 37 °C en una incubadora con un 5 % de CO2, y el medio se sustituyó cada semana. En resumen, tras 21 días, se fijaron las micromasas con metanol y se tiñó la cantidad completa con azul alciano. Se extrajo el azul alciano con hidrocloruro de guanidina 6 mol/l y se leyó la absorbancia a 620 nm.

- Diferenciación osteogénica

Para la diferenciación osteogénica, se colocaron las células en una placa de 24 pocillos con DMEM a una densidad de 5.000 células/pocillo. A las 24-48 h, se añadió el medio osteogénico (NH OsteoDiff Médium; Miltenyi Biotec) a las células adherentes. Cada semana, se alimentaron las células con una sustitución completa del medio. A los 7, 14, y 21 días, se evaluó la mineralización del calcio por coloración con Rojo de Alizarina (Sigma), como describen Meloan et al. con ligeras modificaciones. Las células se lavaron con PBS y se fijaron en etanol al 70 % a temperatura ambiente durante 5 min seguido de varios lavados con H2O. Se tiñeron las células con Rojo de Alizarina 40 mM (Sigma) a pH 4,2 durante 15 min a temperatura ambiente, se aclaró con H2O, y se secó al aire. La tinción roja se examinó con un microscopio de luz.

Se midió también la acumulación de calcio (determinación cuantitativa). Para evaluar la deposición de calcio, se desmineralizó la matriz con la adición de 200 pl de HCl 0,6 N y una incubación durante una noche a 37 °C. Las soluciones se recolectaron entonces y se centrifugaron a 2.000 g durante 5 min. La concentración de calcio en el sobrenadante se determinó por colorimetría (Kit de ensayo de calcio QuantiChrom; BioAssay Systems) como describe el fabricante. En resumen, se combinaron muestras de 5 ml con 200 ml de reactivo de calcio y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se midió la absorbancia inmediatamente tras la incubación a 610 nm utilizando un lector de placas (Organon Teknika Cappel Products).

5. Evaluación de las capacidades inmunomoduladoras de las MSC derivadas del músculo

Se purificaron linfocitos T CD2 de sangre de caballos recolectada en tubos con EDTA, utilizando perlas magnéticas. La población de LT CD2 que se obtuvo mostraba un grado de pureza del 99 % (no mostrado). Los LT CD2 se marcaron entonces de manera fluorescente con éster de succinimidil carboxifluoresceína (CFSE), se estimularon con fito-hemaglutinina (PHA) y se colocaron o no con las fracciones de 15-25 % o 25-35 % de las MSC preparadas con el método de acuerdo con la presente invención con diferentes proporciones de MSC/LT CD2: 4/1, 2/1, 1/1, 1/2, 1/4 y 1/8. La inhibición de la proliferación de LT CD2 (%) provocada por las MSC, se evaluó por el cambio de fluorescencia observada y que representaba las capacidades de inmunomodulación de las MSC.

6. Aislamiento de las células madre mesenquimáticas de la gelatina de Wharton

Se seccionaron longitudinalmente segmentos del cordón umbilical de caballo (5-10 cm) para exponer la gelatina de Wharton. Algunas incisiones se hicieron en la matriz con un bisturí estéril para exponer un área más amplia de tejido para que contactara con la superficie plástica. Las secciones de cordón se transfirieron entonces a una placa de Petri de 10 cm2 y se mantuvieron en la placa durante 5 días en medio de Eagle modificado Dulbecco con 1,0 g/l de glucosa, sin L-glutamina (DMEM; Lonza) suplementado con un 15% de suero fetal bovino (Sigma), 2 mM de L-glutamina (Lonza), y un 0,5 % de solución antibiótica-antimicótica (Lonza). Se mantuvieron los cultivos en una atmósfera humidificada con un 5 % de CO2 a 37 °C. A los 5 días, los segmentos de cordón se desecharon y el medio se renovó. Las células se expandieron entonces hasta que alcanzaban la sub-confluencia (80-90 %) con cambio de medio cada semana. A la sub-confluencia, las células se recolectaron tras despegado por incubación durante 10 min en solución TrypLE Select (Lonza). Para los pasajes, se recolocaron 5 x 104 células en matraces de 75 cm2 (Falcon) en las mismas condiciones de cultivo hasta la sub-confluencia. Se pasaron las células hasta P4.

7. Aislamiento de células madre mesenquimáticas derivadas de médula ósea

En resumen, se aislaron las células mononucleadas (MNC) (de muestras de médula ósea de caballo) por centrifugación en gradiente de densidad (LinfoSep; Biomedics, Madrid, España) y se lavaron en medio HBSS (Bio-Whittaker, Walkersville, MD). Los inventores sembraron 0,5 x 106 células/ml en medio esencial mínimo alfa (a-MEM; BioWhittaker) suplementado con un 15 % de FBS (Biochrom, Berlín, Alemania), 2 mM de L-glutamina (GIBCO BRL, Grand Island, NY), un 0,5 % de solución antibiótica/antifúngica (GIBCO BRL). Este es el medio a-MEM completo. Cuando las MSC se seleccionan por adhesión al plástico, es necesaria la eliminación de las células no adherentes sustituyendo el medio 48 horas después de la siembra de las células. Cuando los cultivos alcanzaban una confluencia del 80 %, se despegaron las células con una solución de tripsina-EDTA (GIBCO BRL), y se sub­ cultivaron a 1 x 104 células/ml.

8. Análisis transcriptómico

Método

Se utilizó el método de secuenciación de ARN (ARN-seq). Se extrajo el ARN total de 20 millones de MSC preparadas de acuerdo con el método de la presente invención (a partir de la fracción 15-25%) de dos caballos diferentes, 20 millones de células madre de la gelatina de Wharton de 1 caballo y 20 millones de células madre derivadas de médula ósea de 1 caballo, utilizando el kit mini RNAeasy (Qiagen). Las células se lisaron en tampón RLT que contenía beta-mercaptoetanol, luego se purificó el ARN en una columna siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Se había verificado la integridad del ARN en el Bioanalizador 2100 con Nano chips RNA 6000, los valores RIN eran > 8 para todas las muestras.

Se utilizó el kit de preparación de muestras de ARNm catenario Truseq Illumina para preparar bibliotecas de 1 microgramo de ARN total. Los ARN poli-A se purificaron con perlas magnéticas revestidas de poli-T y se fragmentaron químicamente en alrededor de 200 nucleótidos. Se utilizaron como armazón para la síntesis de la primera cadena en presencia de hexámeros aleatorios y después la síntesis de la segunda cadena. Luego, se adenilaron los extremos de la doble cadena de los ADNc en los extremos 3'OH antes de ligarlos a los adaptadores que contenían los índices. Finalmente, los fragmentos de la biblioteca ligados a los adaptadores se enriquecieron por PCR siguiendo el protocolo de Illumina y se purificaron con perlas magnéticas Ampure XP. Las bibliotecas se validaron en un chip 1000 del Bioanalizador de ADN y se cuantificó por qPCR con el kit de cuantificación de la biblioteca KAPA. La secuenciación se llevó a cabo en un NextSeq500 Illumina con un protocolo basado en emparejamiento de extremos 2 x 75.

Análisis de datos

Los archivos Fastq se ordenaron por secuencias adaptadoras. Las lecturas se alinearon con Trophat 2.0.9 con el genoma de caballo (Equus caballus (caballo) EquCab2 del UCSC). Se utilizó el programa Cufflinks 2.2.0 para generar los valores FPKM y se utilizó CuffDiff para identificar los genes expresados diferencialmente de manera significativa.

RESULTADOS

1. Método de obtención de muestras

La técnica de microbiopsia permite la adquisición de una cantidad suficiente de tejido muscular de caballo para iniciar fácilmente un cultivo. No se observó contaminación, ni durante la obtención de la muestra ni en el tratamiento en el laboratorio, validando, por lo tanto, las condiciones de trabajo de los inventores. Como cada microbiopsia se cortó en dos piezas, era posible comenzar dos cultivos por separado con solo 15-20 mg de tejido.

2. Cultivo por explantes

Tras tres o cuatro días de cultivo, las primeras células comenzaban a aparecer alrededor del músculo de la muestra. Tras aproximadamente nueve o diez días, el número de células era suficiente para trasplantar los explantes y dejar que las células crecieran solas (llamadas 1as células). Los explantes trasplantados permitían a los inventores obtener un segundo agrupamiento de células (llamadas 2as células) que también se cultivaron hasta la confluencia. También se puede obtener un tercer agrupamiento de células. Además, las 2as células empezaron a aparecer alrededor de la pieza de músculo más rápido que las 1as células.

3. Aislamiento de las células madre pluripotentes

Para cada uno de los 3 caballos y cada una de las fracciones Percoll (es decir, < 15%, 15-25%, 25-35 %) los inventores tuvieron éxito en cultivar y congelar una importante cantidad de células.

Aproximadamente a los 20 días después del inicio del cultivo, el número de células era suficiente para la tripsinización y para comenzar el proceso de aislamiento. Antes de este proceso, se obtuvieron 1.020.000 y 1.340.000 de las 1as células para los caballos 2 y 3 respectivamente. Las 2as células eran 333.333 y 750.000 para el caballo 2 y el caballo 3 respectivos.4

4. Caracterización de las células cultivadas

4.1. Número de células

Caballo 1 <15 % 1,42 6,816

25-35 % 4,44 76,368

15-25 % 6,36 343,44 13325

Caballo 3 <15 % 5,1 703,8 28152

25-35 % 3,9 444,6 9425

4.2. Capacidad clonogénica

Caballo 1 <15 % 22

25-35 % 119

Caballo 2 <15 % 0,076 2,5

25-35 % 0,065 3,54

15-25 % 0,0615 10,277

UFC-F x 106

El aspecto morfológico de las UFC que se observaron era diferente a las que se observan habitualmente en las células madre pluripotentes de la médula ósea o la gelatina de Wharton (Figura 1).

En las secciones 4.1 y 4.2 anteriores, P significa pasaje; P1 es el “pasaje 1” y P2 es el “pasaje 2”. El término pasaje se refiere a “la transferencia o sub-cultivo de células de un matraz de cultivo a otro”; habitualmente, pero no necesariamente, implica la subdivisión de una población celular en proliferación, haciendo posible la propagación de una línea celular o cepa celular. El número de pasaje es el número de veces que un cultivo se ha sub-cultivado.

5. Inmunofenotipificación

Las células obtenidas eran positivas a CD44, CD90 y CD105 y negativas para CD45, MHC II y CD29. La reactividad cruzada de todos estos anticuerpos con el caballo se comprobó en las células mononucleadas de las médulas óseas equinas, excepto para CD29 (Figura 2 y 3).

Para cada una de las tres fracciones Percoll, el 85-95% de las células expresaban CD105 y > 90% de ellas expresaban CD44 y CD90 (Figura 3).

6. Potencial de multi-diferenciación de las células

Las células obtenidas de cada una de las tres fracciones Percoll eran capaces de diferenciarse en adipocitos (Figura 4), condrocitos (Figura 5) y osteocitos (Figura 6) cuando se cultivan en los respectivos medios de diferenciación.

7. Uso clínico de las células

Las MSC de caballo que se obtienen por el método de acuerdo con la presente invención son capaces de reducir la cojera y de promover la curación en caballos afectados por patologías graves del sistema locomotor tales como la desmitis, tendinitis y osteoartritis. Las MSC pueden administrarse directamente en las lesiones (tendones, ligamentos), o en las cápsulas sinoviales tendinosas o articulares.

1/ Inyección intratendinosa de MSC

- Un caballo de carreras (yegua, 9 años de edad, pura sangre) desarrolló una tendinitis grave en el tendón del flexor digital superficial tras una carrera. Se dejó en reposo pero sin otro tratamiento. Tres meses después de la lesión mostraba una cojera de la extremidad anterior de grado III, que era positiva a la flexión de la parte inferior de la extremidad y carpiana. La exploración por diagnóstico por imagen mostraba una tendinopatía post-aguda de curación del tendón del flexor digital superficial (SDFT) con gran vascularización y una lesión central. Se utilizó el método de acuerdo con la presente invención para obtener MSC autólogas de una microbiopsia muscular de la yegua. Se hizo un control seis semanas más tarde. No había una mejoría significativa de la cojera pero la exploración ultrasonográfica mostraba una evolución ligeramente favorable de curación del SDFT anterior izquierdo y reblandecimiento de la lesión central. La yegua recibió una inyección de 107 MSC autólogas guiada por ultrasonidos en la lesión central del SDFT. También se le prescribió reposo en el box con 20 minutos de paseo/día. Seis semanas después, la yegua mostró una mejoría significativa de la cojera de la extremidad anterior izquierda. La exploración ultrasonográfica era significativamente mejor, con una mejoría de la ecogenicidad (véase la tabla 1 posterior). Se siguió un programa de rehabilitación.

- Un caballo de salto (7 años de edad, Zangersheide, macho entero) desarrolló una tendinitis del SDFT de la extremidad delantera derecha. Respondía bien al reposo y AINE (antiinflamatorios no esteroideos). Volvió al nivel previo de rendimiento 4 meses después pero desarrolló otra hinchazón palmar en la extremidad delantera derecha tras 3 semanas. Mostraba un grado III de cojera asociada con la hinchazón. La exploración ultrasonográfica mostraba una gran área hipoecoica, 5*1*0,7 cm, negativa al Doppler con septos hiperecoicos en el aspecto lateral del SDFT en el tercio distal del 3er hueso metacarpiano. Recibió un recorte corrector, herraje ortopédico e inyecciones intralesionales de PrP guiadas por ultrasonidos. Se sugirió un programa de rehabilitación. Se hizo una microbiopsia muscular para la preparación de MSC de acuerdo con el método de la presente invención. El primer control tuvo lugar 8 semanas más tarde. La hinchazón se había reabsorbido totalmente y se había notado una mejoría de 2 estadios de la cojera. La exploración ultrasonográfica mostraba una mejoría también: la lesión era menos hipoecoica reducida por 2 (2,5*0,5*0,7 cm) con un mejor aspecto fibrilar. El caballo recibió una inyección guiada por ultrasonidos de 107 de MSC autólogas en la lesión del SDFT. Se siguió un programa de rehabilitación. En el segundo control (2 meses más tarde), el caballo no mostraba cojera en absoluto y la ultrasonografía mostraba una pequeña área hipoecoica que definía la enfermedad (véase la tabla 1 posterior). El caballo recibió un recorte, se mantuvo el herraje ortopédico y se siguió con el programa de rehabilitación. En el último control (2 meses después del segundo control), no había un cambio significativo en las imágenes ultrasonográficas. Se terminó el programa de rehabilitación y se mantuvo el herraje ortopédico.

2/ Inyección intratendinosa e intrasinovial de MSC

- Un caballo de recreo (macho castrado, de 16 años de edad, media sangre) mostraba una cojera de grado III de la extremidad delantera izquierda localizada debajo del espolón. La exploración por imagen mostraba una tendinopatía anterior bilateral del lóbulo medial del tendón flexor digital profundo (DDFT) y enfermedad articular degenerativa ligera a media de la articulación interfalangiana distal izquierda. Se aplicaron herraduras ortopédicas e intraarticulares convencionales sin una mejoría significativa tras 6 semanas. Se utilizó el método de acuerdo con la presente invención para obtener MSC autólogas a partir de una microbiopsia muscular del caballo castrado. Cuatro semanas más tarde, el caballo recibió una inyección guiada por ultrasonidos de 107 MSC autólogas en el lóbulo medial del tendón flexor digital profundo anterior izquierdo y en la correspondiente vaina digital. El caballo presentó una hinchazón local moderada en el sitio de la inyección durante 2 días después de la administración de las células madre. Seis semanas después se llevó a cabo un control que mostraba una mejoría media de la cojera y una ligera mejoría de las imágenes ultrasonográficas. El programa de rehabilitación comenzó y en el segundo control, el caballo estaba claramente mejor (véase la tabla 1 posterior). Se propuso una intensificación progresiva de la actividad física.

3/ Inyección intraligamentosa e intra-articular de MSC

- Un poni de recreo (macho castrado, 5 años) afectado por una desmitis grave del ligamento lateral colateral de la articulación tarsotibial derecha durante 6 meses y signos moderados de enfermedad articular degenerativa. Cojera III/V, articulación hinchada, flexión dolorosa con movimiento limitado. Los tratamientos convencionales que se aplicaron desde el accidente no mejoraron la cojera significativamente. Se utilizó el método de acuerdo con la presente invención para obtener MSC autólogas a partir de una microbiopsia muscular del poni. Un mes más tarde, se inyectó una dosis de 107 MSC en el ligamento y 107 MSC en la almohadilla sinovial de la articulación tarso-tibial. Seis semanas más tarde, se observó una mejoría clínica de la cojera (grado I/V) con una clara disminución de la hinchazón articular y una flexión normal (véase la tabla 1 posterior). Se prescribió un programa de rehabilitación y el poni asumió la actividad física.

Tabla 1: Efecto de la inyección en sitios específicos de MSC autólogas de caballo preparadas de acuerdo con el método de la presente invención (107/ sitio de inyección) sobre la puntuación de cojera [desde 0: ausencia de cojera a V: imposibilidad para que el caballo utilice la extremidad afectada] de 4 caballos con diferentes enfermedades osteo-articulares.

8. Capacidades inmunomoduladoras de las células

Se observó una inhibición de la proliferación (%) de los linfocitos T CD2 (LT) del caballo. Para las MSC de la fracción 15-25 %, se observó la mayor inhibición con la proporción de MSC/LT CD2 de 1/8. Para las células de la fracción 25­ 35 %, la proporción óptima de MSC/LT CD2 era de 1/2 (véase la tabla 2 posterior).

Tabla 2: Inhibición de la proliferación (%) de LT CD2 de 2 caballos cuando se incubaban con MSC a partir de las fracciones 15-25 % o 25-35 % a diferentes proporciones MSC/LT CD2 (es decir, 4/1,2/1, 1/1, 1/2, 1/4, 1/8).

continuación

9. Análisis transcriptómico - Expresión diferencial de 5 miARN entre las MSC de caballo preparados de acuerdo con el método de la presente invención (abreviado como MSC derivadas de músculo), MSC de gelatina de Wharton y MSC de médula ósea de caballo

Los inventores observaron una expresión diferencial significativa de 56 genes entre las 3 fuentes de células madre. Los inventores eligieron enfocarse en los microARN (miARN). 5 miARN, a saber miR-128, miR-133B, miR-218, miR-656 y miR-802, mostraron una expresión diferencial significativa entre las 3 fuentes de células madre. Probablemente, debido a la técnica que se utilizó, los miARN que se observaban eran los precursores del correspondiente miARN. A partir de este experimento, parece que el miR-128 y miR-133B estaban sobre­ expresados significativamente en las MSC derivadas del músculo en comparación con las MSC de la gelatina de Wharton y las MSC de médula ósea. El miR-218 y el miR-802 también se expresaban por las MSC derivadas del músculo pero el miR-218 se expresaba más significativamente en las MSC de médula ósea en comparación con las MSC de la gelatina de Wharton y las MSC derivadas del músculo, mientras que el miR-802 estaba sobre-expresado significativamente en las MSC de médula ósea y las MSC derivadas del músculo en comparación con las m Sc de la gelatina de Wharton. El miR-656 estaba sobre-expresada significativamente en las MSC de la gelatina de Wharton en comparación con las MSC de la médula ósea y las MSC derivadas del músculo (Figura 7).

Abreviaturas

DF20: Medio de cultivo compuesto por DMEM/F12 con un 20 % de suero fetal bovino, 5 ml de penicilina (1000 U/ml)-estreptomicina (10000 pg/ml), 2,5 ml de anfotericina B (250 pg/ml) y 5 ml de HEPES.

HBSS: Solución salina equilibrada de Hank

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Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la preparación de células madre mesenquimáticas (MSC) de mamífero, que comprende las etapas de:

a) colocar una microbiopsia de tejido muscular esquelético de mamífero en un medio de cultivo adecuado, b) recolectar células que aparecen a partir de dicha microbiopsia durante el cultivo,

c) cultivar las células obtenidas en la etapa b) hasta casi la confluencia,

d) disociar las células de la etapa c),

e) separar las células madre mesenquimáticas (MSC) de las otras células por fraccionamiento en gradiente de densidad, obteniendo de esta manera células madre mesenquimáticas (MSC).

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicho mamífero se selecciona de entre el grupo que comprende: animales domésticos y de granja, animales de zoo, animales deportivos, animales mascota, animales de compañía y animales de experimentación, tales como, por ejemplo, ratones, ratas, hámsteres, conejos, perros, gatos, cobayas, ganado bovino, vacas, ovejas, caballos, cerdos y primates, por ejemplo, simios inferiores y simios superiores.

3. Una población de células madre mesenquimáticas de mamífero que se obtiene mediante el proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 caracterizada por las siguientes características:

(i) que dichas células expresan el antígeno CD105;

(ii) que dichas células expresan adicionalmente CD44 y CD90;

(iii) que dichas células no expresan los siguientes marcadores: CD45, MHC II y CD29

(iv) que dichas células expresan al menos un microARN seleccionado de entre el grupo que comprende: miR-128 y miR-133B;

(v) que dichas células no expresan el siguiente microARN: miR-656;

y en donde las células madre mesenquimáticas pueden diferenciarse en adipocitos, osteocitos, condrocitos, células miogénicas, células endoteliales, células neurales, células cardíacas y hepatocitos.

4. Una composición farmacéutica o veterinaria que comprende una población de células madre mesenquimáticas de acuerdo con la reivindicación 3.

5. La población de células madre mesenquimáticas de acuerdo con la reivindicación 3 o la composición farmacéutica o veterinaria de la reivindicación 4 para su uso como un medicamento o como un agente farmacéutico o veterinario.

6. La población de células madre mesenquimáticas de acuerdo con la reivindicación 3 o la composición farmacéutica o veterinaria de la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento de uno o más de los siguientes trastornos: desmitis, osteocondrosis, artritis, osteoporosis, tendinitis, laminitis, inflamación de los tendones y ligamentos, fracturas y fallo en la curación en un sujeto mamífero.

7. La población de células madre mesenquimáticas para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 5 o 6, en la que se utilizan células madre mesenquimáticas (MSC) autólogas, alogénicas o xenogénicas.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende adicionalmente la etapa de diferenciar las células en adipocitos, osteocitos, condrocitos, células miogénicas, células endoteliales, células neurales, células cardíacas o hepatocitos mediante el cultivo de las MSC en un medio adecuado de diferenciación adipogénica, osteogénica, condrogénica, miogénica, endotelial, neuronal, cardíaca o hepatocítica, respectivamente.

9. El método de la reivindicación 8, que comprende además la etapa de preparación de una composición farmacéutica o veterinaria que comprende los adipocitos, osteocitos, condrocitos, células miogénicas, células endoteliales, células neurales, células cardíacas o hepatocitos diferenciados obtenidos.