KR101516086B1 - 대사체 분석을 이용한 류마티스 관절염 진단방법 - Google Patents

대사체 분석을 이용한 류마티스 관절염 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대사체 분석을 이용한 류마티스 관절염 진단방법에 관한 것으로, 대사체학을 이용하여 다양한 염증성 관절염으로부터 류마티스 관절염을 효과적으로 진단할 수 있는 바이오마커를 제공하며, 이는 류마티스 관절염 치료제 개발에도 적용할 수 있다.

Description

대사체 분석을 이용한 류마티스 관절염 진단방법{Method for diagnosing rheumatoid arthritis by using metabolomics}
본 발명은 대사체 분석을 통해 염증성 관절염으로부터 류마티스 관절염을 진단하는 방법에 관한 것이다.
관절염은 크게 염증성 관절염과 비염증성 관절염으로 구분할 수 있으며, 염증성 관절염에 류마티스 관절염, 베체트 관절염, 통풍성 관절염, 강직성 관절염이 속한다. 류마티스 관절염은 관절막 이상비후와 관절손상에 의해 만성 자가면역 질병으로 구분된다. 종양 궤사 인자 억제제(tumor necrosis factor-α (TNF-α) inhibitors) 등이 류마티스 관절염 치료에 이용되고 있다. 류마토이드 인자(rheumatoid factor)는 류마티스 관절염의 바이오마커로 알려져 있으나 다른 관절염이나 질병 등에도 검출되기 때문에 류마티스 관절염을 진단하기 위해 유용하지 않다(Cammarata RJ et al (1967) JAMA -J Am Med Assoc 199 455-8, Litwin SD et al (1965) Arthritis Rheum 8 538-50). 항-시트룰린 단백 항체(Anti-citrullinated protein antibodies)는 최근에 류마티스 관절염의 조기 진단 표지자로서 각광을 받고 있다(Rantapaa-Dahlqvist S et al (2003) Arthritis Rheum 48 2741-9, Humphreys JH (2012) ?ostpublication validation of the 2010 American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism classification criteria for rheumatoid arthritis: where do we stand??urr Opin Rheumatol). 그러나 항-시트룰린 단백 항체는 모든 류마티스 관절염 환자들에게 혈청반응 양성이 아니며, 혈청반응 음성 환자는 류마티스 관절염으로 2010 ACR/EULAR에서 분류되지 않았다. 따라서, 류마티스 관절염의 초기 진단을 위한 신뢰할 수 있는 바이오마커의 개발이 중요하다.
류마티스 관절염의 바이오마커 발굴을 위해 오믹스 기술이 최근 각광받고 있다. 유전체학을 통해 항-시트룰린 단백 항체의 혈청반응 양성군과 음성군의 차이가 명확함을 밝혔으며(Kallberg H et al (2007) Am J Hum Genet 80 867-75), 전사체학을 이용하여 항종양 궤사 인자(anti-TNF-α) 생물학제제, 인플릭시맙(infliximab)의 효과를 입증하였다(Teixeira VH et al (2009) PLoS One 4, Tanino M et al (2009) Biochem Biophys Res Commun 387 261-5).
그러나, 대사체학을 이용한 류마티스 관절염 진단을 위해 빠르고 정확한 바이오마커 발굴은 아직 미비한 실정이다(Lauridsen MB et al (2010) J Proteome Res 9 4545-53, Madsen RK et al (2011) Arthritis Res Ther 13, Hugle T et al (2012) Clin Exp Rheumatol 30 240-5).
대한민국 공개특허 제2009-0037212호
Hugle T et al (2012) Clin Exp Rheumatol 30 240-5 Madsen RK et al (2011) Arthritis Res Ther 13
본 발명의 목적은 대사체 분석을 통해 염증성 관절염으로부터 류마티스 관절염을 진단하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 염증성 관절염으로부터 류마티스 관절염을 진단하기 대사체 차별성을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 옥타데카놀, 테레프탈산, 살리실알데히드, 시트룰린, 리비톨, 트립토판, 자일로즈 2, 피로인산염, 이소팔미트산, 글리세롤, 미리스트산, 팔미톨레산, 하이드록실아민 및 에탄올아민으로 구성된 군으로부터 선택되는 관절 낭액 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 염증성 관절염으로부터 류마티스 관절염을 진단하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 두 생체시료군 간의 대사체 차별성을 검출하는 방법으로서, (1) GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry)를 이용한 대사체 분석 방법; (2) GC/TOF MS에서 동정된 대사체에 대해 직교부분최소자승판별분석(OPLS-DA)를 이용하여 대사체 프로파일의 차이를 확인하는 방법; (3) OPLS-DA에서 도출된 대사체의 OPLS-DA 로딩 값과 VIP(Variable Importance for Projection) 값으로 구성된 V-plot를 작성하고, VIP 값이 1 이상인 값을 대사체 바이오마커 후보물질로 선정하고, OPLS-DA의 로딩 값을 통해 대사체 바이오마커 후보물질의 증감을 확인하는 방법; (4) GC/TOF MS에서 분석된 대사체의 강도를 이용하여 계층적 군집 분석(hierarchical clustering analysis)을 수행하여 대사체의 증감을 확인하는 방법; (5) 상기 (2), (3) 및 (4)의 방법을 통해 선정된 대사체 바이오마커 후보물질에 대해 Wilcoxon-Mann-Whitney test와 아노바(ANOVA) 분석을 통해 유의적 차이를 나타내는 대사체 바이오마커를 선정하는 방법; 및 (6) ROC 곡선(Receiver Operating Characteristic curve)을 이용하여 대사체 바이오마커를 검증하는 방법을 순차적으로 적용하여, 생체시료로부터 대사체 바이오마커를 분석하는 것을 포함하는 두 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법을 제공한다.
본 발명은 대사체학을 이용하여 다양한 염증성 관절염으로부터 류마티스 관절염을 효과적으로 진단할 수 있는 바이오마커를 제공하며, 이는 류마티스 관절염 치료제 개발에도 적용할 수 있다.
또한, 본 발명은 류마티스 관절염 외에도 다양한 질환 진단을 위한 대사체 바이오마커 분석이 가능하다.
도 1은 GC/TOF MS를 이용하여 류마티스 관절염과 다른 염증성 관절염의 대사체 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 OPLS-DA를 이용하여 류마티스 관절염과 다른 염증성 관절염 대사체 프로파일링 차이를 나타낸 결과이다(RA, 류마티스 관절염; Non-RA, 다른 염증성 관절염).
도 3은 류마티스 관절염과 다른 염증성 관절염을 구분하는데 관여하는 대사체의 로딩 값과 VIP 값으로 구성된 V-plot 결과이다(VIP 값이 1보다 크면 중요한 대사체로 간주됨; p(corr)>0, 류마티스 관절염 환자에서 증가하는 대사체; p(corr)<0, 류마티스 관절염 환자에서 감소하는 대사체).
도 4는 류마티스 관절염과 다른 염증성 관절염의 계층적 군집 분석 결과이다(RA, 류마티스 관절염; Non-RA, 다른 염증성 관절염).
도 5는 류마티스 관절염 진단을 위한 신규 바이오마커로 선정된 대사체의 류마티스 관절염과 다른 염증성 관절염에서의 폴드 체인지(fold change) 결과이다(fold change>0, 류마티스 관절염 환자에서 증가하는 대사체; fold change<0, 류마티스 관절염 환자에서 감소하는 대사체).
도 6은 류마티스 관절염 진단을 위한 신규 바이오마커로 선정된 대사체의 ROC 곡선을 이용한 검증 결과이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 옥타데카놀, 테레프탈산, 살리실알데히드, 시트룰린, 리비톨, 트립토판, 자일로즈 2, 피로인산염, 이소팔미트산, 글리세롤, 미리스트산, 팔미톨레산, 하이드록실아민 및 에탄올아민으로 구성된 군으로부터 선택되는 관절 낭액 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 염증성 관절염으로부터 류마티스 관절염을 진단하는 키트에 관한 것이다.
본 발명자들은 류마티스 관절염의 바이오마커를 찾기 위해 환자들의 관절 낭액으로부터 샘플을 채취하여 메탄올 추출하고 GC/TOF MS를 이용하여 류마티스 관절염 환자들과 다른 염증성 관절염, 예컨대 베체트 관절염, 통풍성 관절염, 강직성 관절염 등 환자들의 대사체 프로파일 차이를 비교 분석하고, 이 차이를 이용하여 류마티스 관절염 환자들을 진단할 수 있는 바이오마커 발굴 연구를 수행하였다.
그 결과, 아민류, 아미노산류, 지방산류, 유기산류, 인산류, 당류 등으로 구분할 수 있는 119종의 대사체를 동정하였다. 이 중 아미노산류가 가장 많이 검출되었으며, 그 다음으로 당류, 지방산류, 유기산류, 인산류, 아민류 등의 순서로 검출 되었다. 동정한 대사체는 기존 연구보다 그 수가 많다.
직교부분최소자승판별분석(OPLS-DA)을 통해 류마티스 관절염과 다른 염증성 관절염의 대사체 프로파일의 명확한 차이를 확인하였으며, VIP 값이 1 이상인 41종의 대사체를 신규 바이오마커 후보 물질로 선정하였으며, OPLS-DA의 로딩 값을 통해 류마티스 관절염 환자의 증감을 확인하였다. 그 결과, 29종의 대사체가 류마티스 관절염 환자에서 증가하였고, 12종의 대사체가 감소하였다.
또한, GC/TOF MS에서 분석된 관절 낭액의 대사체의 강도를 이용하여 계층적 군집 분석을 수행하여 대사체의 증감을 확인한 결과, 시트룰린, 라이신, 티로신, 아스파라긴, 글루타민, 옥타데카놀, 숙신산, 테레프탈산, 페닐알라닌 1TMS 등이 류마티스 관절염 환자에서 증가하였고, 미리스트산, 이소팔미트산, 글리세롤, 알라닌 등은 감소하는 대사체로 확인되었다.
상기 후보 바이오마커로 선정된 41종의 대사체를 Wilcoxon-Mann-Whitney test와 아노바 분석을 통해 류마티스 관절염과 다른 염증성 관절염에서 유의적 차이, 즉 폴드 체인지(fold change)가 0을 초과하는 경우 류마티스 관절염 환자에서 증가하는 대사체, 폴드 체인지가 0 미만인 경우 류마티스 관절염 환자에서 감소하는 대사체로 간주하였다. 그 결과 유의적인 차이를 나타내는 23종 대사체, 즉, 숙신산, 옥타데카놀, 아스파라긴, 테레프탈산, 살리실알데히드, 글루타민, 시트룰린, 티로신, 우라실, 라이신, 페닐알라닌 1TMS, 리비톨, 트립토판, 자일로즈 2, 피로인산염, 이소팔미트산, 글리세롤, 미리스트산, 팔미톨레산, 하이드록실아민, 에탄올아민, 알라닌 3TMS, 세린을 바이오마커로 선정하였다. 이중 숙신산, 옥타데카놀, 아스파라긴, 테레프탈산, 살리실알데히드, 글루타민, 시트룰린, 티로신, 우라실, 라이신, 페닐알라닌 1TMS, 리비톨, 트립토판, 자일로즈 2, 피로인산염은 류마티스 관절염에서 증가하는 대사체이고, 이소팔미트산, 글리세롤, 미리스트산, 팔미톨레산, 하이드록실아민, 에탄올아민, 알라닌 3TMS, 세린은 류마티스 관절염에서 감소하는 대사체이다.
ROC 곡선을 통해 23종의 바이오마커를 검증한 결과, 23종 모두 AUC 값이 0.8 이상으로 높은 값을 나타내었으며, 바이오마커를 결합한 ROC 곡선에서 AUC 값은 0.772로 높은 값을 나타냈다.
이중, 새롭게 규명된 옥타데카놀, 테레프탈산, 살리실알데히드, 시트룰린, 리비톨, 트립토판, 자일로즈 2, 피로인산염, 이소팔미트산, 글리세롤, 미리스트산, 팔미톨레산, 하이드록실아민 및 에탄올아민을 관절 낭액으로부터 염증성 관절염으로부터 류마티스 관절염을 진단할 수 있는 바이오마커로 선정하여 진단 외에도 류마티스 관절염 치료제 개발에도 적용 가능하도록 하였다.
나아가, 본 발명자들에 의하여 새롭게 규명된 류마티스 관절염의 지표 대사체인 옥타데카놀, 테레프탈산, 살리실알데히드, 시트룰린, 리비톨, 트립토판, 자일로즈 2, 피로인산염, 이소팔미트산, 글리세롤, 미리스트산, 팔미톨레산, 하이드록실아민 및 에탄올아민 외에도 숙신산, 아스파라긴, 글루타민, 티로신, 우라실, 라이신, 페닐알라닌 1TMS, 세린 및 알라닌 3TMS에 대한 정량정보를 추가적으로 포함함으로써 염증성 관절염으로부터 보다 일관성 있고 신뢰도 높은 정확한 류마티스 관절염의 진단이 가능하다.
본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것(예컨대, 류마티스 관절염의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 발명의 진단 키트에 포함된 정량 장치는 크로마토그래피/질량분석기일 수 있다.
본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography), 액체-고체 크로마토그래피(Liquid-Solid Chromatography, LSC), 종이 크로마토그래피(Paper Chromatography, PC), 박층 크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography, TLC), 기체-고체 크로마토그래피(Gas-Solid Chromatography, GSC), 액체-액체 크로마토그래피(Liquid-Liquid Chromatography, LLC), 포말 크로마토그래피(Foam Chromatography, FC), 유화 크로마토그래피(Emulsion Chromatography, EC), 기체-액체 크로마토그래피(Gas-Liquid Chromatography, GLC), 이온 크로마토그래피(Ion Chromatography, IC), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatograhy, GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)를 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정량용 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 가스 크로마토그래피이다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 질량분석기는 MALDI-TOF MS 또는 TOF MS이고, 보다 바람직하게는 TOF MS이다.
본 발명의 관절 낭액 대사체는 가스 크로마토그래피에서 각 성분들이 분리되며, Q-TOF MS를 거쳐 얻어진 정보를 이용하여 정확한 분자량 정보뿐만 아니라 구조 정보(elemental composition)를 통해 구성 성분을 확인한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 옥타데카놀, 테레프탈산, 살리실알데히드, 시트룰린, 리비톨, 트립토판, 자일로즈 2 및 피로인산염의 농도가 증가되는 경우, 류마티스 관절염을 나타내고, 이소팔미트산, 글리세롤, 미리스트산, 팔미톨레산, 하이드록시아민 및 에탄올아민의 농도가 감소되는 경우, 류마티스 관절염을 나타낸다.
본 명세서에서, 용어 "관절 낭액 대사체 농도의 증가"는 염증성 관절염 환자에 비해 류마티스 관절염 환자의 관절 낭액 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 증가된 것을 의미하며, 바람직하게는 70% 이상 증가된 것을 의미하고, 보다 바람직하게는 30% 이상 증가된 것을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "관절 낭액 대사체 농도의 감소"는 염증성 관절염 환자에 비해 류마티스 관절염 환자의 관절 낭액 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 감소된 것을 의미하며, 바람직하게는 40% 이상 감소된 것을 의미하고, 보다 바람직하게는 20% 이상 감소된 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, 숙신산, 옥타데카놀, 아스파라긴, 테레프탈산, 살리실알데히드, 글루타민, 시트룰린, 티로신, 우라실, 라이신, 페닐알라닌 1TMS, 리비톨, 트립토판, 자일로즈 2, 피로인산염은 염증성 관절염에 비해 류마티스 관절염에서 유의하게 증가된 농도를 나타내고, 이소팔미트산, 글리세롤, 미리스트산, 팔미톨레산, 하이드록실아민, 에탄올아민, 알라닌 3TMS, 세린은 류마티스 관절염에서 유의하게 감소된 농도를 나타낸다(표 1).
본 발명은 또한 두 생체시료군 간의 대사체 차별성을 검출하는 방법으로서, (1) GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry)를 이용한 대사체 분석 방법; (2) GC/TOF MS에서 동정된 대사체에 대해 직교부분최소자승판별분석(OPLS-DA)를 이용하여 대사체 프로파일의 차이를 확인하는 방법; (3) OPLS-DA에서 도출된 대사체의 OPLS-DA 로딩 값과 VIP(Variable Importance for Projection) 값으로 구성된 V-plot를 작성하고, VIP 값이 1 이상인 값을 대사체 바이오마커 후보물질로 선정하고, OPLS-DA의 로딩 값을 통해 대사체 바이오마커 후보물질의 증감을 확인하는 방법; (4) GC/TOF MS에서 분석된 대사체의 강도를 이용하여 계층적 군집 분석(hierarchical clustering analysis)을 수행하여 대사체의 증감을 확인하는 방법; (5) 상기 (2), (3) 및 (4)의 방법을 통해 선정된 대사체 바이오마커 후보물질에 대해 Wilcoxon-Mann-Whitney test와 아노바(ANOVA) 분석을 통해 유의적 차이를 나타내는 대사체 바이오마커를 선정하는 방법; 및 (6) ROC 곡선(Receiver Operating Characteristic curve)을 이용하여 대사체 바이오마커를 검증하는 방법을 순차적으로 적용하여, 생체시료로부터 대사체 바이오마커를 분석하는 것을 포함하는 두 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법에 관한 것이다.
본 발명의 두 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법은 염증성 관절염과 류마티스 관절염에서 얻은 관절 낭액 생체시료군 간의 대사체 차별성을 분석하는 방법을 예로 들어 구체적으로 설명한다.
우선, 염증성 관절염과 류마티스 관절염에서 채취한 관절 낭액을 80% 메탄올로 추출한 후 GC/TOF MS 분석에 사용할 수 있도록 공지 기술을 이용하여 유도체화 과정을 거친다.
상기 GC/TOF MS를 이용한 관절 낭액의 대사체 분석 방법은 관절 낭액 추출물을 GC/TOF MS 기기로 분석하고, 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환한 다음, 변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 두 생체시료군의 차별성을 검증하는 것을 포함한다.
GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 것은 총 분석시간을 단위시간 간격으로 나누어 단위시간 동안 나타난 크로마토그램 피크의 면적 또는 높이 중 가장 큰 수치를 단위시간 동안의 대표값으로 정하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, GC/TOF MS 분석 결과 아민류, 아미노산류, 지방산류, 유기산류, 인산류, 당류 등으로 구분할 수 있는 119종의 대사체를 동정하였고, 이 중 아미노산류가 가장 많이 검출 되었으며, 그 다음으로 당류, 지방산류, 유기산류, 인산류, 아민류 등의 순서로 검출 되었다.
상기 GC/TOF MS 분석 결과 나온 대사체의 강도를 총 동정된 대사체의 강도 합으로 나누어 각 대사체를 표준화하고, OPLS-DA 분석을 실시한다.
대사체의 OPLS-DA 로딩 값과 VIP 값으로 구성된 V-plot를 작성하고, VIP 값이 1 이상인 값을 대사체 바이오마커 후보물질로 선정하고, OPLS-DA의 로딩 값의 증감을 확인하며, 이때 로딩 값이 양수인 것은 대사체의 증가 경향을, 로딩 값이 음수인 것은 대사체의 감소 경향을 나타내는 것이다.
GC/TOF MS에서 분석된 관절 낭액의 대사체의 강도를 이용하여 계층적 군집 분석을 수행하여 대사체의 증감을 확인할 수 있다.
OPLS-DA, OPLS-DA 로딩 값과 VIP 값으로 구성된 V-plot 및 계층적 군집 분석을 통해 선정된 바이오마커에 대해 Wilcoxon-Mann-Whitney test와 아노바 분석을 수행하고, 류마티스 관절염과 다른 염증성 관절염에서 유의적 차이, 즉 폴드 체인지(fold change)가 0을 초과하는 경우 류마티스 관절염 환자에서 증가하는 대사체, 폴드 체인지가 0 미만인 경우 류마티스 관절염 환자에서 감소하는 대사체로 간주하여 유의적인 차이를 나타내는 대사체를 바이오마커로 선정한다.
ROC 곡선을 통해 상기 대사체 바이오마커를 검증한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 염증성 관절염으로부터 류마티스 관절염을 진단하기 위한 바이오마커로, 숙신산, 옥타데카놀, 아스파라긴, 테레프탈산, 살리실알데히드, 글루타민, 시트룰린, 티로신, 우라실, 라이신, 페닐알라닌 1TMS, 리비톨, 트립토판, 자일로즈 2, 피로인산염, 이소팔미트산, 글리세롤, 미리스트산, 팔미톨레산, 하이드록실아민, 에탄올아민, 알라닌 3TMS 및 세린을 사용할 수 있다.
본 발명의 염증성 관절염과 류마티스 관절염에서 얻은 관절 낭액 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법을 통해 염증성 관절염으로부터 보다 일관성 있고 신뢰도 높은 정확한 류마티스 관절염을 진단할 수 있고, 이를 치료제 개발에 적용할 수 있다. 이러한 방법은 류마티스 관절염 외에 다양한 질환에도 적용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> GC/TOF MS를 이용한 대사체 동정
류마티스 관절염 환자와 다른 염증성 관절염 환자(베체트 관절염, 통풍성 관절염, 강직성 관절염)로부터 관절 낭액을 채취하여 80% 메탄올로 추출하였다. GC/TOF MS 분석을 위한 유도체화 과정은 다음과 같다. 추출한 샘플을 스피드 백으로 건조시킨 후에 5 ㎕의 40%(w/v) 농도의 O-methylhydroxylamine hydrochloride in pyridine을 넣고 30℃ 200 rpm에서 90분간 반응시켰다. 그리고 45 ㎕의 N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide를 넣고 37℃ 200 rpm에서 30분간 반응시켰다. GC/TOF MS 분석을 위한 기기 조건은 다음과 같다. 분석 시 사용한 컬럼은 RTX-5Sil MS capillary column(30 m length, 0.25 mm film thickness, 및 25 mm inner diameter)과 10 m의 guard column이며, GC 컬럼 온도 조건은 먼저 50℃에서 5분간 유지 시킨 후 330℃까지 승온 시킨 후 1분간 유지하였다. 1 ㎕의 샘플을 비분할법(splitless)으로 주입하였다. 트랜스퍼 라인(Transfer line) 온도와 이온 소스(Ion source) 온도는 각각 280℃, 250℃로 유지시켰다.
GC/TOF MS 결과를 보유하고 있는 라이브러리(library)에서 찾아 동정하여, 119종의 대사체를 동정하였다(도 1).
도 1에 나타난 바와 같이, 아민 12종, 아미노산 31종, 지방산 18종, 유기산 16종, 인산 9종, 당 26종, 기타 7종이 동정되었다.
<실시예 2> OPLS-DA를 이용한 류마티스 관절염과 다른 염증성 관절염의 대사체 프로파일링 차이
실시예 1에서 동정된 대사체의 강도를 총 동정된 대사체의 강도의 합으로 나누어 각 대사체를 표준화하였다. 그 후 SIMCA-P+(ver. 12.0)를 이용하여 OPLS-DA 분석을 실시하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 류마티스 관절염과 다른 염증성 관절염의 대사체 프로파일은 명확하게 차이가 났다.
<실시예 3> 대사체의 OPLS-DA의 로딩(loading) 값과 VIP 값으로 구성된 V-plot
실시예 2에서 도출된 대사체 프로파일의 차이에 영향을 미치는 대사체를 선별하기 위하여 로딩 값과 VIP 값을 이용하였다. VIP 값이 1 이상인 대사체를 류마티스 관절염과 다른 염증성 관절염을 구분하기 위한 중요한 대사체로 선정하였다.
VIP 값이 1 이상인 대사체는 총 41종 이었다. OPLS-DA의 로딩 값을 통하여 류마티스 관절염 환자들에게 나타나는 대사체들의 증감을 확인하였다. 로딩 값이 양수인 대사체는 류마티스 관절염 환자들에게 증가하는 경향을 나타내며, 음수인 대사체는 류마티스 관절염 환자들에게 감소하는 경향을 나타낸다. VIP 값을 통하여 선정된 41종의 대사체 중 29종의 대사체가 류마티스 관절염 환자에게 증가하였고, 12종 대사체가 감소하였다(도 3).
<실시예 4> 계층적 군집 분석을 이용한 류마티스 관절염과 다른 염증성 관절염의 대사체 프로파일 차이
실시예 1에서 동정된 대사체의 강도를 이용하여 계층적 군집 분석을 실시하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 류마티스 관절염과 다른 염증성 관절염의 대사체 프로파일이 명확하게 차이가 남을 확인하였으며, 시트룰린(citrulline), 라이신(lysine), 티로신(tyrosine), 아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine), 옥타데카놀(octadecanol), 숙신산(succinic acid), 테레프탈산(terephtalic acid), 페닐알라닌 1TMS(phenylalnine 1TMS) 등이 류마티스 관절염 환자에게 증가하는 대사체로 확인하였고, 미리스트산(myristic acid), 이소팔미트산(isopalmitic acid), 글리세롤(glycerol), 알라닌(alanine) 등은 류마티스 관절염 환자에게 감소하는 대사체로 확인하였다.
<실시예 5> 신규 바이오마커로 선정된 대사체의 류마티스 관절염과 다른 염증성 관절염에서의 폴드 체인지
실시예 2, 3, 4를 통해 신규 바이오마커 후보 41종을 선정하였다. 그 후 Wilcoxon-Mann-Whitney test와 아노바 분석을 통하여 류마티스 관절염과 다른 염증성 관절염에서 유의적 차이를 보이는 23종의 대사체를 류마티스 관절염 진단을 위한 신규 바이오마커로 선정하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 숙신산, 옥타데카놀, 아스파라긴, 테레프탈산, 살리실알데히드(salicylaldehyde), 글루타민(glutamine), 시트룰린, 티로신(tyrosine), 우라실(uracil), 라이신, 페닐알라닌 1TMS, 리비톨(ribitol), 트립토판(tryptophan), 자일로즈 2(xylose 2), 피로인산염(pyrophosphate)의 15개는 류마티스 관절염에서 증가하는 대사체이며, 이소팔미트산, 글리세롤, 미리스트산, 팔미톨레산(palmitoleic acid), 하이드록실아민(hydroxylamine), 에탄올아민(ethanolamine), 알라닌 3TMS(alanine 3TMS), 세린(serine)은 류마티스 관절염에서 감소하는 대사체이다. 특히 숙신산, 살리실알데히드, 글루타민의 폴드 체인지는 70.1, 51.9, 20.0으로 가장 높은 폴드 체인지를 나타냈으며, 다른 대사체의 폴드 체인지는 1.7에서 8.5로 나타났다.
<실시예 6> 신규 바이오마커로 선정된 대사체의 ROC 곡선
실시예 2, 3, 4를 통해 선정된 신규 바이오마커 후보 41종의 Wilcoxon-Mann-Whitney test와 아노바 분석을 통하여 류마티스 관절염의 진단을 위한 23종의 신규 바이오마커를 선정하였다. 이 대사체의 검증을 위해 각각의 대사체의 ROC 곡선을 통한 AUC(area under the ROC curve) 값을 구하였다.
모든 대사체들의 AUC 값이 0.8 이상을 나타내어, 신규 바이오마커로서 적합함을 검증하였다. 신규 바이오마커를 결합한 ROC 곡선을 통한 AUC 값은 0.772로 나타내어 신규 바이오마커를 결합하였을 때에도 바이오마커로서 적합함을 검증하였다(표 1, 도 6).
류마티스 관절염 진단을 위한 신규 바이오마커로 선정 된 대사체의 VIP 값과 AUC 값
염증성 관절염 시료 대비 류마티스 관절염 시료에서 증가된 대사체
대사체 종류 VIP 값(rank) p 값 AUC
숙신산 2.03 (1) <0.0001 1.000
옥타데카놀 2.01 (2) <0.0001 1.000
아스파라긴 1.93 (3) <0.0001 1.000
테레프탈산 1.89 (4) <0.0001 1.000
살리실알데히드 1.88 (5) <0.0001 1.000
글루타민 1.87 (6) <0.0001 0.997
시트룰린 1.87 (7) <0.0001 1.000
티로신 1.84 (8) <0.0001 1.000
우라실 1.82 (9) <0.0001 0.997
라이신 1.81 (10) <0.0001 0.991
페닐알라닌 1TMS 1.75 (12) <0.0001 0.972
리비톨 1.68 (13) <0.0001 0.985
트립토판 1.54 (18) <0.0001 0.880
자일로즈 2 1.50 (19) <0.0001 0.917
피로인산염염 1.42 (23) <0.0001 0.957
염증성 관절염 시료 대비 류마티스 관절염 시료에서 감소된 대사체
대사체 종류 VIP 값(rank) p 값 AUC
이소팔미트산 1.77 (11) <0.0001 0.994
글리세롤 1.64 (14) <0.0001 1.000
미리스트산 1.64 (15) <0.0001 0.988
팔미톨레산 1.62 (16) <0.0001 1.000
하이드록실아민 1.62 (17) <0.0001 1.000
에탄올아민 1.44 (22) <0.0001 0.966
세린 1.35 (26) <0.0001 0.920
알라닌 3TMS 1.32 (28) <0.0001 0.972

Claims (14)

  1. 옥타데카놀, 테레프탈산, 살리실알데히드, 시트룰린, 리비톨, 트립토판, 자일로즈 2, 피로인산염, 이소팔미트산, 글리세롤, 미리스트산, 팔미톨레산, 하이드록실아민 및 에탄올아민으로 이루어진 관절 낭액 대사체군에 대한 정량 장치를 포함하고,
    상기 옥타데카놀, 테레프탈산, 살리실알데히드, 시트룰린, 리비톨, 트립토판, 자일로즈 2 및 피로인산염의 농도가 증가하거나, 이소팔미트산, 글리세롤, 미리스트산, 팔미톨레산, 하이드록실아민 및 에탄올아민의 농도가 감소하는 경우 류마티스 관절염인 것으로 평가하는,
    염증성 관절염으로부터 류마티스 관절염을 진단하는 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    염증성 관절염은 베체트 관절염, 통풍성 관절염 및 강직성 관절염에서 선택된 것인 키트.
  3. 제1항에 있어서,
    키트는 숙신산, 아스파라긴, 글루타민, 티로신, 우라실, 라이신, 페닐알라닌 1TMS, 세린 및 알라닌 3TMS로 이루어진 관절 낭액 대사체군에 대한 정량 장치를 추가적으로 포함하고,
    상기 숙신산, 아스파라긴, 글루타민, 티로신, 우라실, 라이신 및 페닐알라닌 1TMS의 농도가 증가하거나, 세린 및 알라닌 3TMS의 농도가 감소하는 경우 류마티스 관절염인 것으로 평가하는, 키트.
  4. 제1항에 있어서,
    정량 장치는 크로마토그래피/질량분석기인 키트.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 두 생체시료군 간의 대사체 차별성을 검출하는 방법으로서,
    (1) GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry)를 이용한 대사체 분석 방법;
    (2) GC/TOF MS에서 동정된 대사체에 대해 직교부분최소자승판별분석(OPLS-DA)를 이용하여 대사체 프로파일의 차이를 확인하는 방법;
    (3) OPLS-DA에서 도출된 대사체의 OPLS-DA 로딩 값과 VIP(Variable Importance for Projection) 값으로 구성된 V-plot를 작성하고, VIP 값이 1 이상인 값을 대사체 바이오마커 후보물질로 선정하고, OPLS-DA의 로딩 값을 통해 대사체 바이오마커 후보물질의 증감을 확인하는 방법;
    (4) GC/TOF MS에서 분석된 대사체의 강도를 이용하여 계층적 군집 분석(hierarchical clustering analysis)을 수행하여 대사체의 증감을 확인하는 방법;
    (5) 상기 (2), (3) 및 (4)의 방법을 통해 선정된 대사체 바이오마커 후보물질에 대해 Wilcoxon-Mann-Whitney test와 아노바(ANOVA) 분석을 통해 유의적 차이를 나타내는 대사체 바이오마커를 선정하는 방법; 및
    (6) ROC 곡선(Receiver Operating Characteristic curve)을 이용하여 대사체 바이오마커를 검증하는 방법을 순차적으로 적용하여, 생체시료로부터 대사체 바이오마커를 분석하는 것을 포함하는 두 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    GC/TOF MS를 이용한 대사체 분석 방법은 생체시료를 GC/TOF MS 기기로 분석하고, 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환한 다음, 변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 두 생체시료군의 차별성을 검증하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 것은 총 분석시간을 단위시간 간격으로 나누어 단위시간 동안 나타난 크로마토그램 피크의 면적 또는 높이 중 가장 큰 수치를 단위시간 동안의 대표값으로 정하는 것인 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    OPLS-DA의 로딩 값이 양수인 것은 대사체의 증가 경향을, 로딩 값이 음수인 것은 대사체의 감소 경향을 나타내는 것인 방법.
  13. 제9항에 있어서,
    생체시료군은 염증성 관절염과 류마티스 관절염에서 얻은 관절 낭액인 방법.
  14. 제9항에 있어서,
    대사체 바이오마커는 숙신산, 옥타데카놀, 아스파라긴, 테레프탈산, 살리실알데히드, 글루타민, 시트룰린, 티로신, 우라실, 라이신, 페닐알라닌 1TMS, 리비톨, 트립토판, 자일로즈 2, 피로인산염, 이소팔미트산, 글리세롤, 미리스트산, 팔미톨레산, 하이드록실아민, 에탄올아민, 알라닌 3TMS 및 세린으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
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