CN114778722B - 用于辅助诊断隐球菌病的血清标志物、试剂盒和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于辅助诊断隐球菌病的血清标志物、试剂盒和用途，涉及生物医药技术领域。本发明的用于辅助诊断隐球菌病的血清标志物为鞘脂，所述鞘脂为鞘磷脂和/或神经酰胺。本发明的血清标志物可用于辅助诊断隐球菌病和监测隐球菌病疗效，提高诊断隐球菌病的准确性。

Description

用于辅助诊断隐球菌病的血清标志物、试剂盒和用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于辅助诊断隐球菌病的血清标志物、试剂盒和用途。
背景技术
隐球菌病是一种由新生隐球菌及其变种感染人体引起的慢性或亚急性肺部真菌病，多见于免疫抑制人群，如长期使用糖皮质激素、血液病、器官移植、恶性肿瘤以及艾滋病病毒(HIV)感染等。国内荟萃分析发现，2000年以后报道的肺隐球菌病病例明显增多。肺隐球菌感染的临床表现缺乏特异性，从无症状到严重的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)均有发现，其严重程度通常取决于机体的免疫状态。无免疫抑制的肺隐球菌病患者常无临床症状或症状较轻，最常见的症状是咳嗽、咳痰、胸闷及发热等非特异性表现；影像学表现均无特异性，很难与肺癌、肺结核或肺炎相鉴别，容易误诊或延迟诊断从而使病情恶化。由于肺隐球菌起病隐匿，而且临床表现多样，加上易被误诊或漏诊导致病死率高，因此早期诊断及治疗显得尤为重要。
现今临床上用于诊断隐球菌病的技术主要为真菌培养、墨汁显微染色和隐球菌荚膜抗原(CrAg)检测等。然而，真菌培养敏感性低(55-80％)，耗时较长(3-7天)，不利于快速诊断；墨汁显微染色需要较大体积的样本量，而且标本处理繁琐耗时，结果判断主观性强；CrAg检测是目前推荐的隐球菌筛查方法，脑脊液CrAg检测具有高度的敏感性和特异性(100％)，但血清CrAg检测的敏感性较低(<75％)，而且类风湿因子阳性、结核性脑膜炎或系统性红斑狼疮患者均可能出现假阳性反应。再者，CrAg滴度高低与治疗效果的关系还有待研究。
由于早期隐球菌感染临床表现缺乏特异性，容易与肺炎和肺结核等病相混淆，造成误诊，而且病情可迅速加重而导致死亡率可高达20％。为了做到早发现早治疗，有必要开发一种无创、高效、快速，而且敏感性和特异性高的诊断方法或诊断标志物。
鞘脂是一类以长链鞘氨醇为骨架的脂类，拥有多样化的结构。它们不仅是细胞膜的重要结构成分，还参与许多重要的信号转导过程，如调节细胞生长、分化、衰老和程序性细胞死亡，介导细胞的各种生物功能等。鞘脂代谢异常也与各种疾病有关，包括炎症、传染病、心脏病、糖尿病、神经退行性疾病、肿瘤，以及一些呼吸系统疾病，如慢性阻塞性肺病和囊性纤维化。本发明首次发现鞘脂可作为血清标志物辅助诊断隐球菌病。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，本发明提供一种用于辅助诊断隐球菌病的血清标志物，该生物标志物可用于对隐球菌病进行辅助诊断，提高诊断隐球菌病的准确性。
一种用于辅助诊断隐球菌病的血清标志物，所述血清标志物为鞘脂，所述鞘脂为鞘磷脂和/或神经酰胺。
上述血清标志物可以用于对隐球菌病进行辅助诊断，对研究隐球菌病的发生机理以及实现疾病早期诊断有重要作用。本发明的血清标志物有助于提高隐球菌病早期诊断的准确性，帮助临床上对隐球菌病进行快速筛查。
在其中一个实施例中，所述鞘磷脂选自：SM(d18:0/18:0)、SM(d18:1/18:0)、SM(d18:1/20:0)、SM(d18:1/24:0)、SM(d18:1/26:1)、SM(d18:2/18:0)、SM(d18:2/20:0)、SM(d18:2/20:1)、SM(d18:2/22:1)、SM(d18:2/23:1)、SM(d18:2/24:2)中的一种或两种以上。
在其中一个实施例中，所述神经酰胺选自：Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/23:0)、Cer(d18:1/24:1)、Cer(d18:1/25:0)、Cer(d18:2/22:0)、Cer(d18:2/23:0)、Cer(d18:2/24:1)中的一种或两种以上。
以上鞘磷脂和神经酰胺对应的化学名称、CAS号或其它相关信息如表1所示。
表1鞘磷脂和神经酰胺血清标志物相关信息
Figure BDA0003600447760000021
Figure BDA0003600447760000031
在其中一个实施例中，所述血清标志物为：SM(d18:1/18:0)、SM(d18:2/18:0)、SM(d18:2/20:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:2/24:1)中的一种或两种以上。
在其中一个实施例中，当所述血清标志物满足下述(1)～(5)中至少一个条件时，则判定为肺隐球菌病高风险：
(1)SM(d18:1/18:0)在血清中的浓度高于5711.96nM；
(2)SM(d18:2/18:0)在血清中的浓度高于7961.47nM；
(3)SM(d18:2/20:0)在血清中的浓度高于1436.83nM；
(4)Cer(d18:1/18:0)在血清中的浓度高于12.05nM；
(5)Cer(d18:2/24:1)在血清中的浓度高于43.65nM。
其中，“高于”包括本数。
在其中一个实施例中，当Cer(d18:1/18:0)在血清中的浓度高于18.00nM，则判定为肺隐球菌病高风险。
在其中一个实施例中，所述血清标志物为Cer(d18:1/18:0)。
血清标志物Cer(d18:1/18:0)对肺隐球菌病的敏感性和特异性可达到80％以上，可作为肺隐球菌病的特异性诊断标志物，除了可以准确地诊断出肺隐球菌病，同时可用以排除其他与肺隐球菌病临床表现相似的疾病，如肺曲霉菌病和肺结核病等。
以12.05nM作为临界值时，Cer(d18:1/18:0)诊断肺隐球菌验证组的灵敏度达80％，特异性达85％。以18.00nM作为临界值时，对肺隐球菌病人的敏感度为76.6％，但正确判断正常人、肺曲霉菌病人和肺结核病人为肺隐球菌阴性的百分率可以分别提升至95.0％、77.8％和83.3％。
而且，Cer(d18:1/18:0)更可用以监测肺隐球菌病人的治疗效果，发挥早发现早治疗的作用。
在其中一个实施例中，所述血清标志物在血清中的浓度为12.05～100nM。
在其中一个实施例中，所述血清标志物在血清中的浓度为18～100nM。
本发明还提供一种用于辅助诊断隐球菌病的试剂盒，包含用于检测本发明所述的血清标志物的试剂。
本发明还提供一种用于辅助诊断隐球菌病的检测系统，包括：
检测模块，用于检测血清样本中本发明所述的血清标志物；
分析模块，用于获取上述检测结果，根据预定规则判断诊断结果。
在其中一个实施例中，所述检测模块包括液相色谱和质谱，采用液相色谱-质谱法(LC-MS)检测所述血清标志物的种类和浓度。
液相色谱-质谱法具有高灵敏度、高特异性、高通量，以及快速可靠的优点，采用液相色谱-质谱法检测与肺隐球菌病相关的鞘脂可帮助临床上快速、有效地进行筛查。
在其中一个实施例中，所述预定规则为：当检测结果满足下述(1)～(5)中至少一个条件时，则判定为肺隐球菌病高风险：
(1)SM(d18:1/18:0)在血清中的浓度高于5711.96nM；
(2)SM(d18:2/18:0)在血清中的浓度高于7961.47nM；
(3)SM(d18:2/20:0)在血清中的浓度高于1436.83nM；
(4)Cer(d18:1/18:0)在血清中的浓度高于12.05nM；
(5)Cer(d18:2/24:1)在血清中的浓度高于43.65nM。
一种用于辅助监测隐球菌病疗效的血清标志物，所述血清标志物为本发明所述的血清标志物。
通过检测上述血清标志物可帮助监测隐球菌病的治疗效果。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明首次发现可用于辅助诊断隐球菌病和辅助监测隐球菌病疗效的鞘脂标志物。本发明的辅助诊断标志物相比于现有的隐球菌病诊断方法相比具有多种优点：相比于真菌培养和墨汁显微染色的方法，本发明具有非入侵性、省时、可直观判断结果，以及敏感性和特异性较高的优点。相比于CrAg检测的方法，同样具有省时、敏感性和特异性较高的优点。
附图说明
图1为正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)评分图。
其中，A为正常人(圆形，n＝20)、肺隐球菌病人(正方形，n＝27)、肺曲霉菌病人(倒三角形，n＝27)和肺结核病人(三角形，n＝18)的OPLS-DA评分图；B为正常人和肺隐球菌病人的OPLS-DA评分图；C为肺隐球菌病人和肺曲霉菌病人的OPLS-DA评分图；D为肺隐球菌病人和肺结核病人的OPLS-DA评分图。
图2为可以区分正常人与肺隐球菌病人的鞘脂标志物的血清水平图。
其中，A为11个可以区分正常人与肺隐球菌病人的鞘磷脂标志物的血清水平，B为10个可以区分正常人与肺隐球菌病人的神经酰胺标志物的血清水平。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。
图3为接受者特征(ROC)曲线下面积(AUC)>0.9的5个鞘脂标志物的ROC曲线图。
图4为Cer(d18:1/18:0)于验证组(正常人20例，肺隐球菌病人20例)中的血清水平图。
图5为Cer(d18:1/18:0)于正常人(n＝40)、肺隐球菌病人(n＝47)、肺曲霉菌病人(n＝27)和肺结核病人(n＝18)中的血清水平图。
图6为肺隐球菌病人经治疗后血清中Cer(d18:1/18:0)水平的变化图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，以下将给出较佳实施例对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
以下实施例中，除非特殊说明，试剂、材料、设备为市售购得，实验方法为本领域的常规实验方法。
实施例1
一、研究对象
本研究共收集正常人样品40例(测试组20例和验证组20例)、肺隐球菌病人样品47例(测试组27例和验证组20例)、肺曲霉菌病人27例和肺结核病人18例。各样本均采集自广州医科大学第一附属医院，各组别的年龄与性别没有显著性差异(表2)。肺隐球菌、肺曲霉菌和肺结核病例的纳入标准如下。
1、肺隐球菌病患者的入组标准：
(1)年龄>18岁。
(2)首次发病，包括院外和院内感染患者。
(3)确诊肺隐球菌病。
确诊肺隐球菌病依据：具有肺隐球菌病的临床和(或)影像表现，且微生物学检查结果或病理组织学检查结果符合以下任意一项的病例均应全部入选：
(1)无菌条件下采集的血液、胸腔积液(与临床确定的感染部位一致)或病变肺组织标本涂片镜检发现隐球菌或培养有隐球菌生长。
(2)对播散性感染患者，无菌条件下采集的肺外感染部位脓液涂片发现隐球菌或培养有隐球菌生长。
(3)通过支气管镜、肺穿刺或外科手术采自病变组织的标本经组织病理学检查表现为肉芽肿性病变，并伴有相应的组织炎症反应，特殊染色证实为隐球菌。
2、肺曲霉病患者的入组标准：
(1)年龄>18岁。
(2)首次发病，包括院外和院内感染患者。
(3)确诊或临床诊断肺曲霉病。
确诊肺曲霉病依据：具有肺曲霉病的临床和(或)影像表现，且微生物学检查结果或病理组织学检查结果符合以下任意一项的病例均应全部入选：
(1)无菌条件下采集的血液、胸腔积液(与临床确定的感染部位一致)或病变肺组织标本涂片镜检发现曲霉或培养有曲霉生长。
(2)对播散性感染患者，无菌条件下采集的肺外感染部位脓液涂片发现曲霉或培养有曲霉生长。
(3)通过支气管镜、肺穿刺或外科手术采自病变组织的标本经组织病理学检查表现为肉芽肿性病变，并伴有相应的组织炎症反应，特殊染色证实为曲霉。
临床诊断依据：具有肺曲霉病的临床和(或)影像表现，且微生物学检查结果符合以下证据任意一条的病例均应全部入选：
(1)呼吸道标本(痰/咽拭子/BALF/支气管吸引物)镜检或培养提示曲霉。
(2)半乳甘露聚糖抗原检测阳性(包括BALF、胸腔积液)。
(3)分子生物学检测结果包括mNGS或PCR阳性(包括血清、BALF、胸腔积液、脑脊液、肺组织、痰液)。
3、肺结核病患者的入组标准：
(1)年龄>18岁。
(2)首次发病，包括院外和院内感染患者。
(3)确诊或临床诊断肺结核病。
肺结核病确诊依据：
(1)痰涂片阳性性肺结核。符合下列3项之一者：
①2份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性。
②1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+肺部影像学检查符合活动性肺结核影像学表现。
③1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+1份痰标本结核菌培养阳性。
(2)仅培养阳性肺结核。同时符合下列2项者：
①痰涂片阴性。
②肺部影像学检查符合活动性肺结核影像学表现+1份痰标本结核菌培养阳性。
(3)肺部影像学检查符合活动性肺结核影像学表现，分子生物学检测阳性(如PCR、Xpert MTB/RIF)。
(4)肺或胸膜病变标本病理学诊断为结核病变者。
符合下列条件之一者为临床诊断病例：
(1)痰涂片3次阴性，胸部影像学检查显示有与活动性肺结核相符的病变，且伴有咳嗽、咳痰、咯血等肺结核可疑症状。
(2)痰涂片3次阴性，胸部影像学检查显示有与活动性肺结核相符的病变，且TST强阳性。
(3)痰涂片3次阴性，胸部影像学检查显示有与活动性肺结核相符的病变，且结核抗体检查阳性。
(4)痰涂片3次阴性，胸部影像学检查显示有与活动性肺结核相符的病变，且肺外组织病理检查证实为结核病变。
(5)痰涂片3次阴性的疑似肺结核病例，经诊断性治疗或随访观察可排除其他肺部疾病者。
(6)支气管镜检查符合气管、支气管结核改变。
(7)单侧或双侧胸腔积液，胸水检查提示渗出液，胸水ADA明显升高，伴有TST阳性或IGRA阳性。
本研究参与者的血清样本是按照常规的临床操作指南获得的，采血工作由专业护士完成。血液被收集在分离管中，在室温下凝结30分钟，然后离心。收集血清样本，在提取鞘脂之前储存在-80℃。
表2正常人、肺隐球菌病人、肺曲霉菌病人和肺结核病人的年龄与性别
Figure BDA0003600447760000071
二、血清鞘磷脂组样品的制备
将20μL血清样品、0.75mL氯仿/甲醇(1:2，v/v)溶剂和10μL 2.5μM鞘脂内标(Avanti Polar Lipids Inc,AL,USA)转移到一个硼硅酸盐玻璃管中。混合物在室温下超声处理30秒，并在48℃下培养12小时以提取总脂质。然后，加入75μL的1M氢氧化钾进行碱性水解2小时。用醋酸中和后，将上清液保存在一个新的瓶子里，残余物先后用1mL氯仿/甲醇(2:1，v/v)溶剂和由0.4mL氯仿/甲醇(1:2，v/v)、1mL氯仿和2mL水组成的混合溶剂进行提取。最后，合并提取液，并在氮气流下干燥，以100μL甲醇复溶样品，用于超高效液相色谱-质谱检测。
三、血清鞘脂组的超高效液相色谱-质谱法检测
色谱分离在Agilent 1290Infinity UHPLC系统(Agilent,Santa Clara,CA,USA)上进行，使用Agilent Eclipse Plus C18柱(100mm×2.1mm,1.8μm)。流动相由(A)甲醇/水/甲酸(60:40:0.2，v/v/v)和(B)甲醇/异丙醇/甲酸(60:40:0.2，v/v/v)组成，均含有10mM乙酸铵。色谱梯度为：0-3分钟，0-10％B；3-5分钟，10-40％B；5-5.3分钟，40-55％B；5.3-8分钟，55-60％B；8-8.5分钟，60-80％B；8.5-10.5分钟，80-80％B；10.5-16分钟，80-90％B；16-19分钟，90-90％B；19-22分钟，90-100％B。鞘脂的定量在Agilent6460三重四极杆质谱上以多重反应监测和正向模式进行。
四、统计学分析
鞘脂定量数据是用Agilent MassHunter定量分析B.09.00软件获得的。SIMCA软件15.0.2版(Sartorious Stedim Biotech,Umea,Sweden)用于多变量统计分析，其中正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)用于识别可区分不同组间的鞘脂。变量投影重要度(VIP)值大于1，p值<0.05，差异倍数(FC)≥1.5的鞘脂被认为是潜在的诊断生物标志物。R2Y和Q2值表示OPLS-DA模型的拟合度，R2Y和Q2的累积值接近1表示模型优秀。所有的统计分析都使用SPSS软件26.0版(IBM公司，Armonk，NY，USA)和GraphPad Prism软件9.00版(GraphPad软件，LaJolla，CA，USA)。使用方差分析(ANOVA)对呈正态分布的数据进行了比较。所有的假设检验都是双侧的，p<0.05被认为是有统计学意义的。潜在诊断生物标志物的接受者特征(ROC)曲线进行评估，该曲线由所有可能的临界值的敏感性(真阳性率)和1-特异性(假阳性率)组成。ROC曲线下的面积(AUC)反映了潜在生物标志物的诊断功效。AUC越接近于1，说明生物标志物的整体诊断效果越好。
五、基于多变量统计分析发现可区分正常人和肺隐球菌病人的鞘脂
首先对正常人和肺隐球菌病人的测试样本进行OPLS-DA分析，如图1B所示，正常人和肺隐球菌病人具有明显的组间分类趋势，其建模的R2X＝0.796，R2Y＝0.823，Q2＝0.544。同样对正常人与3个患病组(图1A)、肺隐球菌病人与曲霉菌病人(图1C)，以及肺隐球菌病人与肺结核病人进行OPLS-DA分析(图1D)。结果OPLS-DA评分图显示各组别具有明显的组间分类趋势，表明了各组之间的血清鞘脂组存在差异。
继而根据以下准则筛选标志物：VIP>1，p值<0.05，FC≥1.5。结果发现11个鞘磷脂标志物，包括SM(d18:0/18:0)、SM(d18:1/18:0)、SM(d18:1/20:0)、SM(d18:1/24:0)、SM(d18:1/26:1)、SM(d18:2/18:0)、SM(d18:2/20:0)、SM(d18:2/20:1)、SM(d18:2/22:1)、SM(d18:2/23:1)、SM(d18:2/24:2)(图2A)；以及10个神经酰胺标志物，包括Cer(d18:1/16:0)、Cer(d18:1/18:0)、Cer(d18:1/20:0)、Cer(d18:1/22:0)、Cer(d18:1/23:0)、Cer(d18:1/24:1)、Cer(d18:1/25:0)、Cer(d18:2/22:0)、Cer(d18:2/23:0)、Cer(d18:2/24:1)(图2B)；如图所示，这些标志物的水平在肺隐球菌病人血清中明显升高。
进一步对这些潜在诊断标志物进行ROC曲线评估，AUC越接近于1，说明生物标志物的整体诊断效果越好，因此进一步筛选AUC>0.9的标志物。如图3所示，5个AUC>0.9的潜在诊断标志物，包括SM(d18:1/18:0)、SM(d18:2/18:0)、SM(d18:2/20:0)、Cer(d18:1/18:0)和Cer(d18:2/24:1)。
六、设定验证组验证从测试组所发现的潜在标志物的诊断能力
测定验证组中，SM(d18:1/18:0)、SM(d18:2/18:0)、SM(d18:2/20:0)、Cer(d18:1/18:0)和Cer(d18:2/24:1)的水平，并根据从测试组所得的最佳临界值计算各潜在标志物对肺隐球菌验证组的诊断能力，结果只有Cer(d18:1/18:0)对肺隐球菌验证组的敏感度和特异性均高于80％。如图4所示，以12.05nM作为最佳临界值时，Cer(d18:1/18:0)诊断肺隐球菌验证组的灵敏度达80％，特异性达85％。
七、进一步验证Cer(d18:1/18:0)对肺隐球菌病人的特异性诊断能力
比较正常人、肺隐球菌病人、肺曲霉菌病人和肺结核病人血清中Cer(d18:1/18:0)的水平。如图5所示，感染肺隐球菌、肺曲霉菌或肺结核菌后，血清中Cer(d18:1/18:0)的水平普遍比正常人高，表明感染微生物会导致血清中Cer(d18:1/18:0)水平的升高。其中肺隐球菌病人血清中Cer(d18:1/18:0)的上升幅度比肺曲霉菌病人和肺结核病人高，而且具有统计学差异。然而，以12.05nM作为临界值时，正确判断肺曲霉菌病人和肺结核病人为肺隐球菌阴性的百分率分别只有约50％和60％，因而容易出现假阳性的判断。将临界值提高到18.00nM时，对肺隐球菌病人的敏感度虽然下降至76.6％，但正确判断正常人、肺曲霉菌病人和肺结核病人为肺隐球菌阴性的百分率可以分别提升至95.0％、77.8％和83.3％。由此可见，Cer(d18:1/18:0)可作为肺隐球菌病人的特异性诊断标志物。
八、监测肺隐球菌病人血清中Cer(d18:1/18:0)水平于治疗后的变化
对肺隐球菌病人给予氟康唑、伏立康唑等药后，分别监测治疗后3-4个月后血清中Cer(d18:1/18:0)的水平。如图6所示，肺隐球菌病人血清中Cer(d18:1/18:0)水平于治疗后，随着病情的好转水平有下降。由此可见，血清中Cer(d18:1/18:0)的水平于治疗后呈现回调的现象，因此可以同时作为监测疗效的标志物。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种血清标志物在制备用于辅助诊断隐球菌病的试剂盒中的应用，其特征在于，所述血清标志物为：SM (d18:1/18:0)、SM (d18:2/18:0)、SM (d18:2/20:0)、Cer (d18:1/18:0)、Cer (d18:2/24:1)中的一种或两种以上。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当所述血清标志物满足下述（1）~（5）中至少一个条件时，则判定为肺隐球菌病高风险：
（1）SM (d18:1/18:0)在血清中的浓度高于5711.96 nM；
（2）SM (d18:2/18:0)在血清中的浓度高于7961.47 nM；
（3）SM (d18:2/20:0)在血清中的浓度高于1436.83 nM；
（4）Cer (d18:1/18:0)在血清中的浓度高于12.05 nM；
（5）Cer (d18:2/24:1)在血清中的浓度高于43.65 nM。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，当Cer (d18:1/18:0)在血清中的浓度高于18.00 nM，则判定为肺隐球菌病高风险。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血清标志物为Cer (d18:1/18:0)。
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