CN104280478A

CN104280478A - 内源性小分子物质在快速检测肾毒性方面的应用

Info

Publication number: CN104280478A
Application number: CN201410607906.XA
Authority: CN
Inventors: 李遇伯; 张艳军; 邓皓月
Original assignee: Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2014-11-03
Filing date: 2014-11-03
Publication date: 2015-01-14
Anticipated expiration: 2034-11-03
Also published as: CN104280478B

Abstract

本发明公开了基于代谢组学的内源性小分子物质在快速检测肾毒性方面的应用。其中内源性小分子物质指7个肾毒性生物标记物肌酸酐、花生四烯酸以及溶血磷脂酰胆碱类[溶血磷脂酰胆碱(16:1)、溶血磷脂酰胆碱(20:5)、溶血磷脂酰胆碱(20:3)、溶血磷脂酰胆碱(20:2)、溶血磷脂酰胆碱(22:5)]；同时也指3个肾毒性专属生物标记物溶血磷脂酰胆碱(20:3)、溶血磷脂酰胆碱(20:2)和溶血磷脂酰胆碱(22:5)。本发明筛选得到的肾毒性生物标记物能够比生化指标更加快速、灵敏地判断肾脏是否受到损伤，有效地弥补临床肾功能生化评价指标缺乏灵敏性的不足，使肾毒性以及肾脏疾病的诊断更加灵敏、可靠。

Description

内源性小分子物质在快速检测肾毒性方面的应用

技术领域

本发明涉及到使用代谢组学技术寻找肾毒性生物标记物，然后对其进行专属性考察，接着使用支持向量机（SVM）对它们进行验证与优化。更具体地说是内源性小分子物质在快速检测肾毒性以及肾脏疾病方面的应用。

背景技术

近年来，药物安全性问题受到人们极大的关注。由于肾脏是机体主要的排泄器官，因此它特别容易受到药物的影响，从而导致药物肾毒性在临床中较为常见。血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）是临床常用的肾功能评价指标，然而其在临床检测中缺乏灵敏性，不利于肾毒性的检测和诊断。因此，我们亟需寻找灵敏、专属、高效的药物肾毒性评价指标。随着研究的不断深入，代谢组学技术被广泛应用于药物毒性评价。它是系统生物学的重要组成部分，运用现代检测技术考察生物体系受外界刺激所引起的内源性小分子物质变化状况及其变化规律。目前，核磁共振（¹H-NMR），气相色谱-质谱仪（GC-MS）和液相色谱-质谱（LC-MS）是代谢组学常用的分析技术，其中LC-MS由于高灵敏度、宽的动态范围、良好的分离能力，被越来越广泛的应用于代谢组学研究。随着技术的不断进步，超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UPLC/Q-TOF-MS）分析技术为无靶向代谢组学在繁杂的内源性物质中筛选标记物并且鉴定其结构提供了可靠的技术平台，因此它彰显出越来越大的优势。为了更好的发掘数据中包含的潜在信息，SVM已经逐渐发挥出其独特的优势。目前，SVM在人脸识别、图像处理、疾病诊断等领域中占据越来越重要的地位。SVM作为一种智能模式识别技术，它以VC维理论为基础，根据样本信息找到能够区分两类别的最优线性分界面，可以有效地解决二分类问题。因此，可以通过SVM特征选择和分类预测的特性，为代谢组学中相关生物标记物的研究提供可靠的数据分析技术，进一步为代谢组学的应用提供更加广阔的空间。

发明内容

本发明通过代谢组学技术与SVM相结合发现肾毒性生物标记物，排除了非专属物质的干扰来达到灵敏、准确的要求，可以有效地弥补临床肾功能生化评价指标缺乏灵敏性的不足，使肾毒性以及肾脏疾病的诊断更加灵敏、可靠。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术方案：

内源性小分子物质在快速检测肾毒性方面的应用，特别是在快速判断肾脏是否受到损伤方面的应用。其中所述的内源性小分子物质指肾毒性生物标记物，它们是基于代谢组学技术筛选出来的，包括肌酸酐、花生四烯酸以及溶血磷脂酰胆碱类[溶血磷脂酰胆碱(16:1)[LPC(16:1)]、溶血磷脂酰胆碱(20:5)[LPC(20:5)]、溶血磷脂酰胆碱(20:3)[LPC(20:3)]、溶血磷脂酰胆碱(20:2)[LPC(20:2)]、溶血磷脂酰胆碱(22:5)[LPC(22:5)]]，它们能够快速检测肾毒性。在肾毒性生物标记物的基础上经过SVM验证与优化的内源性小分子物质指肾毒性专属生物标记物，包括溶血磷脂酰胆碱(20:3)[LPC(20:3)]、溶血磷脂酰胆碱(20:2)[LPC(20:2)]、溶血磷脂酰胆碱(22:5)[LPC(22:5)]，它们能够快速判断肾脏是否受到损伤。

本发明进一步公开了基于代谢组学技术结合SVM的肾毒性生物标志物的筛选方法，包括样品前处理、数据采集、数据处理（多元统计分析）、生物标记物的专属性考察、专属生物标记物的验证与优化等步骤。其特征在于：在数据采集中使用梯度洗脱的条件：0-0.5 min，A: 99%-99%；0.5-2 min，A: 99%-50%；2-9 min，A: 50%-1%；9-10 min，A: 1%-1%；10-10.5 min，A: 1%-99%；10.5-12 min，A: 99%-99%，其中流动相A指0.1％甲酸的水，流动相B指0.1％甲酸的乙腈；在专属生物标记物的验证与优化中使用MATLAB R2010a软件（USA）基于肾毒性生物标记物建立SVM预测模型，该过程如下：将生物标记物在生理盐水组和各个药物组中的峰面积作为输入变量，随机选择数据作为训练集和测试集建立预测模型，通过优化找到最优的惩罚参数（c）和核函数（g），然后以逐一排除一个生物标志物为基础，利用SVM进行分类预测，得到相应的模型预测准确度，分析准确度，对其是否与肾毒性密切相关进行区分。

我们经过代谢组学技术筛选出肾毒性生物标记物，具体是肌酸酐、花生四烯酸、溶血磷脂酰胆碱(16:1)[LPC(16:1)]、溶血磷脂酰胆碱(20:5)[LPC(20:5)]、溶血磷脂酰胆碱(20:3)[LPC(20:3)]、溶血磷脂酰胆碱(20:2)[LPC(20:2)]、溶血磷脂酰胆碱(22:5)[LPC(22:5)]。肾毒性生物标记物经过专属性考察、验证与和优化后得到肾毒性专属生物标记物，具体是溶血磷脂酰胆碱(20:3)[LPC(20:3)]、溶血磷脂酰胆碱(20:2)[LPC(20:2)]、溶血磷脂酰胆碱(22:5)[LPC(22:5)]。

本发明更加详细的技术方案如下：

1、样品前处理：样品处理前将血浆在室温下解冻。然后，将300μL乙腈加入到100μL血浆中，并涡旋混合1分钟。接着将混合物在冰水浴中超声10分钟，然后以13000转在4℃下离心15分钟。收集上清液用于UPLC/Q-TOF-MS分析。

2、数据采集：使用UPLC/Q-TOF-MS系统（美国Waters公司）对大鼠血浆样品进行信息采集。色谱柱用ACQUITY UPLC HSS C₁₈（2.1×100 mm，1.7μm，美国Waters公司），柱温为40℃，流速为0.3mL/min，进样量为5μL。UPLC分离系统包括二元溶剂系统，用流动相A（0.1％甲酸的水）和流动相B（0.1％甲酸的乙腈）。采用梯度洗脱，具体洗脱条件：0-0.5 min，A: 99%-99%；0.5-2 min，A: 99%-50%；2-9 min，A: 50%-1%；9-10 min，A: 1%-1%；10-10.5 min，A: 1%-99%；10.5-12 min，A: 99%-99%。质谱采用电喷雾电离（ESI）源，在正离子电离模式下进行质谱分析。MS参数如下：干燥气流速为10mL/min，干燥气体温度为325℃，雾化气气压为350 psi，脱溶剂气流量600L/h，毛细管电离电压3.5 kV，四极杆扫描范围m/z50-1000。蒸发气体和辅助气体是高纯度氮。用（[M+H]⁺= 556.2771, [M-H]^-= 554.26）作为参考离子来确保光谱采集过程中的精度。为了确保代谢组学数据采集的可靠性，我们从每个样品中吸取等量的血浆混合成为QC样品，用它们对仪器的稳定性、方法精密度进行监控，直到整个系统在一个良好稳定的状态下才能开始样品信息采集。同时在24小时之内，QC样品每4个小时检测一次，用来监测整个采集过程中样品与系统的稳定性。

3、数据处理：数据分析过程如下：我们使用MarkerLynx V4.1（美国Waters公司）将肾毒性三个药物组的原始信息分别进行处理转化为Excel格式。然后分别将其导入SIMCA-P +11.5软件（Umetrics，瑞典）进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA），选择VIP>1的物质作为候选代谢产物。接着分别用SPSS17.0它们进行t检验，将p<0.05的物质作为候选代谢物进行下一步的筛选与分析。我们将三个肾毒性药物组各自的候选代谢物进行整合化分析（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），筛选出它们共同的代谢物。然后，通过HMDB（http://www.hmdb.ca/）数据库中检索得到潜在生物标志物。最后，通过比较标准品和样品之间的指纹图谱来鉴定物质。如果没有标准品，我们分析它们的MS/MS信息来识别它们。我们鉴定得到的物质认为是肾毒性共同生物标记物。然后，我们用它们的m/z值在非肾毒性药物组中筛选代谢组数据。然后进行t检验和含量变化等分析，初步确定肾毒性专属生物标志物。接下来，我们使用MATLAB R2010a软件（USA）基于这些初步的肾毒性专属生物标记物建立SVM预测模型。该过程如下：将生物标记物的峰面积作为输入变量，随机选择数据作为训练集和测试集建立预测模型，通过优化找到最优的惩罚参数（c）和核函数（g）。然后，我们以逐一排除一个生物标志物为基础，利用SVM进行分类预测，得到相应的模型预测准确度。分析准确度，对其是否与肾毒性密切相关进行区分。

本发明具有的有益效果在于：

临床中用Scr和BUN作为肾损伤的检测指标，但是它们常在肾脏组织出现明显病理性损伤之后才会发生显著性变化，表明用生化指标来诊断肾损伤具有延后性。因此，及时发现、预防、治疗肾损伤就显得十分重要。首先，通过本发明发现的肾毒性生物标记物能够比生化指标更加快速、灵敏地判断肾脏是否受到损伤，有助于我们对肾损伤进行及时地预防和治疗。其次，它们能从代谢水平上揭示药物对体内内源性物质代谢的影响情况，并且从它们所涉及的生物学意义为切入点解释药物肾毒性的发生机制。最后，关于相关毒性的专属生物标记物的发现，为建立一套基于代谢组学技术的药物毒性评价方法有着推动作用，同时也为疾病诊断提供一条新的思路。

附图说明：

图1：整个实验的总体流程图；

图2：肾毒性各药物组多元统计分析的PLS-DA得分图；

图3：用维恩图显示整合化分析筛选得到28个肾毒性共同代谢物；

图4：鉴定得到的7个肾毒性共同生物标记物；

图5：支持向量机模型的预测准确率，其中：

图6：3个肾毒性专属生物标记物在肾毒性组和非肾毒性组中的PLS-DA模型得分图；

图7：各个组的肾毒性生化指标Scr和BUN含量变化。

具体实施方式：

下面结合说明书和具体实施方式对做进一步说明。整个实验的总体流程图见图1。但本实施例并不用于限制本发明，凡是采用本发明的相似变化，均应列入本发明的保护范围。本发明所用到的试剂、药品均有市售。

实施例1

1、试剂：乙腈购自Oceanpak（瑞典哥德堡），甲酸购自ROE（美国），均为分析纯。纯净水购自娃哈哈公司（中国杭州）。生理盐水购自齐都药业有限公司（中国山东）。庆大霉素，依替米星，硫代乙酰胺，异丙肾上腺素，5-氟尿嘧啶，柴胡和四氯化碳购自士兰科技有限公司（中国天津），分别用生理盐水溶解。

2、动物实验：动物实验在中国医学科学院生物医学工程研究所（中国天津）进行。80只雄性Wistar大鼠（200±20克）保持在SPF级实验室。大鼠购入后置12小时昼夜更替，环境温度为25±1℃，环境湿度为50±5％的控制环境条件下饲养。经过一周的适应后，将大鼠随机分为8组，分别为生理盐水组、庆大霉素组、依替米星组、硫代乙酰胺组、异丙肾上腺素组、5-氟尿嘧啶组、柴胡组和四氯化碳组。

3、样品收集：样品收集之前，所有动物禁食12小时。大鼠轻微麻醉后从腹主动脉搜集血液。一部分血样置肝素化试管中，3500转离心15 分钟，分离血浆，置-80℃冰箱中储存，用于代谢组学研究。另一部分血样置于普通炮弹管中，500转离心15 分钟，分离血清，置-80℃冰箱中储存，用于临床生化检测。

4、我们将上述血浆样品按照本发明的技术方案进行分析研究。首先基于SIMCA-P +11.5软件采用PLS-DA模型对肾毒性三个组分别进行优化，它们的PLS-DA得分图见图2；然后分别挑取VIP>1的物质进行T检验，筛选P<0.05的物质作为显著性变化的代谢物。其中在庆大霉素组中找到252个，依替米星组有295个，硫代乙酰胺组有341个。接下来将它们进行整合分析，筛选得到28个肾毒性共同代谢物。用维恩图谱清楚、直观地显示它们之间的关系，见图3。接着对它们进行物质鉴定，确定了7个物质（见图4），初步认为是肾毒性共同生物标记物，其中LPC(16:1)的含量升高，肌酸酐、花生四烯酸、LPC(20:5)、LPC(20:3)、LPC(20:2)、LPC(22:5)这6个物质的含量均有不同程度的下降。然后将这7个物质在非肾毒性组中进行专属性考察，筛选得到LPC(20:5)、LPC(20:3)、LPC(20:2)、LPC(22:5)。接着我们将这4个标记物的代谢组学数据从每个给药组中调出。在这些数据中以35个作为训练集、以18个作为测试集建立模型，预测准确率为83.33%。然后，逐一删除这4个标记物，可得到相应的模型准确率，见图5。基于上述不同的SVM预测模型，我们认为肾毒性专属生物标记物可能是LPC(20:3)、LPC(20:2)、LPC(22:5)。最后，我们在生理盐水组、肾毒性组和非肾毒性组中基于这3个物质建立PLS-DA模型，见图6，结果显示这三个物质的肾毒性组与非肾毒性组分布在不同区域，表明它们具有一定的专属性。

5、我们筛选出的3个肾毒性专属生物标记物[LPC(20:3)、LPC(20:2)、LPC(22:5)]的生物学意义：本发明找到的3个肾毒性专属生物标记物能够从代谢水平上解释药物引起肾毒性的机制。首先，溶血磷脂酰胆碱（LPC）属于磷脂酰胆碱类（PC），PC在磷脂酶A2的作用下形成LPC。其次，PC不仅可以清除过氧化物，也是机体内甘油的直接供给者，所以可以说LPC是甘油磷脂类的代谢产物。然后，当肾脏受到肾毒性药物刺激时，体内的活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）大量生成，使体内氧化应激水平升高。所以此时我们推测机体可能需要PC清除氧化物以求达到正常的氧化应激水平，从而使甘油磷脂类代谢受到影响，导致LPC含量下降。这正好与我们得到的结果一致，即肾毒性引起LPC类物质含量下降。

实施例2

实施例3

实际应用：

我们将收集起来的血清在室温下解冻，用于检测血清中的血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）。结果显示肾毒性药物组的两个指标与空白组相比都有升高的趋势，而非肾毒性组的Scr基本保持不变，个别组的BUN有升高的趋势，见图7。由于BUN也受肾脏以外的因素影响，只有Scr和BUN的含量同时显著性升高的情况下才能说明肾已经受到损害，并且才能被临床诊断。相比较之下，我们通过代谢组学结合SVM发现的肾毒性专属生物标记物已经表现出显著的差异。因此，它们能够比生化指标更加快速、灵敏地判断肾脏是否受到损伤，有助于我们对肾损伤进行及时地预防和治疗。

具体的数据比较如下：

--：表示含量未见显著性变化 ↓*：表示含量显著下降 ↑*：表示含量显著上升

结论：

本发明通过代谢组学的方法发现肾毒性生物标记物。首先我们采用UPLC/Q-TOF-MS采集大鼠血浆样品信息，然后经过多元统计分析、肾毒性给组的整合化分析发现28个肾毒性共同碎片离子。然后进过物质鉴定获得7个肾毒性共同生物标记物。随后结合非肾毒性组的代谢组学信息进行专属性考察，初步确定了4个肾毒性专属生物标记物。最后借助于SVM模式识别的方法，对4个生物标记物进行验证和优化，最终找到其中3个作为专属的肾毒性生物标记物，其SVM模型预测率为83.33%。本发明发现的肾毒性专属生物标记物能够比生化指标更加快速、灵敏地判断肾脏是否受到损伤，有助于我们对肾损伤进行及时地预防和治疗。

Claims

1.内源性小分子物质在快速检测肾毒性方面的应用；其中所述的内源性小分子物质指7个肾毒性生物标记物，它们是基于代谢组学技术筛选出来的，包括肌酸酐、花生四烯酸以及溶血磷脂酰胆碱类[溶血磷脂酰胆碱(16:1)[LPC(16:1)]、溶血磷脂酰胆碱(20:5)[LPC(20:5)]、溶血磷脂酰胆碱(20:3)[LPC(20:3)]、溶血磷脂酰胆碱(20:2)[LPC(20:2)]、溶血磷脂酰胆碱(22:5)[LPC(22:5)]]。

2.内源性小分子物质在快速判断肾脏是否受到损伤方面的应用；其中所述的内源性小分子物质指的是3个肾毒性专属生物标记物，它们是在肾毒性生物标记物的基础上经过专属性考察和SVM验证与与优化筛选出来的，包括溶血磷脂酰胆碱(20:3)[LPC(20:3)]、溶血磷脂酰胆碱(20:2)[LPC(20:2)]、溶血磷脂酰胆碱(22:5)[LPC(22:5)]。

3.权利要求1-2任一项所述的应用，其中基于代谢组学技术结合SVM的肾毒性生物标志物的筛选方法，包括样品前处理、数据采集、数据处理（多元统计分析）、生物标记物的专属性考察、专属生物标记物的验证与优化步骤；其特征在于：在数据采集中使用梯度洗脱的条件：0-0.5 min，A: 99%-99%；0.5-2 min，A: 99%-50%；2-9 min，A: 50%-1%；9-10 min，A: 1%-1%；10-10.5 min，A: 1%-99%；10.5-12 min，A: 99%-99%，其中流动相A指0.1％甲酸的水，流动相B指0.1％甲酸的乙腈；在专属生物标记物的验证与优化中使用MATLAB R2010a软件（USA）基于肾毒性生物标记物建立SVM预测模型，该过程如下：将生物标记物在生理盐水组和各个药物组中的峰面积作为输入变量，随机选择数据作为训练集和测试集建立预测模型，通过优化找到最优的惩罚参数（c）和核函数（g），然后以逐一排除一个生物标志物为基础，利用SVM进行分类预测，得到相应的模型预测准确度，分析准确度，对其是否与肾毒性密切相关进行区分。