CN114137193A - 一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种评估冠状动脉疾病的试剂盒，该试剂盒包括：用于检测受试对象的样品中的神经酰胺类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6浓度的检测试剂。本发明的试剂盒能够高效、准确用于冠状动脉疾病诊断、危险分层、病情监测和疗效评价，且灵敏度和特异性较好，能够满足冠状动脉疾病的临床诊断和治疗的需求。

Description

一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，特别涉及一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒及其应用。
背景技术
鉴于冠状动脉疾病的高发病率和高死亡率，预防冠状动脉患者的致命性和非致命性心肌梗死，仍然是临床上的挑战。每年稳定性冠状动脉患者的死亡率在1-3％之间，非致命性发病率在1-2％之间。在急性病症存活的急性冠状动脉综合征患者中，心肌梗死的死亡率明显升高(尤其在第一年内)。然而发病风险在各个病人中非常不同，这就需要有效的诊断、危险分层、病情监测和疗效评价的工具来提高病人的识别和管理。
冠状动脉疾病标志物是动脉粥样硬化发生发展过程中增加或减少的生物活性物质，可用于冠状动脉疾病的诊断、危险分层、病情监测和疗效评价。它会对冠状动脉疾病的临床治疗带来巨大的影响，因此为了满足冠状动脉疾病的临床诊断和治疗的需求，高效、准确的标志物的研发亟待加速。
目前用于冠状动脉疾病诊断、危险分层、病情监测和疗效评价的标志物，大多由于缺乏灵敏度和特异性而不能为临床医生提供更多的参考价值。例如，血清中的总胆固醇(TC) 和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)与动脉粥样硬化相关联，其被长期用来进行心血管疾病的诊断、危险分层和预后。但是，这些传统的危险分子的测定不能识别出很大一部分具有高风险心血管疾病的病人。因此，除了低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)这些传统的危险分子，急需寻找一种更准确的、更具预测性的危险因子。神经酰胺是由鞘氨醇和脂肪酸组成，主要通过鞘磷脂酶通路产生，鞘磷脂酶分解鞘细胞膜上的磷脂并释放神经酰胺。同时神经酰胺可以通过新合成通路由六种脂酰选择性神经酰胺合成酶利用简单分子合成。不同的神经酰胺类分子具有特定的生理功能。几个关键的细胞因子(如肿瘤坏死因子和白介素)可以诱导炎性反应(如动脉粥样硬化和缺血再灌流损伤)，而神经酰胺水平在这些炎性反应中升高。一些心血管危险因子和标志物(如氧化的低密度脂蛋白和同型半胱氨酸)可以增加神经酰胺的产生。另外，神经酰胺作为信号分子参与调控许多细胞反应和功能，包括分化、增值、细胞凋亡、活性氧产生和基因表达，这些作用直接参与心血管疾病的分子机制。
磷脂酰胆碱是属于磷脂类物质，磷脂具有维持细胞膜完整性和功能性的作用，研究表明磷脂类物质可能在心脑血管疾病进程中发挥重要作用。
已有大量的分析方法来测量神经酰胺和磷脂酰胆碱类化合物，包括薄层色谱法、常液相色谱法、免疫化学方法、气相色谱法和串联质谱法。然而，大部分的方法都是为研究工作而非临床使用而设计的，这些方法的共同缺点是它们在分子种类水平上无法对神经酰胺进行分析，并缺乏选择性、通量低、精确度和准确性低，因此不能满足临床实验室的要求。同样不能利用传统的免疫实验方法来特异性检测神经酰胺和磷脂酰胆碱类化合物，只能识别一类神经酰胺分子，它们只在脂肪酸链长度上有所不同。因此，现有抗体的低选择性阻碍了临床有效免疫测定方法的发展(Krishnamurthy,K.,Dasgupta,S.&Bieberich,E.Development and characterization of a novel anti-ceramide antibody.J LipidRes 48,968-975, doi:10.1194/jlr.D600043-JLR200(2007).)。
发明内容
本发明基于磷脂类物质与动脉粥样硬化的发生和发展密切相关，并与心血管死亡显著相关的发现，将心血管死亡风险相关的神经酰胺类化合物Cer(d18:1/16:0)、 Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物 PC aa C38:6的浓度，Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、 Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)比值以及Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6、 Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0浓度比值用于冠状动脉疾病患病风险、急性冠脉综合征的诊断、以及确诊患者的危险分层、病情监测、疗效评价及候选药物疗效评价。
本发明的目的之一在于提供用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度及浓度比值的试剂在制备用于确定可能或潜在患病受试对象是否具有罹患冠状动脉疾病风险的试剂盒中的应用。
本发明的目的之二在于提供用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度比值的试剂在制备用于确定可能或潜在患病受试对象是否罹患急性冠脉综合征的试剂盒中的应用。
本发明的目的之三在于提供用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度及浓度比值的试剂在制备用于对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价的试剂盒中的应用。
本发明的目的之四在于提供一种评估冠状动脉疾病的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
冠状动脉疾病标志物包括神经酰胺类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、 Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物 PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6，通过测定神经酰胺和磷脂酰胆碱化合物的浓度，并经过浓度比值换算，确定受试对象是否罹患疾病、患病风险以及确诊患者的疗效评价和危险分层。
所述浓度是指Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、 Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物PC aa C38:6的浓度。所述浓度比值是指 Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)比值以及Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6、Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0浓度比值。
本文所称的冠状动脉疾病为冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、急性非ST段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死、急性心肌梗死、缺血性心脏病中的一种或多种。急性冠脉综合征是指不稳定性心绞痛、急性非ST段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死中的一种。
用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度及浓度比值的试剂在制备确定受试对象是否具有罹患冠状动脉疾病的试剂盒中的应用，所述冠状动脉疾病标志物包括神经酰胺类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、 Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6，所述浓度是指Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、 Cer(d18:1/24:1)、PC aa C38:6的浓度，所述浓度比值是指Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)比值以及 Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6、Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0浓度比值；优选地，所述冠状动脉疾病为冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、急性非ST 段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死、急性心肌梗死、缺血性心脏病中的一种或多种。
用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物的浓度比值的试剂在制备用于确定各受试者是否罹患急性冠脉综合征的试剂盒中的应用，所述冠状动脉疾病标志物包括神经酰胺类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、 Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6，所述浓度比值是指Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、 Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)比值，优选地，急性冠脉综合征是指不稳定性心绞痛、急性非ST段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死中的一种。
用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度及浓度比值的试剂在制备用于对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价的试剂盒中的应用，所述冠状动脉疾病标志物包括神经酰胺类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、 Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物PC aa C36:6、PC aa C38:0、PCaa C38:6，所述浓度是指Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)、 PC aa C38:6的浓度，所述浓度比值是指Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、 Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)比值以及Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6、Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0浓度比值；优选地，所述冠状动脉疾病为冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、急性非ST段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死、急性心肌梗死、缺血性心脏病中的一种或多种。
在上述应用中，作为一种优选实施方式，确定所述来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度的方法为蛋白快速沉淀的方法和LC-MS/MS的方法；优选地，所述样品为血液、血浆或血清。
在上述应用中，作为一种优选实施方式，所述冠状动脉疾病标志物还包括非神经酰胺类化合物，所述非神经酰胺类化合物为总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、低密度脂蛋白颗粒数目(LDL-P)、致密的低密度脂蛋白(sdLDL)、载脂蛋白B(apoB)、脂蛋白a(LP(a))、脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、高密度脂蛋白颗粒数目(HDL-P)、致密的高密度脂蛋白(sdHDL)、载脂蛋白A1(apoA1)、C反应蛋白(CRP)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白T (cTnT)、肌钙蛋白I(cTnI)、肌钙蛋白C(cTnC)、肌红蛋白(Mb)中的一种或多种。
一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒，包括：
用于检测受试对象的样品中的神经酰胺类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物 PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6浓度的检测试剂。
作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括检测所述受试对象的样品中的非神经酰胺类化合物的浓度的试剂，所述非神经酰胺类化合物为总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、低密度脂蛋白颗粒数目(LDL-P)、致密的低密度脂蛋白(sdLDL)、载脂蛋白B(apoB)、脂蛋白a(LP(a))、脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、高密度脂蛋白颗粒数目(HDL-P)、致密的高密度脂蛋白(sdHDL)、载脂蛋白A1(apoA1)、C反应蛋白(CRP)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白T(cTnT)、肌钙蛋白I(cTnI)、肌钙蛋白C(cTnC)、肌红蛋白(Mb)中的一种或多种。
针对所述受试对象为可能或潜在患病受试对象，检测方法包括：
确定健康人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、 Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的 Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)比值的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的 Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6、Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0比值的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的PC aa C38:6浓度的50％分位值和75％分位值；
确定可能或潜在患病受试对象是否具有罹患冠状动脉疾病的风险的方法，其中所述方法具体如下：
将所述可能或潜在患病受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、 Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)、PC aa C38:6的浓度，Cer(d18:1/16:0)、 Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0) 比值以及Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6、Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0浓度比值，分别与健康人群样本总体的相应指标值进行比较、评分，根据分值范围对受试对象是否具有罹患冠状动脉疾病风险进行评价；
当所述九项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的50％分位值以下时加0分，当所述九项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述九项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的75％分位值以上时加2分，所述九项检测指标的总得分范围为0-18分；
在判断受试对象罹患冠状动脉疾病的风险时，当所述九项检测指标的总得分为0-4.5 分时，判断为低风险；当所述九项检测指标的总得分为4.5-9分时，判断为中等风险；当所述九项检测指标的总得分为9-13.5分时，判断为较高风险；当所述九项检测指标的总得分为13.5-18分时，判断为高风险；
确定可能或潜在患病受试对象是否罹患急性冠脉综合征的方法，其中所述方法具体如下：
将所述可能或潜在患病受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、 Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)比值，与阈值进行比较,对所述可能或潜在患病受试对象是否患有急性冠脉综合征疾病进行辅助诊断；当所述Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1) 总浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值超过所述阈值时，则判定受试对象患有急性冠脉综合征；
针对所述受试对象为正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象，检测方法包括：
确定标准人群样本总体的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、 Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的 Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)比值的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的 Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6、Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0比值的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的PC aa C38:6浓度的50％分位值和75％分位值；
对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价的方法，其中所述方法具体如下：
将所述正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、 Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)、PC aaC38:6的浓度， Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)比值以及Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6、Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0浓度比值，九项检测指标值与标准人群样本总体的相应指标值进行比较、评分，根据分值范围对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和 /或候选药物疗效评价，所述标准人群样本由健康人的样本和具有稳定性冠状动脉疾病的人的样本组成，其中所述健康人的样本占标准人群样本总数的50％；
当所述九项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的 50％分位值以下时加0分，当所述九项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述九项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的75％分位值以上时加2分，所述九项检测指标的总得分范围为0-18分；
对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层评价时，，当所述九项检测指标的总得分为0-4.5分时，判断为低风险；当所述九项检测指标的总得分为4.5-9 分时，判断为中等风险；当所述九项检测指标的总得分为9-13.5分时，判断为较高风险；当所述九项检测指标的总得分为13.5-18分时，判断为高风险；
在对所述受试对象进行病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价时，对比所述受试对象在治疗前和治疗后的所述九项检测指标的总得分；当治疗后所述受试对象的九项检测指标的总得分大于治疗前所述受试对象的九项检测指标的总得分，则判定该受试对象的病情进展和/或疗效较差，或判定所述候选治疗药物疗效较差；当治疗后所述受试对象的九项检测指标的总得分小于治疗前所述受试对象的九项检测指标的总得分，则判定该受试对象的病情进展和/或疗效较好，或判定所述候选治疗药物疗效较好；
优选地，前述评价方法还包括：神经酰胺类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、 Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物 PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6浓度的检测方法；进一步优选地，所述检测方法是蛋白快速沉淀的方法和LC-MS/MS的方法；所述样品优选为血液、血浆或血清。
作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括检测所述受试对象的样品中的非神经酰胺类化合物的浓度的试剂，所述非神经酰胺类化合物为总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、低密度脂蛋白颗粒数目(LDL-P)、致密的低密度脂蛋白(sdLDL)、载脂蛋白B(apoB)、脂蛋白a(LP(a))、脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、高密度脂蛋白颗粒数目(HDL-P)、致密的高密度脂蛋白(sdHDL)、载脂蛋白A1(apoA1)、C反应蛋白(CRP)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白T(cTnT)、肌钙蛋白I(cTnI)、肌钙蛋白C(cTnC)、肌红蛋白(Mb)中的一种或多种；优选地，所述评估方法还包括所述非磷脂类化合物浓度的检测方法，以及所述非磷脂类化合物的阈值；
更优选地，针对所述受试对象为可能或潜在患病受试对象，所述方法还包括：综合利用Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1) 和Cer(d18:1/24:0)的浓度以及非神经酰胺类化合物的浓度检测结果确定所述可能或潜在患病受试对象是否患有急性冠脉综合征疾病风险的方法，其中，所述具体如下：
将所述可能或潜在患病受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值与所述阈值进行比较；对所述可能或潜在患病受试对象是否患有急性冠脉综合征疾病进行辅助诊断；当所述Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、 Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值超过所述阈值时，则判定受试对象患有急性冠脉综合征；
更优选地，针对所述受试对象为可能或潜在患病受试对象，所述方法还包括：综合利用神经酰胺类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、 Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物PC aa C38:6浓度，Cer(d18:1/16:0)、 Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0) 比值以及Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6、Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0浓度比值；以及非磷脂类化合物的浓度检测结果确定所述可能或潜在患病受试对象是否具有罹患冠状动脉疾病风险、是否患有急性冠脉综合征的方法，其中，所述具体如下：
将所述可能或潜在患病受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、 Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物PC aaC38:6浓度， Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)比值以及Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6、Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0浓度比值九项检测指标值与健康人群样本总体的相应指标值进行比较、评分；然后，将所述非磷脂类化合物的浓度与所述阈值进行比较；根据分值范围和比较结果对所述可能或潜在患病受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险进行评价；
当所述九项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的 50％分位值以下时加0分，当所述九项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述九项检测指标值中的一项指标值位于所述标准人群样本总体的相应指标值的75％分位值以上时加2分，所述九项检测指标的总得分范围为0-18分；
在判断受试对象是否患有急性冠脉综合征时，当所述九项检测指标的总得分等于或大于9分时，且所述非磷脂类化合物的浓度达到或超过所述阈值，则判定受试对象患有急性冠脉综合征；
在判断罹患冠状动脉疾病的风险时：
当所述九项检测指标的总得分超过9分且所述非磷脂类化合物的浓度超过所述阈值时，判断为高风险；当所述九项检测指标的总得分未超过9分且所述非磷脂类化合物的浓度未超过所述阈值时，判断为低风险；当所述九项检测指标的总得分超过9分且所述非神经酰胺类化合物的浓度未超过所述阈值、或者所述九项检测指标的总得分未超过9分且所述非磷脂类化合物的浓度超过所述阈值(即判断相反)时，判断为中风险，需要进一步检测；
进一步优选地，针对所述受试对象为正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象，所述方法还包括：综合利用受试对象Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、 Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物PC aa C38:6浓度，Cer(d18:1/16:0)、 Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0) 比值以及Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6、Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0浓度比值以及非磷脂类化合物的浓度检测结果对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层评价的方法，其中，所述方法具体如下：
将正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物 PC aa C38:6浓度，Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、 Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)比值以及Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6、 Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0浓度比值与所述标准人群样本总体的相应指标值进行比较、评分；然后，将所述非磷脂类化合物的浓度与所述阈值进行比较；根据分值范围和比较结果对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层；
在对所述受试对象进行危险分层评价时，当所述九项检测指标的总得分超过9分且所述非磷脂类化合物的浓度超过所述阈值时，判断为高风险；当所述九项检测指标的总得分未超过9分且所述非磷脂类化合物的浓度未超过所述阈值时，判断为低风险；当所述九项检测指标的总得分超过9分且所述非磷脂类化合物的浓度未超过所述阈值、或者所述九项检测指标的总得分未超过9分且所述非磷脂类化合物的浓度超过所述阈值(即判断相反)时，判断为中风险，需要进一步检测。
作为一种优选实施方式，前述试剂盒中所述用于检测受试对象的样品中的神经酰胺类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、 Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物PC aa C36:6、PC aa C38:0、PCaa C38:6浓度的检测试剂包括：
所述受试对象的样本的预处理试剂，优选包括：蛋白质沉淀溶剂，所述蛋白质沉淀溶剂优选是体积比为2:8的乙酸乙酯和异丙醇的混合物；
用于制作Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、 Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6九种化合物的标准曲线的试剂，优选包括纯品或纯品存储溶液、5％的BSA稀释剂；
其中，D7-Cer(d18:1/16:0)、D7-Cer(d18:1/18:0)、D7-Cer(d18:1/24:0)、D7-Cer(d18:1/24:1) 四种神经酰胺内标纯品或溶液，优选地，四种神经酰胺内标溶液的浓度分别为：
D7-Cer d18:1/16:0：0.125pmol/μl；
D7-Cer d18:1/18:0：0.05pmol/μl；
D7-Cer d18:1/24:0：1.5pmol/μl；
D7-Cer d18:1/24:1：0.5pmol/μl。
在上述试剂盒中，作为一种优选方式，所述试剂盒还包括：
质控品为新鲜冻存混合血浆质控品，所述混合血浆质控品是有稳定心脏病史的多位病人的血浆混合而成的血盘；优选地，所述混合血浆质控品包括：中间质量控制(MQC)：未处理的FFP；低质量控制(LQC)：用水稀释中间质量控制2倍来制备；下限量化质量控制(LLOQ)：用水稀释中间质量控制3倍来制备；高质量控制：向未处理的FFP中加入Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0神经酰胺纯品或溶液使Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、 Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)的浓度达到0.1pmol/μl，且加入Cer d18:1/24:0、Cerd18:1/24:1神经酰胺纯品或溶液使Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1的浓度达到1pmol/μl；加入磷脂酰胆碱类化合物PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6纯品或纯品存储溶液使浓度达到20μg/mL。
上限量化质量控制：向未处理的FFP中加入Cer d18:1/16:0和Cer d18:1/18:0神经酰胺纯品或溶液以使Cer d18:1/16:0和Cer d18:1/18:0浓度达到0.15pmol/μl，且加入Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1神经酰胺纯品或溶液以使Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1浓度达到1.5pmol/μl；加入磷脂酰胆碱类化合物PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aaC38:6纯品或纯品存储溶液使浓度达到30μg/mL。
在上述试剂盒，作为一种优选实施方式，所述冠状动脉疾病为冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、急性非ST段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死、急性心肌梗死、缺血性心脏病中的一种或多种。
在上述试剂盒，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括：基质空白对照：人血浆，所述人血浆是无心脏病史的多位健康人的血浆混合而成的血盘；更优选地，所述试剂盒还包括：用于采集血液样本的容器，并且所述容器中包含EDTA-K2、EDTA-K3或肝素；优选地，所述容器为包含EDTA-K2的采血管。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
1、本发明利用磷脂类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、 Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6 作为冠状动脉疾病标志物，本发明的试剂盒能够高效、准确用于冠状动脉疾病患病风险评估，急性冠脉综合征诊断、确诊患者危险分层、病情监测和疗效评价，且灵敏度和特异性较好，能够满足冠状动脉疾病的临床诊断和治疗的需求。
2、本发明采用LC-MS/MS(液相二级质谱)方法检测标志物，能够从分子种类水平上对神经酰胺标志物和磷脂酰胆碱类化合物进行分析，选择性好、通量高、精确度和准确性高。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。其中：
图1：Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1的产物离子谱；
图2：在5％BSA中的Cer d18:1/16:0的校准曲线；
图3：在5％BSA中的Cer d18:1/18:0的校准曲线；
图4：在5％BSA中的Cer d18:1/20:0的校准曲线；
图5：在5％BSA中的Cer d18:1/22:0的校准曲线；
图6：在5％BSA中的Cer d18:1/24:0的校准曲线；
图7：在5％BSA中的Cer d18:1/24:1的校准曲线；
图8：在5％BSA中的PC aa C36:6的校准曲线；
图9：在5％BSA中的PC aa C38:6的校准曲线；
图10：在5％BSA中的PC aa C36:0的校准曲线；
图11：罹患冠状动脉疾病的风险评估；
图12：冠状动脉疾病危险分层评估。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。应理解，这些实施例仅用于解释本发明而不用于限制本发明的范围。对外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Cer(d18:1/16:0)为N-棕榈酰基-D-赤式-鞘氨醇(N-Palmitoyl-D-erythro-sphingosine)，结构如式I所示：
Figure RE-RE-GDA0003462731390000121
Cer(d18:1/18:0)为N-硬脂酰基-D-赤式-鞘氨醇(N-stearoyl-D-erythro-sphingosine)，结构如式II所示：
Figure RE-RE-GDA0003462731390000122
Cer(d18:1/20:0)为:N-二十酰基-D-赤式-鞘胺醇(N-eicosanoyl-D-erythro-sphingosine),结构如式Ⅲ所示：
Figure RE-RE-GDA0003462731390000123
Cer(d18:1/22:0)为N-二十二酰基-D-赤式-鞘胺醇(N-behenoyl-D-erythro-sphingosine), 结构如式Ⅳ所示：
Figure RE-RE-GDA0003462731390000131
Cer(d18:1/24:0)为N-二十四烷酰基-D-赤式-鞘氨醇 (N-lignoceroyl-D-erythro-sphingosine)，结构如式Ⅴ所示：
Figure RE-RE-GDA0003462731390000132
Cer(d18:1/24:1)为N-二十四碳烯酰基-D-赤式-鞘氨醇 (N-nervonoyl-D-erythro-sphingosine)，结构如式Ⅵ所示：
Figure RE-RE-GDA0003462731390000133
D7-Cer(d18:1/16:0)为N-棕榈酰基-D-赤式-鞘氨醇-d7 (N-palmitoyl-D-erythro-sphingosine-d7)，结构如式Ⅶ所示：
Figure RE-RE-GDA0003462731390000134
D7-Cer(d18:1/18:0)为N-硬脂酰基-D-赤式-鞘氨醇-d7 (Nstearoyl-D-erythro-sphingosine-d7)，结构如式所示VIII：
Figure RE-RE-GDA0003462731390000135
D7-Cer(d18:1/24:0)为N-廿四烷酰基-D-赤式-鞘氨醇-d7 (Nlignoceroyl-D-erythro-sphingosine-d7)，结构如式Ⅸ所示：
Figure RE-RE-GDA0003462731390000141
D7-Cer(d18:1/24:1)为N-二十四碳烯酰基-D-赤式-鞘氨醇-d7 (N-nervonoyl-D-erythro-sphingosine-d7)，结构如式Ⅹ所示：
Figure RE-RE-GDA0003462731390000142
判断是否患有冠状动脉疾病时，所选择的受试对象为来医院就诊的可能患者；
判断受试对象具有罹患冠状动脉疾病的风险时，所选择的受试对象为来医院就诊的潜在患者或进行体检的健康人；
健康人群样本总体指目前实验研究收录的所有健康人的样本的总和(健康人数在200 个，都是经过常规检查确定无冠状动脉疾病史的人)，对每个健康人的样本或血液样本进行Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、 Cer(d18:1/24:1)和PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6浓度的测定，测定方法可以按下方实施例中对受试者样本中的各项指标的测定方法相同，并换算出Cer(d18:1/16:0)、 Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0) 比值以及Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6、Cer(d18:1/18:0)/PC aaC38:0浓度比值。所有健康人的Cer(d18:1/16:0)浓度形成一组数据，并通过这组数据计算出健康人群样本总体的 Cer(d18:1/16:0)浓度的中位数和四分位数间距，即计算出健康人群样本总体的 Cer(d18:1/16:0)浓度的50％分位值和75％分位值。同理，计算健康人群样本总体的 Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)浓度的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体的Cer(d18:1/24:0)浓度的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、 Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)比值的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6浓度比值的50％分位值和75％分位值，健康人群样本总体Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0浓度比值的50％分位值和75％分位值。健康人群样本总体的各项指标值的50％分位值和75％分位值用于评价受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险。
标准人群样本总体指由目前实验研究收录的健康无冠状动脉疾病史的人的样本和具有稳定性冠状动脉疾病的人的样本组成，其中所述健康人的样本占标准人群样本总数的 50％，(健康无冠状动脉疾病史的人的人数为200个，具有稳定性冠状动脉疾病的人的人数为200个)，对每个健康人的样本或血液样本进行Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6浓度的测定，测定方法可以按下方实施例中对受试者样本中的各项指标的测定方法相同，并换算出Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、 Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)比值，Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6、Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0比值。所有健康人和具有稳定性冠状动脉疾病的人的 Cer(d18:1/16:0)浓度形成一组数据，并通过这组数据计算出标准人群样本总体的 Cer(d18:1/16:0)浓度的中位数和四分位数间距，即计算出标准人群样本总体的 Cer(d18:1/16:0)浓度的50％分位值和75％分位值。同理，计算标准人群样本总体的 Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/24:0)浓度的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体的Cer(d18:1/24:1)浓度的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体 Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)比值的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体 Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6浓度比值的50％分位值和75％分位值，标准人群样本总体 Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0浓度比值的50％分位值和75％分位值。标准人群样本总体的各项指标值的50％分位值和75％分位值用于对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价。
所述非磷脂类化合物的阈值可以采用已公开的数据，比如(TC):3.4-6.5mmol/L、(TG):0.3-1.8mmol/L、(LDL-C):0-3.36mmol/L、(apoB):0.6-1.1g/L、(LP(a)):0-30 mg/L、(Lp-PLA2):0-200ng/ml、(HDL-C):1.0-1.6mmol/L、(apoA1):1.40-1.45g/L、 (CRP):0.068-8.2mg/L、(CK-MB):0-25IU/L、(cTnT):0.02-0.13mg/L、肌钙蛋白I (cTnI):0-1ng/ml、(Mb):0-100μg/L。无论是用于评价受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险还是用于对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价，所述阈值都可以采用相同标准。
受试对象样本中的非磷脂类化合物浓度的测定可以采用常规方法，在此不再赘述。
以下通过不同实施例来说明具体说明用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度及浓度比值的试剂在制备用于确定受试对象是否患有急性冠脉综合征或具有罹患冠状动脉疾病风险的试剂盒中的应用；以及用于确定来自受试对象的样品中的冠状动脉疾病标志物浓度及浓度比值的试剂在制备用于对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价的试剂盒中的应用。或者说用如下具体实施例来说明本发明试剂盒的内含物和使用方法，或者说用如下具体实施例来说明利用磷脂类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、 Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6 的浓度，及Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、 Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)比值，Cer(d18:1/16:0)/PC aaC36:6、 Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0的比值来确定可能或潜在患病受试对象是否患有急性冠脉综合征或具有罹患冠状动脉疾病风险的方法以及对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价。
实施例1：受试者样品采集、保存与运输
用于采集受试者样品的试剂和试验用品可以包含在本发明的试剂盒中，比如下方使用到的EDTA抗凝管(紫色盖)。
(1)样本采集
通过静脉采血采集受试对象的血液3ml，采血后6小时内采用离心沉淀法(离心条件为：1300g,10min)分离出血浆；优选地，首选采用EDTA抗凝管(紫色盖)来分离血浆。
(2)样本保存
如果不能立即用于检测，须将分离出的血浆置于2-8℃或-20℃避光保存。
(3)样本运输
在4℃蓝冰的条件下运输血浆。
实施例2：在LC-MS/MS检测前对实施例1采集的血浆样品进行预处理(蛋白质快速沉淀法)
用于对血浆样品进行预处理的试剂和试验用品可以包含在本发明的试剂盒中，比如：蛋白质沉淀(PPT)溶剂：乙酸乙酯：异丙醇(2:8，v/v)，本发明的试剂盒中还可以包括：用于制作Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、 Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6)标准曲线的磷脂化合物纯品(市售产品)或者由甲醇溶剂配制的纯品存储溶液(存储溶液的浓度可以为500pmol/μl)；采用甲醇溶剂配制的四种神经酰胺内标(IS，即四种神经酰胺相应氘代物)溶液，其浓度分别为D7-Cer d18:1/16:0：0.125pmol/μl，D7-Cer d18:1/18:0 0.05pmol/μl，D7-Cer d18:1/24:0：1.5pmol/μl，D7-Cer d18:1/24:1：0.5pmol/μl；质控品(QC)：新鲜冻存混合血浆(FFP，Fresh frozen pooled plasma)，具体地，该混合血浆质控品是具有稳定心脏病史的病人400例(2ml/人)的血浆混合而成的血盘；基质空白对照：人血浆，具体地，该人血浆是无心脏病史的健康人200例的血浆混合而成的血盘。另外，下方的预处理方法也可以记载于本申请试剂盒的说明书上。
将实施例1采集的血浆样品在4℃内解冻并恢复到室温后进行如下预处理，除了实施例1采集的血浆样品采用如下方法进行预处理以外，用于制备标准曲线的由四种神经酰胺纯品存储溶液稀释后的四种神经酰胺纯品工作液、质控品、基质空白对照在进行 LC-MS/MS分析前也需要做如下预处理：将等量(通常为10μl)的九种磷脂纯品的工作液(以5％的BSA作为稀释剂稀释九种磷脂纯品存储溶液得到的，浓度均为1pmol/μl)、质控品(QC)、基质空白对照或受试者的血浆样品加到96孔板内(2ml/孔)，然后分别向九种磷脂纯品的工作液、质控品(QC)、基质空白对照(10μl)或研究样本(即受试者的血浆样品)加入九种磷脂内标(IS)的混合物(九种磷脂内标溶液等体积混合，共计 20μl)，再向其中加入蛋白质沉淀(PPT)溶剂，每个孔中的混合溶液的最终体积为600 μl。各孔中混合溶液混合10分钟后在3,000g条件下离心10分钟。然后将上清转移到 Eppendorf的PCR 96孔板内，在进行LC-MS/MS分析检测之前，用热密封箔片(Hamburg, Germany)密封。
实施例3：LC-MS/MS检测分析条件优化。
本实施例得到优化后的LC-MS/MS检测分析条件以及采用的设备可以记载于本申请试剂盒的说明书上。或者/和将优化LC-MS/MS检测分析条件所需的试剂作为本发明试剂盒中试剂的一部分。
LC-MS/MS分析是在一个与Thermo SCIENTIFIC UPLC Ultimate3000相结合的Thermo SCIENTIFIC TSQ Quantitative质谱仪上进行。在阳离子模式下的电喷雾电离化(ESI)采用多反应监测(MRM)。使用Thermo SCIENTIFIC TSQ Quantitative配套软件控制仪器和数据采集。
在对受试者血浆样品进行检测工作之前，对检测条件进行了综合优化，以获得D7-Cer d18:1/16:0、D7-Cer d18:1/16:0、D7-Cer d18:1/18:0、D7-Cer d18:1/18:0、Cer(d18:1/16:0)、 Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6的最佳质谱仪条件分析，分析条件的优化是1pmol/μl 磷脂标准品溶液(即以5％的BSA作为稀释剂稀释磷脂纯品存储溶液得到的九种磷脂纯品工作液，浓度均为1pmol/μl)在20μl/min条件下进行的(标准品溶液分别进行)。以下为优化后的参数：汽化温度，320℃；离子传输管温度，350℃；气帘气压，40Arb；补充气压，15Arb；残气，0Arb；正离子电压，3500V；扫描模式，SRM。色谱分离是在Waters CORTECS UPLC C18,2.1mm*50mm*1.6μm的色谱柱进行的。温度设定在 40℃。流动相包括(A)40％10mM醋酸铵溶液(溶剂为LC-MS级水)和60％的乙腈， (B)90％的异丙醇和10％的乙腈。注入体积为1μl，流量设置为0.3ml/min。应用以下梯度：0到0.5分钟，A/B(65/35％)；0.5到1.5分钟，A/B(65/35％)；1.5到3.6分钟，A/B (2/98％)；3.6到3.7分钟，A/B(2/98％)；3.7到5分钟，A/B(65/35％)。
利用LC-MS/MS分析方法得到的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、 Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和PC aa C36:6、PC aaC38:0、PC aa C38:6 的产物离子谱参见附图1，图中标明了出峰时间(横坐标)、峰强度(纵坐标)以及荷质比。
实施例4：校准曲线(又称标准曲线)的制作。
本发明的试剂盒中可以包括用于制作校准曲线的试剂比如5％的BSA(牛血清蛋白)。
制作校准线的四种神经酰胺纯品的工作液(标准品溶液)是采用连续稀释法以5％的 BSA(牛血清蛋白)作为稀释剂稀释磷脂类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6的存储溶液得到的。由于在人血浆中存在内源性脂质和无脂质血浆基质，因此，为了增加检测结果的准确性，用于制作校准线的四种神经酰胺纯品的工作液用 5％的BSA(牛血清蛋白)制备。实验的线性度是通过每种磷脂化合物的六个不同浓度来确定的。Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)的校准线点的浓度为0.008、0.01、0.02、0.1、1和2pmol/μl，Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1的校准线点的浓度为0.08、0.1、0.2、1、10和20pmol/μl，PC aa C36:6、PC aa C38:0的校准线点的浓度为0.5，2.5，5，25，75，150，250和500μg/mL；PC aa C38:6的校准线点的浓度为0.05，0.25，0.5，2.5，7.5，15，25和50μg/mL.
也就是说，每种神经酰胺纯品工作液包括九种不同浓度，同时以水作为完全空白对照，人血浆(该人血浆是无心脏病史的健康人200例的血浆混合而成的血盘)作为基质空白对照，在利用LC-MS/MS分析前，这九种不同浓度的神经酰胺纯品工作液、完全空白对照、基质空白对照均需要按照实施例2的预处理方法进行预处理，然后，再按照实施例3记载的条件进行LC-MS/MS分析，利用LC-MS/MS分析方法得到的Cer(d18:1/16:0)、 Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和PC aaC36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6的校准点对应的质谱信号峰面积结果参见附图2-10，图2～10的横坐标代表相应磷脂化合物的浓度(pmol/μl)，纵坐标代表质谱信号峰面积。本实施例得到的校准线可以用于查询受试者血浆样本中相应神经酰胺的浓度。
在每个试验中，两个校准线集包含了所有9个磷脂分析物。所有的校准曲线都以1/x2 (浓度平方的倒数)加权，将校准线集中到校准线的低点，从而减少了在低浓度下的定量误差。
本发明同时对5％BSA基质与临床血样本基质的一致性进行了评价。对5％BSA的标准品溶液和人血浆进行了评估。从人血浆样品(该人血浆是无心脏病史的健康人200例的血浆混合而成)中获得的校准线与上述5％BSA的校准线进行比较。其中，人血浆样品制作的标准线上的校准线点分别是：用5％的BSA稀释人血浆样本2-3倍以获得较低的校准点，未稀释的人血浆样本代表中间点，而体积浓缩为原人血浆样本体积的三分之一至二分之一时的样本代表高点。用这两条线斜率的95％置信区间的重叠来表明它们的平行度。结果表明二者平行度良好，说明采用5％BSA作为标准品溶液的稀释剂是可行的，5％BSA 中做出的校准曲线可以作为以后在人血浆中测得的神经酰胺浓度的参考。
实施例5：质量控制。
本发明的试剂盒中可以包括用于质量控制的试剂，比如FFP。
利用新鲜冻存混合血浆(FFP，Fresh frozen pooled plasma，该混合血浆质控品是具有稳定心脏病史的病人400例(2ml/人)的血浆混合而成的血盘)用来代表质量控制样品。为了确定每个神经酰胺的内源性浓度，重复6次提取(按照实施例2的预处理方法)和分析(按照实施例3的分析方法)未处理的FFP。具体地，未处理的FFP代表中间质量控制(MQC)，低质量控制(LQC，用水稀释中间质量控制2倍来制备)，以及下限量化质量控制(LLOQ，用水稀释中间质量控制3倍来制备)，高质量控制：向未处理的FFP中加入Cer d18:1/16:0、Cerd18:1/18:0神经酰胺纯品或溶液使Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、 Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)的浓度达到0.1pmol/μl，且加入Cer d18:1/24:0、Cer d18:1/24:1神经酰胺纯品或溶液使Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1的浓度达到1pmol/μl；加入磷脂酰胆碱类化合物PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6纯品或纯品存储溶液使浓度达到20μg/mL。
上限量化质量控制：向未处理的FFP中加入Cer d18:1/16:0和Cer d18:1/18:0神经酰胺纯品或溶液以使Cer d18:1/16:0和Cer d18:1/18:0浓度达到0.15pmol/μl，且加入Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1神经酰胺纯品或溶液以使Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1浓度达到1.5pmol/μl；加入磷脂酰胆碱类化合物PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aaC38:6 纯品或纯品存储溶液使浓度达到30μg/mL。
在对上述质量控制品进行LC-MS/MS分析前采用实施例2的方法对其进行预处理，预处理后采用实施例3的条件进行LC-MS/MS分析。
利用LC-MS/MS分析方法得到的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、 Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和PC aa C36:6、PC aaC38:0、PC aa C38:6 的ULOQ、HQC、MQC、LQC、LLOQ质量控制品精密度结果参见表1-4。
表1：PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6精密度结果
PC aa C36:6 PC aa C38:6 PC aa C38:0
样品浓度(μg/mL) 300 300 50
％CV 6.23 7.31 11.02
％Accuracy 100.9 101.9 103.1
表2：神经酰胺精密度结果
Figure RE-RE-GDA0003462731390000201
表1-2显示试验准确度，通过多次检测线性范围内的5种不同浓度的样品，观察其检测结果的变异系数(CV％)，判断试验准确度，其中Area Ratio是指神经酰胺与其相应的氘代物内标准品(IS)的峰面积比值。在对受试者血浆样品进行LC-MS/MS分析的同时设置质量控制，质量控制的目的是为了排除检测过程中因为仪器不正常和人员操作失误导致的结果不可信的情况。
实施例6：辅助诊断是否患有急性冠脉综合征疾病的临床试验。
临床试验被试入组条件：
急性冠脉综合征(ACS)是由于急性心肌缺血导致的一组临床综合征，主要包括急性心肌梗死、不稳定型心绞痛，其临床发病率、死亡率均处于较高水平。根据第四版心肌梗死全球统一定义，2019年急性冠脉综合征急诊快速诊疗指南，2017ESC急性ST段抬高型心肌梗死管理指南[5],ACS拟诊患者的诊断标准需结合患者病史、症状和体征，心电图，生物标志物和影像学检查综合分析。
本研究入组确诊病例200例，均由临床专家诊断组依据诊断标准确诊,另选择200例非ACS病例，其中包括稳定型心绞痛病例和健康体检人群。使用本本发明的试剂盒(液相色谱-串联质谱法)检测所收集血浆样本中神经酰胺浓度，分析神经酰胺浓度比值Conc(Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)) /Cer(d18:1/24:0)，根据该比值＞0.465判定患者为ACS阳性，对比考核试剂检测结果和临床诊断结果，评价本发明的诊断效能。
排除条件：
(a)肾功能衰竭(肌酐清除率<15ml/min)；
(b)随机分组前12个月出现严重胃肠道出血；
(c)有颅内出血病史；
(d)其他疾病可能直接影响药物选择或测试结果。
样品采集、保存与运输方法具体参见实施例1所述，样品预处理具体参见实施例2所述，LC-MS/MS分析具体见实施例3所述。
将所述可能或潜在患病受试对象的样品中的Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、 Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值与所述阈值进行比较；对所述可能或潜在患病受试对象是否患有急性冠脉综合征疾病进行辅助诊断；当所述Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、 Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)浓度的比值超过所述阈值时，则判定受试对象患有急性冠脉综合征；
以临床参考标准判断结果为标准，计算的假阳性(b)，假阴性(c)，真阳性(a) 和真阴性(d)的例数，统计结果见表3.
表3：统计结果
Figure RE-RE-GDA0003462731390000221
使用Medcalc检验诊断灵敏度，特异度，ROC曲线下面积AUC，总符合率，阳性符合率和阴性符合率，统计结果见表4。
表4：统计结果
检验项目 结果 95％置信区间
灵敏度 91.5％ 86.7％～94.9％
特异度 82.5％ 76.5％～87.5％
AUC 0.87 0.83～0.90
总符合率 87.0％ 83.3％0～90.1％
阳性符合率 83.9％ 79.4％～87.6％
阴性符合率 90.6％ 85.9％～93.9％
据检验结果，总符合率95％置信区间的下限为83.3％，可满足临床使用需求(＞80％)，灵敏度95％置信区间的下限为86.7％，可满足临床使用需求(＞85％)，特异度95％置信区间的下限为76.5％，可满足临床使用需求(＞75％)，ROC曲线下面积AUC为0.83～0.90，判断考核试剂诊断效能可满足临床使用需求。根据定性分析四格表，进行Kappa一致性检验，检验结果显示Kappa系数K值为0.76，95％置信区间为(0.70～0.84)。根据K＞ 0.7,判定两诊断系统一致。由此确定，本发明的方法对急性冠脉综合征的诊断准确度高。
实施例7：判断罹患冠状动脉疾病风险的临床试验。
临床试验被试入组条件：
受试对象：以社区或社团为基础，选择未患或未患过冠状动脉疾病的50岁以上60岁以下的健康人作为研究队列，共70人。
正常对照组(即形成健康人群样本的组)：年龄、性别配对的志愿者(男女各一半，年龄分布在20-70岁之间)，无任何心血管疾病或其他长期疾病的病史或没有临床症状或生化指标指示心血管疾病或其他长期疾病的志愿者，共计200名志愿者。
排除条件：
(a)肾功能衰竭(肌酐清除率<15ml/min)；
(b)随机分组前12个月出现严重胃肠道出血；
(c)有颅内出血病史；
(d)其他疾病可能直接影响药物选择或测试结果。
研究终点：
被试者因心血管相关疾病死亡，明确诊断为动脉粥样硬化、稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、非ST段抬高心肌梗死和ST段抬高心肌梗死。
样品采集、保存与运输方法具体参见实施例1所述，样品预处理具体参见实施例2所述，LC-MS/MS分析具体见实施例3所述。
将受试对象的样品中的磷脂类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)和PC aa C38:6的浓度，及Cer(d18:1/16:0)、 Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0) 比值，Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6、Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0的比值九项检测指标值与健康人群样本总体的相应指标值进行比较、评分，根据分值范围对受试对象具有罹患冠状动脉疾病风险进行评价，当所述九项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的50％分位值以下时加0分，当所述九项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述九项检测指标值中的一项指标值位于健康人群样本总体的相应指标值的75％分位值以上时加2 分，所述九项检测指标的总得分范围为0-18分。在判断罹患冠状动脉疾病的风险时，当所述九项检测指标的总得分为0-4.5分时，判断为低风险；当所述九项检测指标的总得分为4.5-9分时，判断为中等风险；当所述九项检测指标的总得分为9-13.5分时，判断为较高风险；当所述九项检测指标的总得分为13.5-18分时，判断为高风险。
结果参见附图11。
实施例8：对冠状动脉疾病患者进行危险分层的临床试验。
临床试验被试入组条件：
以医院为基础，选择确诊的稳定性心绞痛和急性冠状动脉综合征(包括不稳定性心绞痛、非ST段抬高心肌梗死、ST段抬高心肌梗死)作为研究队列。(注：所有的病例确诊都进行冠状动脉造影检查)。
1)稳定性心绞痛组：可由运动或其他增加心肌需氧量的情况诱发短暂的胸痛(<10分钟)，休息或舌下含服硝酸甘油可迅速缓解症状，入院前6个月没有病情恶化或在静息状态下发生心绞痛；
2)不稳定性心绞痛：入院前24小时内在静息状态下发生心绞痛，胸痛发作时心电图出现至少2个相邻导联ST段压低≥0.1mV，或一过性至少2个相邻导联ST段升高≥0.1mV(<30分钟)，心肌损伤标记物(肌酸激酶CK、肌酸激酶同工酶CK-MB、心脏特异的肌钙蛋白cTNT和cTNI、肌红蛋白)在正常范围内；
3)非ST段抬高心肌梗死组：入院前24小时内在静息状态下发生心绞痛，胸痛发作时心电图出现至少2个相邻导联ST段压低≥0.1mV，或一过性至少2个相邻导联ST段升高≥0.1mV(<30分钟)，心肌损伤标记物(肌酸激酶CK、肌酸激酶同工酶CK-MB、心脏特异的肌钙蛋白cTNT和cTNI、肌红蛋白)升高(增高或增高后降低，至少有一次数值超过参考值上限的99百分位)；
4)ST段抬高心肌梗死组：持续剧烈胸痛>30分钟，含服硝酸甘油不缓解，相邻两个或两个以上导联心电图ST段抬高≥0.1mV，心肌损伤标记物(肌酸激酶CK、肌酸激酶同工酶CK-MB、心脏特异的肌钙蛋白cTNT和cTNI、肌红蛋白)异常升高；
排除条件：
1)肾功能衰竭(肌酐清除率<15ml/min)；
2)随机分组前12个月出现严重胃肠道出血；
3)有颅内出血病史；
4)残疾；
5)痴呆等导致无法理解研究；
6)由于非心血管相关疾病预计生命不超过1年的患者。
7)其他疾病可能直接影响药物选择或测试结果。
研究终点：
被试者因心血管死亡(心源性猝死、致死性心肌梗塞、充血性心脏衰竭死亡、缺血性心脏病死亡、干预治疗冠心病后立刻死亡、致死性中风、其他由于心脏疾病引发的死亡)。
样品采集、保存与运输方法具体参见实施例1所述，样品预处理方法具体参见实施例2所述，LC-MS/MS分析具体见实施例3所述。
将受试对象的样品中的磷脂类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)和PC aa C38:6的浓度，及Cer(d18:1/16:0)、 Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0) 比值，Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6、Cer(d18:1/18:0)/PC aa C38:0的比值九项检测指标值与标准人群样本总体的相应指标值进行比较、评分，根据分值范围对受试对象是否患有冠状动脉疾病或具有罹患冠状动脉疾病风险进行评价，当所述九项检测指标值中的一项指标值位于标准人群样本总体的相应指标值的50％分位值以下时加0分，当所述九项检测指标值中的一项指标值位于标准人群样本总体的相应指标值的50％分位值和75％分位值之间时加1分，当所述九项检测指标值中的一项指标值位于标准人群样本总体的相应指标值的 75％分位值以上时加2分，所述九项检测指标的总得分范围为0-18分。在进行危险分层时，当所述九项检测指标的总得分为0-4.5分时，判断为低风险；当所述九项检测指标的总得分为4.5-9分时，判断为中等风险；当所述九项检测指标的总得分为9-13.5分时，判断为较高风险；当所述九项检测指标的总得分为13.5-18分时，判断为高风险。
结果参见附图12。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生物标志物，包括神经酰胺类化合物和磷脂酰胆碱类化合物，优选地，神经酰胺类化合物选自Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)中的一种或多种，磷脂酰胆碱类化合物选自PC aaC36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6中的一种或多种，所述生物标志物：
用于评估受试对象是否具有罹患冠状动脉疾病风险，或者
用于确定受试对象是否罹患急性冠脉综合征，或者
用于对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价。
2.如权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，包括神经酰胺类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6。
3.如权利要求1或2所述的生物标志物，其特征在于，还包括非磷脂类化合物，包括总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白颗粒数目、致密的低密度脂蛋白、载脂蛋白B、脂蛋白a、脂蛋白磷脂酶A2、高密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白颗粒数目、致密的高密度脂蛋白、载脂蛋白A1、C反应蛋白、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、肌钙蛋白C、肌红蛋白中的一种或多种。
4.如权利要求1-3任一项所述的生物标志物在制备用于确定受试对象是否具有罹患冠状动脉疾病风险的试剂盒的应用，优选地，所述冠状动脉疾病为冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、急性非ST段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死、急性心肌梗死中的一种或多种。
5.如权利要求1-3任一项所述的生物标志物在制备用于确定受试对象是否患有急性冠脉综合征的试剂盒的应用，优选的，所述急性冠脉综合征是指不稳定性心绞痛、急性非ST段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死中的一种。
6.如权利要求1-3任一项所述的生物标志物在制备用于对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价的试剂盒中的应用，优选地，所述冠状动脉疾病为冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、急性非ST段抬高性心肌梗死、急性ST段抬高性心肌梗死、急性心肌梗死中的一种或多种。
7.如权利要求4或6所述的应用，通过测定受试样品中Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)、PC aa C38:6的浓度，Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)比值以及Cer(d18:1/16:0)/PC aa C36:6、Cer(d18:1/18:0)/PCaa C38:0浓度比值，对受试对象是否具有罹患冠状动脉疾病风险或对正在接受治疗的患有冠状动脉疾病的受试对象进行危险分层、病情监测、疗效评价和/或候选药物疗效评价，优选地，受试样品为血液、血清或血浆。
8.如权利要求5所述的应用，通过测定受试样品中标志物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:1)总浓度与Cer(d18:1/24:0)比值，对受试对象是否罹患急性冠脉综合征进行评价，优选地，受试样品为血液、血清或血浆。
9.一种用于评估冠状动脉疾病的试剂盒，其特征在于，包括：用于检测受试对象的样本中的神经酰胺类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物PC aa C36:6、PC aaC38:0、PC aa C38:6浓度的检测试剂。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括：所述受试对象的样本的预处理试剂，优选包括：蛋白质沉淀溶剂，所述蛋白质沉淀溶剂优选是体积比为2:8的乙酸乙酯和异丙醇的混合物；
优选地，所述试剂盒还包括用于制作神经酰胺类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6浓度的的标准曲线的试剂，优选包括：神经酰胺类化合物Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)和磷脂酰胆碱类化合物PC aa C36:6、PC aaC38:0、PC aa C38:6纯品或纯品存储溶液、5％的BSA稀释剂；
优选地，所述试剂盒还包括质控品，优选包括新鲜冻存混合血浆质控品，所述混合血浆质控品是有稳定心脏病史的多位病人的血浆混合而成的血盘；进一步优选地，所述混合血浆质控品包括：
中间质量控制：未处理的FFP；
低质量控制：用水稀释中间质量控制2倍来制备；
下限量化质量控制：用水稀释中间质量控制3倍来制备；
高质量控制：向未处理的FFP中加入Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0神经酰胺纯品或溶液使Cer d18:1/16:0、Cer d18:1/18:0、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)的浓度达到0.1pmol/μl，且加入Cer d18:1/24:0、Cer d18:1/24:1神经酰胺纯品或溶液使Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1的浓度达到1pmol/μl；加入磷脂酰胆碱类化合物PC aa C36:6、PCaa C38:0、PC aa C38:6纯品或纯品存储溶液使浓度达到20μg/mL；
上限量化质量控制：向未处理的FFP中加入Cer d18:1/16:0和Cer d18:1/18:0神经酰胺纯品或溶液以使Cer d18:1/16:0和Cer d18:1/18:0浓度达到0.15pmol/μl，且加入Cerd18:1/24:0和Cer d18:1/24:1神经酰胺纯品或溶液以使Cer d18:1/24:0和Cer d18:1/24:1浓度达到1.5pmol/μl；加入磷脂酰胆碱类化合物PC aa C36:6、PC aa C38:0、PC aa C38:6纯品或纯品存储溶液使浓度达到30μg/mL。
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