CN109613131B - 基于尿液磷脂组学的肾损伤早期诊断标志物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供基于尿液磷脂组学的肾损伤早期诊断标志物及应用，本发明从临床患者、大鼠、细胞的生物样品三个方面同时验证尿液磷脂在不同程度肾脏损伤过程中的含量变化趋势及定量，根据统计学方法遴选出了与肾脏损伤程度密切相关的有标志性作用的尿液磷脂化合物。这些化合物的含量变化在临床鉴别不同程度肾脏损伤方便发挥巨大作用，初步成为更加敏感、特异且能准确反映药源性肾脏损伤程度的磷脂标志物，实现临床疾病的无创筛查，有助于早期进行临床干预和动态治疗监测，阻止疾病进一步恶化，具有重要的临床意义和科研价值。

Description

基于尿液磷脂组学的肾损伤早期诊断标志物及应用
技术领域
本发明属于临床检验诊断领域，具体地说，涉及一种基于尿液磷脂组学的肾损伤早期诊断标志物及应用。
背景技术
急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)是导致发病率和死亡率升高的重要因素，肾毒性药物是造成急性肾损伤的常见原因。2016 年日本药物相关性肾损伤临床实践指南中明确了药源性肾损伤的定义：由于给药导致新出现的肾脏损伤或现有肾脏损伤恶化。庆大霉素（Gentamicin，GM）作为最有效、最广泛使用的抗革兰氏阴性菌的抗菌药物之一，具有诱发肾近端小管上皮细胞损伤和坏死的风险，甚至可能造成急性肾衰竭。
目前，肾活检是判断肾损伤的直接方法，但是形态学改变并不一定与功能变化相平行；而且作为有创检查，肾活检无法作为一种常规、动态的检测手段应用于临床。血肌酐（Serum Creatinine，SCr）和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)作为目前临床诊断肾损伤的主要指标，反映早期肾功能减退很不敏感，缺乏特异性，同时易受到年龄、性别、肌肉代谢、药物、容量状态等多种因素的影响。近些年研究较多的肾脏损伤标志物多为蛋白类物质，主要包括：b2微球蛋白和胱抑素C（Cystatin C）、肾损伤分子-1（KIM-1）、中性粒细胞明胶酶相关性脂质运载蛋白（NGAL）、丛生蛋白（Clusterin）、白介素-18（IL-18）、NAG酶。但受敏感性、特异性、检测方法及无法表明肾损伤程度等方面的限制这些标志物仍未在临床中广泛应用和推广。例如，尿NAG酶的升高与肾小管间质的形态学改变不完全平行，并“迟滞于”形态学改变；KIM-1 虽然对肾小管上皮细胞表现出高度特异性，但它升高较慢，有一定的滞后性，且只能说明肾小管损伤但无法通过其水平来区分肾小管损伤的程度，病因诊断仍需除外慢性小管-间质性疾病；NGAL是急性肾损伤众多标志物中最有效的预测指标，但由于其研究多为儿童患者和单一中心研究，尚需更多大规模随机化的多中心研究以确定NGAL的预测作用。由于药源性肾损伤的临床表现无特异性，大多数药物肾损害又缺乏特异、敏感的检测手段，临床上极易造成误诊或漏诊。而研究表明如能对药源性肾损伤及时确诊并早期治疗，多数患者的肾功能可完全恢复。因此，发现和发展新的肾损伤早期诊断的生物标志物十分必要。
代谢组学是组学研究中的一个重要分支，系统性地研究生物样本中的代谢物及其由于生理刺激和/或基因修饰的改变，有助于发现更可靠的潜在诊断和治疗生物标志物集。在大量的代谢物中，磷脂(phospholipids，PLs)作为生物膜的基本骨架成分，也是重要生物分子的前体，例如白三烯、前列腺素、内源性大麻素、血小板活化因子，其在生物信号传导方面也发挥着重要的作用，广泛参与调节多种生命活动过程，包括能量转换、物质运输、信息识别与传递、细胞发育和分化，以及细胞凋亡等。研究表明磷脂在肾脏疾病及其他疾病中可以作为有前景的生物标志物，如老年痴呆症、肥胖、妊娠糖尿和癌症。
目前肾脏损伤的诊断方法较少，肾活检是判断肾损伤的直接方法，但是形态学改变并不一定与功能变化相平行；而且作为有创检查，肾活检无法作为一种常规、动态的检测手段应用于临床。血肌酐（Serum Creatinine，SCr）和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)作为目前临床诊断肾损伤的主要指标，反映早期肾功能减退很不敏感，缺乏特异性，同时易受到年龄、性别、肌肉代谢、药物、容量状态等多种因素的影响。由于药源性肾损伤的临床表现无特异性，大多数药物肾损害又缺乏特异、敏感的检测手段，临床上极易造成误诊或漏诊。
脂质组学于2003年被正式提出用于检测存在于生物基质中的全部脂质，以及各种刺激或干预对于脂质的影响，该方法目前已在疾病诊断和疾病生物标志物的发现及医药研发等多方面取得了较大进展。迄今已报道的生物标志(还包括一些脂质分析物)未能产生具有临床价值的新颖的脂质生物标志结果。目前，针对肾脏损伤研究所采集的生物样本主要为血液，尚未见关于辅助诊断肾脏损伤的无创的尿液磷脂筛查方法的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于尿液磷脂组学的肾损伤（特别是药源性肾损伤）早期诊断标志物及应用。
本发明构思如下：本发明涉及围绕磷脂水平来诊断、预测、预防肾脏损伤的方法和应用。这些方法包括分析不同生物种类的尿液或细胞培养液中的磷脂水平并将其与对照组进行比较。共涉及3类生物物种的磷脂浓度的验证，所述对照组为对应生物物种的健康个体的样品或者不同肾脏损伤程度的个体。3类生物物种分别为人（临床患者）、动物（Wistar大鼠）、细胞（HK-2细胞），对应采集的生物样品为尿液、尿液、细胞培养液。分析方法至少包括以下步骤：a）提供来自肾脏损伤的受试对象的生物样品；b）确定所述样品的磷脂浓度；c）使用组学统计分析方法将所确定的样品磷脂浓度与对照组中的对应磷脂浓度进行比较，初步筛选出潜在的磷脂标志物。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供基于尿液磷脂组学的肾损伤（特别是药源性肾损伤）早期诊断标志物，当受试对象为人时，所述标志物选自PC(16:0-22:4)、LPC(20:4)、PC(16:0-20:4)、PC(22:4-18:2)、PC(18:0-20:4)、PC(16:0-20:2)、PC(16:0-18:2)、PC(20:4-18:2)、PC(18:0-18:2)、SM(36:3)、LPC(18:0)、PS(18:1-20:0)、PC(18:0-20:3)、LPC(18:1)等中的至少一种。
当受试对象为鼠时，所述标志物选自SM(38:1)、SM(40:3)、PC(30:1) FA 16:1、PE(36:1) FA 16:1、PG(34:1) FA 16:1、PC(28:0) FA 14:0、PC(40:2) FA 18:0、PC(38:6) FA22:6、PC(38:6) FA 18:2、PC(38:6) FA 16:0等中的至少一种。
进一步地，本发明提供用于预测或早期诊断IgA肾病的生物标志物，所述标志物选自PC(16:0-22:4)、LPC(20:4)、PC(16:0-20:4)、PC(22:4-18:2)、PC(18:0-20:4)、PC(16:0-20:2)、PC(16:0-18:2)、PC(20:4-18:2)、PC(18:0-18:2)、SM(36:3)、LPC(18:0)、PS(18:1-20:0)等中的至少一种。
本发明还提供用于预测或早期诊断膜性肾病的生物标志物，所述标志物选自PC(16:0-22:4)、PC(16:0-20:4)、LPC(20:4)、LPC(18:0)、PC(20:4-18:2)、SM(36:3)、PC(18:0-20:3)、LPC(18:1)、PS(18:1-20:0)等中的至少一种。
当受试对象为HK-2细胞时，所述标志物选自PC(16:0-22:2)、PC(16:0-18:2)、PC(16:0-22:5)、PC(18:0-20:5)、PC(18:1-20:5)、PC(18:2/18:2)、PC(18:2-20:1)、PE(16:0-22:3)、PS(20:3-20:3)、PS(18:0-22:4)、PG(18:0-20:4)、PC(16:0-16:1)、PC(16:0-18:1)、SM(42:2)、SM(40:4)等中的至少一种。
本发明所述的受试对象包括：
①所有哺乳动物，包括但不限于人，以及非人灵长类动物、犬、猫、马、羊、牛、兔、猪和啮齿类动物等；以及
②细胞，如HK-2细胞。
当受试对象为①时，所述标志物为尿液标志物。
第二方面，本发明提供所述标志物的以下任一应用：
1）作为肾损伤（特别是药源性肾损伤）预测或早期诊断标志物及治疗靶点的应用；
2）制备或筛选肾损伤（特别是药源性肾损伤）药物或组合物方面的应用，其中所述药物或组合物靶向所述标志物。
第三方面，本发明提供检测所述标志物的试剂在制备肾损伤（特别是药源性肾损伤）预测或早期诊断的检测试剂或试剂盒中的应用。
第四方面，本发明提供所述检测试剂或试剂盒的以下任一用途：
（a）确定所述群体发展药源性或其他肾脏损伤的风险；
（b）确定所述群体的肾脏损伤的早期示警征兆；
（c）确定或预测所述群体的肾脏损伤的发生；
（d）确定或预测所述群体的肾脏损伤的严重程度。
本发明提供的肾脏损伤疾病的尿液磷脂组学生物标志物，是指针对药源性和其他肾损伤疾病的尿液磷脂组学生物标志物。
本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。
本发明提供用于预测肾脏损伤发展的新的磷脂组学标志物。具体而言，本发明提供的磷脂分子含量变化在当来自肾脏损伤患者/大鼠/细胞的样品中显示出升高的或者降低的水平（视具体情况而定）时是本发明的方法和应用中的有用的磷脂组学标志物。与目前预测肾脏损伤的临床用标志方法相比，这些灵敏的特异性的标志物经特定测试显示出优越的诊断价值和预后价值，并且生物样品是尿液，实现无创诊断，为临床带来极大便利。因此，相比于目前用于诊断和或预测肾脏损伤的其他标志物（血肌酐、尿素氮、肾脏病理切片），本发明具有显著优势。因此，本发明提供的磷脂组学标志物使得可以对发展肾脏损伤的风险进行更好的诊断和评估。
本发明特别公开了用于确定发展肾脏损伤风险的早期示警征兆和或预测和或诊断肾脏损伤的临床患者、大鼠、细胞三个方面研究的具体方法。
本发明的方法包括以下步骤：a）提供来自肾脏损伤的受试对象的生物样品；b）确定所述样品的磷脂浓度；c）使用组学统计分析方法将所确定的样品磷脂浓度与对照组中的对应磷脂浓度进行比较。
本发明共涉及3类生物物种的磷脂浓度的验证，所述对照组为对应生物物种的健康个体的样品或者不同肾脏损伤程度的个体。3类生物物种分别为人（临床患者）、动物（Wistar大鼠）、细胞（HK-2细胞），对应采集的生物样品为尿液、尿液、细胞培养液。
本发明提供（a）确定来自所述受试对象的样品中的一种或多种磷脂的浓度/含量的试剂；（b）确定来自所述受试对象的样品中的一种或多种磷脂的试剂在制备用于确定受试对象是否患有或有风险发展肾脏损伤的试剂盒中的应用，所述样品选自尿液和细胞培养液。
本发明提供确定来自所述受试对象的样品中的一种或多种磷脂的浓度/含量的试剂，其中，所述样品中与对照组相比时升高的含量表明所述受试对象患有或者有增大的风险发展肾脏损伤，受试对象为人的组：
其中，与所述对照组相比含量升高的所述一种或多种磷脂选自：PC(16:0-22:4)、LPC(20:4)、PC(16:0-20:4)、PC(22:4-18:2)、PC(18:0-20:4)、PC(16:0-20:2)、PC(16:0-18:2)、PC(20:4-18:2)、PC(18:0-18:2)、SM(36:3)、LPC(18:0)、PS(18:1-20:0)、PC(18:0-20:3)、LPC(18:1)。
本发明提供确定来自所述受试对象的样品中的一种或多种磷脂的浓度/含量的试剂，其中，所述样品中与对照组相比时升高的含量表明所述受试对象患有或者有增大的风险发展肾脏损伤，受试对象为大鼠的组：
其中，与所述对照组相比含量升高的所述一种或多种磷脂选自：SM(38:1)、SM(40:3)、PC(30:1) FA 16:1、PE(36:1) FA 16:1、PG(34:1) FA 16:1、PC(28:0) FA 14:0；或者
与所述对照组相比含量降低的所述一种或多种磷脂选自：PC(40:2) FA 18:0、PC(38:6) FA 22:6、PC(38:6) FA 18:2、PC(38:6) FA 16:0。
本发明提供确定来自所述受试对象的样品中的一种或多种磷脂的浓度/含量的试剂，其中，所述样品中与对照组相比时升高的含量表明所述受试对象患有或者有增大的风险发展肾脏损伤，受试对象为细胞的组，采集样品为细胞培养液的组：
其中，与所述对照组相比含量升高的所述一种或多种磷脂选自：PC(16:0-22:2)、PC(16:0-18:2)、PC(16:0-22:5)、PC(18:0-20:5)、PC(18:1-20:5)、PC(18:2/18:2)、PC(18:2-20:1)、PE(16:0-22:3)、PS(20:3-20:3)；或者
与所述对照组相比含量降低的所述一种或多种磷脂选自：PS(18:0-22:4)、PG(18:0-20:4)、PC(16:0-16:1)、PC(16:0-18:1)、SM(42:2)、SM(40:4)。
其中，所述受试对象为人的组、大鼠的组或细胞培养液的组。
所述样品为尿液的组、细胞培养液的组。
所述对象具有肾脏损伤或所述对象不具有肾脏损伤。
优选地，所述磷脂浓度/含量通过使用质谱法、高效液相色谱法来确定。
本发明中的第一类生物类群，临床患者的磷脂含量与肾损伤程度的相关性研究。该研究运用HPLC-ESI-Q Trap 5500系统和磷脂组学平台对10个健康人、10个膜性肾病、8个IgA肾病患者的尿液进行磷脂组学的分析研究，结合多元变量统计VIP值及T检验中P值的标准，初步筛选出潜在的磷脂标志物。主要结果为：IgA肾病与健康人之间的潜在的生物标志物中共筛选出12种磷脂化合物：PC(16:0-22:4)、LPC(20:4)、PC(16:0-20:4)、PC(22:4-18:2)、PC(18:0-20:4)、PC(16:0-20:2)、PC(16:0-18:2)、PC(20:4-18:2)、PC(18:0-18:2)、SM(36:3)、LPC(18:0)、PS(18:1-20:0)。膜性肾病与健康人之间的潜在的生物标志物共筛选出9种磷脂化合物：PC(16:0-22:4)、PC(16:0-20:4)、LPC(20:4)、LPC(18:0)、PC(20:4-18:2)、SM(36:3)、PC(18:0-20:3)、LPC(18:1)、PS(18:1-20:0)。根据实验的最终结果也发现以上两种肾损伤类型与健康人群的标志物有6个共同的生物标志物：PC(16:0-20:4)，PC(16:0-22:4)，PS(18:1-20:0)，LPC(18:0)，LPC(20:4)，SM(36:3)。与健康对照组相比，两组肾病组之间共同的磷脂标志物在相对含量上的变化趋势上PC，LPC，SM在肾病组中的水平显著高于健康对照组，而两组肾病组之间没有显著差异。
本发明中的第二类生物类群，Wistar大鼠的磷脂含量与肾损伤程度的相关性研究。研究通过对Wistar大鼠进行庆大霉素药物诱导，模拟在庆大霉素诱导下的急性肾小管损伤的不同阶段和程度，以进行药源性肾损伤的机制探索研究，并初步探索尿磷脂与药源性肾损伤之间的定性、定量关系，以寻找可能潜在磷脂标志物实现肾损伤的早期无创筛查。采用随机分组的方法将Wistar大鼠分为3组：模型组1（GM 80 mg/kg）、模型组2（GM 140 mg/kg）和空白对照组（等体积的0.9%氯化钠注射液），其中模型组Wistar大鼠每组 2只，空白对照2只。在大鼠的腹腔缓慢注射不同剂量的庆大霉素注射夜及氯化钠注射液，尽量保证试剂不外漏。每天给药1次，连续给药12天。硫酸庆大霉素经腹腔注射Wistar大鼠后，会对其肾小管造成不同程度的损伤。经肾脏病理切片结果显示：药物诱导后的主要病理变化为肾小管上皮细胞坏死、肾小管扩张、肾小管内有均质红染的蛋白样物质以及间质增宽炎性细胞浸润。即表明庆大霉素诱导的急性肾损伤动物模型造模成功，可进一步进行磷脂成分分析。
尿液样品初筛后，对166个目标磷脂化合物进行正式进样扫描。将正、负离子扫描模式下的21个尿液样本的相对峰面积进行加和取均值比较相对含量，发现MRM+/MRM-模式下空白组与造模组的大鼠尿液磷脂在相对含量分布上有较大差异。
空白组共含有11个样本量信息，造模组含有10个样本量信息，将这两组数据原始信息整理形成矩阵并导入SIMCA 14.1中，作log10转换，并利用Pareto缩放（scaling）对所有数据平均中心化，进行多元统计分析（PCA、OPLS-DA）以筛查潜在的生物标志物。正离子模式(MRM+)下，采用PCA考察21个尿液样本的分布情况，从得到的score plot图可以看出，大部分的空白组与造模组之间有明显的分离。利用OPLS-DA模型对预处理的数据集合进行分析可以增强空白组和造模组样本的分离效果，更好地识别两个组别中具有差异的磷脂化合物。通过OPLS-DA分析可以得到Score Scatter Plot图、S-Plot图、VIP图。从Score ScatterPlot图可以看出，空白对照组与造模组分离效果很好，两组间的确存在明显的磷脂代谢差异。OPLS-DA-Score Scatter Plot图可以很直观地看出在分类过程中贡献较大的关键化合物，这些化合物的点在图中越远离中心、靠近s曲线的两端，对分类的贡献越大。VIP图总结了化合物在分类中的贡献并以柱状图的形式表示出来。VIP值大于1.0则被认为是潜在的生物标志物。在空白组与造模组筛选时，MRM+模式下共有8种化合物的VIP>1.0，成为空白组与造模组之间差异显著的潜在的生物标志物。因磷脂矩阵中变量为磷脂化合物，数据量较大，将数据进行方差齐性检验后进行独立样本T检验，得到双侧P值，若P<0.05，则认为两组间的磷脂代谢具有显著性差异。潜在生物标志物的选择需要综合P值、VIP值2个指标，故最终筛选出潜在磷脂化合物。
从以上潜在标志物的筛选可以看出，相较于空白对照组，造模组在SM(38:1)、SM(40:3)、PC(30:1) FA 16:1、PE(36:1) FA 16:1、PG(34:1) FA 16:1、PC(28:0) FA 14:0 共6个磷脂化合物中出现了相对含量的显著上升，在PC(40:2) FA 18:0、PC(38:6) FA 22:6、PC(38:6) FA 18:2、PC(38:6) FA 16:0共4个磷脂化合物中有相对含量的显著下降。因此考虑可以将该10个化合物作为判断有无肾脏损伤时的潜在磷脂化合物。
本发明中的第三类生物类群，HK-2细胞的磷脂含量与肾损伤程度的相关性研究。研究主要目的是验证庆大霉素诱导HK-2细胞能够释放富含磷脂的外泌体（exosomes）且磷脂水平与肾脏毒性损伤程度相关，并完成磷脂谱检测，寻找潜在磷脂标志物。
HK-2细胞，源于导入永生化基因（GenBank: FJ952142.1）的人肾脏近端小管细胞，培养于DMEM培养液中，内含10%胎牛血清，置于37℃、5%CO2恒温培养箱-中培养。在37℃培养2-3d后，用0.25%胰蛋白酶消化、传代。细胞分为正常对照组和庆大霉素损伤组(庆大霉素浓度设定为从0.1 mg/mL至2mg/mL的浓度梯度：0.1mg/mL，0.2 mg/mL，0.4 mg/mL，0.5 mg/mL，0.8 mg/mL，1.0 mg/mL，1.5 mg/mL，2 mg/mL)。随后HK-2细胞分为4组：1）正常对照组（C）：不含药物的完全培养基培养细胞；2）三个庆大霉素损伤组：庆大霉素在培养基中的浓度为0.1mg/mL（L）、0.5mg/ mL（M）、1mg/mL（H）。
已知外泌体腔由脂质双分子层包围。由结果可见，外泌体中磷脂的组成与亲缘细胞不同，后者富含鞘磷脂（SM）。当鞘磷脂（SM）在exosomes中表达升高时，磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰丝氨酸（PS）表达下降。总体来说，实验组外泌体中PC比例高于对照组，但随着实验组中庆大霉素浓度增加，PC比例逐渐降低。PG和Lyso-PC变化不显著，但PS呈浓度依赖式增加，PI降低。初筛后最终确定111种目标磷脂。主成分分析法 (Principal componentanalysis，PCA得分图表明对照组和实验组产生了明显的分离，该结果表明庆大霉素造成HK-2细胞明显的磷脂谱改变。正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial leastsquares discriminant analysis，OPLS-DA)得分图显示，实验组与对照组分离效果很好，两组间的确存在明显的磷脂代谢差异，这也进一步表明庆大霉素诱导细胞异常的磷脂代谢。VIP图(variable influence on projection plot，VIP)总结了化合物在分类中的贡献并以柱状图的形式表示出来，VIP值大于1.0则被认为是潜在的生物标志物。根据VIP值共筛选出15种药源性肾损伤潜在的生物标志物。其中，与对照组相比含量升高的所述一种或多种磷脂选自：PC(16:0-22:2)、PC(16:0-18:2)、PC(16:0-22:5)、PC(18:0-20:5)、PC(18:1-20:5)、PC(18:2/18:2)、PC(18:2-20:1)、PE(16:0-22:3)、PS(20:3-20:3)；或者，与所述对照组相比含量降低的所述一种或多种磷脂选自：PS(18:0-22:4)、PG(18:0-20:4)、PC(16:0-16:1)、PC(16:0-18:1)、SM(42:2)、SM(40:4)。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供了能反应肾脏损伤程度的特异性脂质标志物及其在临床检测方面可能的应用。主要通过检测不同生物的尿液样品中的磷脂浓度并将得到的磷脂谱与对照组进行比较来诊断和/或预测肾脏损伤的不同程度，并从中鉴定出了特异性的磷脂标志物，所述磷脂标志物在诊断和/或预测肾脏损伤程度方面比目前临床采用的具有更高的特异性和灵敏度，并且尿液样品具有无创和更易获取的优点，易于广泛推广。
本发明从临床患者、大鼠、细胞的生物样品（主要是尿液）三个方面同时验证尿液磷脂在不同程度肾脏损伤过程中的含量变化趋势及定量，根据统计学方法遴选出了与肾脏损伤程度密切相关的有标志性作用的尿液磷脂化合物。这些化合物的含量变化在临床鉴别不同程度肾脏损伤方便发挥巨大作用，初步成为更加敏感、特异且能准确反映药源性肾脏损伤程度的磷脂标志物，实现临床疾病的无创筛查，有助于早期进行临床干预和动态治疗监测，阻止疾病进一步恶化，具有重要的临床意义和科研价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中正离子模式下磷脂标准品的TIC。
图2为本发明实施例1中负离子模式下磷脂标准品的TIC。
图3为本发明实施例1中保留时间稳定性考察结果(进样135次)。其中，RSD<3.44%；PC (18:0-20:3)，0.76%；PC (16:0-18:1)，1.69%；PC (18:1-22:5)，0.76%；PE (18:0-20:3)，0.73%；PE (16:0-18:1)，1.65%；PS (18:1-18:2)，1.20%；PS (20:0-20:4)，0.82%；PI(16:0-18:1)，2.39%；PI (18:0-20:4)，2.60%；PG (16:1-20:3)，1.26%；PG (18:1-18:5)，1.49%；LPC 18:0，3.00%；LPC 20:3，3.44%；SM (34:2)，2.53%；SM (42:0)，1.12%。
图4为本发明实施例1中反复冻融PCA分析图; R2[X]1=0.675 R2[X]2=0.115。
图5为本发明实施例2中QC样本在第一主成分的得分图。其中，A: 负离子模式，B:正离子模式
图6为本发明实施例2中三组样本和QC样本的Score图（R2X[1]=0.76 R2X[2]=0.109 R2X[3]=0.055）
图7为本发明实施例2中28个临床患者尿液样品的Score图。
图8为本发明实施例2中27个临床患者尿液样品的Score图。
图9为本发明实施例2中临床患者不同亚组的Loading图。其中，A：IgA组和H健康组R2X[1]=0.584 R2X[2]=0.207，B：MN和健康组R2X[1]=0.759 R2X[2]=0.0677。
图10为本发明实施例2中负离子模式下临床患者不同亚组的OPLS-DA Score图。其中，A：IgA组和H健康组R2X[1]=0.159 R2X0[1]=0.603，B：MN和健康组R2X[1]=0.122 R2X0[1]=0.701。
图11为本发明实施例2中正离子模式下临床患者不同亚组的OPLS-DA Score图。其中，A：组和H健康组R2X[1]=0.326 R2X0[1]=0.497，B：MN和健康组R2X[1]=0.356 R2X0[1]=0.468。
图12为本发明实施例2中负离子模式下临床患者不同亚组的Permutation Test n=200。其中，A：IgA组和H健康组R2=0.475，Q2=-0.635，B：MN和健康组R2=0.664，Q2=-1。
图13为本发明实施例2中正离子模式下临床患者不同亚组的Permutation Test n=200。其中，A：IgA组和H健康组R2=0.239，Q2=-0.613，B：MN和健康组R2=0.248，Q2=-0.481 n=200。
图14为本发明实施例2中负离子模式下临床患者不同亚组的S-Plot图。其中，A：IgA组和H健康组R2X[1]=0.159，B：MN和健康组 R2X[1]=0.122。
图15为本发明实施例2中正离子模式下临床患者不同亚组的S-Plot（a）IgA vs H（b）MN vs H图。其中，IgA组和H健康组R2X[1]=0.326，B：MN和健康组R2X[1]=0.356。
图16为本发明实施例2中负离子模式下临床患者不同亚组的VIP图。其中，A：IgA组与健康组，VIP>1的磷脂有16个，B：MN组与健康组，VIP>1的磷脂有24个。
图17为本发明实施例2中正离子模式下临床患者不同亚组的VIP图。其中，A：IgA组与健康组，VIP>1的磷脂6个，B：MN与健康组，VIP>1的磷脂5个。
图18为本发明实施例2中临床患者中3种潜在生物标志物的箱形图。其中，A：SM(36:3)，B：LPC(20:4)，C：PS (18:1-20:0)。
图19为本发明实施例2中临床患者4类磷脂标志物的总含量组间变化。其中，A：IgA组与健康组，B：MN组与健康组。
图20为本发明实施例2中临床患者4类磷脂标志物的总含量在3组间变化情况。
图21为本发明实施例3中MRM+模式下大鼠空白组混合样品的TIC。
图22为本发明实施例3中MRM+模式下大鼠造模组混合样品的TIC图。
图23为本发明实施例3中MRM-PC模式下大鼠空白组混合样品的TIC图。
图24为本发明实施例3中MRM-PC模式下大鼠造模组混合样品的TIC图。
图25为本发明实施例3中MRM-PG/PI/PS/PE模式下大鼠空白组混合样品的TIC图。
图26为本发明实施例3中MRM-PG/PI/PS/PE模式下大鼠造模组混合样品的TIC图。
图27为本发明实施例3中MRM+模式下大鼠空白组与造模组的PCA-Score ScatterPlot图。
图28为本发明实施例3中MRM+模式下大鼠空白组与造模组的OPLS-DA-ScoreScatter Plot图。
图29为本发明实施例3中MRM+模式下大鼠空白组与造模组的OPLS-DA S-Plot图。
图30为本发明实施例3中MRM+模式下大鼠空白组与造模组的OPLS-DA VIP图。
图31为本发明实施例3中MRM-模式下大鼠空白组与造模组的PCA-Score ScatterPlot图。
图32为本发明实施例3中MRM-模式下大鼠空白组与造模组的OPLS-DA-ScoreScatter Plot图。
图33为本发明实施例3中MRM-模式下大鼠空白组与造模组的OPLS-DA S-Plot图。
图34为本发明实施例3中MRM-模式下大鼠空白组与造模组的OPLS-DA VIP图。
图35为本发明实施例4中细胞Exosomes磷脂成分分析。其中，A：细胞中磷脂分布图，B：exosomes 中磷脂分布图。
图36为本发明实施例4中细胞Exosomes对照组与损伤组的PCA分析-Score图。
图37为本发明实施例4中细胞Exosomes对照组与损伤组的PCA分析-Loading图。
图38A-图38E为本发明实施例4中细胞Exosomes对照组与损伤组的的OPLS-DA分析。其中，图38A：检验图，图38B：score图，图38C：loading图，图38D：VIP图，图38E：s-plot图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
术语：
药物性肾脏损伤或药源性肾脏损伤（drug-induced kidney injury，DKI）是指由药物引起的肾脏病理结构和功能异常的疾病。临床可表现为血尿、蛋白尿、尿量异常、肾小管功能障碍、肾炎综合征、肾病综合征和慢性肾衰竭等。
英文缩写：甘油磷脂（GP）、鞘磷脂（SM）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂酸（PA）、溶血磷脂酰胆碱（LPC）、鞘氨醇（FA）。
以下实施例中样品的来源：样品的定义为从受试对象或受试对象群体获得的任何生物样品，为实现本发明的目的，所述生物样品主要是尿液，还可以是细胞培养液或其中的外泌体。采集患者的尿液样品属于常规临床实践，且具有无创性。将采集的尿液及细胞外泌体在离心机中低速离心后，放入-80℃的冰箱中冷冻，待集齐所有实验样品后一起进行浓度测定。
实施例1 高通量靶标磷脂组学平台的建立及方法学考察
1.1 仪器
岛津LC-20A高效液相色谱仪（Shimadzu，Japan）
Sciex QTRAP 5500质谱系统（Sciex，USA），Turbo Spray离子源，干燥气温度200℃，离子喷雾电压-4500/5500V。
C18液相色谱柱：Synergi 4μ Fusion-RP 80 Å，150×1.0mm（Phenomenex Inc.，USA）
电子分析天平，XSE105 DualRange（Mettler-Toledo，Switzerland）
涡旋振荡器，MS3 digital（IKA，Germany）
多轨道混旋器（Targin Tech，Beijing，China）
高速台式冷冻离心机（Thermo Scientific，USA）
氮气吹干仪，BF-2000M型（北京八方世纪科技有限公司）
1.2 试剂
异丙醇（HPLC Grade，Fisher Scientific，USA）
甲酸（HPLC Grade，Dikma Technologies Inc.，Beijing，China）
甲醇（MeOH）（HPLC Grade，Fisher Scientific，USA）
氨水（优级纯GR，25.0-28.0%，国药集团化学试剂有限公司）
三氯甲烷/氯仿（HPLC Grade，北京市通广精细化工公司）
MTBE（HPLC Grade，Fisher Scientific，USA）
BHT（GC，Aldrich Chemistry，USA）
PALL超纯水系统（PALL，USA）
1.3 磷脂标准品：
PC(17:0/17:0)，粉末，批号：170PC-41（Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL，USA）
LPC(17:0)，粉末，批号：170LPC-29（Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL，USA）
PE(17:0/17:0)，粉末，批号：170PE-19（Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL，USA）
PS(17:0/17:0)（钠盐），粉末，批号：170PS-18（Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL，USA）
SM(d18:1/17:0)，粉末，批号：170SM-13（Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL，USA）
PI(17:0/14:1)（铵盐），甲醇溶液，12.67uM，批号：LM39-130A（Avanti PolarLipids，Alabaster，AL，USA）
PG(17:0/17:0)（钠盐），粉末，批号#K1505061（Aladdin，Shanghai，China）
因人体不能合成奇数碳链的脂肪酸，故于每类磷脂中选择一种样本中不存在的磷脂化合物作为内标物，最终对每一个峰进行归一化，如PC (17:0/17:0)，Lyso-PC (17:0)，PE (17:0/17:0)，PG (17:0/17:0)，PS (17:0/17:0)，SM (d18:1/17:0)，PI (17:0/14:1)，一方面可利用内标物的峰面积进行归一化，消除进样误差，另一方面防止因质谱信号不稳定导致的误差，以保证相对定量的准确性。
1.4 软件
Analyst 1.5.2，SIMCA 14.1，SPSS 20.0，EXCEL 2016，HemI 1.0.3
1.5 标准品溶液配制
配制PC(17:0/17:0)、L-PC(17:0)、PE(17:0/17:0)、PS(17:0/17:0)、SM(d18:1/17:0)、PI(17:0/14:1)、PG(17:0/17:0)的混合溶液，每种标准品的浓度均为500ng/mL，PE(17:0/17:0)、PS(17:0/17:0)、PG(17:0/17:0)的粉末以氯仿/MeOH/H2O（65:35:8，v/v/v/）溶解，PC(17:0/17:0)、L-PC(17:0)、SM(d18:1/17:0)以MeOH溶解，混合液配制以MeOH为溶剂。
配制方法学考察实验工作液：取1mg/ml的7种标准品的储备液，用甲醇梯度稀释成质量浓度为500ng/mL，300ng/mL，200ng/mL，100ng/mL，50ng/mL，25ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，625pg/mL的11个浓度梯度混合标准品工作液。
1.6 样本前处理
尿液样本每份400微升，于-80℃冰箱中贮存。使用时解冻至室温，加入七个磷脂标准品的混合溶液20 微升，加入1.5 mL 0.01%（w/v）BHT的甲醇溶液，涡旋1 min，再加入5 mLMTBE，低速涡旋10min，缓慢加入1.25 mL超纯水诱导两相分离，冰浴10 min，4℃下1000×g离心10 min。收集上层有机相（用移液枪吸取上层有机相5 mL），下层水相用2 mL MTBE/MeOH/H2O的混合物（10:3:2.5，v/v/v）再次萃取，合并第二萃取的1 mL有机相，并在不加热的条件下将有机相在氮气吹干仪上吹干，-20℃下保存。进样前以100 微升初始流动相A复溶（异丙醇/甲醇/水（5:1:4，v/v/v）+0.2%甲酸和0.028% 氨水），过程中需涡旋100 s，使充分复溶后，12000 rpm离心5 min后吸取上层约80 微升，转移至棕色进样小瓶中的内插管中，准备进样。
1.7 HPLC/Q-Trap分析
1.7.1 色谱条件
流动相A：异丙醇/甲醇/水（5:1:4，v/v/v）+0.2%甲酸和0.028%氨水；流动相B：异丙醇+0.2%甲酸和0.028%氨水。流速：0.0400 mL/min，柱温：30℃，进样量5 微升。采用梯度洗脱，洗脱梯度如表1所示，洗脱时间共63 min。
表1 梯度洗脱程序
时间（min） 流动相B
0 30%
5 50%
30 80%
31 95%
41 95%
42 5%
47 5%
52 30%
62 30%
63 Stop
每批样本进样前，需以初始流动相平衡色谱柱20 min。
1.7.2 质谱条件
根据文献调研与前期工作，采用多反应监测模式（multiple reactionmonitoring，MRM）的正离子模式（ESI+）检测LPC(17:0)，SM(35:1)，采用负离子模式（ESI-）检测PC(17:0/17:0)，PE(17:0/17:0)，PS(17:0/17:0)，PG(17:0/17:0), PI(17:0/14:1)。结合前期研究基础，针对负离子模式下的电压参数（CE）进行优化，使得磷脂标准品的脂肪酸链信号达到最大值。7种标准品的质谱参数如表2所示。
其余质谱参数设置：驻留时间（dwell time）：10 ms（初筛），50-100 ms（尿样正式测定）；入口电压（entrance potential，EP）：-10 V。离子源：Turbo Spray；气帘气（CurtainGas，CUR）：15.0 psi；碰撞气（Collision Gas，CAD）：Medium；离子源温度：200℃；雾化气（Ion Source Gas 1）：20.0 psi；辅助气（Ion Source Gas 2）:0.0 psi。
表2 磷脂标准品质谱参数
Figure 756497DEST_PATH_IMAGE001
注：DP(V)：declustering potential，去簇电压；CE(Ev)：collision energy，碰撞能；CXP(V)：collision cell exit potential，碰撞室出口电压；IS(V)：ionsprayvoltage，喷雾电压。
图1和2分别为正离子模式下和负离子模式下的磷脂标准品的总离子流图（TIC），可以看出在本发明设置的色谱条件下，各类磷脂标准品的有较好的分离，磷脂标准品的洗脱顺序为：正离子模式下LPC<SM，负离子模式下PI<PS<PG<PE<PC，其中PS和PG保留时间相近，PC和PE保留时间相近。在正式测定时，保留时间相近的磷脂化合物可根据质谱的MRM工作模式，进一步得到分离。
1.8 目标磷脂的选择与筛选
1.8.1 目标磷脂化合物的选择
本发明所设定的目标磷脂化合物主要依据LIPID Maps中部分磷脂和全部HMDB中纳入的尿液中检测到的磷脂化合物，并纳入文献报道的尿液中被认为潜在生物标志物的磷脂化合物。根据其species组成，推断其sub-class的组成，或者根据sub-class组成，推断其species组成。比如PE(38:3)在以上三3种方式中只收录了PE(16:1-22:2)，PE (18:0-20:3)，PE(18:1-20:2)，PE (18:2-20:1)， PE (18:3-20:0)，此时按照人体内磷脂的碳链长度一般从C14至C24开始补齐PE(38:3)下的species组成：PE（14:0-24:3），PE (14:1-24:2) ，PE (14:2-24:1)， PE (14:3-24:0) ，PE (16:0-22:3) ，PE (16:2-22:1) ，PE (16:3-22:0)。并根据裂解规律写出其MRM扫描时的Q1（母离子）和Q3（子离子）信息，电压参数与同类的标准品所使用的相同。
按本方法共得到包含147个sub-class磷脂，470个species（不包含SM，因本发明无法判断其species组成），共需扫描个MRM跃迁离子923对的数据库。供初筛通道时使用。
1.8.2 目标磷脂化合物的初步筛选
初筛目的：由于Q-Trap/MS 5500的检测能力有限，不能同时扫描过多的MRM通道，初筛后目标化合物的数量合适可供一次进样时测定；为了使研究集中于那些含量较高且富有变化的样本。
初筛方法：将用于方法开发的10个膜性肾病患者等体积混合尿样QC1、8个IgA肾病组的等体积混合尿样QC2，10个健康人等体积混合尿样QC3分别取400微升按照1.6的方法进行样本前处理，但不加入内标，防止信号干扰。L-PC、SM在正离子模式下扫描，PC、PE、PI、PG、PS在负离子模式扫描。每个样本平行测定3次。
排除标准：
1）S/N<2.5：删除在QC1、QC2、QC3混合样本中3次测定的信噪比都小于2.5甚至都没有响应的MRM通道；
2）删除经EPI鉴定，色谱峰不是目标磷脂化合物的MRM通道；
由于许多对SM和PC的相对分子质量只相差1，例如SM(38:0)和PC(34:1)，碳数相差4，不饱和度相差1的SM和PC往往都具有相近的相对分子质量，而Q Trap 5500的分辨率（精确到1）又不足以准确分辨这样的差别，实际正离子模式下的一部分SM通道产生的峰其实是PC。并且PC、SM在正离子模式下的特征子离子都是184.1（m/z），故PC会对SM的测定产生干扰。将上述相对分子质量差1的PC与SM通道筛选后经EPI（-）鉴定，从二级质谱图上的结果考察容易混淆的PC与SM的脂肪酸链的特征信息，如果特征信息保持一致（即脂肪酸链的信息完全一致），则删除该SM磷脂化合物的离子对信息。正式检测时PC在负离子模式下检测，不会造成干扰。
3）负离子模式下，每个化合物的两条脂肪酸链都会扫描，若只有一条通道中有响应，而另一条通道中信噪比小于2.5，则无法相互验证该目标物质的脂肪酸链组成，故针对该sub-class作EPI扫描，可根据保留时间得到该位置的二级质谱图，从而进一步确认可能的脂肪酸链构成，指认成功的则纳入最终的目标磷脂化合物名单，否则舍去。
1.9 空白基质筛选
筛选目的：样品前处理过程中使用的MTBE、超纯水、异丙醇等溶剂中可能会含有干扰某些磷脂离子对测定的杂质，需要加以鉴别并删除。
筛选方法：以50% MeOH、50% 纯化水冲洗色谱柱1h后，再以90% MeOH、10% 纯化水冲洗色谱柱1 h。取四份400 微升超纯水，分别为样本A、B、C、D，前三份同尿液一样以前述方法做前处理，样本D不经前处理；样本E为流动相A。将按上述方式处理的样本各取100 微升放入自动进样器，依次进入LC-MS/MS系统，进样量为5 微升，观察在正负离子模式下是否出现磷脂信号。
筛选结果：样本A、B和C中产生磷脂信号峰的通道有：L-PC(16:0)、L-PC(18:2)、SM(30:0)、SM(32:0)、SM(32:1)、SM(32:2)、SM(34:0)、SM(34:1)、SM(36:1)、SM(40:1)，样本D在SM(40:1)的通道中产生较弱信号，样本E在L-PC(16:0)、L-PC(18:2)、SM(32:0)、SM(32:1)通道中产生信号。
空白组A、B、C在经过整个磷脂组学平台被引入了信号干扰，其中有部分干扰来源于流动相A和纯化水，故在测定尿液样本时，舍弃上述会引入干扰的MRM离子对，最终需要检测的目标磷脂化合物共65种，82对跃迁离子对。
1.10 数据分析
所有提取离子流色谱峰面积均通过软件Analyst 1.5.2中的QuantitationWizard模块得到。峰面积提取参数设置如下：平滑系数3；保留时间窗口60s；基底窗口2min；噪音百分比50%；峰分裂因子4。导出数据由Microsoft Office Excel 15.13.4版本和SIMCA14.1进行统计分析。
1.11 方法学考察
由于LC-MS对于不同化合物的响应不同，同时质谱仪的稳定性同样能影响数据的重复性与重现性，为评估检测方法的稳定性与可靠性，结合美国临床实验室标准协会（TheClinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）于2014年发布的质谱分析方法开发与验证的标准规程CLSI C62-A指导文件以及FDA的生物分析方法验证指南（Guidancefor Industry: Bioanalytical Method Validation）针对本实验平台做如下项目的方法学考察。
方法学样品制备
1）QC样本：取10个健康志愿者、10个膜性肾病患者和8个IgA肾病患者的新鲜的尿液样本各1mL混合成28 mL的QC样本，实验中的每份QC样本均从该混合尿液样本取出，每份体积均为400微升。
2）空白基质样本：取QC样本400 微升，按照1.6方法进行样本前处理，吹干后于-20℃下保存，检测前用100 微升流动相A复溶。
3）提取前加入标准品：取400 微升的QC样本，加入20 微升的7种混合标准品溶液，按照1.6方法进行样本前处理，吹干后于-20℃下保存，检测前用100 微升流动相A复溶。
4）提取后加入标准品：取400 微升的QC样本，按照1.6方法进行样本前处理，吹干后加入20 微升的7种混合标准品溶液，继续吹干，于-20℃下保存，检测前用100 微升流动相A复溶。
由于检测的磷脂化合物有82种，需随机选取每种磷脂化合物中的2~3个作为该类磷脂的代表，以下为实验开始前选取的15种磷脂化合物：PC (18:0-20:3)，PC (16:0-18:1)，PC (18:1-22:5)，PE (18:0-20:3)，PE (16:0-18:1)，PS (18:1-18:2)，PS (20:0-20:4)，PI (16:0-18:1)，PI (18:0-20:4)，PG (16:1-20:3)，PG (18:1-18:5)，LPC 18:0，LPC20:3，SM (34:2)，SM (42:0)。
1.12 精密度
1.12.1 方法学精密度
取3份QC样本各400 微升，加入500 ng/mL混合标准品溶液20 微升，按照1.6方法进行样本前处理，每份样本在正离子模式下和负离子模式下各平行测定3次。考察7种标准品的保留时间和峰面积的变异系数。如表2.3所示7种磷脂标准品峰面积的变异系数均小于15%，表明MTBE提取法和LC-MS检测方法的精密度良好。
1.12.2 尿液样本精密度
取3份QC样本400 微升,不加入混合标准品溶液，按照1.6操作进行样本前处理，在正负离子模式下平行测定3次。随机选取尿液样本中的15个峰进行保留时间和峰面积考察。根据一篇Nature protocol [Dunn WB, Broadhurst D, Begley P, et al. Proceduresfor large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gaschromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. NatProtoc, 2011:1060-1083]上提出的关于液质联用技术研究代谢组学的变异度标准：QC样本中随机峰强的变异度（RSD）均在20%以内，认为该批数据的变异度满足初步的要求。如表3所示随机选取的15个峰的CV值均在20%以内，且在82个离子通道中，仅有4个离子通道超出上限值的20%（即95.1%的离子通道满足要求），表明本平台的方法在真实尿液样本中的精密度良好。
同时在整在方法学验证过程中，从1.12精密度到1.18回收率验证过程保持了LC-MS仪器的连续进样状态，共计135次进样，进样时长为8505min。考察预先随机选取的15个磷脂化合物的保留时间的变异系数。如图3所示，保留时间的变异系数范围0.72%~3.44%，远小于15%，表明整个进样过程中机器性能维持稳定。
表3 方法学精密度及尿液样本精密度考察
Figure 939216DEST_PATH_IMAGE002
注：右上角标*为磷脂标准品
1.13 稳定性
1.13.1 室温放置12 h稳定性
同时取出6份QC样本，每份400 微升，其中3份QC样本在室温下放置，另外3份QC样本放置于-80℃环境中，12 h后同时取出，按照1.6前处理步骤提取后进行检测，每份QC样本在正负离子模式下各平行检测3次，考察7种磷脂标准品和随机选取15个峰的积分面积的变异系数和上述22个峰在室温下放置12 h后的峰面积A1与-80℃下的峰面积A2的偏差值A0。A0=（1- A1/ A2）*100%。
如表4所示室温下放置12 h和-80℃下放置12 h后的峰面积变异系数均小于15%，且偏差值均小于20%（82个离子通道中峰面积的偏差值范围为0.13%~18.43%）。结果表明本方法对于尿液中的磷脂化合物和磷脂标准品溶液在室温放置12 h内基本稳定，同时为正式实验中磷脂的提取处理操作时间提供参考。
表4 室温12 h稳定性结果
Figure 250112DEST_PATH_IMAGE003
注：右上角标*为磷脂标准品
1.13.2 自动进样器中24 h稳定性
取3份QC样本，每份加入20 微升浓度为500 ng/mL混合标准品溶液，按照1.6前处理步骤提取，待离心后，每份QC样本取上层80 微升分装于2个进样小瓶中，其中一瓶放置于质谱检测室中的自动进样器中，另一个小瓶放入-80℃环境下保存。24 h后同时取出检测，每份QC样本在正负离子模式下各平行检测3次，考察放置在自动进样器中的7种磷脂标准品和随机选取15个峰的峰面积变异系数与偏差值。
如表5所示，上述22种磷脂化合物在自动进样器中放置24 h和-80℃下放置24 h后的峰面积变异系数均小于15%，且偏差值均小于20%（82个离子通道中峰面积的偏差值范围为0%~17.61%）。
表5 自动进样器24h稳定性结果
Figure 973217DEST_PATH_IMAGE004
注：右上角标*为磷脂标准品
1.13.3 反复冻融稳定性
如表6所示，第1天从-80℃的冰箱中取出3*3份QC样本，室温下放置12 h后同时放入-80℃的环境下保存。第2天取出其中的2*3份QC样本，室外25℃下放置6 h待完全融化后，再次放入-80℃的环境下保存。第3天相同时间，在前1日取出的2*3份QC样本中取出3份QC样本放置于室外25℃的条件下，待12 h完全解冻后重新置于-80℃下的冰箱中保存。第4天同时取出3*3份QC样本和3份对照QC样本，按照1.6的方法进行样本前处理，按照共经过0次冻融的3份对照样本，1次冻融循环的3份样本，2次冻融循环的3份样本，3次冻融循环的3份样本的进样顺序在正离子模式和负离子模式下检测，每份样本平行检测3次。对12份QC样本进行PCA分析，考察冻融次数对待测磷脂成分变化的影响。
表6 反复冻融循环实验
DAY1 DAY2 DAY3 DAY4
1次冻融样本 取出解冻>2h，再次冷冻 / / 取出后室温解冻＞2h，制备，测定
2次冻融样本 取出解冻>2h，再次冷冻 取出，室温解冻＞2h，再次冷冻 / 取出，室温解冻＞2h，制备，测定
3次冻融样本 取出解冻>2h，再次冷冻 取出，室温解冻＞2h，再次冷冻 取出，室温解冻＞2h，再次冷冻 取出，室温解冻＞2h，制备，测定
对照样本 / / / 取出，室温解冻＞2h，制备，测定
如图4所示，每组冻融循环样本聚集程度良好，经过1次冻融循环和2次冻融循环的QC样本距离对照样本较近，经过3次冻融循环的样本与前两次冻融样本相比，发生了较大偏移，提示在分析尿液样本时，反复冻融次数不应超过2次以上。
1.13.4 长期冻存稳定性
取新鲜混合的QC样本3份，每份400 微升，加入20 微升浓度为500 ng/mL的混合标准品后按照1.6的步骤进行样本前处理，每份QC样本在正离子和负离子模式下平行测定3次。另取2*3份QC样本，加入20 微升浓度为500 ng/mL的混合标准品后放置于-80℃的冰箱中，分别于15天、30天后取出3份QC样本，进行样本前处理，每份QC样本在正离子和负离子模式下平行测定3次。考察7种标准品和随机选取的15个峰的峰面积的RSD值。
如表7所示7种磷脂标准品和随机15种磷脂分子峰在-80℃条件下保存30天后的变异系数均小于20%，检测的82种磷脂分子峰面积RSD在1.67%~18.78%内。表明样品在-80℃下保存1个月内，稳定性良好。
表7 30天冻存稳定性考察
Figure 554634DEST_PATH_IMAGE005
注：右上角标*为磷脂标准品
1.14 基质效应
分别取体积为400 微升的6个健康志愿者的尿液样本及3份纯化水。每个样本按照1.6的步骤进行提取吹干后，加入浓度为500 ng/mL混合标准品溶液20 微升，用流动相A稀释到100 微升，正离子模式和负离子模式下各平行检测3次。每个尿液样本得到7种磷脂标准品的峰面积，分别标记为A1~A7。3份水中的7种磷脂标准品峰面积为B1、B2和B3，取均值B。考察每一个尿液样本中的7种磷脂标准品的基质因子范围（基质因子计算公式=A/B）。由于实验过程中未采用合适的内标物质来校正待测磷脂标准品的峰信号，需同时考察7个未经过校正的基质因子的变异系数和每个尿液样本中的7个基质因子数值，课题组制定的MF的接受标准是：1.20≥MF≥0.80。
如表8所示，PC(17:0/17:0)，LPC(17:0)，PE(17:0/17:0)，PS(17:0/17:0)，SM(d18:1/17:0)，PI(17:0/14:1)，PG(17:0/17:0)在6个不同个体中，仅有N1个体中的PC(17:0/17:0)和N3个体中的SM(d18:1/17:0) 刚好超出接受标准的上限，其余均在标准范围内（1.17≥MF≥0.87），并且峰面积的变异系数范围2.31%~4.22%，说明基质不会对磷脂的测定产生影响。
表8 7个磷脂标准品基质因子考察
PC PE PS PG PI LPC SM
N<sub>1</sub> 1.21 1.08 1.20 1.16 1.09 0.92 1.14
N<sub>2</sub> 1.14 1.05 1.17 1.15 1.10 0.87 1.13
N<sub>3</sub> 1.12 1.13 1.15 1.11 1.08 0.91 1.22
N<sub>4</sub> 1.17 1.08 1.13 1.07 1.08 0.95 1.12
N<sub>5</sub> 1.13 1.11 1.09 1.15 1.13 0.88 1.09
N<sub>6</sub> 1.13 1.12 1.07 1.12 1.14 0.90 1.10
RSD（%） 3.15 2.77 4.22 3.13 2.31 3.37 4.18
注：N1~N6来源于6个不同的个体尿样
1.15 灵敏度
采用HPLC-Q-Trap/MS的检测方法检测磷脂的最低定量限值，为后期进行磷脂生物标志物定量研究打下基础。取500 ng/mL的混合磷脂标准品溶液，依次用MeOH进行梯度稀释成浓度为300 ng/mL，200 ng/mL，100 ng/mL，50 ng/mL，25 ng/mL，10 ng/mL，5 ng/mL，2.5ng/mL，1.25 ng/mL，625 pg/mL的10个浓度梯度混合标准品溶液。依次取以上混合标准品溶液（包括500 ng/mL的混合标注品溶液）20 微升加入11个QC样本中，按照1.6的步骤进行样本前处理，每份样本在正离子模式和负离子模式下各平行检测3次。用加权最小二乘法计算回归方程（W=1/x2），考察梯度稀释溶液的线性和7种磷脂标准品的定量下限。
根据FDA生物样本分析方法指南的规定，一般生物样本定性要求S/N＞5，定量要求S/N＞10。采用半定量的研究，对于LLOQ的标准：S/N＞5左右。线性结果和灵敏度结果如表9所示。
表9 磷脂标准品线性结果
磷脂标准品 回归方程 回归系数r LLOQ(ng/ml) S-To-N-Script
PC(17:0/17:0) y=17900x+2630 0.9988 0.25 5.5
PE(17:0/17:0) y=10000x+4870 0.9994 2 11.2
PS(17:0/17:0) y=8360x+1590 0.9993 2 6.6
PG(17:0/17:0) y=20300x+12100 0.9992 1 7.2
PI(17:0/14:1) y=12400x+9940 0.9985 1 4.8
LPC(17:0) y=105000x+301000 0.9938 0.25 10.1
SM(d18:1/17:0) y=113000x+1040000 0.9983 0.125 9.3
注：LLOQ为进样小瓶中磷脂的终浓度
1.16 专属性
为评估7种磷脂标准品在LLOQ处检测的选择性，根据灵敏度实验确定7种磷脂标准品的定量下限浓度，从磷脂标准品的储备液中分别用MeOH梯度稀释为50ug/mL ，5 ug/mL，500 ng/mL，100 ng/mL的溶液。根据灵敏度实验结果，从100 ng/mL的PC(17:0/17:0)和LPC(17:0)分别取出40 微升，PG(17:0/17:0)和PI(17:0/14:1)中分别取出160 微升，PE(17:0/17:0)和PS(17:0/17:0)分别取出320 微升，SM(35:1)取出20 微升，最后用MeOH稀释成终体积为3200 微升的7种混合标准品LLOQ溶液，使得其中PC(17:0/17:0)和LPC17:0浓度为0.25ng/mL，PE(17:0/17:0)和PS(17:0/17:0)浓度为2 ng/mL，PG(17:0/17:0)和PI(17:0/14:1)浓度为1 ng/mL，SM(35:1)浓度为0.125 ng/mL。取12份QC样本，对12份QC样本进行前处理，其中6份加入上述配制的LLOQ混合标准品溶液各20 微升，剩下6份作为空白基质尿样，其余步骤均相同。进样顺序为一个空白基质QC样本后接一个LLOQ的QC样本，交叉进行检测，每份样本在正离子模式和负离子模式下各平行检测3次。考察空白基质中的磷脂标准品保留时间附近的峰面积与LLOQ样本中磷脂标准品峰面积的比值。
在上述色谱条件下，7个标准品的保留时间如表10所示，7个磷脂标准品保留时间附近，空白尿样基质中干扰峰占定量下限峰面积比均小于10%，表明方法的专属性良好，空白尿样中的内源性物质不会干扰磷脂的测定。
表10 专属性结果
Standard Compounds Retention time(min) Blank/LLOQ(%)
PC(17:0/17:0) 18.5 2.69
PE(17:0/17:0) 19.9 0.61
PS(17:0/17:0) 13.7 5.44
PG(17:0/17:0) 15.2 0.71
PI(17:0/14:1) 8.89 7.41
LPC(17:0) 5.17 2.00
SM(d18:1/17:0) 13.3 0.76
1.17 携带效应
为评估正式测定时高浓度的磷脂标准品混合溶液样本对LLOQ样本的干扰，需要评价500 ng/mL的磷脂标准品溶液的携带效应。取3份QC样本，第1份加入20 微升浓度为500ng/mL的混合标准品溶液，第2份为空白基质尿样，第3份加入20 L的LLOQ混合标准品溶液，按照1.6的步骤依次提取并按顺序进样检测，考察在空白基质中7种磷脂标准品保留时间附近的峰与LLOQ样品中的峰的面积比。
如表11所示，携带效应值均小于10%，表明高浓度500 ng/mL下的标准品混合溶液对空白基质的携带效应不会对LLOQ溶液中的磷脂标准品的测定产生影响，符合分析要求。
1.18 回收率
回收率的测定是通过比较提取前和提取后的标准品的浓度得到的。根据灵敏度实验结果，考察7个磷脂标准品在高低两个浓度梯度400 ng/mL和20 ng/mL的混合磷脂标准品溶液中的回收率。取3*2份各400 微升的QC样本，3份各加入20 微升的400 ng/mL混合标准品溶液，另外3份各加入20 微升的20 ng/mL混合标准品溶液。进行样品前处理后，每份样本在正负离子模式下平行测定3次，得到提取前每份尿液样本中的7种磷脂分子的峰面积均值A1~A7。另取3*2份QC样本，按照样品前处理的步骤，待吹干后，3份加入20 微升的400 ng/mL混合标准品溶液, 另外3份各加入20 微升的20 ng/mL混合标准品溶液用流动相A稀释成100 微升，每份样本在正负离子模式下平行测定3次，得到提取后7种磷脂分子的峰面积均值B1~B7。在高低两个浓度下考察7个磷脂标准品的回收率。
如表11所示，高低两个浓度下，绝对回收率范围为54.05%~105.73%，其中PC(17:0/17:0) ，PE(17:0/17:0)，PS(17:0/17:0)，PG(17:0/17:0) 回收率可达80%以上。
表11 携带效应与回收率结果
Figure 704992DEST_PATH_IMAGE006
实施例2 膜性肾病与IgA肾病患者尿磷轮廓分析及标志物筛选
2.1 仪器与试剂
仪器与试剂同实施例1。
2.2 样本收集
肾病患者纳入标准：既往未发生过肾脏疾病的住院患者或者既往未进行过肾脏穿刺的患者，本次入院后进行肾穿检查，有明确的病理结果如膜性肾病（MN）、IgA肾病、微小病变等。
排除标准：①进行环磷酰胺冲击治疗及其他常用免疫抑制剂（他克莫司、环孢素等）治疗的病人；②出院诊断上没有写明详细诊断的患者（如出院诊断为肾功能不全，无法得知病理分型）；③没有进行肾穿刺检查，仅根据临床表现和检查报告得出的病理类型的患者；④同时患有MN和IgA的患者；⑤诊断明确的合并有癌症、动脉粥样硬化性心脏病、阿兹海默症以及糖尿病的患者。
尿液样本采集方法：符合纳入标准的患者于晚间签署知情同意，第二天早上在做肾脏穿刺之前留取中段尿液，及时取出尿样，分装于多个2 mL的EP管中，置于-80℃下保存。
共采集尿液样本28份，其中膜性肾病组10人，IgA肾病组8人，健康组10人。肾病组尿样来自于北京大学第三医院肾内科病房，健康组尿样来自于北京大学第三医院健康体检中心。受试者基本信息如表12所示。收集受试者中段晨尿20-30 mL，立即贮存于-80℃冰箱。本发明得到北京大学第三医院伦理委员会批准，所有受试者均签署了知情同意书。
2.3 数据分析
对得到的矩阵数据共28*63个，检索缺失值，并用所有数据中最小值的1/2替代，之后导入SIMCA14.1软件中进行log10转换以及Pareto scaling（Par）标度化，建立PCA以及OPLS-DA模型进行分析。
表12 纳入的临床患者基本信息
Health 组 MN 组 IgA 组
人数 10 10 8
性别（M/F） 4M/6F 6M/4F 3M/5F
年龄（周岁） 45.10±12.47 39.60±16.06 35.13±11.60
SCr (umol·L<sup>-1</sup>) 73.20±12.51 68.70±14.30 100.38±36.63*
HGB (g·L<sup>-1</sup>) 134.80±14.05 134.30±17.76 125.63±18.53
SBP (mmHg) 120.1±10.9* 135.50±18.50 137.25±11.80
DBP (mmHg) 74.20±10.46 82.20±10.42 90.88±14.07*
ALB (g·L<sup>-1</sup>) NA 30.34±5.62 41.69±6.05
注：表中连续性变量表示均值±标准差（服从正态分布）。*P<0.05（与其他两组均有显著差异）。缩略语：HGB：Hemoglobin，血红蛋白；SBP：Systolic blood pressure，收缩压；DBP：Diastolic blood pressure，舒张压；ALB：Serum albumin，血清白蛋白
2.4 实验结果
2.4.1 质控分析
采用本方法对28例尿样进行靶向磷脂组学分析，连续4次测定QC样品，使系统达到平衡后，每5个样品穿插1个QC样品的检测，如图5所示，分别在正、负离子模式下，10个QC样品经HPLC-Q/Trap检测后进行PCA分析，各样本在第一主成分上的得分图。结果表明第1次QC样品检测，偏差较大，之后的QC样品都维持2SD范围内，精密度高。排除了样本之间的磷脂代谢的差异是由于操作误差所致，由该方法得到的磷脂生物标志物的可靠性较高。
进一分析结果如图6所示，为在整个实验过程中健康组、MN组、IgA组以及进样序列中穿插的6个QC样本的在3个主成分上的score图，黄色的QC样本在整个实验过程中聚集程度良好，组内差异小，表明前期的操作及检测过程稳定，数据能真实反应各组之间的差异。
2.4.2 PCA分析
PCA是从原始变量之间的相互关系入手，根据变最大化的原则将其线性变换到几个独立的综合指标上(即主成分)，取2～3个主成分作score图，直观地描述不同组别之间的代谢模式差别和聚类结果，并通过loading图寻找对组间分类有贡献的原始变量作为生物标志物。通常情况下，由于代谢组学数据具有高维、小样本的特性，同时有噪声变量的干扰，PCA的分类结果往往不够理想。尽管如此，PCA作为代谢组学数据的预分析和质量控制步骤，通常用于观察是否具有组间分类趋势和数据离群点。
在包含28*63个数据矩阵中，对于缺失值用数据集中的最小值的1/2代替，本发明为1.63E+03，之后导入SIMCA中进行分析。图7所示为28个样品的score图，可以看出MN组6号个体的散落在95%置信区间范围外，与其余各组中的个体差异较大，回溯原始数据结果，发现MN-06个体的磷脂数据较其他组倍数值在100倍以上，考虑个体差异大，故舍弃MN-06组，重新进行PCA分析。
图8所示为排除了数据离群点MN-06后采用PCA考察27个尿液样本的分布情况，从得到的score图中可以看出，健康人和肾病患者之间有明显的分离，MN组与IgA组之间没有区分，但3组组内差异都比较大。该PCA结果表示，与健康人相比肾病组出现了磷脂代谢的异常。
图9所示（A）分别为IgA肾病与健康组、（B）MN与健康组的loading图，loading图可以提供对组间分类有贡献的原始变量，将其作为初步筛选出的生物标志物。但其结果易受仪器偏移、操作误差、对研究对象区分能力不强等缺点而有偏差。此时，利用关于样本的先验知识将数据分析进一步聚焦到要研究的方面更为有效，如PLS和OPLS，这两类相比PCA更广泛应用于代谢组学数据分析，也更能够分析出次生代谢产物的差异。
2.4.3 OPLS-DA分析
相较于PCA这种无监督的模式识别方法，有监督的模式识别方法更适合于进行样品间的分类差异识别分析。OPLS-DA便是这一类有监督的模式识别方法。它是PLS-DA 的扩展，即首先使用正交信号校正技术，将X矩阵信息分解成与Y相关和不相关的两类信息，然后过滤掉与分类无关的信息，相关的信息主要集中在第一个预测成分，适合发现潜在的生物标志物。图10和图11分别为负离子模式和正离子模式下，经OPLS-DA处理分析后得到组间得分图，此图提供的样品分离信息，可得到比PCA更大的样品区分度。
从score图可以看出，肾病患者与健康人分离效果很好，两组间的确存在明显的磷脂代谢差异。
由于代谢组学数据具有高维、小样本的特性，使用有监督学习方法进行分析时很容易产生过拟合的现象。为此，需要使用置换检验考察OPLS-DA在无差异情况下的建模效果。该方法在固定X矩阵的前提下，随机置换Y分类标签n次，每次随机置换后建立新的OPLS-DA 模型，并计算相应的Ｒ2Y和Q2Y；之后与真实标签模型得到的结果进行比较，用图形直观表达是否有过拟合现象（overfitting）。如图12和图13所示为对负离子模式和正离子模式的OPLS-DA模型分别进行200次的置换检验图（Permutation test），结果显示负离子模式下IgA组和MN组分别为R2=0.475，0.664<0.7，Q2=-0.635，-1<0，正离子模式下IgA组和MN组分别为R2=0.239，0.248<0.3，Q2=-0.613，-0.481<0，200次置换检验组合得到数据集在Y轴上的截距都小于右边的原点，说明此OPLS-DA模型随机分组可靠，无过拟合现象，建立模型的预测能力远高于200个随机检测组。
OPLS-DA分析下的S-plot主要是运用多元变量统计分析策略，迅速定位可能的标志物，是初步筛选潜在生物标志物的一种方式。S-plot图中纵坐标关联性（correlation）解释了每个变量对模型分组的可靠性，横坐标为方差（covariance）解释了每个变量对模型分组的影响的大小，所以在S-plot中化合物的点在图中越远离中心、越靠近s曲线的两端，对区分两组的可靠性就越大，贡献值就越高。常用|p(corr)|>0.5和|p|>0.1缩小筛选潜在标志物的范围。如图14和图15所示，标红的三角符号分别是正负离子模式下肾病组与健康组区分明显的磷脂化合物。通过S-plot筛选的化合物还需与原始数据进行比较，进一步查看范围内化合物的显著关系来确定最终潜在的生物标志物。
VIP图总结了化合物在分类中的贡献并以柱状图的形式表示出来。VIP值大于1.0则被认为是潜在的生物标志物。如图16和17所示，IgA组有22种化合物的VIP>1.0，MN组29种化合物的VIP>1.0，这些可能成肾病组潜在的生物标志物。
2.5 潜在生物标志物的确定
用双尾student’s test检验，在单元变量维度上考察每种磷脂化合物的P值，结合单元变量信息P值<0.05和多元变量VIP值>1筛选出潜在生物标志物，如表13和14所示。
表13 临床患者 IgAN和Health组中目标磷脂化合物测定及分析结果
Figure 237605DEST_PATH_IMAGE007
表14 临床患者 MN和Health组中目标磷脂化合物测定及分析结果
Figure 967663DEST_PATH_IMAGE008
IgA肾病与健康人之间的潜在的生物标志物为表13中序号1-12中的磷脂化合物：PC(16:0-22:4)，LPC(20:4)，PC(16:0-20:4)，PC(22:4-18:2)，PC(18:0-20:4)，PC(16:0-20:2)，PC(16:0-18:2)，PC(20:4-18:2)，PC(18:0-18:2)，SM(36:3)，LPC(18:0)，PS(18:1-20:0)。
膜性肾病与健康人之间的潜在的生物标志物为表14中序号1-9中的磷脂化合物：PC(16:0-22:4)，PC(16:0-20:4)，LPC(20:4)，LPC(18:0)，PC(20:4-18:2)，SM(36:3)，PC(18:0-20:3)，LPC(18:1)，PS(18:1-20:0)。
根据实验的最终结果也发现二者与健康人群的标志物有6个共同的生物标志物如：PC(16:0-20:4)，PC(16:0-22:4)，PS(18:1-20:0)，LPC(18:0)，LPC(20:4)，SM(36:3)。
图18所示为筛选出的3组间共同的磷脂标志物在相对含量上的变化趋势，可以看出SM(36:3)和LPC(20:4)在肾病组中的水平显著高于对照组，而两组肾病组之间没有显著差异。PS(18:1-20:0)的变化趋势则相反。
为了分析了每一类磷脂化合物在肾病组和健康人间的代谢差异，研究根据筛选出生物标志物，假设同类磷脂的响应程度差别不大，将生物标志物中的每一类磷脂含量即相对峰面积进行加合，比较每组间每一类磷脂代谢的差异，作统计分析，结果如表15和16所示。本发明筛选的PS和SM只有一个化合物，所以表中的PS和SM分别就是PS(18:1-20:0)和SM(36:3)。可以看出，LPC、SM、PC这3类磷脂在肾病组的含量要高于健康组，而PS则在健康人中间的含量则要高于肾病组患者。
表15 临床患者IgA肾病组的磷脂含量变化
Class Health组 IgA组 P vaule Fold change
PC 3.96E-01 1.81E+00 0.00 4.57
LPC 5.24E-02 1.93E-01 0.00 3.68
PS 2.88E-01 1.25E-01 0.00 0.43
SM 2.03E-03 1.23E-02 0.00 6.05
表16 临床患者膜性肾病组的磷脂变化
Class Health组 MN组 P vaule Fold change
PC 8.51E-02 6.22E-01 0.05 7.31
LPC 6.93E-01 1.39E+00 0.03 2.00
PS 2.88E-01 1.42E-01 0.05 0.49
SM 2.03E-03 1.69E-02 0.01 8.34
如图19所示为6个共同的生物标志物按照类别进行加合，在3组间的含量变化图，可以发现LPC在膜性肾病中组的含量要远远多于IgA肾病。而其余类别的磷脂两者含量无显著差异。图20所示为4类磷脂在3组间的相对含量。
实施例3 基于庆大霉素诱导的Wistar大鼠肾脏损伤与尿液磷脂分布相关性研究
3.1 实验材料、软件
实验试剂、仪器、软件分析等同实施例1。
3.2 Wistar尿液样本基本信息
用庆大霉素诱导Wistar大鼠急性肾脏损伤造模过程中，对造模0、3、7、12天的24小时尿液进行收集后，低速离心并分装编号后存入-80℃的冰箱中，待所有样本都收齐后统一进行尿液进样预处理。
急性肾损伤的Wistar大鼠造模实验共采集到尿液样本21份，其中空白组7份，模型组14份。样本例数的信息如表17所示。
表17 大鼠尿样例数信息
Figure 964438DEST_PATH_IMAGE009
注：- 表示无
3.3 大鼠尿液样本进样方案
准备进样前，将已用封口膜封装的EP管从冰箱中取出，解冻至室温。将解冻至室温的样本用200 微升初始流动相A复溶（异丙醇/甲醇/水（5:1:4，v/v/v）+0.2%甲酸和0.028%氨水），过程中需涡旋200 s使充分复溶，在4℃下1000×g离心5 min，转移200 微升至棕色进样小瓶中的内插管，并排尽管内气泡准备进样。
研究前期发现尿液样本中磷脂的稳定性在12小时、6小时内稳定性最好，但本实验有21个尿液样本，且每个样本需进行正、负两个模式的质谱扫描，每个样品进样至少需要2小时，因此，21个样本采用连续进样的方式，并每隔3个样本加入一个质控样本。进样前1小时将目标样本从冰箱拿出准备复溶进样，这样有效保证了样本在进样过程中的稳定性。样本进样顺序如表18所示。
表18 21份尿液连续进样顺序
Figure 223381DEST_PATH_IMAGE010
注：Q表示标准品混合样，C0-1表示空白组第0天标号为1的小鼠尿液，A0-3表示造模1组第0天标号为3的小鼠尿液，B0-5表示造模组2第0天标号为5的小鼠尿液，以此类推。
样本连续进样过程中一直记录柱压与温度，以监测系统稳定性，确保实验过程顺利，结果可靠。
3.4 目标磷脂化合物的初筛结果
本发明建立了目前研究相关的磷脂化合物数据库，共有磷脂782个，其中正离子扫描模式47个，负离子扫面模式735个。但考虑Q Trap 5500的检测能力有限，不能同时扫描过多的MRM通道，且为使研究集中于那些含量较高、模型组和健康组差异更大的目标磷脂化合物，使得研究的检测效率更高，检测结果也更准确，因此考虑进行磷脂数据库的初步筛选。方法如下：在正式进样前，需要将磷脂化合物进行初步筛选。首先，将所有6只造模实验小鼠的0、3、7、12天的尿液均取400 微升混合，涡旋200 s后形成混合样，取400 微升进行前处理后进样进行筛选。其次，设置空白对照样：空白A、B、C三组用超纯水400 微升并按照样本前处理方式进行，空白D组用超纯水但不进行样本前处理的步骤，空白E组用流动相A，将上述空白对照5组进样进行磷脂化合物的初步筛选。
磷脂化合物的初步筛选标准：（1）在混合样本中信噪比都小于2.5甚至都没有响应的MRM通道应舍去；（2）混合样本中通道信号无峰、峰强度低于1000的应舍去；（3）保留时间与标准品差异较大的通道应舍去；（4）空白对照样品中峰强度大于1000的通道应舍去。
经混合样本和空白对照样初步筛选后，共筛选出目标磷脂化合物166个，其中正离子扫描模式26个，负离子扫面模式140个。
3.5 正式进样后的潜在生物标志物的确定
分别于正离子模式、负离子模式下连续测定21份大鼠尿液样本，可以得到总离子流图（TIC）和提取离子流图（XIC），根据TIC可以看出尿液样本中待测物质的整体轮廓，以MRM+、MRM-模式下空白组、造模组混合样本的TIC为例（图21-26），可以大致看出不同造模组间的磷脂轮廓差别。所有的目标磷脂化合物都集中在5-25 min出峰，大致位置可参考各类磷脂标准品，但由于磷脂的脂肪酸链长度和不饱和度的不同，保留时间差异会比较大。通常，不饱和度一定的情况下磷脂的碳链越长，极性越小，保留时间越长；碳链长度一定的情况下，不饱和度越高，保留时间越短，这也是判断目标化合物位置的一种方式。
3.6 空白对照组与造模组对比
将空白对照组与造模组进行亚组比较分析，其中，空白对照组包含空白组编号1、2的2只大鼠造模第0、3、7、12天的数据，磷脂数据编号分别为C0-1，C0-2，C3-1，C3-2，C7-1，C7-2，C12-2（下标表示造模天数，数字代表小鼠编号，C代表空白对照组）；以及造模组1（80 mg/kg GM，用A表示）编号3、4和造模组2（140 mg/kg GM，用B表示）编号5、6的共4只大鼠造模0天时的数据，分别为A0-3，A0-4，B0-5，B0-6。造模组则为造模组1、造模组2的4只大鼠造模第3、7、12天的数据，磷脂数据编号分别为A3-3，A3-4，A7-3，A7-4，A12-4，B3-5，B3-6，B7-5，B7-6，B12-6。
3.6.1 多元数据统计分析
空白组共含有11个样本量信息，造模组含有10个样本量信息，将这两组数据原始信息整理形成矩阵并导入SIMCA 14.1中，作log10转换，并利用Pareto缩放（scaling）对所有数据平均中心化，进行多元统计分析（PCA、OPLS-DA）以筛查潜在的生物标志物。
正离子模式(MRM+)下，采用PCA考察21个尿液样本的分布情况，从得到的scoreplot（如图27）中可以看出，大部分的空白组与造模组之间有明显的分离（红色代表空白组，绿色代表造模组）。
利用OPLS-DA模型对预处理的数据集合进行分析可以增强空白组和造模组样本的分离效果，更好地识别两个组别中具有差异的磷脂化合物。通过OPLS-DA分析可以得到Score Scatter Plot图、S-Plot图、VIP图。
从Score Scatter Plot图可以看出，空白对照组与造模组分离效果很好，两组（蓝色为空白对照组，绿色为造模组）间的确存在明显的磷脂代谢差异。OPLS-DA-ScoreScatter Plot图如图28所示：
S-Plot可以很直观地看出在分类过程中贡献较大的关键化合物，这些化合物的点在图中越远离中心、靠近s曲线的两端，对分类的贡献越大。图29中以红色标示的磷脂化合物，正处于S线的远端，说明它们对空白对照组和造模组的分类贡献最大。
VIP图总结了化合物在分类中的贡献并以柱状图的形式表示出来。VIP值大于1.0则被认为是潜在的生物标志物。在空白组与造模组筛选时，MRM+模式下共有8种化合物的VIP>1.0，成为空白组与造模组之间差异显著的潜在的生物标志物，如图30中红色标出的部分。
负离子模式（MRM-）下，采用PCA考察21个尿液样本的分布情况，从得到的scoreplot（图31）中可以看出，大部分的空白组与造模组之间有明显的分离（红色代表空白组，绿色代表造模组）。
利用OPLS-DA模型对预处理的数据集合进行分析可以增强空白组和造模组样本的分离效果，更好地识别两个组别中具有差异的磷脂化合物。通过OPLS-DA分析可以得到Score Scatter Plot图、S-Plot图、VIP图。
从Score Scatter Plot图可以看出，空白对照组与造模组分离效果很好，两组（红色为空白对照组，绿色为造模组）间的确存在明显的磷脂代谢差异。OPLS-DA-ScoreScatter Plot如图32所示：
S-Plot可以很直观地看出在分类过程中贡献较大的关键化合物，这些化合物的点在图中越远离中心、靠近s曲线的两端，对分类的贡献越大。图33中以红色标示的磷脂化合物，正处于S线的远端，说明它们对空白对照组和造模组的分类贡献最大。
VIP图总结了化合物在分类中的贡献并以柱状图的形式表示出来。VIP值大于1.0则被认为是潜在的生物标志物。在空白组与造模组筛选时，MRM-模式下共有59种化合物的VIP>1.0，成为空白组与造模组之间差异显著的潜在的生物标志物，如图34中红色标示出所示。
3.6.2 潜在磷脂生物标志物的筛选
因磷脂矩阵中变量为磷脂化合物，数据量较大，将数据进行方差齐性检验后进行独立样本T检验，得到双侧P值，若P<0.05，则认为两组间的磷脂代谢具有显著性差异。同时，计算空白对照组与造模组每种磷脂的相对含量的比值，即倍数变化（Fold Change），若其大于2.0或小于0.5，则认为两组间差异比较大。
潜在生物标志物的选择需要综合P值、VIP值2个指标，故最终MRM+模式下筛选出的化合物为表19中的5个磷脂化合物；MRM-模式下筛选出的化合物为表20中的17个磷脂化合物。
表19 MRM+模式下大鼠空白组与造模组间的潜在磷脂标志物
Figure 10334DEST_PATH_IMAGE011
表20 MRM-模式下大鼠空白组与造模组间的潜在磷脂标志物
Figure 75242DEST_PATH_IMAGE012
再通过VIP>1.5和FD值大于2倍进一步筛选发现，相较于空白对照组，造模组在SM(38:1)、SM(40:3)、PC(30:1) FA 16:1、PE(36:1) FA 16:1、PG(34:1) FA 16:1、PC(28:0)FA 14:0 共6个磷脂化合物中出现了相对含量的显著上升，在PC(40:2) FA 18:0、PC(38:6)FA 22:6、PC(38:6) FA 18:2、PC(38:6) FA 16:0共4个磷脂化合物中有相对含量的显著下降。因此考虑可以将该10个化合物作为判断有无肾脏损伤时的潜在磷脂化合物。
实施例4 HK-2细胞源exosomes与庆大霉素诱导肾损伤的关联研究
4.1 实验材料与软件
实验试剂、仪器、分析软件等同实施例1。
4.2 Exosomes的磷脂谱及成分分析
HK-2细胞培养液经超速离心后得到exosomes。传统的超速离心法提取外泌体步骤繁琐、耗时长，但提取效率较高，速度梯度的设置可依次排除死细胞、细胞碎片以及亚细胞器的干扰，避免了其他细胞成分对磷脂成分分析的影响。
经HPLC-MS/MS分析磷脂组成，如图35所示。已知exosomes腔由脂质双分子层包围。由本实验结果可见，exosomes中磷脂的组成与亲缘细胞不同，后者富含鞘磷脂（SM）。当神经鞘磷脂（SM）在exosomes中表达升高时，磷脂酰胆碱（PC）表达下降。一般的，脂质决定了囊泡的硬度和生物流动性。
4.3 PCA分析结果
采用PCA考察12个HK-2细胞源exosomes样本（3个对照组，3 个低浓度组，3个中浓度组及 3 个高浓度组）的分布情况，对其磷脂含量进行分析，从得到的scores plot（图36）中可以看出，大部分的对照组和损伤组之间有明显的分离，但损伤组内间差异比较大。该PCA结果表示，与对照组相比，损伤组细胞的exosomes中出现了磷脂代谢的异常，进而造成磷脂组成的差异。
由图36（A）可知，庆大霉素诱导一天时，与对照组的磷脂含量很接近，但是到了第二天、第三天，从第一主成分上可以看到exosomes中的磷脂含量已经出现了很大的变化，与其它三组对照组明显的区分开来。由此可知HK-2细胞在庆大霉素诱导时磷脂代谢的确发生了重大的变化，此外随着培养时间的延长，HK-2细胞分泌的exosomes中的磷脂代谢也出现了一定变化，如图36（B）显示的高浓度下，庆大霉素分别作用一天、两天与三天的HK-2细胞源exosomes磷脂代谢谱情况。但是低浓度下的变化与这一趋势发生了一定程度的偏离，如图36（C），细胞可能对低浓度的刺激更为敏感，或者说低浓度下exosomes存在一定的保护或者代偿性的磷脂代谢调节。
具体以诱导两天的四组数据为例，如图36（D）可以看出低浓度组与对照组之间的距离最远，而PCA图中，两样本点之间的距离长短就代表差异大小，即，与对照组相比，低浓度组的差异最大，而中等浓度与高浓度组，虽然与对照组之间也存在差异，但从差异程度上来说，似乎有减小的趋势。这与图A对于结果的解读一致，exosomes可能是细胞对低浓度庆大霉素刺激而进行的磷脂代偿调节载体，用以减缓细胞的快速损伤，使得细胞存活率虽然下降，但剩余具有功能的细胞更加接近对照组细胞。但即使这种“修复”现象可能存在，对照组与高浓度损伤组之间仍然存在可区分的差异。
图37为 PCA 分析的 loading 图，可以看出，除了 Lyso-PC 和 PC，其它的磷脂是聚集在一起的，并且值得注意的是，这两种磷脂都不是其中一种或几种发生变化，而是集体出现了改变，从而表现出两个明显的生物标志物群。
4.4 OPLS-DA分析结果
OPLS-DA是一种成熟的有监督的聚类分析方法，在分类上比PCA更有优势。本发明中，利用此方法对预处理的色谱数据集合进行分析可以增强损伤组和对照组的分离效果。利用软件构建了一个OPLS-DA模型用于识别损伤组和对照组的exosomes中具有差异的磷脂化合物。
在脂质组学研究中，通常X矩阵中变量数比样本数更多，使得OPLS-DA模型的预测能力被高估，模型过拟合（overfitting），此时需要再进行置换检验（permutation test），以判断模型是否存在过拟合。置换检验结果显示：R2=0.272<0.3，Q2=-0.491<0.05，说明此OPLS-DA模型不存在过拟合。
通过OPLS-DA分析得到了检验图、score图、loading图、VIP图和s-plot，分别如图38A-图38E所示。从score图可以看出，损伤组与对照组分离效果很好，两组间的确存在明显的磷脂代谢差异。
loading图中可以看出，对于每一个目标磷脂化合物，损伤组与对照组哪一组含量更高。横轴上方的磷脂化合物都是损伤组含量更高，反之，横轴下方的磷脂化合物都是对照组含量更高，且代表磷脂化合物的柱子越高，两组间的差异就越大。大部分目标磷脂化合物都在损伤组含量更高。
4.6 潜在标志物的确定
VIP图总结了化合物在分类中的贡献并以柱状图的形式表示出来。VIP值大于1.5则被认为是潜在的生物标志物。共有15种化合物的VIP>1.0，成为药源性肾损伤潜在的生物标志物。s-plot可以很直观地看出在分类过程中贡献较大的关键化合物，这些化合物的点在图中越远离中心、靠近s曲线的两端，对分类的贡献越大。在图38E中以红色标示上述15种磷脂化合物（表21），正处于S线的远端，说明它们对损伤组与对照组的分类贡献最大。
越来越多的磷脂代谢异常研究发现与肾脏疾病相关，但以血液中的研究发现居多，尿液的研究较少。庆大霉素的肾毒性早已得到广泛关注，传统的肾毒性评价研究主要通过动物实验进行。药物引起人或动物产生毒性损伤，最终是在细胞水平上发挥作用。肾近曲小管是肾脏毒性最常见的损伤部位。在细胞、大鼠尿液以及肾脏损伤患者中，标志肾脏损伤的潜在磷脂化合物的分类是基本相同的，为PE、PG、PS、PC、SM这5大类，但考虑样品来源不同，因此在磷脂的亚类（species）分布上会有差异。这些潜在磷脂标志物的变化趋势反映出了急性肾损伤HK-2细胞、大鼠尿液、肾脏损伤患者磷脂代谢的异常情况，本发明还证实了尿液磷脂组学是研究肾脏损伤生物标志物的可行手段，可以进一步探索成为无创肾脏损伤早期筛查的指标，促进了疾病的早期诊断、分期、治疗效果动态监测等临床实际应用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.基于尿液磷脂组学的肾损伤早期诊断标志物，其特征在于，当受试对象为人时，所述标志物为PC(16:0-22:4)、LPC(20:4)、PC(16:0-20:4)、PC(22:4-18:2)、PC(18:0-20:4)、PC(16:0-20:2)、PC(16:0-18:2)、PC(20:4-18:2)、PC(18:0-18:2)、SM(36:3)、LPC(18:0)、PS(18:1-20:0)、PC(18:0-20:3)和LPC(18:1)；
当受试对象为鼠时，所述标志物为SM(38:1)、SM(40:3)、PC(30:1) FA 16:1、PE(36:1)FA 16:1、PG(34:1) FA 16:1、PC(28:0) FA 14:0、PC(40:2) FA 18:0、PC(38:6) FA 22:6、PC(38:6) FA 18:2和PC(38:6) FA 16:0；
所述标志物为尿液标志物。
2.用于预测或早期诊断IgA肾病的生物标志物，其特征在于，所述标志物为PC(16:0-22:4)、LPC(20:4)、PC(16:0-20:4)、PC(22:4-18:2)、PC(18:0-20:4)、PC(16:0-20:2)、PC(16:0-18:2)、PC(20:4-18:2)、PC(18:0-18:2)、SM(36:3)、LPC(18:0)和PS(18:1-20:0)；
所述标志物为尿液标志物。
3.用于预测或早期诊断膜性肾病的生物标志物，其特征在于，所述标志物为PC(16:0-22:4)、PC(16:0-20:4)、LPC(20:4)、LPC(18:0)、PC(20:4-18:2)、SM(36:3)、PC(18:0-20:3)、LPC(18:1)和PS(18:1-20:0)；
所述标志物为尿液标志物。
4.基于磷脂组学的肾损伤早期诊断标志物，其特征在于，当受试对象为HK-2细胞时，所述标志物为PC(16:0-22:2)、PC(16:0-18:2)、PC(16:0-22:5)、PC(18:0-20:5)、PC(18:1-20:5)、PC(18:2/18:2)、PC(18:2-20:1)、PE(16:0-22:3)、PS(20:3-20:3)、PS(18:0-22:4)、PG(18:0-20:4)、PC(16:0-16:1)、PC(16:0-18:1)、SM(42:2)和SM(40:4)。
5.权利要求1-4任一项所述标志物在制备或筛选肾损伤药物或组合物方面的应用，其中所述药物或组合物靶向所述标志物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肾损伤包括药源性肾损伤。
7.检测权利要求1-4任一项所述标志物的试剂在制备肾损伤预测或早期诊断的检测试剂或试剂盒中的应用。
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