CN102864123B - 一种外周血间充质干细胞的获得方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明目的在于提供一种试剂盒及其应用；本发明的另一个目的还在于提供有效稳定的获得外周血MSG的方法。本发明采用GCSF联合AMD100成功动员外周血并分离培养出成纤维细胞样贴壁细胞，通过形态学、贴壁能力、表面标记和三系分化鉴定分离的细胞为MSC，并与同一动物骨髓来源MSC的生物学特性比较发现：外周血和骨髓来源的MSC具有相同的形态学特征和贴壁生长能力、表面标记、抗凋亡和衰老的特性；均具备自我更新和三系分化潜能，但骨髓MSC的增殖潜能和成骨能力强于外周血MSC，而成脂和成软骨分化能力弱于外周血MSC。再者，PB-MSC用于治疗关节软骨缺损取得较好的修复效果。因此，动员外周血来源的MSC基本具备骨髓MSC相似的生物学特性，其作为一种可供选择的MSC来源用于细胞治疗和再生医学领域具有非常广阔的临床应用前景。

Description

一种外周血间充质干细胞的获得方法及其应用

技术领域

本发明涉及再生医学领域，特别涉及具有极大临床应用前景的外周血来源MSC的动员采集培养、生物学特性及应用。

背景技术

因损伤、感染等导致的组织器官的修复重建一直是临床细胞治疗和再生医学领域的研究重点和难题。虽然异体移植的基础和临床研究取得了很大的进展，但是自体移植修复重建自体组织器官一直是治疗的金标准。近年来中胚层来源的成体干细胞间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)因其自我更新、多向分化潜能和免疫调控及不存在伦理道德的争议成为目前细胞治疗和组织工程种子细胞的研究热点。在适当的诱导条件下，MSC在体内外能分化成骨、软骨、脂肪细胞、纤维组织和支持造血组织、甚至内胚层和外胚层来源的任一组织，移植后能修复重建骨、软骨、肌肉、肌腱韧带、脑、脊髓、肺、心血管、肝、皮肤、胃肠道和造血系统，当其注射到早期囊胚泡时能形成大多数成体细胞类型。

传统的MSC主要来源于骨髓(Bone Marrow，BM)，但是其应用于临床最大的瓶颈是取材的创伤和并发症、非常有限的数目(0.01％～0.001％)及其体外培养生物学特性的改变和转化。因此开发其它来源的MSC非常紧迫。除骨髓外，MSC还广泛分布于间充质组织(如骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、脂肪)、骨膜、滑膜、滑液、皮肤、外周血、心血管、肝、胰腺、神经系统、肾、肺、脐(带)血、胎盘、羊水、胚胎甚至胎儿组织。

近年来动员外周血(Peripheral Blood，PB)来源的MSC因其取材微创甚至无创，可以实现真正的自体移植具有非常广阔的临床应用前景。但其进入实验研究和临床应用的瓶颈是有效的动员方法、动员后MSCs的有限数量和生物学特性容易发生改变。在正常生理成年或非动员的情况下外周血中很难分离得到贴壁的MSC，有作者报道即使采用常用动员药物粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony Stimulating Factor，GCSF)动员后在外周血中也只能分离极少量的MSC，且在体外分离培养20～25天后就出现衰老，增殖能力非常有限，表现为检测不到端粒酶的活性且端粒酶显著变短。

研究证据表明在某些病理状况下从骨髓或其他组织释放MSC归巢到损伤组织参与其修复，此时在外周血中可以分离得到MSC。骨髓中含有3种细胞：造血干细胞(HSC)、内皮祖细胞(EPC)和MSC，干细胞贮留在骨髓微环境是因为CXCR4和附近支持细胞释放的SDF-1的相互作用。目前常用的骨髓动员药物是GCSF，其作用机制是通过减少受体和配子的表达来破坏SDF-1/CXCR4轴动员HSC释放进入循环中。最近的研究表明采用GCSF联合CXCR4(chemokine(C-X-C motif)receptor 4)拮抗剂AMD3100(又名Plerixafor)可以导致HSC10倍甚至更多的释放。在动员HSC的同时是否能刺激MSC的动员呢？目前的问题是MSC的有效的动员及采集方法，再者获得的细胞是否具备骨髓MSC同样的生物学特性及体内修复组织缺损的效果目前仍不清楚。

技术内容

本发明目的在于提供一种试剂盒及其应用；本发明的另一个目的还在于提供有效稳定的获得外周血MSC的方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种试剂盒：每一个试剂盒中G-CSF(0.6ml:100ug/支)与CXCR4拮抗剂AMD3100(5mg/支)。所述试剂盒在有效稳定的获得外周血MSC的制剂中的应用。

一种有效稳定的获得外周血MSC的方法，包括如下步骤：

1)、采用G-CSF结合AMD3100联合动员骨髓MSC释放入血：连续5天皮下注射GCSF(50μg/kg i.h)，第6天皮下注射AMD3100(5mg/kg i.h)，1h后无菌条件下采血10ml注入含300U/ml管中。

2)、外周血MSC的分离培养扩增：

抽取血标本与红细胞裂解液(0.154M氯化铵，10mM碳酸氢钾，0.1mM乙二胺四乙酸)按体积比1∶10的比例混合，常温裂解10min，经离心、PBS洗后，以10⁶/ml密度重悬于完全培养基中(αMEM，10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，25ng/ml两性霉素B，2m M L-谷氨酰胺)，置于37°、5％CO₂培养箱中。3～4天后去除不贴壁细胞，以后每3-4天换液一次，10～15天后细胞达到80％～90％融合，用0.25％胰酶/0.1EDTA消化，按1∶3或1∶4传代，体外培养扩增至P3，得到均一的MSC。

另一方面，本发明还提供上述动员培养的外周血MSC与同一动物个体来源的骨髓MSC的生物学特性比较。

此外本发明还提供上述动员培养的外周血MSC用于修复关节软骨缺损的实例说明其可应用于组织器官病损修复重建中的用途。

附图说明：

图1：外周血和骨髓来源MSC的形态学观察(相差倒置显微镜)

图2：流式细胞仪鉴定外周血和骨髓来源MSC表面标记

图3：外周血和骨髓来源MSC的三系分化潜能比较(成骨、成脂、成软骨)

图4：外周血和骨髓来源MSC的增殖潜能比较

图5：外周血和骨髓来源MSC抗凋亡能力比较

图6：外周血和骨髓来源MSC体外培养细胞衰老比较

图7：PB-MSC体内修复兔关节软骨缺损的效果比较

本发明采用GCSF联合AMD100成功动员外周血并分离培养出成纤维细胞样贴壁细胞，通过形态学、贴壁能力、表面标记和三系分化鉴定分离的细胞为MSC，并与同一动物骨髓来源MSC的生物学特性比较发现：外周血和骨髓来源的MSC具有相同的形态学特征和贴壁生长能力、表面标记、抗凋亡和衰老的特性；均具备自我更新和三系分化潜能，但骨髓MSC的增殖潜能和成骨能力强于外周血MSC，而成脂和成软骨分化能力弱于外周血MSC。再者，PB-MSC用于治疗关节软骨缺损取得较好的修复效果。因此，动员外周血来源的MSC基本具备骨髓MSC相似的生物学特性，其作为一种可供选择的MSC来源用于细胞治疗和再生医学领域具有非常广阔的临床应用前景。

实验例1：兔外周血MSC的动员、分离培养及与骨髓MSC的体外生物学特性比较

实验动物：3月龄新西兰兔，体重±2kg，雌雄不限。

连续5天皮下注射GCSF(50μg/kg i.h)，第6天皮下注射AMD3100(5mg/kg i.h)，1h后无菌条件下经耳中央动脉采血10ml注入含300U/ml管中。

外周血、骨髓MSC的分离、培养扩增：抽取的血标本与红细胞裂解液(0.154M氯化铵，10mM碳酸氢钾，0.1mM 乙二胺四乙酸)按1∶10比例混合常温裂解10min，经离心、PBS洗后，以106/ml密度重悬于完全培养基中(αMEM，10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，25ng/ml两性霉素B，2m M L-谷氨酰胺)，至于37°5％CO₂培养箱中。3～4天后去除不贴壁细胞，以后每4天换液一次。10～15天后细胞达到80％～90％融合，用0.25％胰酶/0.1％EDTA消化传代，体外培养扩增至第三代(P3)。

麻醉下抽吸同一动物股骨和胫骨骨髓(4ml)，1∶1PBS稀释后置于等体积的Ficoll淋巴分离液上，经密度梯度离心，PBS洗后以10⁶/ml密度重悬于完全培养基中接种，培养扩增同外周血MSC。

2.1形态：原代分离的外周血、骨髓来源的MSC于3d、P3在相差倒置显微镜(X100)观察并拍照。

见图1外周血和骨髓来源MSC的形态学观察(相差倒置显微镜)

结果：3～4天可见少量的长梭型的贴壁细胞，5～7天细胞表现典型的成纤维细胞样表型，10～15天细胞传代，以后约每3天传代一次直到P3，此时细胞形态表现均一、状态良好。

2.2表面标记鉴定：取生长状态良好的P3 MSC经0.25％胰酶/0.1％EDTA消化后以0.5X10⁶/ml密度重悬于PBS中，加入5μl荧光交联的抗体(抗CD29/CD44/CD45/MHC2)混匀4°孵育30min，PBS洗后经FACS分析。

见图2流式细胞仪鉴定外周血和骨髓来源MSC表面标记

结果：两种来源的细胞都表达CD29、CD44，而不表达CD45，MHCII，两者比较无统计学差异。

2.3三系诱导分化(成骨、成脂、成软骨诱导分化)：

成骨分化：生长良好的P3 MSC加入成骨诱导液(DMEM、10％FBS、0.1μM地塞米松，50μM维生素C，10mM β-磷酸甘油，1％双抗)中诱导21d后行茜素红和ALP染色分别鉴定成骨特异标志钙结节和ALP的表达。并通过计算钙结节染色阳性占总面积的百分率比较两者的成骨分化能力。

成脂分化：生长良好的P3 MSC加入成脂诱导液(DMEM、10％FBS、0.5mMisobutyl-methylxanthine(IBMX)，1μM地塞米松，10μM胰岛素，200μM吲哚美辛，1％双抗)中诱导21d后行油红O染色鉴定。并通过数脂滴染色阳性细胞占总细胞的百分率比较两者的成脂分化能力。

成软骨分化

取P3成软骨采用无血清、细胞微团三维诱导培养。取消化的10⁶ P3 MSC离心后重悬于成软骨诱导液中(DMEM、100×ITS，1mmol/L丙酮酸盐，0.17mmol/L维生素C，0.1μM地塞米松，0.35mmol/L脯氨酸，10ng/ml TGFβ1，1％双抗)诱导21天后，固定、石蜡包埋、切片，通过HE染色、甲苯胺蓝、阿利新蓝、II型胶原免疫组化鉴定成软骨标志蛋白多糖GAG和II型胶原。并通过测量细胞微团的直径大小和II型胶原免疫组化染色的强弱比较两者的成软骨分化能力。

见图3外周血和骨髓来源MSC的三系分化潜能比较(成骨、成脂、成软骨)

结果：两种来源的细胞都具有三系分化潜能，骨髓的成骨能力强于外周血，而外周血的成脂和成软骨强于骨髓。

2.4描绘细胞生长曲线评价其增殖能力

CCK8细胞增殖分析通过CCK8检测试剂盒描绘两种组织来源MSC的生物学特性。取P3MSC以10⁵/ml密度100μl/孔接种于96孔板，每组5个复孔1个对照，重复3次。于接种后1，3，5，7，9，11，13，15d每孔加入10μlCCK8溶液37°孵育2h，在酶标仪450nm处读数并统计，描绘生长曲线。

见图4外周血和骨髓来源MSC的增殖潜能比较

结果：两种MSC的生长曲线图可以看出骨髓MSC的增殖活性强于外周血MSC。

2.5抗凋亡检测：H2O2诱导凋亡模型

不同浓度H₂O₂(0，0.1，0.2，0.4，0.8mM)刺激生长良好的P3MSC，1h后通过Annexin V/PI染色FACS流式检测和TUNEL染色激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡的情况。

见图5外周血和骨髓来源MSC抗凋亡能力比较

结果：随着H₂O₂浓度的增加，两种细胞的凋亡率逐渐上升，FCM检测结果无统计学差异。

2.6抗衰老：端粒酶活性检测；β半乳糖苷酶染色

通过细胞衰老相关β-gal染色检测MSC长期培养的细胞衰老比例。

见图6外周血和骨髓来源MSC体外培养细胞衰老比较

结果：随着传代的进行，骨髓和外周血来源的MSC β-gal染色逐渐增强，两者无显著差异。

实验例2：PB-MSC体内修复兔股骨滑车软骨缺损的效果比较

脱矿皮质骨的制备：取4-5月龄新西兰兔的四肢骨，经脱矿、脱脂、脱蛋白、冷冻干燥、修剪成直径5mm深2～3mm圆柱形状后，25KGYγ射线消毒备用。

取第3代外周血和骨髓来源的MSC，采用二次沉淀接种法将MSC以1×107个/mL的细胞密度种植于脱矿皮质骨上，直接修复兔股骨滑车软骨缺损模型，于术后1m，2m，3m，6m通过MRI、组织学染色和评分、免疫组化评价体内修复兔股骨髁滑车直径5mm深2～3mm骨软骨缺损的效果。

见图7：PB-MSC体内修复兔关节软骨缺损的效果比较

结果：采用外周血和骨髓来源的MSC复合脱矿皮质骨修复兔关节软骨缺损(图7A)，随访3月时软骨缺损光滑平整，组织学染色发现有软骨特异基质GAG和II型胶原表达(图7B、C、D、E、F)，随着时间的增加表达逐渐增强，组织学评分两者无统计学差异。(见图7)

实施例1：一种试剂盒：每一个试剂盒中，包含G-CSF(0.6ml:100ug/支，购自山东齐鲁制药有限公司)与CXCR4拮抗剂AMD3100(5mg/支，购自SIGMA)，用于生物学特性检测。

实施例2：一种有效稳定的获得外周血MSC的方法，包括如下步骤：

1)、采用G-CSF结合AMD3100联合动员骨髓MSC释放入血：连续5天皮下注射GCSF(50μg/kg i.h)，第6天皮下注射AMD3100(5mg/kg i.h)，1h后无菌条件下采血10ml注入含300U/ml管中。

2)、外周血MSC的分离培养扩增：

抽取血标本与红细胞裂解液(0.154M氯化铵，10mM碳酸氢钾，0.1mM 乙二胺四乙酸)按体积比：1∶10的比例混合，常温裂解10min，经离心、PBS洗后，以10⁶/ml密度重悬于完全培养基中(αMEM，10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，25ng/ml两性霉素B，2m M L-谷氨酰胺)，置于37°5％CO₂培养箱中。3～4天后去除不贴壁细胞，以后每3-4天换液一次，10～15天后细胞达到80％～90％融合，用0.25％胰酶/0.1％EDTA消化，调整细胞密度按1∶3或1∶4传代，重悬于10～15ml/皿新鲜完全培养基中，以后每3-4天换液一次，待细胞达到80％～90％融合时按上述的传代方法传代，体外培养扩增至第三代(P3)，得到均一的MSC。用于生物学特性检测和体内应用。

实施例3：一种试剂盒：每一个试剂盒中G-CSF(0.6ml:100ug/支)与CXCR4拮抗剂AMD3100(5mg/支)，所述试剂盒在获得外周血MSC的制剂中的应用。

Claims (3)

1.一种有效稳定的获得外周血MSC的方法，包括如下步骤：

采用G-CSF结合AMD3100联合动员骨髓MSC释放入血：连续5天皮下注射50 μg/kg i.h GCSF，第6天皮下注射5 mg/kg i.h AMD3100，1h后无菌条件下采血10ml注入含300U/ml的管中；

外周血MSC的分离 培养 扩增：抽取的血标本与红细胞裂解液按体积比1：10的比例混合，常温裂解10min，经离心、PBS洗后，以10⁶/ml密度重悬于完全培养基中，置于37℃、5%CO₂培养箱中；3~4天后去除不贴壁细胞，以后每3-4天换液一次，10~15天后细胞达到80%~90%融合，用0.25%胰酶/ 0.1%EDTA消化，按1:3或1:4传代，体外培养扩增至P3，得到均一的MSC。

2.如权利要求1所述的一种有效稳定的获得外周血MSC的方法，其中红细胞裂解液组成为：0.154M 氯化铵, 10mM 碳酸氢钾, 0.1mM 乙二胺四乙酸。

3.如权利要求2或3所述的一种有效稳定的获得外周血MSC的方法，其中培养基组成为：αMEM，10% 胎牛血清, 100U/ml青霉素, 100μg/ml链霉素, 25ng/ml 两性霉素B, 2m M L-谷氨酰胺。