CN111279193A - 利用尿代谢组分析诊断白塞氏病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用尿代谢组分析诊断白塞氏病的方法。本发明提供一种能够使用代谢组学有效诊断白塞氏病的生物标记，并且所述生物标记可应用于治疗塞氏病的药剂的研发。

Description

利用尿代谢组分析诊断白塞氏病的方法
技术领域
本发明涉及一种通过尿代谢组学分析(metabolomic analysis)来诊断白塞氏病(Behcet’s disease)的方法。
背景技术
白塞氏病是一种病因未知且由例如以下症状表征的系统性血管炎：在口腔或生殖器的皮肤粘膜区域出现溃疡、关节炎、疾病侵入例如血管及中枢神经系统等重要器官。也就是说，白塞氏病是一种可发生在任何血液流动地方的系统性血管炎，并表现出各种临床及严重症状。白塞氏病非常频繁地发生在从地中海到远东的地区，例如韩国、中国、日本及土耳其。白塞氏病临床表现多样，且在某些情况下可能引起严重的并发症及疾病，且因此早期诊断白塞氏病非常重要。据报道，在已知白塞氏病发病率高的土耳其，治疗普通白塞氏病每年每个患者花费约3,300美元，且治疗有神经症状的白塞氏病患者花费约5,000美元。具体来说，由于在20到40岁的人群中疾病活性最高，因此在较年轻的人群中，由于严重并发症的发生而造成的经济及社会损失可能会非常大。此外，据估计，大约42％的白塞氏病患者一年中约有120天不能工作。由于白塞氏病在韩国也是一种非常常见的疾病，因此预计由白塞氏病引起的直接及间接医疗费用所需的支出非常高。
因此，认为发现能够快速准确地进行白塞氏病鉴别诊断的生物标记不仅在医学上而且在社会经济上都非常重要。
目前，还没有可区分白塞氏病患者与健康个体的客观的诊断生物标记，且因此白塞氏病的诊断主要依赖于临床症状。然而，白塞氏病具有多种临床症状，因此基于临床症状的诊断显示出低敏感度及特异性。此外，还存在一个问题，即在白塞氏病发病后需要长时间才能作出诊断。为了克服这一点，发明一种客观的诊断生物标记是非常重要的。因此，通过发现能够诊断白塞氏病的客观诊断生物标记，便可在早期诊断白塞氏病，从而可减少确诊白塞氏病所需的时间，并且可进行适合于疾病水平的定制化治疗，且因此可避免症状恶化及昂贵且不必要的治疗。此外，利用关于疾病相关预后的准确信息，可获得更好的治疗结果。
近年来，用于发现各种疾病中的生物标记的代谢组学方法受到了广泛关注。迄今为止，文献已报道了存在使用蛋白质组学发现用于诊断白塞氏病的生物标记的尝试，但蛋白质生物标记的问题在于它们在检测方面不如代谢物生物标记快速及方便，且因此难以用于实际诊断。此外，为了诊断白塞氏病，已经使用代谢组学方法在血液中发现了生物标记。当通过代谢组学方法在尿中发现的生物标记与其结合使用时，有望提供更合适的诊断。此外，由于通过非侵入性方法可更容易及方便地采集尿，因此预期尿将用作诊断白塞氏病的合适样本。
白塞氏病是一种非常复杂的疾病，表现出各种临床症状，这些症状是由于包括遗传及环境因素在内的各种原因引起的免疫系统激活而产生的，且因此代谢组学方法被认为是发现白塞氏病中生物标记的有用且合适的方法，并且据研究人员所知，还没有关于利用尿来鉴别诊断白塞氏病的代谢组学方法的研究。与白塞氏病诊断相关联的相关技术如下。
迄今为止报道的在白塞氏病中发现生物标记的技术主要基于蛋白质组学方法，但结果不清楚或者难以在白塞氏病的诊断中实际使用这些技术[非专利文献1]。
非专利文献2是对通过由白塞氏病引起的关节炎的滑液与其他血清阴性炎性关节炎的滑液之间的代谢物差异进行鉴别诊断的研究，且其目的是在关节炎患者中诊断出由白塞氏病引起的关节炎，而不是通过将白塞氏病患者与正常个体区分来进行诊断。此外，非专利文献3描述了通过比较血清阳性类风湿性关节炎的滑液与包括白塞氏病在内的其他形式的炎性关节炎的滑液之间的代谢物来发现用于诊断血清阳性类风湿性关节炎的生物标记的尝试，并且其目的是诊断出类风湿性关节炎患者中由白塞氏病引起的关节炎，而不是诊断白塞氏病。
如在非专利文献2及3中所示，滑液代谢物的使用需要特定的侵入性方法来采集滑液样本，且因此使得在一般检查中难以采集这些样本用于诊断目的，并且滑液代谢物仅可用于特定疾病的亚组分类，导致在一般检查中难以使用滑液代谢物。
非专利文献4旨在利用白塞氏病患者的血液样本与健康个体的血液样本中的代谢物之间的差异来诊断白塞氏病。在血液样本的情形中，需要侵入式方法，此需要授权的专业人员来采集，且因此测试对象无法直接采集样本并进行自我诊断。
[相关技术文献]
[非专利文献]
诚道(Seido)等人。通过蛋白质组学方法对白塞氏病患者自身抗原进行蛋白质组学监测(Proteomic surveillance of autoantigens in patients with Behcet'sdisease by a proteomic approach)。(2010)微生物免疫学54:354-361((2010)MicrobiolImmunol 54:354-361)。
安杰(Ahn J)等人。使用滑液对白塞病伴关节炎及血清阴性关节炎进行代谢组学比较评估(A comparative metabolomic evaluation of Behcet's disease witharthritis and seronegative arthritis using synovial fluid)。(2015)公共科学图书馆10:e0135856((2015)PLOS ONE 10:e0135856)。
金姆斯(Kim s)等人。滑液的整体代谢物图谱用于类风湿性关节炎与其他炎性关节炎的特异性诊断(Global metabolite profiling of synovial fluid for thespecific diagnosis of rheumatoid arthritis from other inflammatoryarthritis)。(2014)公共科学图书馆9:e97501((2014)PLOS ONE 9:e97501)。
安杰(Ahn J)等人。使用气相色谱及飞行时间质谱对白塞氏病进行可靠诊断的潜在代谢组学生物标记(Potential metabolomic biomarkers for reliable diagnosis ofBehcet's disease using gas chromatography with time-of-flight massspectrometry)。(2018)关节骨脊柱95:337-343((2018)Joint Bone Spine 95:337-343)。
发明内容
技术问题
为了对白塞氏病患者特异性地进行鉴别诊断，本发明的发明人发现了能够通过尿液样本来诊断白塞氏病的生物标记，所述尿液样本可使用非侵入性方法采集，以通过代谢组学方法进行快速、准确及方便的诊断。通过使用气相色谱/飞行时间质谱(gaschromatography/time-of-flight mass spectrometry，GC/TOF MS)对白塞氏病患者及正常个体进行尿代谢组学分析而检测到了110种代谢物。其中，通过计算除尿之外的109种代谢物的正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminantanalysis，OPLS-DA)值及变量投影重要性(variable importance for projection，VIP)值、受试者操作特性(receiver operating characteristic，ROC)曲线的曲线下面积(areaunder the curve，AUC)的值、倍数变化、p值等，提出了白塞氏病患者尿中的10种有效代谢物生物标记(鸟嘌呤、3-羟基吡啶、次黄嘌呤、L-瓜氨酸、异苏糖酸盐、吡咯-2-羧酸酯、植物半乳糖、葡萄糖酸内酯、景天庚酮糖及甘露糖)。此外，同时使用10种生物标记构建了用于诊断白塞氏病的有效小组(potent panel)，并使用确认集(validation set)验证了其临床有效性。
因此，本发明的目的是提供一种通过尿代谢组学分析诊断白塞氏病的试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种分析代谢物差异用于诊断白塞氏病的方法。
技术解决方案
本发明提供一种白塞氏病诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括用于一种或多种尿代谢物的定量装置，所述尿代谢物选自由鸟嘌呤(guanine)、3-羟基吡啶(3-hydroxypyridine)、次黄嘌呤(hypoxanthine)、L-瓜氨酸(L-citrulline)、异苏糖酸盐(isothreonate)、吡咯-2-羧酸酯(pyrrole-2-carboxylate)、植物半乳糖(galactonate)、葡萄糖酸内酯(gluconic acid lactone)、景天庚酮糖(sedoheptulose)及甘露糖(mannose)组成的群组。
本发明还提供一种检测从正常对照获得的尿与从白塞氏病获得的尿之间的代谢物差异的方法，所述方法包括：通过依序执行以下过程来分析来自尿的代谢物生物标记：
(1)利用气相色谱/飞行时间质谱(GC/TOF MS)来分析代谢物；
(2)通过对利用气相色谱/飞行时间质谱所识别的所述代谢物进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)来确认代谢物图谱(metabolite profile)之间的差异；
(3)在通过偏最小二乘判别分析获得的所述代谢物中选择变量投影重要性(VIP)值为1.0或大于1.0的代谢物作为代谢物生物标记候选物，并通过偏最小二乘判别分析的负荷值来确认所述代谢物生物标记候选物的增加或减少；以及
(4)使用受试者操作特性曲线(ROC曲线)验证代谢物生物标记。
发明的有利效果
根据本发明，首先验证了能够使用基于代谢组学的尿分析来特异性诊断白塞氏病的生物标记。这些生物标记可作为揭示尚未完全被发现的白塞氏病发病机制的研究基础。此外，这些生物标记也可用于研发针对各种临床症状优化的治疗剂。有助于诊断白塞氏病的生物标记的发现使得能够快速且准确地诊断白塞氏病患者，并且显著减少临床诊断所需的长时间，从而快速地为患者提供定制化治疗，并且因此预期例如快速恢复日常生活等社会及经济连锁效应是相当大的。具体来说，与使用现有血液样本诊断白塞氏病的情况不同，测试对象可通过以非侵入性方式直接采集尿液样本来执行自我诊断。此外，当同时使用血液样本及尿液样本进行诊断时，可进一步增强特异性。
附图说明
图1示出使用OPLS-DA获得的显示从白塞氏病患者获得的尿与从健康对照获得的尿之间的代谢物图谱差异的结果，
其中A是由OPLS-DA产生的多元统计模型的得分图，其中白塞氏病患者的代谢物与健康对照的代谢物显示出明显的差异，
B是由OPLS-DA产生的多元统计模型的负荷图(loading plot)，其示出每种代谢物的丰度如何有助于构建的模型(参见表2)，且
C示出OPLS-DA模型的排列结果，其示出OPLS-DA模型没有被过度拟合，并且还可用于确认集的分析，而不限于用于分析的样本[BD：白塞氏病；HC：健康对照]。
图2是一组图表，用于比较在白塞氏病组中显示显著增加的3种代谢物(A)的水平与在白塞氏病组中显示显著减少的7种代谢物(B)的水平。
图3示出PLS-DA结果，其显示施用或未施用类固醇(steroid)、秋水仙碱(colchicine)或硫唑嘌呤(azathioprine)的白塞氏病患者组之间的代谢物差异，其中每个施药组与未施药组之间的差异由于其非常低的Q2值而没有再现性(reproducibility)，并且在各组代谢物之间没有统计学上显著的差异。
图4示出通过OPLS-DA使用在白塞氏病组中显示显著增加的3种代谢物(例如，鸟嘌呤、吡咯-2-羧酸酯及3-羟基吡啶)及在白塞氏病组中显示显著减少的7种代谢物(次黄嘌呤(hypoxanthine)、L-瓜氨酸(L-citrulline)、异苏糖酸盐(isothreonate)、植物半乳糖(galactonate)、葡萄糖酸内酯(gluconic acid lactone)、景天庚酮糖(sedoheptulose)及甘露糖(mannose))分析用于诊断白塞氏病的代谢物生物标记小组的结果，其中当使用单轴(t[1])时，R2X值为0.650，其显示恰当的分类，并且所述模型显示出为0.600的Q2值，由此确认所述模型具有再现性。
图5示出用于使用尿液样本诊断白塞氏病的代谢诊断小组的受试者操作特性曲线(ROC)结果，其中使用10种代谢物的组合的生物标记小组在诊断白塞氏病时表现出96.7％的敏感度、93.3％的特异性及0.974的AUC值。
图6示出用于使用尿液样本诊断白塞氏病的代谢诊断小组的确认集验证结果，其中主成分分析结果显示，在白塞氏病患者的14份尿液样本及健康对照的11份尿液样本中，所述小组能够准确预测白塞氏病患者的11份尿液样本及健康对照的11份尿液样本。
具体实施方式
在下文中，将详细描述本发明的配置。
本发明涉及一种白塞氏病诊断试剂盒，所述白塞氏病诊断试剂盒包括用于一种或多种血液代谢物的定量装置，所述血液代谢物选自由鸟嘌呤(guanine)、3-羟基吡啶(3-hydroxypyridine)、次黄嘌呤(hypoxanthine)、L-瓜氨酸(L-citrulline)、异苏糖酸盐(isothreonate)、吡咯-2-羧酸酯(pyrrole-2-carboxylate)、植物半乳糖(galactonate)、葡萄糖酸内酯(gluconic acid lactone)、景天庚酮糖(sedoheptulose)及甘露糖(mannose)组成的群组。
为了发现白塞氏病的生物标记，本发明的发明人从白塞氏病患者采集尿液样本，对尿液样本进行甲醇提取，使用GC/TOF MS比较及分析白塞氏病患者与正常个体之间代谢物图谱的差异，并对利用所述差异发现能够诊断白塞氏病患者的生物标记进行研究。
结果，识别出总共110种代谢物，且其中，检测到最大数量的有机酸，然后依次是氨基酸、糖、脂肪酸、胺及磷酸盐等。
在统计分析中使用除尿之外的109种代谢物，且当将30名白塞氏病患者的尿液样本与30名健康对照的尿液样本进行比较时，通过正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)确认了白塞氏病患者的尿液样本与健康对照的尿液样本之间代谢物的明显差异，并选择VIP值为1.0或大于1.0、倍数变化为1.5或大于1.5、AUC为0.800或大于0.800以及p值小于0.01的10种代谢物作为新颖生物标记候选物。此外，为了确认白塞氏病的特异代谢物图谱及生物标记候选物不是由于被施用以治疗白塞氏病的药物的作用，将白塞氏病患者根据施用的药物进行分组以进行PLS-DA，且结果确认了施予白塞氏病患者的药物未导致代谢物差异。
此外，为更简易且更有利地进行诊断，产生了由被选择作为候选生物标记的10种代谢物组成的用于区别白塞氏病的代谢物生物标记小组。为了确认由10种代谢物组成的将用于诊断白塞氏病的生物标记小组的潜力，使用ROC曲线进行了验证，并且所述生物标记小组具有96.7的敏感度、93.3％的特异性及0.974的AUC值，从而显示出对诊断白塞氏病来说非常好的结果。此外，为了确认模型的适用性，检查了由10种代谢物组成的生物标记小组是否能够通过使用从14个白塞氏病患者获得的尿液样本及11份健康对照的尿液样本来诊断确定集。结果，验证了使用本发明的发明人发现的10种代谢物的生物标记小组适用于诊断白塞氏病。
更优选地，可使用选自由甘露糖、L-瓜氨酸、次黄嘌呤、葡萄糖酸内酯、鸟嘌呤及3-羟基吡啶组成的群组中的一种或多种代谢物来诊断白塞氏病，所述代谢物具有为2.0或大于2.0的倍数变化。
本文中所用的术语“诊断”旨在包括确定实验对象对特定疾病或失调症的易感性，确定实验对象当前是否患有特定疾病或失调症(例如，识别白塞氏病)，确定具有特定疾病或失调症的实验对象的预后，或治疗量度(therametrics)(例如，监测实验对象的状况以提供关于治疗功效的信息)。
本发明的诊断试剂盒中所包括的定量装置可以是色谱仪/质谱仪。
在本发明中使用的色谱仪包括用于气相色谱、液固色谱(liquid-solidchromatography，LSC)、纸色谱(paper chromatography，PC)、薄层色谱(thin-layerchromatography，TLC)、气固色谱(gas-solid chromatography，GSC)、液液色谱(liquid-liquid chromatography，LLC)、泡沫色谱(foam chromatography，FC)、乳液色谱(emulsionchromatography，EC)、气液色谱(gas-liquid chromatography，GLC)、离子色谱(ionchromatography，IC)、凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography，GFC)或凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography，GPC)的色谱仪，但本发明并不仅限于此，且可使用所属领域中常用的任何用于定量的色谱仪。优选地，在本发明中使用的色谱仪是气相色谱仪。此外，在本发明中使用的质谱仪是MALDI-TOF MS或TOF MS，更优选地是TOF MS。
本发明的尿代谢物的各组分通过气相色谱分离，并且不仅通过准确的分子量信息、而且通过使用通过Q-TOF MS获得的信息的元素组成对所述各组分进行识别。
根据本发明的示例性实施例，其中选自由鸟嘌呤、吡咯-2-羧酸酯及3-羟基吡啶组成的群组中的一者或多者的浓度增加的情形指示白塞氏病，并且其中选自由次黄嘌呤、L-瓜氨酸、异苏糖酸盐、植物半乳糖、葡萄糖酸内酯、景天庚酮糖及甘露糖组成的群组中的一者或多者的浓度降低的情形指示白塞氏病。
本文中所用的术语“尿代谢物浓度的增加”是指白塞氏病患者的尿代谢物浓度与健康个体相比可测量地显著增加，优选地增加70％或大于70％，且更优选地增加30％或大于30％。
本文中所用的术语“尿代谢物浓度的降低”是指白塞氏病患者的尿代谢物浓度与健康个体相比可测量地显著降低，优选地降低40％或大于40％，且更优选地降低20％或大于20％。
根据本发明，与健康个体相比，在白塞氏病患者中表现出选自由鸟嘌呤、吡咯-2-羧酸酯及3-羟基吡啶组成的群组中的一者或多者的浓度显著增加，且与健康个体相比，在白塞氏病患者中表现出选自由次黄嘌呤、L-瓜氨酸、异苏糖酸盐、植物半乳糖、葡萄糖酸内酯、景天庚酮糖及甘露糖组成的群组中的一者或多者的浓度显著降低(参见表3)。
本发明还提供一种检测从正常对照获得的尿与从白塞氏病获得的尿之间的代谢物差异的方法，所述方法包括：通过依序执行以下过程来分析来自尿的代谢物生物标记：
(1)利用气相色谱/飞行时间质谱(GC/TOF MS)来分析代谢物；
(2)通过对利用气相色谱/飞行时间质谱所识别的所述代谢物进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)来确认代谢物图谱之间的差异；
(3)在通过偏最小二乘判别分析获得的所述代谢物中选择变量投影重要性(VIP)值为1.0或大于1.0的代谢物作为代谢物生物标记候选物，并通过偏最小二乘判别分析的负荷值来确认所述代谢物生物标记候选物的增加或减少；以及
(4)使用受试者操作特性曲线(ROC曲线)验证代谢物生物标记。
将详细描述根据本发明分析两个生物样本群组(即，从白塞氏病患者获得的尿液样本及从正常对照获得的尿液样本)之间代谢物差异的方法作为实例。
首先，用100％甲醇提取从正常个体及白塞氏病患者采集的尿液样本，且然后用已知的技术进行衍生化(derivatized)以用于GC/TOF MS中。
使用GC/TOF MS分析尿液样本的代谢物的方法包括：使用GC/TOF MS系统分析尿提取物，将分析结果转换成统计学上可处理的值，且然后使用经转换的值以统计方式验证两组生物样本之间代谢物的差异。
将GC/TOF MS结果转换成统计学上可处理的值可为在以单位时间间隔划分总分析时间后，确定代表单位时间的色谱峰的面积或高度的最大值作为所述单位时间的代表值。
根据本发明的一个实施例，作为GC/TOF MS分析的结果，识别出了总共110种代谢物，且其中检测到最大数量的有机酸，然后依次是氨基酸、糖、脂肪酸、胺、磷酸盐等。
通过将由GC/TOF MS获得的代谢物的强度除以所有已识别代谢物的强度之和，对每种代谢物进行正规化，并对其进行PLS-DA。
创建由代谢物的PLS-DA负荷值及VIP值组成的V图(V-plot)，选择VIP值为1.0或大于1.0的代谢物作为代谢物生物标记候选物，并且确认PLS-DA的负荷值的增加或减少，且就此来说，正的负荷值表示代谢物倾向于增加，且负的负荷值表示代谢物倾向于减少。
可使用通过GC/TOF MS分析的血液样本的代谢物的强度来确认代谢物的增加或减少。
通过ROC曲线验证了代谢物生物标记。
根据本发明的一个实施例，作为用于诊断白塞氏病的生物标记，可使用选自由鸟嘌呤、3-羟基吡啶、次黄嘌呤、L-瓜氨酸、异苏糖酸盐、吡咯-2-羧酸酯、植物半乳糖、葡萄糖酸内酯、景天庚酮糖及甘露糖组成的群组中的一者或多者。
根据本发明，分析从正常组获得的尿液样本与从白塞氏病患者获得的尿液样本之间代谢物差异的方法使得能够对白塞氏病进行更一致、高度可靠且准确的诊断，并且可应用于治疗剂的研发。
本发明的实施方式
在下文中，将参照以下实例更详细地描述本发明，但这些实例并不旨在限制本发明的范围。
[实例]
实例1：使用GC/TOF MS识别代谢物
将白塞氏病患者组及健康对照各10微升尿与990微升纯甲醇混合并大力旋转，且将混合物离心以提取代谢物。
GC/TOF MS的衍生化过程如下。
将每个所提取的样本在速度袋(speed bag)中进行了干燥，且然后向其中添加了5微升吡啶中40％(w/v)O-甲基羟胺盐酸盐(O-methylhydroxylamine hydrochloride)，以使它们之间在30℃及200转/分钟(rpm)下反应90分钟。然后，向其中添加了45微升的N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide)以使它们之间在37℃及200转/分钟下反应30分钟。
GC/TOF MS的仪器条件如下。
用于分析的柱是RTX-5Sil MS毛细管柱(长为30米、膜厚为0.25毫米且内径为25毫米)，且气相色谱柱(GC column)温度条件如下：首先，将温度保持在50℃下达5分钟，且然后将温度升高到330℃并保持1分钟。以无分流方式(splitless mode)注射每份样本1微升。将传输线(transfer line)温度及离子源温度分别保持在280℃及250℃下。在具有GC/TOF MS结果的库中发现了110种代谢物并进行了识别，并且由于超出仪器检测范围的高浓度的尿可能对统计分析产生不利影响，因此使用了109种代谢物进行分析(参见表1)。表1示出作为使用白塞氏病患者的尿液样本及健康对照的尿液样本分析代谢物的结果而识别出的109种代谢物，并且当按代谢物组分类时，存在23.6％的有机酸、21.8％的氨基酸、21.8％的糖、12.7％的脂肪酸、11.8％的胺、1.8％的磷酸盐及6.4％的其他物质。
[表1]
Figure BDA0002464167650000111
Figure BDA0002464167650000121
实例2：使用OPLS-DA获得的白塞氏病患者的尿液样本与健康对照的尿液样本中代谢物图谱的差异
将根据实例1识别的每种代谢物的强度除以所有所识别的代谢物的强度之和，以使每种代谢物正规化。随后，使用SIMCA-P+(版本14.1)对其进行了OPLS-DA分析。
如图1所示，确认了白塞氏病患者的尿液样本与健康对照的尿液样本之间代谢物图谱存在明显差异。
表2示出负荷值及VIP值，此指示每种代谢物对模型的影响程度。
[表2]
Figure BDA0002464167650000122
Figure BDA0002464167650000131
Figure BDA0002464167650000141
实例3：白塞氏病患者特异性生物标记代谢物的选择
为了找到在白塞氏病患者中显示出特异增加或减少的生物标记，获得了影响从实例2获得的每种代谢物的代谢组学图谱差异的VIP值、倍数变化、AUC值及p值。将为1.0或大于1.0的VIP值、为1.5或大于1.5的倍数变化、为0.800或大于0.800的AUC值及小于0.01的p值设定为每种代谢物的标准，并且10种代谢物表现出对诊断白塞氏病的适用性(参见表3)。
下表3显示了被选择作为用于诊断白塞氏病的潜在生物标记的10种代谢物的VIP值、AUC值、倍数变化及p值(BD：白塞氏病患者；对照：健康个体)。
另外，使用箱线图(参见图2)比较组之间的代谢物峰强度。
[表3]
Figure BDA0002464167650000151
AUC，ROC曲线下的面积；BD，白塞氏病；VIP，变量投影重要性
实例4：使用PLS-DA验证药物对白塞氏病患者中代谢物表现出增加或减少是否有影响
为了验证白塞氏病患者中表现出特异增加或减少的生物标记不受药物影响，使用PLS-DA对每个施药组及未施药组进行了比较，结果发现分离水平(level of separation)不充分且不可再现。根据被施用类固醇、秋水仙碱或硫唑嘌呤的3组中的药物，没有再现性且没有统计学显著差异。
因此，由于在实例3中表现出的白塞氏病组的代谢物的增加或减少是由于疾病本身引起的变化，因此确认所述代谢物适合作为生物标记(参见图3)。
实例5：使用10种代谢物通过尿液样本来诊断白塞氏病的代谢诊断小组的建立
通过OPLS-DA同时使用在实例3中选择的用于诊断白塞氏病的10种生物标记，即在白塞氏病患者显示出显著增加的3种代谢物(鸟嘌呤、吡咯-2-羧酸酯及3-羟基吡啶)及在白塞氏病患者中显示出显著减少的7种代谢物(次黄嘌呤、L-瓜氨酸、异苏糖酸盐、植物半乳糖、葡萄糖酸内酯、景天庚酮糖及甘露糖)，建立了能够诊断白塞氏病的代谢诊断小组。
当使用单轴(即t[1])时，所述模型表现出R2X值为0.529，R2Y值为0.650，且Q2值为0.600，这些在统计学上是显著的，从而表明白塞氏病患者与健康对照被适当的且可再现地区别开(参见图4)。
实例6：通过ROC的模型验证及使用尿液样本诊断白塞氏病的代谢诊断小组的确认集验证
为了检查根据实例5产生的用于使用尿液样本中的10种生物标记诊断白塞氏病的代谢物生物标记小组是否适合于诊断，在模型中使用每个样本的PC1分数(PC1 score)绘制了受试者操作特性(ROC)曲线。结果，所述模型表现出96.7％的敏感度、93.3％的特异性及0.974的AUC值，从而表明所述模型非常适合用于诊断白塞氏病(参见图5)。
此外，为了检查所述小组是否能够使用确认集来预测白塞氏病的诊断，将白塞氏病患者的14份尿液样本及健康对照的11份尿液样本(即总共25份样本)放入小组中并用于预测。结果，所述小组预测：由于具有健康对照的值(模型中的正值)，健康对照的所有11份尿液样本都属于健康对照，并且由于具有白塞氏病患者的值(模型中的负值)，白塞氏病患者的14份尿液样本中的11份尿液样本指示白塞氏病患者。结果显示出，所述小组能够准确预测总共25份样本中的22份样本是白塞氏病患者还是健康对照，此表明具有10种代谢物的生物标记小组也适用于确认集的白塞氏病诊断(参见图6)。

Claims (10)

1.一种白塞氏病诊断试剂盒，包括用于一种或多种尿代谢物的定量装置，所述尿代谢物选自由鸟嘌呤、3-羟基吡啶、次黄嘌呤、L-瓜氨酸、异苏糖酸盐、吡咯-2-羧酸酯、植物半乳糖、葡萄糖酸内酯、景天庚酮糖及甘露糖组成的群组。
2.根据权利要求1所述的白塞氏病诊断试剂盒，其中所述白塞氏病诊断试剂盒包括所述尿代谢物中选自由以下组成的群组中的一者或多者：甘露糖、L-瓜氨酸、次黄嘌呤、葡萄糖酸内酯、鸟嘌呤及3-羟基吡啶。
3.根据权利要求1所述的白塞氏病诊断试剂盒，其中所述定量装置是色谱仪/质谱仪。
4.根据权利要求1所述的白塞氏病诊断试剂盒，其中，在选自由鸟嘌呤、吡咯-2-羧酸酯及3-羟基吡啶组成的群组中的一者或多者的浓度增加的情形中，所述情形指示白塞氏病。
5.根据权利要求1所述的白塞氏病诊断试剂盒，其中，在选自由次黄嘌呤、L-瓜氨酸、异苏糖酸盐、植物半乳糖、葡萄糖酸内酯、景天庚酮糖及甘露糖组成的群组中的一者或多者的浓度降低的情形中，所述情形指示白塞氏病。
6.一种检测从正常对照获得的尿与从白塞氏病获得的尿之间的代谢物差异的方法，所述方法包括：通过依序执行以下过程来分析来自血液的代谢物生物标记：
(1)利用气相色谱/飞行时间质谱(GC/TOF MS)来分析代谢物；
(2)通过对利用气相色谱/飞行时间质谱所识别的所述代谢物进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)来确认代谢物图谱之间的差异；
(3)在通过偏最小二乘判别分析获得的所述代谢物中选择变量投影重要性(VIP)值为1.0或大于1.0的代谢物作为代谢物生物标记候选物，并通过偏最小二乘判别分析的负荷值来确认所述代谢物生物标记候选物的增加或减少；以及
(4)使用受试者操作特性曲线(ROC曲线)验证代谢物生物标记。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述利用气相色谱/飞行时间质谱来分析所述代谢物包括利用气相色谱/飞行时间质谱系统来分析尿样本，将分析结果转换成统计学上可处理的值，且然后使用经转换的值以统计方式验证从正常对照获得的尿与从白塞氏病获得的尿之间的所述代谢物差异。
8.根据权利要求7所述的方法，其中将气相色谱/飞行时间质谱结果转换成统计学上可处理的值包括在以单位时间间隔划分总分析时间后，确定代表单位时间的色谱峰的面积或高度的最大值作为所述单位时间的代表值。
9.根据权利要求6所述的方法，其中在偏最小二乘判别分析的所述负荷值为正值的情形中，指示所述代谢物增加的趋势，并且在偏最小二乘判别分析的所述负荷值为负值的情形中，指示所述代谢物减少的趋势。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述代谢物生物标记包括选自由鸟嘌呤、3-羟基吡啶、次黄嘌呤、L-瓜氨酸、异苏糖酸盐、吡咯-2-羧酸酯、植物半乳糖、葡萄糖酸内酯、景天庚酮糖及甘露糖组成的群组中的一者或多者。
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