CN116539880B - 检测代谢物和/或组织蛋白的试剂在制备痛风性关节炎筛查试剂盒中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于关节病诊断技术领域，具体涉及检测代谢物和/或组织蛋白的试剂在制备痛风性关节炎筛查试剂盒中的用途。本发明提供了一系列新的痛风性关节炎筛查标记物，包括五种代谢物和五种组织蛋白，所述代谢物包括如下五种化合物中的至少一种：N‑油酰基组氨酸、硬脂酰肉碱、棕榈酰肉碱、十四烷酰肉碱或硬脂酸；所述组织蛋白包括如下五种蛋白中的至少一种：组织蛋白酶D、组织蛋白酶B、组织蛋白酶G、组织蛋白酶S或溶酶体α‑甘露糖苷酶。本发明的生物标志物能够实现痛风性关节炎的有效筛查。由于只需要以关节液作为检测样本，本发明具有无创、检测简单等有点，更易于在临床性或基层医院推广应用。

Description

检测代谢物和/或组织蛋白的试剂在制备痛风性关节炎筛查 试剂盒中的用途
技术领域
本发明属于关节病诊断技术领域，具体涉及检测代谢物和/或组织蛋白的试剂在制备痛风性关节炎筛查试剂盒中的用途。
背景技术
痛风性关节炎是指由于血液中尿酸浓度过高，导致单钠尿酸盐晶体析出，晶体在关节或关节周围软组织等部位沉积后所引起的炎症反应。机体嘌呤代谢异常导致的人体内血尿酸增高与遗传和环境因素密切相关，痛风的发生生化基础是机体内血尿酸升高，当血尿酸浓度达到一定的饱和度析出的尿酸盐晶体沉积在关节、肾脏和皮下等不同沮织造成病理改变，出现各种常见的关节炎、痛风石、痛风石等痛风临床表现。然而，虽然高尿酸血症人群数量巨大，但罹患痛风的髙尿酸人群为10％左右口，90％的人群是无症状的高尿酸血症存在，并不发展至痛风阶段，说明痛风的发生不仅仅与代谢因素密切相关，尚有目前尚未知道的其它因素。
痛风性关节炎的早期诊断是预防痛风致残最为关键的环节，据国家风湿病数据中心统计仍有14.3％的患者在初次就诊时未正确诊断，15.2％的患者在发病五年内未明确诊。
关节穿刺镜检发现MSU仍是痛风性关节炎诊断的金标准，但受限于有创性及专业性未得到广泛的开展。近年来，包括超声、CT和MRI等影像学技术越来越多地应用于痛风关节炎的诊断和鉴别，这些技术的普及不仅提高了诊断的敏感性和特异性，还可以有效评估疾病的严重程度、尿酸盐沉积的范围以及监测患者降尿酸治疗的情况。多年来，除了血尿酸水平的测定以外，关节X线检查一直是诊断痛风关节炎的主要辅助手段，但是由于敏感性差，不利于早期诊断。
通过损伤小、快速的抽取关节液方法可以作为一种检测手段诊断急性痛风性膝关节炎，对病人造成伤害小，干扰因素少。通过代谢组学的蛋白组学方法便可以检测这两大类物质的含量，有望用于诊断痛风性关节炎的发病进程。然而，关节液中所含有的代谢物和蛋白种类繁多，如何选择对痛风性关节炎具有诊断作用的生物标志物仍然是困扰本技术领域的难题。
脂肪酰基物质是脂肪酰也称脂酰化合物，泛指脂肪酸及含有脂肪酸残基的脂质。脂肪酰是由乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A及甲基丙二酸单酰辅酶A经由脂肪酸合成反应而得的多种分子。组织蛋白是在各种动物组织的细胞内发现的一类蛋白酶，是半胱氨酸蛋白酶家族的主要成员，在人体中主要存在11种，研究表明目前它们与人类的多种重大疾病密切相关，是近年来备受关注的一类靶标蛋白酶。
目前，对于脂肪酰基物质和组织蛋白能否作为痛风性关节炎的生物标志物，什么样的脂肪酰基物质和组织蛋白能够作为痛风性关节炎的生物标志物，实现痛风关节炎的诊断，目前尚缺乏相关报道。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供五种脂肪酰基物质代谢物和五种组织蛋白作为生物标志物，实现了痛风性关节炎的风险筛查，可作为诊断指标用于痛风性关节炎的早期诊断。
检测代谢物和/或组织蛋白的试剂在制备痛风性关节炎筛查试剂盒中的用途，其特征在于：
所述代谢物包括如下五种化合物中的至少一种：N-油酰基组氨酸、硬脂酰肉碱、棕榈酰肉碱、十四烷酰肉碱或硬脂酸；
所述组织蛋白包括如下五种蛋白中的至少一种：组织蛋白酶D、组织蛋白酶B、组织蛋白酶G、组织蛋白酶S或溶酶体α-甘露糖苷酶。
优选的，所述组织蛋白酶D的Uniprot编号为P07339，
和/或，所述组织蛋白酶B的Uniprot编号为P07858，
和/或，所述组织蛋白酶G的Uniprot编号为P08311，
和/或，所述组织蛋白酶S的Uniprot编号为P25774，
和/或，所述溶酶体α-甘露糖苷酶的Uniprot编号为O00754。
优选的，检测组织蛋白的试剂为酶联免疫分析试剂、western blot试剂或蛋白芯片检测方法用试剂。
优选的，检测组织蛋白的试剂包括将所述组织蛋白裂解为多肽的试剂和利用LC-MS法检测所述多肽用试剂。
优选的，检测代谢物的试剂为LC-MS法检测用试剂。
优选的，所述试剂是用于检测关节液中所述代谢物和/或所述组织蛋白的试剂。
本发明还提供一种痛风性关节炎筛查试剂盒，它包括用于检测代谢物和/或组织蛋白的试剂，
所述代谢物包括如下五种化合物中的至少一种：N-油酰基组氨酸、硬脂酰肉碱、棕榈酰肉碱、十四烷酰肉碱或硬脂酸；
所述组织蛋白包括如下五种蛋白中的至少一种：组织蛋白酶D、组织蛋白酶B、组织蛋白酶G、组织蛋白酶S或溶酶体α-甘露糖苷酶。
优选的，检测组织蛋白的试剂为酶联免疫分析试剂、western blot试剂或蛋白芯片检测方法用试剂；
或，检测组织蛋白的试剂包括将所述组织蛋白裂解为多肽的试剂和利用LC-MS法检测所述多肽用试剂。
优选的，检测代谢物的试剂为LC-MS法检测用试剂。
优选的，所述试剂是用于检测关节液中所述代谢物和/或所述组织蛋白的试剂。
本发明的关键在于，确定了人体关节液中五种脂肪酰基物质代谢物和五种组织蛋白的含量与患痛风性关节炎的风险显著相关。这五种脂肪酰基物质为N-油酰基组氨酸(N-oleoyl histidine)、硬脂酰肉碱(Stearoylcarnitine)、十四烷酰肉碱(Tetradecanoylcarnitine)、硬脂酸(Stearidonic Acid)和棕榈酰肉碱(Palmitoylcarnitine)；五种组织蛋白为组织蛋白酶D、组织蛋白酶B、组织蛋白酶G、组织蛋白酶S和溶酶体α-甘露糖苷酶。因此可以通过检测人体关节液中这些代谢物和组织蛋白的含量来判断患痛风性关节炎的风险，至于具体检测人体关节液中这些代谢物和组织蛋白的手段，可以采用现有技术公开的各种手段，本发明实施例具体采用液相色谱质谱(LC-MS)联用技术进行检测，但不仅仅限于该手段，任何能够检测这些代谢物和组织蛋白含量的方法均可用于痛风性关节炎筛查。
本发明提供了一系列新的痛风性关节炎筛查标记物，能够实现痛风性关节炎的有效筛查。相较于活检获取软骨组织样本来检测相关蛋白和代谢物的表达，关节液样本更容易获取，更便于差异蛋白和代谢物的表达水平的检测，且液相色谱质谱检测方法更为简便，更易于在临床性或基层医院推广应用。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1的实验流程示意图；
图2为：A、主成分分析(PCA)利用蛋白表达来显示不同维度的样本之间的关系。图中的每个点代表一个分组实验的重复，用不同的颜色区分不同的组。B、差异蛋白表达对照组聚类分析热图，红色表示高表达蛋白，蓝色表示低表达蛋白。每一行表示不同组中各蛋白的表达量，每一列表示各组中所有差异蛋白的表达量。上面的树是来自不同子组的数据的聚类分析结果，左边的树是来自不同蛋白质的不同组的数据的聚类分析结果。C、差异表达蛋白质的统计图。
图3为：A、通过7倍交叉验证获得的所有样本的PCA模型图。B、偏最小二乘判别分析是一种监督判别统计方法。C、正交偏最小二乘判别分析OPLS-DA是一种只有一个预测主成分和多个正交主成分的监督判别统计方法。可以有不止一个。组间变异在t1上最大，使组间变异直接与t1区分，而组内变异反映在正交主成分上。两组在OPLS-DA评分图上有显著性差异。D、TOP-50个差异代谢物热图，基于VIP值可视化前50个差异代谢物表达(水平坐标表示样本名称，垂直坐标表示差异代谢物。颜色范围从绿色到红色，表示代谢物的表达丰度从低到高，即越红表示差异代谢物的表达丰度较高)。
图4为差异蛋白和差异代谢物的验证结果。(A)采用蛋白印迹法检测组织蛋白酶D、组织蛋白酶B、组织蛋白酶G、组织蛋白酶S或溶酶体α-甘露糖苷酶的表达。(B-F)溶酶体α-甘露糖苷酶、组织蛋白酶D、组织蛋白酶G、组织蛋白酶S、组织蛋白酶B表达的定量(n＝3，所有数据均以平均±SD表示，采用双向方差分析，然后采用图基检验)。(G-K)代谢物N-oleoylhistidine、Stearoylcarnitine、Tetradecanoylcarnitine、Stearidonic Acid、Palmitoylcarnitine相对表达的定量(n＝3)。*表示P<0.05，**表示P<0.01,***means P<0.001。
具体实施方式
以下实施例和实验例中，所用的试剂和材料均为市售品。
对于实施例中出现的英文和术语作出如下解释：
FC，是fold change缩写，指某给特定代谢物在病人血清中与在正常人血清中的浓度比值。
P value，统计学中用来判断假设是否成立的依据。
VIP，是Variable Importance for the Projection缩写，衡量各代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力。
实施例1关节液中代谢物和组织蛋白的组学分析
一、实验方法
本实施例的实验流程如图1所示，主要包括对通风关节炎患者和正常人群的关节液进行代谢组学和蛋白组学的分析，筛选差异代谢物和差异蛋白。
具体的：
(一)蛋白组学具体实施步骤
1.抽取关节液，每个样本取40μL关节液，加入400μL结合缓冲液(5mM Tris-HCl(pH＝6.8)1.25mL，甘油2mL，10％SDS 4mL，DTT1g，0.1％溴酚蓝500μL，加无离子水定容至20mL)进行稀释。
2.除去柱子上的盖子，倒出贮存的缓冲液(137mM NaCl 8g，2.7mM KCl0.2g，10mMNa2HPO41.42g，2mM KH2PO40.27g，无离子水定容到1升终PH＝7.4)，以纸吸去管口残留液。
3.除去柱底部的尖咀，下方放置大小适合的收集管。
4.加入850μL结合缓冲液(5mM Tris-HCl(pH＝6.8)1.25mL，甘油2mL，10％SDS4mL，DTT1g，0.1％溴酚蓝500μL，加无离子水定容至20mL)，让其靠重力流过柱体，进行活化。
5.将柱子放入一个新的大小适合的收集管中。
6.加入稀释后的样本，让其靠重力流过柱体。
7.以600μL结合缓冲液清洗柱体。
8.再次以600μL结合缓冲液清洗柱体收集上三步的洗脱组份，即为去除白蛋白/IgG后的样本真空冷冻干燥后备用。
9.将冻干的样品加入150μL SDS裂解液(50mM Tris(pH8.1)，1％ SDS及其他蛋白抑制剂+无离子水)进行复溶。
10.将溶液在室温下12000×g离心10min,取上清，并再次离心取上清。
11.上清即样品的总蛋白溶液，进行蛋白浓度测定并分装后储存于-80℃备用。
12.蛋白浓度测定，使用BCA蛋白浓度测定方法根据标准蛋白溶液的已知浓度和吸光度值计算标准曲线，算得蛋白浓度值。
13.胰蛋白酶酶解，根据测定的蛋白浓度，每个样品取50μg的蛋白，并用裂解液将不同组样品稀释调整到相同的浓度和体积。在以上蛋白溶液中加入DTT(巯基还原剂)，使得DTT的终浓度为4.5mM，混匀，在55℃孵育30min。在冰上进行冷却直到达到室温。加入相应体积的10mM碘乙酰胺，使得终浓度为9mM，充分混匀，室温避光放置15min。在以上溶液中加入6倍体积的丙酮沉淀蛋白，-20℃放置四小时以上或者过夜。4℃,8000×g离心10分钟收集沉淀，挥发丙酮2-3min。加入100μL TEAB2(50mM)(四乙基溴化铵缓冲水溶液tetraethylammonium bromide)复溶沉淀，加入1/50样品质量的1mg/ml胰酶Trypsin-TPCK，并于37℃消化过夜。加磷酸调pH值为3左右终止酶解反应。
14.酶解后的肽段采用SOLATMSPE 96孔板脱盐。(1).活化：200μL甲醇活化柱子，再重复2次。(2).平衡：200μL纯水活化柱子，再重复2次。(3).Load样品：体积50-500μL样品，调节真空，液滴速度保持在1mL/min(约1滴/秒)(4).重复load一次。(5).Wash：200μL 5％甲醇清洗，再重复2次。(6).洗脱：150μL甲醇洗脱肽段，重复2次，共3次，得到450μL洗脱液，真空挥干。15.LC-MS/MS高分辨质谱检测。
15.高pH液相分离(1)样品：所有酶解后的样本取等量肽段混合，使用Agilent1100HPLC系统，在pH＝10的流动相中进行组分分离。(2)分离条件色谱柱：Agilent ZorbaxExtend–C18窄径柱，2.1×150mm，5μm。检测波长：紫外210nm和280nm。流动相A相：ACN-H2O(2：98，v/v)，流动相B相：ACN-H2O(90：10，v/v)(两个流动相均用氨水调节pH至10)，流速：250μL/min。梯度洗脱条件：0-10min,2％ B；10-10.01min,2-5％ B；10.01-37min,5-20％B；37-48min,20-40％ B；48-48.01min,40-90％ B；48.01-58min,90％ B；58-58.01min,90-2％ B；58.01-63min,2％ B。
16.组份收集：收集洗脱液到离心管中,按顺序循环收取馏分,共收集10个组份，真空冷冻干燥抽干，样品冷冻保存待上质谱。质谱进样前，每个样品按照体积比iRT:待测样品＝1:10的体积比混合，作为内标。
17.每个样品酶解后的肽段单独上机采集，扫描范围设置为350-1250m/z，isolation window为26m/z，将质谱输出的谱图与fasta库产生的理论谱图进行匹配，将机器信号转变为肽段和蛋白序列信息，然后结合序列信息、肽段保留时间、碎片离子信息等进行谱图库的建立，用于DIA分析。
(二)代谢组学具体实施步骤
1.抽取膝关节液，移取100μL样品，加入内标(L-2-氯苯丙氨酸，0.3mg/mL；LysoPC17:0，0.01mg/mL，均为甲醇配置)各10μL，涡旋震荡10s；
2.加入300μL的蛋白沉淀剂甲醇-乙腈(V:V＝2:1)，涡旋震荡1min；
3.冰水浴中超声提取10min；
4.-20℃下静置30min；
5.离心10min(13000rpm，4℃)，取300μL上清液挥干，然后用200μL甲醇-水(V:V＝1:4)复溶，涡旋30s，超声2min；
6.离心10min(13000rpm，4℃)，用注射器吸取150μL的上清液，使用0.22μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移到LC进样小瓶，-80℃下保存，直到进行LC-MS分析。
7.质控样本(QC)由所有样本的提取液等体积混合制备而成，每个QC体积与样本相同。
8.使用ACQUITY UPLC超高效液相串联AB Triple TOF 5600高分辨质谱仪组成的液质联用系统进行组学分析。
(三)数据分析
多元统计分析将先采用无监督的主成分分析(PCA)来观察各样本之间的总体分布和整个分析过程的稳定性，然后用有监督的偏最小二乘法分析(PLS-DA)及正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)来区分各组间代谢轮廓的总体差异，找到组间的差异代谢物。
二、临床资料
*p值表示student t检验比较的组间差异。
**p值表示威尔科克森符号秩检验比较的组间差异。
***p值表示组间差异，采用卡方检验进行比较。
三、实验结果
蛋白组学：DIA原始数据的处理使用Spectronaut Pulsar软件完成。利用蛋白的表达量进行主成分分析(PCA分析)，从不同维度展现样本间的关系。每个点代表一个分组实验中的一次重复，不同颜色区分不同分组。PCA从不同维度展现样品间关系，同组的样品在空间分布较集中(图2A)。差异蛋白表达水平聚类分析聚类热图可以用来进行标准化后的实验数据的质量控制和差异数据富集后的定制化数据展示。可以对数据和样品进行聚类，观测样品质量，也可以根据表达谱对共表达数据进行分组。基于R语言进行非监督层次聚类,可以看到痛风组和正常组蛋白表达有明显的差异(图2B)。发现的差异蛋白一共有183种，其中表达上调蛋白98种，表达下调蛋白85种。通过对差异蛋白分析发现，组织蛋白酶D，组织蛋白酶B，组织蛋白酶G，组织蛋白酶S，溶酶体α-甘露糖苷酶表达量关节液丰度的显著改变(表1)，可能参与机关节腔内多种免疫反应和代谢物相关，并可作为痛风性关节炎鉴别诊断的生物标识，以及为后续的疾病治疗提供新的靶点。
表1各组织蛋白关节液丰度的变化
蛋白质 痛风性关节炎/正常人对照 P-value FC
组织蛋白酶G 升高 0.02 149.26
溶酶体α-甘露糖苷酶 升高 0.00 111.30
组织蛋白酶S 升高 0.00 2.319
组织蛋白酶B 升高 0.02 1.73
组织蛋白酶D 升高 0.00 1.52
代谢组学：进行QC样本主成分分析，对系统稳定性进行评价，经7-fold cross-validation(7次循环交叉验证)得到的PCA模型图(图3A)，QC样本紧密聚集在一起，表明此实验稳定性和重复性较好。偏最小二乘-判别分析PLS-DA是一种有监督的判别统计方法，该方法运用偏最小二乘回归建立代谢物表达量与样本分组之间的关系模型，解释率R2Y(cum)和预测率Q2(cum)，两者接近1，说明PLS-DA模型能更好地解释和预测两组样本之间的差异(图3B)，代表模型预测能力好。正交偏最小二乘方-判别分析(OPLS-DA)是有监督的判别分析统计方法,两组样本在OPLS-DA得分图上具有显著的差异(图3C)。然后根据VIP值大于一认定为是差异代谢物，P＜0.05具有显著性，一共有106种差异代谢物。显著差异代谢物表达量进行层次聚类，根据VIP值对top50差异代谢物表达量进行可视化分析(图3D)，直观展示痛风组和正常组之间的关系及代谢物在不同样本之间的表达差异。在差异代谢物中发现脂质和脂质样分子具有显著差异如。通过对差异代谢物分析发现，N-油酰基组氨酸(N-oleoylhistidine)，硬脂酰肉碱(Stearoylcarnitine),十四烷酰肉碱(Tetradecanoylcarnitine),和硬脂酸(Stearidonic Acid)，棕榈酰肉碱(Palmitoylcarnitine)等的膝关节液丰度的显著改变(表2)，可能参与机体多种免疫细胞的功能和代谢反应相关，并可作为痛风性关节炎诊断的生物标识，以及为后续的疾病治疗提供新的靶点。
表2各代谢物关节液丰度的变化
代谢物 痛风性关节炎/正常人对照 VIP P-value FC
N-油酰基组氨酸 升高 3.63 0 2.39
硬脂酸肉碱 升高 2.38 0.03 1.94
十四酰基肉碱 升高 1.71 0.03 1.92
硬脂酸 升高 1.86 0 1.85
棕榈酰肉碱 升高 2.94 0.05 1.66
通过本实施例的实验结果可知，差异蛋白：组织蛋白酶D、组织蛋白酶B、组织蛋白酶G、组织蛋白酶S和溶酶体α-甘露糖苷酶；以及差异代谢物：N-油酰基组氨酸(N-oleoylhistidine)、硬脂酰肉碱(Stearoylcarnitine)、十四烷酰肉碱(Tetradecanoylcarnitine)、硬脂酸(Stearidonic Acid)和棕榈酰肉碱(Palmitoylcarnitine)是具有较高通用性、可靠性，易于推广普及的可用于痛风性关节炎风险筛查的生物标志物。
实施例2痛风性关节炎筛查试剂盒
本实施例的试剂盒组成包括两部分，用于代谢物检测的部分和用于组织蛋白检测的部分。
所述代谢物包括如下五种化合物中的至少一种：N-油酰基组氨酸、硬脂酰肉碱、十四烷酰肉碱或硬脂酸；
所述组织蛋白包括如下五种蛋白中的至少一种：蛋白酶D、组织蛋白酶B、组织蛋白酶G、组织蛋白酶S或溶酶体α-甘露糖苷酶。
试剂盒组成及其使用方法具体如下：
一、用于组织蛋白检测的部分
(一)试剂盒组成(50人份)
(二)检测方法
1.抽取关节液，每个样本取40μL关节液，加入400μL结合缓冲液(5mM Tris-HCl(pH＝6.8)1.25mL，甘油2mL，10％SDS 4mL，DTT1g，0.1％溴酚蓝500μL，加无离子水定容至20mL)进行稀释。
2.除去柱子上的盖子，倒出贮存的缓冲液(137mM NaCl 8g，2.7mM KCl 0.2g，10mMNa2HPO41.42g，2mM KH2PO40.27g，无离子水定容到1升终PH＝7.4)，以纸吸去管口残留液。
3.除去柱底部的尖咀，下方放置大小适合的收集管。
4.加入850μL结合缓冲液(5mM Tris-HCl(pH＝6.8)1.25mL，甘油2mL，10％SDS4mL，DTT1g，0.1％溴酚蓝500μL，加无离子水定容至20mL)，让其靠重力流过柱体，进行活化。
5.将柱子放入一个新的大小适合的收集管中。
6.加入稀释后的样本，让其靠重力流过柱体。
7.以600μL结合缓冲液(5mM Tris-HCl(pH＝6.8)1.25mL，甘油2mL，10％SDS 4mL，DTT1g，0.1％溴酚蓝500μL，加无离子水定容至20mL)清洗柱体。
8.再次以600μL结合缓冲液(5mM Tris-HCl(pH＝6.8)1.25mL，甘油2mL，10％SDS4mL，DTT1g，0.1％溴酚蓝500μL，加无离子水定容至20mL)清洗柱体收集上三步的洗脱组份，即为去除白蛋白/IgG后的样本真空冷冻干燥后备用。
9.将冻干的样品加入150μL SDS裂解液(50mM Tris(pH8.1)，1％ SDS及其他蛋白抑制剂+无离子水)进行复溶。
10.将溶液在室温下12000×g离心10min,取上清，并再次离心取上清。
11.上清即样品的总蛋白溶液，进行蛋白浓度测定并分装后储存于-80℃备用。
12.蛋白浓度测定，使用BCA蛋白浓度测定方法根据标准蛋白溶液的已知浓度和吸光度值计算标准曲线，算得蛋白浓度值。
13.胰蛋白酶酶解，根据测定的蛋白浓度，每个样品取50μg的蛋白，并用裂解液将不同组样品稀释调整到相同的浓度和体积。在以上蛋白溶液中加入DTT(巯基还原剂)，使得DTT的终浓度为4.5mM，混匀，在55℃孵育30min。在冰上进行冷却直到达到室温。加入相应体积的碘乙酰胺，使得终浓度为9mM，充分混匀，室温避光放置15min。在以上溶液中加入6倍体积的丙酮沉淀蛋白，-20℃放置四小时以上或者过夜。4℃,8000×g离心10分钟收集沉淀，挥发丙酮2-3min。加入100μL TEAB2(50mM)(四乙基溴化铵缓冲水溶液tetraethylammoniumbromide)复溶沉淀，加入1/50样品质量的1mg/ml胰酶Trypsin-TPCK，并于37℃消化过夜。加磷酸调pH值为3左右终止酶解反应。
14.酶解后的肽段采用SOLATMSPE 96孔板脱盐。(1).活化：200μL甲醇活化柱子，再重复2次。(2).平衡：200μL纯水活化柱子，再重复2次。(3).Load样品：体积50-500μL样品，调节真空，液滴速度保持在1mL/min(约1滴/秒)(4).重复load一次。(5).Wash：200μL 5％甲醇清洗，再重复2次。(6).洗脱：150μL甲醇洗脱肽段，重复2次，共3次，得到450μL洗脱液，真空挥干。LC-MS/MS高分辨质谱检测。
15.高pH液相分离(1)样品：所有酶解后的样本取等量肽段混合，使用Agilent1100HPLC系统，在pH＝10的流动相中进行组分分离。(2)分离条件色谱柱：Agilent ZorbaxExtend–C18窄径柱，2.1×150mm，5μm。检测波长：紫外210nm和280nm。流动相A相：ACN-H2O(2：98，v/v)，流动相B相：ACN-H2O(90：10，v/v)(两个流动相均用氨水调节pH至10)，流速：250μL/min。梯度洗脱条件：0-10min,2％ B；10-10.01min,2-5％ B；10.01-37min,5-20％B；37-48min,20-40％ B；48-48.01min,40-90％ B；48.01-58min,90％ B；58-58.01min,90-2％ B；58.01-63min,2％ B。
16.组份收集：收集洗脱液到离心管中,按顺序循环收取馏分,共收集10个组份，真空冷冻干燥抽干，样品冷冻保存待上质谱。质谱进样前，每个样品按照体积比iRT:待测样品＝1:10的体积比混合，作为内标。
17.每个样品酶解后的肽段单独上机采集，扫描范围设置为350-1250m/z，isolation window为26m/z，将质谱输出的谱图与fasta库产生的理论谱图进行匹配，将机器信号转变为肽段和蛋白序列信息，然后结合序列信息、肽段保留时间、碎片离子信息等进行上述五种组织蛋白的定量分析。
二、用于代谢物检测的部分
(一)试剂盒组成(50人份)
L-2-氯苯丙氨酸 0.15mg
Lyso PC17:0 0.05mg
甲醇 15mL
乙腈 5mL
(二)检测方法
1.抽取膝关节液，移取100μL样品，加入内标(L-2-氯苯丙氨酸，0.3mg/mL；LysoPC17:0，0.01mg/mL，均为甲醇配置)各10μL，涡旋震荡10s；
2.加入300μL的蛋白沉淀剂甲醇-乙腈(V:V＝2:1)，涡旋震荡1min；
3.冰水浴中超声提取10min；
4.-20℃下静置30min；
5.离心10min(13000rpm，4℃)，取300μL上清液挥干，然后用200μL甲醇-水(V:V＝1:4)复溶，涡旋30s，超声2min；
6.离心10min(13000rpm，4℃)，用注射器吸取150μL的上清液，使用0.22μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移到LC进样小瓶，-80℃下保存，直到进行LC-MS分析。
7.质控样本(QC)由所有样本的提取液等体积混合制备而成，每个QC体积与样本相同。
8.使用ACQUITY UPLC超高效液相串联AB Triple TOF 5600高分辨质谱仪组成的液质联用系统进行上述五种代谢物的定量检测。
实施例3利用蛋白印迹法和靶向脂质代谢组学检测通风关节炎
本实施例在实施例1的基础上进一步验证差异蛋白和差异代谢物对通风关节炎的诊断性能。
所述代谢物包括如下五种化合物中的至少一种：N-油酰基组氨酸、硬脂酰肉碱、十四烷酰肉碱或硬脂酸；
所述组织蛋白包括如下五种蛋白中的至少一种：蛋白酶D、组织蛋白酶B、组织蛋白酶G、组织蛋白酶S或溶酶体α-甘露糖苷酶。
一、实验方法
(一)蛋白印迹法(western blot法)
在冰上使用含PMSF缓冲液的RIPA裂解适量的关节滑液蛋白30分钟，以获得蛋白质。通过以12000rpm(25分钟，4℃)离心除去碎片，并将上清液立即储存在-80℃。然后，用BCA试剂盒定量从滑液中获得的蛋白质，并在8％-15％SDS-PAGE凝胶上分离等量的蛋白质(40μg)，转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，并与适当的一抗孵育过夜。PVDF膜用TBST洗涤，并与二抗(1：10，000；ABclonal，中国)在室温下90分钟。最后，BeyoECL Plus检测这些频段，并通过ImageJ 1.39V软件量化带材强度。一抗如下：Anti-CTSD(1:1000；ABclonal,A13292)；
Anti-CTSS,(1:1000；ABclonal,A1874)；Anti-CTSB,(1:1000；ABclonal,A0967)；Anti CTSG(1:1000；ABclonal,A5636)；Anti-MAN2B1(1:500；Abcam,ab104521)。
(二)靶向脂质代谢组学
1、样本于-80℃冰箱取出,在4℃冰箱解冻(或8℃水浴解冻)，涡旋混匀3min；
2、每个样本取20-30μL,混匀,用于QC样本；
3、分别取25μL正式样本和QC样本至Eppendorf管(自始至终于冰上操作)；
4、加228μL加标甲醇，4℃，1500rpm，涡旋1min；
5、加750μL MTBE(甲基叔丁基醚)，4℃，1500rpm，涡旋1min,室温避光静置30min；
6、加188μL质谱级水，涡旋1min，室温避光静置10min,观察分层；
7、4℃，13300rpm，离心10min，取上清700μL至新EP管(样本分三层，上至下分别为脂质、水相、蛋白沉淀)；30℃真空浓缩(约2h),干燥后存于-80℃冰箱。
8、样本置冰上复溶,加入200μL DCM：MeOH＝1:1(10mM乙酸铵),4℃涡旋30s；
9、4℃，13300rpm离心10min；
10、对于正式样本,分别取80μL上清于2个进样小瓶,用于LC-MS/MS分析；
11、对于QC样本,每个样本取180μL上清混匀,分装80μL于进样小瓶,用于LC-MS/MS分析。
LC-MS/MS分析的条件为：
(1)仪器
(2)流动相
1)流动相A：水：甲醇：乙腈＝1：1：1(7mM NH4AC)；
2)流动相B：IPA(7mM NH4AC)；
3)洗针液：IPA。
(3)色谱条件
Method:C18_Schedule_20201111
色谱柱Phenomenex Kinetex C18 2.6μm 2.1x100mm
柱温45℃
进样温度8℃
进样量2μL
梯度洗脱程序：
(4)质谱条件
(5)数据处理
使用MultiQuant 3.0.2处理。
由ShapiroeWilk检验证明数据是否属于正态分布，不符合正态分布的则用非参数检验中的(W-H)秩和检验。而对于符合正态分布的数据，Leven检验用于评估方差的同质性。使用90％的置信区间(CIs)用于描述数据的百分界限。使用one-way ANOVA进行组间比较分析。P值<0.05被认为是具有统计学意义。所有分析均采用美国IBM公司的SPSS 22.0统计软件。
二、临床资料
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*p值表示student t检验比较的组间差异。
**p值表示威尔科克森符号秩检验比较的组间差异。
***p值表示组间差异，采用卡方检验进行比较。
三、实验结果
差异蛋白和差异代谢物的验证结果如图4所示，可以看到，五种组织蛋白和五种代谢物的表达在关节炎患者和健康人群之间具有显著的差异。这表明检测这五种组织蛋白和五种代谢物能够对关节炎患者进行筛查。
实施例4痛风性关节炎筛查试剂盒
本实施例的试剂盒用于检测关节液样本，组成包括两部分，用于代谢物检测的部分和用于组织蛋白检测的部分。
所述代谢物包括如下五种化合物中的至少一种：N-油酰基组氨酸、硬脂酰肉碱、十四烷酰肉碱或硬脂酸；
所述组织蛋白包括如下五种蛋白中的至少一种：蛋白酶D、组织蛋白酶B、组织蛋白酶G、组织蛋白酶S或溶酶体α-甘露糖苷酶。
试剂盒组成及其使用方法具体如下：
一、用于组织蛋白检测的部分
(一)试剂盒组成(50人份)
(二)检测方法
与实施例3中实验方法的蛋白印迹法部分相同。
二、用于代谢物检测的部分
(一)试剂盒组成(50人份)
甲醇 100ml
甲基叔丁基醚 40ml
DCM 10ml
乙酸铵 50ml
乙腈 100ml
异丙醇 100ml
(二)检测方法
与实施例3中实验方法的靶向脂质代谢组学部分相同。
通过上述实施例可以看到，本发明提供了一系列新的痛风性关节炎筛查标记物，能够实现痛风性关节炎的有效筛查。由于只需要以关节液作为检测样本，本发明具有无创、检测简单等有点，更易于在临床性或基层医院推广应用。

Claims (9)

1.检测代谢物和/或组织蛋白的试剂在制备痛风性关节炎筛查试剂盒中的用途，其特征在于：
所述代谢物包括如下四种化合物中的至少一种：N-油酰基组氨酸、硬脂酰肉碱、棕榈酰肉碱或十四烷酰肉碱；
所述组织蛋白包括如下三种蛋白中的至少一种：组织蛋白酶D、组织蛋白酶G或溶酶体α-甘露糖苷酶；
所述检测代谢物和/或组织蛋白的试剂是用于检测关节液中所述代谢物和/或所述组织蛋白的试剂。
2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于：所述试剂包括检测代谢物和组织蛋白的试剂；
所述代谢物由N-油酰基组氨酸、硬脂酰肉碱、棕榈酰肉碱、十四烷酰肉碱和硬脂酸组成；
所述组织蛋白由组织蛋白酶D、组织蛋白酶B、组织蛋白酶G、组织蛋白酶S和溶酶体α-甘露糖苷酶组成。
3.按照权利要求1所述的用途，其特征在于：所述组织蛋白酶D的Uniprot数据库编号为P07339，
和/或，所述组织蛋白酶G的Uniprot数据库编号为P08311，
和/或，所述溶酶体α-甘露糖苷酶的Uniprot数据库编号为O00754。
4.按照权利要求1所述的用途，其特征在于：检测组织蛋白的试剂为酶联免疫分析试剂、western blot试剂或蛋白芯片检测方法用试剂。
5.按照权利要求1所述的用途，其特征在于：检测组织蛋白的试剂包括将所述组织蛋白裂解为多肽的试剂和利用LC-MS法检测所述多肽用试剂。
6.按照权利要求1所述的用途，其特征在于：检测代谢物的试剂为LC-MS法检测用试剂。
7.一种痛风性关节炎筛查试剂盒，其特征在于：它包括用于检测代谢物和组织蛋白的试剂，
所述代谢物由N-油酰基组氨酸、硬脂酰肉碱、棕榈酰肉碱、十四烷酰肉碱和硬脂酸组成；
所述组织蛋白由组织蛋白酶D、组织蛋白酶B、组织蛋白酶G、组织蛋白酶S和溶酶体α-甘露糖苷酶组成；
所述检测代谢物和组织蛋白的试剂是用于检测关节液中所述代谢物和所述组织蛋白的试剂。
8.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：检测组织蛋白的试剂为酶联免疫分析试剂、western blot试剂或蛋白芯片检测方法用试剂；
或，检测组织蛋白的试剂包括将所述组织蛋白裂解为多肽的试剂和利用LC-MS法检测所述多肽用试剂。
9.按照权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：检测代谢物的试剂为LC-MS法检测用试剂。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116930511A (zh) * 2023-09-18 2023-10-24 四川大学华西医院 一种检测组织蛋白试剂在试剂盒中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011097276A1 (en) * 2010-02-02 2011-08-11 Martek Biosciences Corporation Methods and compositions for treating arthritis with docosahexaenoic acid
CN102864123A (zh) * 2011-07-06 2013-01-09 北京大学第三医院 一种外周血间充质干细胞的获得方法及其应用
WO2018195111A1 (en) * 2017-04-17 2018-10-25 Ampersand Biopharmaceuticals, Llc Parenteral non-systemic administration of buffering agents for inhibiting metastasis of solid tumors, hyperpigmentation and gout
CN109001443A (zh) * 2018-06-19 2018-12-14 上海市第十人民医院 一种用于检测急性痛风发作的早期标志物
CN109613127A (zh) * 2018-11-01 2019-04-12 青岛大学附属医院 一种鉴定痛风性关节炎生物标记物的方法及检测试剂盒
WO2022129702A1 (en) * 2020-12-18 2022-06-23 Nightingale Oyj Method for determining whether a subject is at risk of developing a musculoskeletal and/or connective tissue disease

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050202421A1 (en) * 2001-10-31 2005-09-15 Raphael Hirsch Method for diagnosis and treatment of rheumatoid arthritis
SI2124997T1 (sl) * 2006-10-20 2012-11-30 Regeneron Pharma Uporaba IL antagonista za zdravljenje putike inpsevdo putike
DK2103942T5 (da) * 2008-03-20 2012-10-22 Universitaetsklinikum Freiburg Fremgangsmåde til bestemmelse af typen af en inflammatorisk-rheumatisk sygdom i synovialvæske
EP2192196A1 (en) * 2008-11-27 2010-06-02 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Prediction of lipid-metabotype-related physiological susceptibilities
AU2016301231A1 (en) * 2015-08-04 2018-02-22 Cd Diagnostics, Inc. Methods for detecting adverse local tissue reaction (ALTR) necrosis

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011097276A1 (en) * 2010-02-02 2011-08-11 Martek Biosciences Corporation Methods and compositions for treating arthritis with docosahexaenoic acid
CN102864123A (zh) * 2011-07-06 2013-01-09 北京大学第三医院 一种外周血间充质干细胞的获得方法及其应用
WO2018195111A1 (en) * 2017-04-17 2018-10-25 Ampersand Biopharmaceuticals, Llc Parenteral non-systemic administration of buffering agents for inhibiting metastasis of solid tumors, hyperpigmentation and gout
CN111093774A (zh) * 2017-04-17 2020-05-01 安珀桑德生物制药有限责任公司 用于抑制实体瘤的转移、色素沉着过度和痛风的缓冲剂的肠胃外非全身性施用
CN109001443A (zh) * 2018-06-19 2018-12-14 上海市第十人民医院 一种用于检测急性痛风发作的早期标志物
CN109613127A (zh) * 2018-11-01 2019-04-12 青岛大学附属医院 一种鉴定痛风性关节炎生物标记物的方法及检测试剂盒
WO2022129702A1 (en) * 2020-12-18 2022-06-23 Nightingale Oyj Method for determining whether a subject is at risk of developing a musculoskeletal and/or connective tissue disease

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cathepsin B and cystatin C play an inflammatory role in gouty arthritis of the knee;Shu-Chen Chu等;Clinica Chimica Acta;第411卷;第1788-1792页 *
Phospholipase A2 regulates autophagy in gouty arthritis: proteomic and metabolomic studies;Weili Fu等;Journal of Translational Medicine;第21卷(第1期);第1-20页 *
Serum metabolomic profiling of prostate cancer risk in the prostate, lung, colorectal, and ovarian cancer screening trial;Jiaqi Huang等;British Journal of Cancer;第115卷(第9期);第1087–1095页 *
基于非靶向和靶向代谢组学的高尿酸血症生物标志物研究;秦楠坤;全国优秀硕士学位论文全文数据库(第03期);第9-85页 *
急性痛风性膝关节炎治疗方法及效果比较;罗大辉等;华西医学;第24卷(第04期);第937-939页 *
硬脂酸激活NLRP3炎性体参与痛风炎症反应的机制研究;童晓霞;全国优秀硕士学位论文全文数据库(第01期);第1-51页 *
组织蛋白酶S在类风湿关节炎中的作用;赵进军;全国优秀博士学位论文全文数据库(第01期);第1-80页 *

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